JPH083062A - ヘモグロビン含有リポソーム - Google Patents
ヘモグロビン含有リポソームInfo
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- JPH083062A JPH083062A JP6133043A JP13304394A JPH083062A JP H083062 A JPH083062 A JP H083062A JP 6133043 A JP6133043 A JP 6133043A JP 13304394 A JP13304394 A JP 13304394A JP H083062 A JPH083062 A JP H083062A
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- liposome
- glucose
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Abstract
(57)【要約】
【構成】ヘモグロビン溶液に、グルコースとアデニンと
イノシンとＡＴＰが添加されている。 【効果】ヘモグロビンのメト化を抑制できる。
イノシンとＡＴＰが添加されている。 【効果】ヘモグロビンのメト化を抑制できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生体内に投与するヘモ
グロビン含有リポソームに関する。本発明は、更に詳し
くは生体内に投与したときのヘモグロビン経時メト化を
著しく抑制したヘモグロビン含有リポソームに関する。
グロビン含有リポソームに関する。本発明は、更に詳し
くは生体内に投与したときのヘモグロビン経時メト化を
著しく抑制したヘモグロビン含有リポソームに関する。
【０００２】
【従来の技術】血液の代用と成り得る薬剤として、ゼラ
チン分解産物の溶液、デキストラン溶液、ヒドロキシエ
チルスターチ（ＨＥＳ）溶液等の血漿増量剤が使用され
ている。しかし、これらの代用血液は大量出血等の緊急
時に血管内の血漿量を補充し、循環動態を維持する目的
で開発された製剤で、天然赤血球の酸素運搬能を代替え
する事はできない。近年、こうした血漿増量剤とは異な
り、天然赤血球類似の酸素運搬能を保持した代用血液と
して、人工酸素運搬体の研究開発が進められている。
チン分解産物の溶液、デキストラン溶液、ヒドロキシエ
チルスターチ（ＨＥＳ）溶液等の血漿増量剤が使用され
ている。しかし、これらの代用血液は大量出血等の緊急
時に血管内の血漿量を補充し、循環動態を維持する目的
で開発された製剤で、天然赤血球の酸素運搬能を代替え
する事はできない。近年、こうした血漿増量剤とは異な
り、天然赤血球類似の酸素運搬能を保持した代用血液と
して、人工酸素運搬体の研究開発が進められている。
【０００３】当初の開発段階にあっては、フッ化炭素エ
マルジョン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ：Ｐ
ＦＣ［通称：ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ］）の酸素溶解
能力（水の２０倍）を利用した化学合成品が検討された
が、十分な酸素運搬量の不足や体内蓄積性などの問題点
が危惧されている。
マルジョン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ：Ｐ
ＦＣ［通称：ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ］）の酸素溶解
能力（水の２０倍）を利用した化学合成品が検討された
が、十分な酸素運搬量の不足や体内蓄積性などの問題点
が危惧されている。
【０００４】一方、酸素運搬体として天然赤血球由来ヘ
モグロビンを利用する試みも行われているが遊離ヘモグ
ロビンの生体内半減期は極端に短く（４時間以内）、末
梢への酸素運搬能も低く、腎毒性等の問題点が指摘され
ており、実用化は難しい。最近、こうした遊離ヘモグロ
ビン溶液の持つ問題点を改善した修飾ヘモグロビン（安
定化ヘモグロビン、重合ヘモグロビンetc.）やリポソー
ム化ヘモグロビンの開発検討が中心と成りつつある。
モグロビンを利用する試みも行われているが遊離ヘモグ
ロビンの生体内半減期は極端に短く（４時間以内）、末
梢への酸素運搬能も低く、腎毒性等の問題点が指摘され
ており、実用化は難しい。最近、こうした遊離ヘモグロ
ビン溶液の持つ問題点を改善した修飾ヘモグロビン（安
定化ヘモグロビン、重合ヘモグロビンetc.）やリポソー
ム化ヘモグロビンの開発検討が中心と成りつつある。
【０００５】その例として、ヘモグロビンを含有するリ
ポソームとして薄膜法により製造されたものがミラー
（Ｍｉｌｌｅｒ）らによって報告されている（米国特許
第４,１３３,８７４号）。この方法によればヘモグロビ
ン含有リポソームは、リポソーム形成脂質をクロロホル
ム等の適当な有機溶媒に溶解し、得られた溶液から溶媒
を留去して脂質の薄膜をつくり、この薄膜に溶血ヘモグ
ロビン水溶液を加え、激しく撹拌して多重層リポソーム
を形成し、次にこれを超音波処理することによって得ら
れる。この方法よれば、ヘモグロビンが酸素に触れる時
間が少ないのでヘモグロビンの変性が比較的少ない利点
がある。
ポソームとして薄膜法により製造されたものがミラー
（Ｍｉｌｌｅｒ）らによって報告されている（米国特許
第４,１３３,８７４号）。この方法によればヘモグロビ
ン含有リポソームは、リポソーム形成脂質をクロロホル
ム等の適当な有機溶媒に溶解し、得られた溶液から溶媒
を留去して脂質の薄膜をつくり、この薄膜に溶血ヘモグ
ロビン水溶液を加え、激しく撹拌して多重層リポソーム
を形成し、次にこれを超音波処理することによって得ら
れる。この方法よれば、ヘモグロビンが酸素に触れる時
間が少ないのでヘモグロビンの変性が比較的少ない利点
がある。
【０００６】しかしながら、これらヘモグロビンを原料
とした人工赤血球の酸素運搬能はヘモグロビンと酸素分
子との可逆的結合により生じ、ヘム鉄（プロトヘム）の
原子価が２価の状態（Ｆｅ2+）でのみ保たれる機能であ
る。ヘモグロビンはその可逆的酸素化（ｏｘｉｇｅｎａ
ｔｉｏｎ）の過程で徐々に酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）
され酸素結合能を持たない３価のメトヘモグロビン（Ｆ
ｅ3+）に変化する。このため正常赤血球は、これらの酸
化作用に対し、ヘモグロビンが酸化されるのを抑制する
機構を持っている。しかし、こうした天然赤血球の酸化
抑制機構は、人工酸素運搬体として調製されたヘモグロ
ビン溶液においては認められず、ヘモグロビン酸化物の
占める割合は経時的に増加する。このため、天然ヘモグ
ロビンならびにその誘導体を医薬品や試薬として使用す
る場合には、酸化防止剤あるいは還元剤を用いる必要が
あった。亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、硫
酸第一鉄、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム等の物質
が知られているが、、生体に対して有害となる。また、
還元型グルタチオン、アスコルビン酸、トコフェロール
類、糖類、アミノ酸類なども一般に用いられる。しかし
ながら、これらの添加物の抑制効果は低く、特に体内投
与後の経時的な酸化抑制効果は不十分であった。
とした人工赤血球の酸素運搬能はヘモグロビンと酸素分
子との可逆的結合により生じ、ヘム鉄（プロトヘム）の
原子価が２価の状態（Ｆｅ2+）でのみ保たれる機能であ
る。ヘモグロビンはその可逆的酸素化（ｏｘｉｇｅｎａ
ｔｉｏｎ）の過程で徐々に酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）
され酸素結合能を持たない３価のメトヘモグロビン（Ｆ
ｅ3+）に変化する。このため正常赤血球は、これらの酸
化作用に対し、ヘモグロビンが酸化されるのを抑制する
機構を持っている。しかし、こうした天然赤血球の酸化
抑制機構は、人工酸素運搬体として調製されたヘモグロ
ビン溶液においては認められず、ヘモグロビン酸化物の
占める割合は経時的に増加する。このため、天然ヘモグ
ロビンならびにその誘導体を医薬品や試薬として使用す
る場合には、酸化防止剤あるいは還元剤を用いる必要が
あった。亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、硫
酸第一鉄、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム等の物質
が知られているが、、生体に対して有害となる。また、
還元型グルタチオン、アスコルビン酸、トコフェロール
類、糖類、アミノ酸類なども一般に用いられる。しかし
ながら、これらの添加物の抑制効果は低く、特に体内投
与後の経時的な酸化抑制効果は不十分であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
点を鑑み、ヘモグロビンの経時酸化抑制、特に、体内に
投与した時のヘモグロビンの酸化が抑制されたヘモグロ
ビン含有リポソームを提供するものである。
点を鑑み、ヘモグロビンの経時酸化抑制、特に、体内に
投与した時のヘモグロビンの酸化が抑制されたヘモグロ
ビン含有リポソームを提供するものである。
【０００８】
【問題を解決するための手段】この上記課題は下記の構
成からなる、本発明のヘモグロビン含有リポソームによ
り解決される。
成からなる、本発明のヘモグロビン含有リポソームによ
り解決される。
【０００９】（１）脂質からなるリポソーム内に酵素活
性を有するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロ
ビン含有リポソームにおいて、前記ヘモグロビン溶液
に、アデニン、イノシン、アデノシン三リン酸（以後、
ＡＴＰと称す）からなる群の少なくとも１つと、グルコ
ースが含まれていることを特徴とするヘモグロビン含有
リポソーム。
性を有するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロ
ビン含有リポソームにおいて、前記ヘモグロビン溶液
に、アデニン、イノシン、アデノシン三リン酸（以後、
ＡＴＰと称す）からなる群の少なくとも１つと、グルコ
ースが含まれていることを特徴とするヘモグロビン含有
リポソーム。
【００１０】（２）脂質からなるリポソーム内に酵素活
性を有するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロ
ビン含有リポソームにおいて、前記ヘモグロビン溶液
に、ＡＴＰと、グルコースが含まれていることを特徴と
する上記（１）に記載のヘモグロビン含有リポソーム。
性を有するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロ
ビン含有リポソームにおいて、前記ヘモグロビン溶液
に、ＡＴＰと、グルコースが含まれていることを特徴と
する上記（１）に記載のヘモグロビン含有リポソーム。
【００１１】（３）脂質からなるリポソーム内に酵素活
性を有するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロ
ビン含有リポソームにおいて、前記ヘモグロビン溶液
に、アデニンおよびイノシンと、グルコースが含まれて
いることを特徴とする上記（１）に記載のヘモグロビン
含有リポソーム。
性を有するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロ
ビン含有リポソームにおいて、前記ヘモグロビン溶液
に、アデニンおよびイノシンと、グルコースが含まれて
いることを特徴とする上記（１）に記載のヘモグロビン
含有リポソーム。
【００１２】（４）脂質からなるリポソーム内に酵素活
性を有するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロ
ビン含有リポソームにおいて、前記グルコースとアデニ
ンとイノシン、またはグルコースとＡＴＰ、またはグル
コースとアデニンとイノシンとＡＴＰが添加されている
ヘモグロビン溶液に、さらに還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（以後、ＮＡＤＨと称す）、酸化型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以後、ＮＡＤ
と称す）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸（以後、ＮＡＤＰＨと称す）、酸化型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以後、ＮＡＤＰ
と称す）よりなる群の少なくとも１つが含まれてなるこ
とを特徴とする上記（１）乃至（３）に記載のヘモグロ
ビン含有リポソーム。
性を有するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロ
ビン含有リポソームにおいて、前記グルコースとアデニ
ンとイノシン、またはグルコースとＡＴＰ、またはグル
コースとアデニンとイノシンとＡＴＰが添加されている
ヘモグロビン溶液に、さらに還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（以後、ＮＡＤＨと称す）、酸化型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以後、ＮＡＤ
と称す）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
ドリン酸（以後、ＮＡＤＰＨと称す）、酸化型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以後、ＮＡＤＰ
と称す）よりなる群の少なくとも１つが含まれてなるこ
とを特徴とする上記（１）乃至（３）に記載のヘモグロ
ビン含有リポソーム。
【００１３】（５）グルコースの量（重量モル比）がヘ
モグロビン溶液中にヘモグロビン１モルに対して１〜２
０モル含まれていることを特徴とする上記（１）乃至
（４）に記載のヘモグロビン含有リポソーム。
モグロビン溶液中にヘモグロビン１モルに対して１〜２
０モル含まれていることを特徴とする上記（１）乃至
（４）に記載のヘモグロビン含有リポソーム。
【００１４】（６）ＡＴＰの量（重量モル比）がヘモグ
ロビン溶液中にヘモグロビン１モルに対して０.０１〜
１モル含まれていることを特徴とする上記（１）、
（２）および（４）に記載のヘモグロビン含有リポソー
ム。
ロビン溶液中にヘモグロビン１モルに対して０.０１〜
１モル含まれていることを特徴とする上記（１）、
（２）および（４）に記載のヘモグロビン含有リポソー
ム。
【００１５】（７）アデニンの量（重量モル比）がヘモ
グロビン溶液中にヘモグロビン１モルに対して０.１〜
１モル、およびイノシンの量（重量モル比）がヘモグロ
ビン溶液中にヘモグロビン１に対して０.１〜１モル含
まれていることを特徴とする上記（１）、（３）および
（４）に記載のヘモグロビン含有リポソーム。
グロビン溶液中にヘモグロビン１モルに対して０.１〜
１モル、およびイノシンの量（重量モル比）がヘモグロ
ビン溶液中にヘモグロビン１に対して０.１〜１モル含
まれていることを特徴とする上記（１）、（３）および
（４）に記載のヘモグロビン含有リポソーム。
【００１６】（８）洗浄赤血球を溶血後、赤血球膜成分
を除去し、３０〜６０(W/W)％の濃縮ヘモグロビン溶液
に、アデニン、イノシン、ＡＴＰからなる群の少なくと
も１つと、グルコースを添加して混和させ、ヘモグロビ
ン溶液中の酵素失活が無い緩和な条件下でリポソーム化
することを特徴とする上記（１）乃至（７）に記載のヘ
モグロビン含有リポソームの製法。
を除去し、３０〜６０(W/W)％の濃縮ヘモグロビン溶液
に、アデニン、イノシン、ＡＴＰからなる群の少なくと
も１つと、グルコースを添加して混和させ、ヘモグロビ
ン溶液中の酵素失活が無い緩和な条件下でリポソーム化
することを特徴とする上記（１）乃至（７）に記載のヘ
モグロビン含有リポソームの製法。
【００１７】本発明はヘモグロビン含有リポソームの酸
化変性に対する問題を解決するために、ＡＴＰおよびグ
ルコースを添加し、経時的に生成するヘモグロビン酸化
物を還元することにより、ヘモグロビン経時酸化に伴う
機能低下を防止するものである。
化変性に対する問題を解決するために、ＡＴＰおよびグ
ルコースを添加し、経時的に生成するヘモグロビン酸化
物を還元することにより、ヘモグロビン経時酸化に伴う
機能低下を防止するものである。
【００１８】また本発明はヘモグロビン含有リポソーム
の酸化変性に対する問題を解決するために、アデニン、
イノシンおよびグルコースを添加し、経時的に生成する
ヘモグロビン酸化物を還元することにより、ヘモグロビ
ン経時酸化に伴う機能低下を防止するものである。
の酸化変性に対する問題を解決するために、アデニン、
イノシンおよびグルコースを添加し、経時的に生成する
ヘモグロビン酸化物を還元することにより、ヘモグロビ
ン経時酸化に伴う機能低下を防止するものである。
【００１９】また本発明はヘモグロビン含有リポソーム
の酸化変性に対する問題を解決するために、グルコー
ス、アデニン、イノシンおよびＡＴＰを添加し、経時的
に生成するヘモグロビン酸化物を還元することにより、
ヘモグロビン経時酸化に伴う機能低下を防止するもので
ある。
の酸化変性に対する問題を解決するために、グルコー
ス、アデニン、イノシンおよびＡＴＰを添加し、経時的
に生成するヘモグロビン酸化物を還元することにより、
ヘモグロビン経時酸化に伴う機能低下を防止するもので
ある。
【００２０】本発明においてグルコースの量（重量モル
比）はヘモグロビン１モルに対して、１〜２０モル、好
ましくは２〜１５モル、より好ましくは２〜１０モルで
ある。１モルより少ないとヘモグロビンのメト化防止効
果が少なく、また２０モルより多いと溶液の流動性の問
題でリポソーム化効率があまり良くはない。
比）はヘモグロビン１モルに対して、１〜２０モル、好
ましくは２〜１５モル、より好ましくは２〜１０モルで
ある。１モルより少ないとヘモグロビンのメト化防止効
果が少なく、また２０モルより多いと溶液の流動性の問
題でリポソーム化効率があまり良くはない。
【００２１】また本発明においてアデニンおよびイノシ
ンの量（重量モル比）は、各々ヘモグロビン１モルに対
して、０.１〜１モル、好ましくは０.１〜０.５モル、
より好ましくは０.２〜０.５モルである。０.１モルよ
り少ないとヘモグロビンのメト化防止効果が少なく、ま
た１モルより多いと溶液の流動性の問題でリポソーム化
効率があまり良くはない。
ンの量（重量モル比）は、各々ヘモグロビン１モルに対
して、０.１〜１モル、好ましくは０.１〜０.５モル、
より好ましくは０.２〜０.５モルである。０.１モルよ
り少ないとヘモグロビンのメト化防止効果が少なく、ま
た１モルより多いと溶液の流動性の問題でリポソーム化
効率があまり良くはない。
【００２２】また本発明においてＡＴＰの量（重量モル
比）はヘモグロビン１モルに対して、０.０１〜１モ
ル、好ましくは０.１〜１モル、より好ましくは０.１〜
０.５モルである。０.０１モルより少ないとヘモグロビ
ンのメト化防止効果が少なく、また１モルより多いと溶
液の流動性の問題でリポソーム化効率があまり良くはな
い。
比）はヘモグロビン１モルに対して、０.０１〜１モ
ル、好ましくは０.１〜１モル、より好ましくは０.１〜
０.５モルである。０.０１モルより少ないとヘモグロビ
ンのメト化防止効果が少なく、また１モルより多いと溶
液の流動性の問題でリポソーム化効率があまり良くはな
い。
【００２３】本発明に使用するヘモグロビンは、赤血球
を常法によって溶血し分画分子量１万の膜を使用した限
外濾過により３０％（W/W）以上に濃縮したものに所定
量のリンゴ酸を添加し混和したものが使用される。ヘモ
グロビンは水溶液の形態で取り込まれ、その濃度は３０
〜６０％（W/W）が好ましい。
を常法によって溶血し分画分子量１万の膜を使用した限
外濾過により３０％（W/W）以上に濃縮したものに所定
量のリンゴ酸を添加し混和したものが使用される。ヘモ
グロビンは水溶液の形態で取り込まれ、その濃度は３０
〜６０％（W/W）が好ましい。
【００２４】本発明において、ヘモグロビン溶液にイノ
シトールヘキサホスフェートなどの有機リン化合物を末
梢における酸素放出量を調整するため、加えると良い。
シトールヘキサホスフェートなどの有機リン化合物を末
梢における酸素放出量を調整するため、加えると良い。
【００２５】本発明において使用する赤血球は、本発明
のヘモグロビン含有リポソームをヒトに使用する場合、
ヒト由来のものであれば特に問題はなく、また、新鮮な
もの程良いが、採血後４℃以下で５０日以上保存したも
のでも充分に使用できる。
のヘモグロビン含有リポソームをヒトに使用する場合、
ヒト由来のものであれば特に問題はなく、また、新鮮な
もの程良いが、採血後４℃以下で５０日以上保存したも
のでも充分に使用できる。
【００２６】また本発明において、ヘモグロビン溶液に
はグルコースとアデニンとイノシン、またはグルコース
とＡＴＰ、またはグルコースとアデニンとイノシンとＡ
ＴＰのみならず、これらに加えてＮＡＤＨ、ＮＡＤ、Ｎ
ＡＤＰＨ、ＮＡＤＰのうちの少なくとも１つを加えても
良い。その量（重量モル比）はヘモグロビン１モルに対
して０.１〜２５モルである。
はグルコースとアデニンとイノシン、またはグルコース
とＡＴＰ、またはグルコースとアデニンとイノシンとＡ
ＴＰのみならず、これらに加えてＮＡＤＨ、ＮＡＤ、Ｎ
ＡＤＰＨ、ＮＡＤＰのうちの少なくとも１つを加えても
良い。その量（重量モル比）はヘモグロビン１モルに対
して０.１〜２５モルである。
【００２７】本発明に用いるリポソームの脂質としては
リポソームが形成できるものであれば特に制限はなく、
天然のもの及び合成のものが利用できる。その例として
は、レシチン（＝ホスファチジルコリン）、ホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチ
ジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチ
ジルグリセロース、スフィンゴミエリン、カルジオリビ
ン等、およびこれらを常法に従って水素添加したものが
あげられ、これらを組み合わせて用いることもできる。
リポソームが形成できるものであれば特に制限はなく、
天然のもの及び合成のものが利用できる。その例として
は、レシチン（＝ホスファチジルコリン）、ホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチ
ジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチ
ジルグリセロース、スフィンゴミエリン、カルジオリビ
ン等、およびこれらを常法に従って水素添加したものが
あげられ、これらを組み合わせて用いることもできる。
【００２８】本発明においては、リポソーム膜の構成成
分として所望によりステロール類や脂肪酸等の電荷付与
物質を添加して、膜構造の強化や体内消失時間の調節を
図ることができる。
分として所望によりステロール類や脂肪酸等の電荷付与
物質を添加して、膜構造の強化や体内消失時間の調節を
図ることができる。
【００２９】本発明において、リポソームにはその酸化
を防止するためにトコフェロール同族体すなわちビタミ
ンＥを添加してもよい。トコフェロールには、α，β，
γ，δの４個の異性体が存在するが、本発明においては
いずれの異性体も使用することができる。トコフェロー
ルの添加量はリポソーム膜の総脂質に対して０.５〜４.
５モル％、好ましくは１.０〜２.０モル％である。
を防止するためにトコフェロール同族体すなわちビタミ
ンＥを添加してもよい。トコフェロールには、α，β，
γ，δの４個の異性体が存在するが、本発明においては
いずれの異性体も使用することができる。トコフェロー
ルの添加量はリポソーム膜の総脂質に対して０.５〜４.
５モル％、好ましくは１.０〜２.０モル％である。
【００３０】本発明のヘモグロビン含有リポソームは、
洗浄赤血球を溶血後、赤血球膜成分を除去し、３０〜６
０（W/W）％の濃縮ヘモグロビン溶液に、グルコースと
アデニンとイノシン、またはグルコースとＡＴＰ、また
はグルコースとアデニンとイノシンとＡＴＰを添加して
混和させ、ヘモグロビン溶液中の酵素失活が無い緩和な
条件下で高圧吐出処理によりリポソーム化することによ
って製造することができる。
洗浄赤血球を溶血後、赤血球膜成分を除去し、３０〜６
０（W/W）％の濃縮ヘモグロビン溶液に、グルコースと
アデニンとイノシン、またはグルコースとＡＴＰ、また
はグルコースとアデニンとイノシンとＡＴＰを添加して
混和させ、ヘモグロビン溶液中の酵素失活が無い緩和な
条件下で高圧吐出処理によりリポソーム化することによ
って製造することができる。
【００３１】なお、前記酵素失活が無い緩和な条件下と
は、５０〜１８００ｋｇ/ｃｍ2、好ましくは８０〜１２
００ｋｇ/ｃｍ2の圧で細隙から１回〜数回吐出させるこ
とである。また、処理温度は４０℃以下に保持する。具
体的な例としては、高圧吐出型乳化機に、マイクロフル
イダイザー １１０Ｙ［Microfluidizer 110Y］（マイ
クロフルイダイザー社［Microfluidics Co.］）を用い
る場合には４８０〜１４５０ｋｇ/ｃｍ2、パール細胞破
砕器（パール社［Parr Co.］) を用いる場合には８０〜
２００ｋｇ/ｃｍ2であり、いずれも４０℃以下、好まし
くは氷冷下で実施する。
は、５０〜１８００ｋｇ/ｃｍ2、好ましくは８０〜１２
００ｋｇ/ｃｍ2の圧で細隙から１回〜数回吐出させるこ
とである。また、処理温度は４０℃以下に保持する。具
体的な例としては、高圧吐出型乳化機に、マイクロフル
イダイザー １１０Ｙ［Microfluidizer 110Y］（マイ
クロフルイダイザー社［Microfluidics Co.］）を用い
る場合には４８０〜１４５０ｋｇ/ｃｍ2、パール細胞破
砕器（パール社［Parr Co.］) を用いる場合には８０〜
２００ｋｇ/ｃｍ2であり、いずれも４０℃以下、好まし
くは氷冷下で実施する。
【００３２】天然赤血球中のヘモグロビンは、経時酸化
によりメトヘモグロビンとなるが、赤血球酵素の作用に
より元のヘモグロビンへ還元され、可逆的にヘモグロビ
ン−メトヘモグロビンの反応が起こっている。つまり、
ヘモグロビンがメト化される際、その酵素反応（ＮＡＤ
Ｈ−チトクロームｂ５還元酵素など）と同時に天然赤血
球中のＮＡＤ、ＮＡＤＰが還元され、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ
ＰＨを生じる。この生じたＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨは可逆
的に酸化され、それと同時にメト化ヘモグロビンはヘモ
グロビンに還元される。
によりメトヘモグロビンとなるが、赤血球酵素の作用に
より元のヘモグロビンへ還元され、可逆的にヘモグロビ
ン−メトヘモグロビンの反応が起こっている。つまり、
ヘモグロビンがメト化される際、その酵素反応（ＮＡＤ
Ｈ−チトクロームｂ５還元酵素など）と同時に天然赤血
球中のＮＡＤ、ＮＡＤＰが還元され、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ
ＰＨを生じる。この生じたＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨは可逆
的に酸化され、それと同時にメト化ヘモグロビンはヘモ
グロビンに還元される。
【００３３】しかしながら、本発明のようにリポソーム
に含有させるために天然赤血球外に取り出されたヘモグ
ロビンはこのようなメト化ヘモグロビン還元機構が働か
なくなり、一度メト化したヘモグロビンは再びヘモグロ
ビンに戻ることができず、酸素運搬機能を失ってしま
う。
に含有させるために天然赤血球外に取り出されたヘモグ
ロビンはこのようなメト化ヘモグロビン還元機構が働か
なくなり、一度メト化したヘモグロビンは再びヘモグロ
ビンに戻ることができず、酸素運搬機能を失ってしま
う。
【００３４】本発明者らは、これはリポソーム化の段階
でヘモグロビンにかかる物理的エネルギーあるいは熱に
よって、還元機構に関与する酵素が失活してしまうのが
原因と考え、リポソーム化処理条件を検討し、ヘモグロ
ビン溶液中の酵素活性が維持できる５０〜１６００ｋｇ
/ｃｍ2、好ましくは８０〜１２００ｋｇ/ｃｍ2の圧で細
隙から１回〜数回吐出させるなどの穏やかな製造条件を
設定してヘモグロビン含有リポソームを製造した。しか
しながら、これらのヘモグロビン含有リポソームでもな
お、体内投与後のヘモグロビン経時酸化は進行した。
でヘモグロビンにかかる物理的エネルギーあるいは熱に
よって、還元機構に関与する酵素が失活してしまうのが
原因と考え、リポソーム化処理条件を検討し、ヘモグロ
ビン溶液中の酵素活性が維持できる５０〜１６００ｋｇ
/ｃｍ2、好ましくは８０〜１２００ｋｇ/ｃｍ2の圧で細
隙から１回〜数回吐出させるなどの穏やかな製造条件を
設定してヘモグロビン含有リポソームを製造した。しか
しながら、これらのヘモグロビン含有リポソームでもな
お、体内投与後のヘモグロビン経時酸化は進行した。
【００３５】しかし、本発明者らは鋭意研究を行った結
果、上記のような穏やかな条件で製造するとき、グルコ
ースとアデニンとイノシン、またはグルコースとＡＴ
Ｐ、またはグルコースとアデニンとイノシンとＡＴＰを
ヘモグロビン溶液中に共存させることによって、体内投
与後のヘモグロビン経時酸化を顕著に抑制できることを
発見した。
果、上記のような穏やかな条件で製造するとき、グルコ
ースとアデニンとイノシン、またはグルコースとＡＴ
Ｐ、またはグルコースとアデニンとイノシンとＡＴＰを
ヘモグロビン溶液中に共存させることによって、体内投
与後のヘモグロビン経時酸化を顕著に抑制できることを
発見した。
【００３６】そのメカニズムは次のように考えられる。
つまり、上記のような穏やかな条件でリポソーム化を行
えば、ヘモグロビン溶液中の酵素は失活することはない
が、天然赤血球から膜成分を除去し、ヘモグロビンを取
り出す過程、または精製、濃縮の過程で分子量１万以下
の酵素基質や補酵素類等の酵素反応に必要な物質も失わ
れてしまい、結果的にメトヘモグロビン還元酵素反応が
消失してしまう。そこで、グルコースとＡＴＰを生成す
るアデニンとイノシン、またはグルコースとＡＴＰ、ま
たはグルコースとアデニンとイノシンとＡＴＰを添加す
ると、まずアデニン、イノシン、無機リン酸から生じた
ＡＴＰまたは添加したＡＴＰと、ＮＡＤを補酵素として
グルコースの解糖系が動きだしその結果として天然の赤
血球と同様にＮＡＤおよびＮＡＤＰからＮＡＤＨおよび
ＮＡＤＰＨへの還元反応も起こるためリポソーム内に生
じたメトヘモグロビンもこのＮＡＤＨ−チトクロームｂ
５還元酵素により還元され、ヘモグロビンの経時酸化の
抑制にも寄与しているものと推定される。
つまり、上記のような穏やかな条件でリポソーム化を行
えば、ヘモグロビン溶液中の酵素は失活することはない
が、天然赤血球から膜成分を除去し、ヘモグロビンを取
り出す過程、または精製、濃縮の過程で分子量１万以下
の酵素基質や補酵素類等の酵素反応に必要な物質も失わ
れてしまい、結果的にメトヘモグロビン還元酵素反応が
消失してしまう。そこで、グルコースとＡＴＰを生成す
るアデニンとイノシン、またはグルコースとＡＴＰ、ま
たはグルコースとアデニンとイノシンとＡＴＰを添加す
ると、まずアデニン、イノシン、無機リン酸から生じた
ＡＴＰまたは添加したＡＴＰと、ＮＡＤを補酵素として
グルコースの解糖系が動きだしその結果として天然の赤
血球と同様にＮＡＤおよびＮＡＤＰからＮＡＤＨおよび
ＮＡＤＰＨへの還元反応も起こるためリポソーム内に生
じたメトヘモグロビンもこのＮＡＤＨ−チトクロームｂ
５還元酵素により還元され、ヘモグロビンの経時酸化の
抑制にも寄与しているものと推定される。
【００３７】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説
明する。
明する。
【００３８】なお、特に明示しない場合、調製の各工程
は冷蔵状態（４℃）に維持し、無菌的環境で実施した。
また、試薬・器具類は滅菌処理を行い、重金属イオン・
無機イオン等の残留の無い無菌的超純水（１５ｍｅｇΩ
℃・ｃｍ ａｔ ２５℃以上（パイロジェンフリー））
を調製に使用した。
は冷蔵状態（４℃）に維持し、無菌的環境で実施した。
また、試薬・器具類は滅菌処理を行い、重金属イオン・
無機イオン等の残留の無い無菌的超純水（１５ｍｅｇΩ
℃・ｃｍ ａｔ ２５℃以上（パイロジェンフリー））
を調製に使用した。
【００３９】（実施例１）赤血球膜除去ヘモグロビン溶液（ＳＦＨ）の調製 濃厚赤血球製剤１５Ｌ．を、連続遠心機を用いて生理食
塩水で洗浄し、混在する血小板・白血球等の血漿成分を
除去した洗浄赤血球を得た。この洗浄赤血球５Ｌ．に対
して純水１０Ｌ．を添加し溶血させた。孔径０.４５μ
ｍの血漿分離器及び分画分子量３０万（孔径５ｎｍ）の
フィルターを用いて赤血球膜成分を除去し、ヘモグロビ
ン濃度８％（w/v）の赤血球膜除去ヘモグロビン溶液
（ＳＦＨ溶液）、１２Ｌ．を回収した。得られたＳＦＨ
溶液は重炭酸ナトリウムを添加しｐＨを７.４に調整し
た後、ホローファイバー型ダイアライザー（テルモ社
製、ＣＬ−Ｃ８Ｎ）を用いて純水に対して透析を行った
後、限外濾過により濃縮し、ヘモグロビン濃度５０％
（w/v）の濃縮ＳＦＨ溶液、１.８Ｌ．を得た。
塩水で洗浄し、混在する血小板・白血球等の血漿成分を
除去した洗浄赤血球を得た。この洗浄赤血球５Ｌ．に対
して純水１０Ｌ．を添加し溶血させた。孔径０.４５μ
ｍの血漿分離器及び分画分子量３０万（孔径５ｎｍ）の
フィルターを用いて赤血球膜成分を除去し、ヘモグロビ
ン濃度８％（w/v）の赤血球膜除去ヘモグロビン溶液
（ＳＦＨ溶液）、１２Ｌ．を回収した。得られたＳＦＨ
溶液は重炭酸ナトリウムを添加しｐＨを７.４に調整し
た後、ホローファイバー型ダイアライザー（テルモ社
製、ＣＬ−Ｃ８Ｎ）を用いて純水に対して透析を行った
後、限外濾過により濃縮し、ヘモグロビン濃度５０％
（w/v）の濃縮ＳＦＨ溶液、１.８Ｌ．を得た。
【００４０】濃縮ＳＦＨ溶液への試薬添加 上述の工程を経て調整した濃縮ＳＦＨ溶液２００mlに対
してβ−ＮＡＤ（１ｍＭ、１３３ｍｇ）、Ｄ−グルコー
ス（１００ｍＭ、３.６ｇ）、ＡＴＰ−Ｎａ（１ｍＭ、
１１０ｍｇ）、塩化マグネシウム・６水和塩（１ｍＭ、
４０ｍｇ）、リン酸２水素カリウム（９ｍＭ、２４７ｍ
ｇ）、リン酸水素２ナトリウム（１１ｍＭ、３１０ｍ
ｇ）、フィチン酸（３ｍＭ、３９６ｍｇ）を添加し均一
になるように混合した。
してβ−ＮＡＤ（１ｍＭ、１３３ｍｇ）、Ｄ−グルコー
ス（１００ｍＭ、３.６ｇ）、ＡＴＰ−Ｎａ（１ｍＭ、
１１０ｍｇ）、塩化マグネシウム・６水和塩（１ｍＭ、
４０ｍｇ）、リン酸２水素カリウム（９ｍＭ、２４７ｍ
ｇ）、リン酸水素２ナトリウム（１１ｍＭ、３１０ｍ
ｇ）、フィチン酸（３ｍＭ、３９６ｍｇ）を添加し均一
になるように混合した。
【００４１】濃縮ＳＦＨ溶液のリポソーム化 水素添加率９０％以上の精製大豆由来フォスファチジル
コリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ミ
リスチン酸（ＭＡ）、トコフェロール（Ｔｏｃ）の均一
混合粉末［HSPE:Chol:MA:Toc=７:７:２:０.２８］４５
ｇに４５ｍｌの純水を加え、６０−７０℃に加温し膨潤
させた。この膨潤脂質にで調製したＳＦＨを加え撹拌
混合（１５秒間）した。この脂質−濃縮ＳＦＨ混合液を
マイクロフルイダイザー（Microfluidics co., Microfl
uidizer 110Y）を用いて、氷冷下、１２０００psi（約
８４４ｋｇ／ｃｍ2）の圧力でリポソーム化した。
コリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ミ
リスチン酸（ＭＡ）、トコフェロール（Ｔｏｃ）の均一
混合粉末［HSPE:Chol:MA:Toc=７:７:２:０.２８］４５
ｇに４５ｍｌの純水を加え、６０−７０℃に加温し膨潤
させた。この膨潤脂質にで調製したＳＦＨを加え撹拌
混合（１５秒間）した。この脂質−濃縮ＳＦＨ混合液を
マイクロフルイダイザー（Microfluidics co., Microfl
uidizer 110Y）を用いて、氷冷下、１２０００psi（約
８４４ｋｇ／ｃｍ2）の圧力でリポソーム化した。
【００４２】ヘモグロビン含有リポソームの精製 上記の処理液に対して、等量のデキストラン加生理食
塩水（３％（w/v））を加え、遠心分離（１００００rpm
（１３０００ｇ）×３０分、ａｔ４℃）を行った。効率
良くヘモグロビンを含有したリポソームは、この遠心処
理により沈殿物として回収された。リポソーム化されな
かった遊離ヘモグロビン及び原料脂質を含む上澄はデカ
ンテーションもしくは吸引により除去した、以上の洗浄
操作を上澄中のヘモグロビンが肉眼的に認められなくな
るまで繰り返した後、０.４５μｍのデュラポアメンブ
ランフィルター（Millipore Ltd., Minitan system）を
用いて濾過し、懸濁液中に混在する粗大粒子を除去し
た。濾液をホローファイバー型ダイアライザー（テルモ
社製、ＣＬ−Ｃ８Ｎ）により限外濾過、濃縮しヘモグロ
ビン濃度５％（w/v）の精製ヘモグロビン含有リポソー
ム懸濁液６００ｍｌを得た。
塩水（３％（w/v））を加え、遠心分離（１００００rpm
（１３０００ｇ）×３０分、ａｔ４℃）を行った。効率
良くヘモグロビンを含有したリポソームは、この遠心処
理により沈殿物として回収された。リポソーム化されな
かった遊離ヘモグロビン及び原料脂質を含む上澄はデカ
ンテーションもしくは吸引により除去した、以上の洗浄
操作を上澄中のヘモグロビンが肉眼的に認められなくな
るまで繰り返した後、０.４５μｍのデュラポアメンブ
ランフィルター（Millipore Ltd., Minitan system）を
用いて濾過し、懸濁液中に混在する粗大粒子を除去し
た。濾液をホローファイバー型ダイアライザー（テルモ
社製、ＣＬ−Ｃ８Ｎ）により限外濾過、濃縮しヘモグロ
ビン濃度５％（w/v）の精製ヘモグロビン含有リポソー
ム懸濁液６００ｍｌを得た。
【００４３】（実施例２） 実施例１−で調製した濃縮ＳＦＨ溶液２００mlに対し
てβ−ＮＡＤ（１ｍＭ、１３３ｍｇ）、Ｄ−グルコース
（１００ｍＭ、３.６ｇ）、アデニン（２ｍＭ、５４ｍ
ｇ）、イノシン（５ｍＭ、２６８ｍｇ）、塩化マグネシ
ウム・６水和塩（１ｍＭ、４０ｍｇ）、リン酸２水素カ
リウム（９ｍＭ、２４７ｍｇ）、リン酸水素２ナトリウ
ム（１１ｍＭ、３１０ｍｇ）、フィチン酸（３ｍＭ、３
９６ｍｇ）を添加し均一になるように混合し、実施例１
同様の方法でリポソーム化、精製、濃縮し、ヘモグロビ
ン濃度５％（w/v）の精製ヘモグロビン含有リポソーム
懸濁液６００ｍｌを得た。
てβ−ＮＡＤ（１ｍＭ、１３３ｍｇ）、Ｄ−グルコース
（１００ｍＭ、３.６ｇ）、アデニン（２ｍＭ、５４ｍ
ｇ）、イノシン（５ｍＭ、２６８ｍｇ）、塩化マグネシ
ウム・６水和塩（１ｍＭ、４０ｍｇ）、リン酸２水素カ
リウム（９ｍＭ、２４７ｍｇ）、リン酸水素２ナトリウ
ム（１１ｍＭ、３１０ｍｇ）、フィチン酸（３ｍＭ、３
９６ｍｇ）を添加し均一になるように混合し、実施例１
同様の方法でリポソーム化、精製、濃縮し、ヘモグロビ
ン濃度５％（w/v）の精製ヘモグロビン含有リポソーム
懸濁液６００ｍｌを得た。
【００４４】（比較例）実施例に準じて調製した濃縮Ｓ
ＦＨにたいしフィチン酸（３ｍＭ、３９６ｍｇ）のみを
添加し、同様な方法でリポソーム化、精製し、ヘモグロ
ビン濃度５％（w/v）のコントロール精製ヘモグロビン
含有リポソーム懸濁液６００ｍｌを得た。
ＦＨにたいしフィチン酸（３ｍＭ、３９６ｍｇ）のみを
添加し、同様な方法でリポソーム化、精製し、ヘモグロ
ビン濃度５％（w/v）のコントロール精製ヘモグロビン
含有リポソーム懸濁液６００ｍｌを得た。
【００４５】（試験例１）リポソーム内ＡＴＰ量の測定 上記ヘモグロビン含有リポソーム懸濁液１０ｍｌを３７
℃にてインキュベート、経時的に０.５ｍｌサンプリン
グし、これに１０％（w/v）・Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００
−ＨＥＰＥＳ緩衝液（０.５Ｍ、ｐＨ７.４）２ｍｌを加
え撹拌後、さらにフレオン２ｍｌを添加し約１分間撹拌
した。この溶液を３０００rpmで１５分間遠心処理し、
上清１.８ｍｌを分画分子量５０００の限外濾過膜にて
除蛋白した。この除蛋白した溶液をＯＤＳカラム（セン
シュウ科学、ＯＤＳ−１３０１−Ｎ）を用いた高速液体
クロマトグラフィーによりＡＴＰ量の定量を行った。結
果を図１に示す。
℃にてインキュベート、経時的に０.５ｍｌサンプリン
グし、これに１０％（w/v）・Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００
−ＨＥＰＥＳ緩衝液（０.５Ｍ、ｐＨ７.４）２ｍｌを加
え撹拌後、さらにフレオン２ｍｌを添加し約１分間撹拌
した。この溶液を３０００rpmで１５分間遠心処理し、
上清１.８ｍｌを分画分子量５０００の限外濾過膜にて
除蛋白した。この除蛋白した溶液をＯＤＳカラム（セン
シュウ科学、ＯＤＳ−１３０１−Ｎ）を用いた高速液体
クロマトグラフィーによりＡＴＰ量の定量を行った。結
果を図１に示す。
【００４６】（試験例２）リポソーム経時メト化の測定（ｉｎ ｖｉｖｏ） ヘモグロビン濃度が５％（w/v）の上記ヘモグロビン含
有リポソーム懸濁液１ｍｌを、ＩＣＲ系雄性マウス（５
週令）の尾静脈から投与し、２４時間経過後、腹大動脈
から全血を回収し、下記の方法で酸化率を算出した。
有リポソーム懸濁液１ｍｌを、ＩＣＲ系雄性マウス（５
週令）の尾静脈から投与し、２４時間経過後、腹大動脈
から全血を回収し、下記の方法で酸化率を算出した。
【００４７】ヘモグロビン含有リポソームは、浸透圧差
に対して強く、この特徴を利用して天然赤血球と分離し
た。すなわち、ヘパリン添加全血に８〜１０倍容の純水
を添加、撹拌しマウス由来赤血球を溶血後、１８０００
rpmで３０分間（４℃）高速遠心を行いヘモグロビン含
有リポソームを沈殿物として回収した。この操作を３回
繰り返し、完全に血液成分を洗浄除去した。得られた試
料に１０％（w/v）・Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００−ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液（０.５Ｍ、ｐＨ７.４）２ｍｌを加え撹拌
後、さらにフレオン２ｍｌを添加し約１分間撹拌した。
この溶液を３０００rpmで１５分間遠心処理し、上清１.
８ｍｌに対しＨＥＰＥＳ緩衝液（０.５Ｍ、ｐＨ７.４）
を１ｍｌ加えて調製した溶液の可視領域（７００ｎｍ〜
４６０ｎｍ）における吸収スペクトルを測定し、酸化率
を算出した。結果を表１及び図２に示す。
に対して強く、この特徴を利用して天然赤血球と分離し
た。すなわち、ヘパリン添加全血に８〜１０倍容の純水
を添加、撹拌しマウス由来赤血球を溶血後、１８０００
rpmで３０分間（４℃）高速遠心を行いヘモグロビン含
有リポソームを沈殿物として回収した。この操作を３回
繰り返し、完全に血液成分を洗浄除去した。得られた試
料に１０％（w/v）・Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００−ＨＥＰ
ＥＳ緩衝液（０.５Ｍ、ｐＨ７.４）２ｍｌを加え撹拌
後、さらにフレオン２ｍｌを添加し約１分間撹拌した。
この溶液を３０００rpmで１５分間遠心処理し、上清１.
８ｍｌに対しＨＥＰＥＳ緩衝液（０.５Ｍ、ｐＨ７.４）
を１ｍｌ加えて調製した溶液の可視領域（７００ｎｍ〜
４６０ｎｍ）における吸収スペクトルを測定し、酸化率
を算出した。結果を表１及び図２に示す。
【００４８】
【表１】
【００４９】
【発明の効果】本発明のヘモグロビン含有リポソーム
は、リポソーム内のＡＴＰの量が多いためグルコースが
有効に消費され、その過程でへモグロビンがメト化する
際に生じたＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨがＮＡＤまたはＮ
ＡＤＰに酸化され、同時にメト化されたヘモグロビンが
元のヘモグロビンに還元される。
は、リポソーム内のＡＴＰの量が多いためグルコースが
有効に消費され、その過程でへモグロビンがメト化する
際に生じたＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨがＮＡＤまたはＮ
ＡＤＰに酸化され、同時にメト化されたヘモグロビンが
元のヘモグロビンに還元される。
【００５０】そのため、本発明のヘモグロビン含有リポ
ソームは、優れたヘモグロビンのメト化抑制能を有し、
人工赤血球として有効に使用できる。
ソームは、優れたヘモグロビンのメト化抑制能を有し、
人工赤血球として有効に使用できる。
【図１】リポソーム内のＡＴＰ量の測定結果を示す。
【図２】リポソーム内のヘモグロビンの経時メト化の測
定結果を示す。
定結果を示す。
Claims (5)
- 【請求項１】脂質からなるリポソーム内に酵素活性を有
するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロビン含
有リポソームにおいて、前記ヘモグロビン溶液に、アデ
ニン、イノシン、アデノシン三リン酸からなる群の少な
くとも１つと、グルコースが含まれていることを特徴と
するヘモグロビン含有リポソーム。 - 【請求項２】脂質からなるリポソーム内に酵素活性を有
するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロビン含
有リポソームにおいて、前記ヘモグロビン溶液に、アデ
ノシン三リン酸と、グルコースが含まれていることを特
徴とする請求項１に記載のヘモグロビン含有リポソー
ム。 - 【請求項３】脂質からなるリポソーム内に酵素活性を有
するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロビン含
有リポソームにおいて、前記ヘモグロビン溶液に、アデ
ニンおよびイノシンと、グルコースが含まれていること
を特徴とする請求項１に記載のヘモグロビン含有リポソ
ーム。 - 【請求項４】脂質からなるリポソーム内に酵素活性を有
するヘモグロビン溶液を取り込んでなるヘモグロビン含
有リポソームにおいて、アデニン、イノシン、アデノシ
ン三リン酸からなる群の少なくとも１つと、グルコース
が添加されているヘモグロビン溶液に、さらに還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチド、酸化型ニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸、酸化型ニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドリン酸よりなる群の少なくとも
１つが含まれていることを特徴とする請求項１乃至請求
項３に記載のヘモグロビン含有リポソーム。 - 【請求項５】洗浄赤血球を溶血後、赤血球膜成分を除去
し、３０〜６０(W/W)％の濃縮ヘモグロビン溶液に、ア
デニン、イノシン、アデノシン三リン酸からなる群の少
なくとも１つと、グルコースを添加して混和させ、ヘモ
グロビン溶液中の酵素失活が無い緩和な条件下でリポソ
ーム化することを特徴とする請求項１乃至請求項４に記
載のヘモグロビン含有リポソームの製法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13304394A JP3925665B2 (ja) | 1994-06-15 | 1994-06-15 | ヘモグロビン含有リポソーム |
| US08/490,509 US5674528A (en) | 1994-06-15 | 1995-06-14 | Hemoglobin-encapsulated liposome |
| DE69519332T DE69519332T2 (de) | 1994-06-15 | 1995-06-15 | Liposomen mit eingekapseltem Hämoglobin |
| EP95401394A EP0687463B1 (en) | 1994-06-15 | 1995-06-15 | Hemoglobin-encapsulated liposome |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13304394A JP3925665B2 (ja) | 1994-06-15 | 1994-06-15 | ヘモグロビン含有リポソーム |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH083062A true JPH083062A (ja) | 1996-01-09 |
| JP3925665B2 JP3925665B2 (ja) | 2007-06-06 |
Family
ID=15095482
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13304394A Expired - Fee Related JP3925665B2 (ja) | 1994-06-15 | 1994-06-15 | ヘモグロビン含有リポソーム |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3925665B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005245342A (ja) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories Inc | 細胞中ａｔｐの定量法 |
| EP2058398A1 (en) | 2007-11-09 | 2009-05-13 | Nipro Corporation | Production of recombinant human hemoglobin using pichia yeast |
| JP2012063348A (ja) * | 2010-08-16 | 2012-03-29 | Arkray Inc | ヘモグロビンの分析方法 |
-
1994
- 1994-06-15 JP JP13304394A patent/JP3925665B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005245342A (ja) * | 2004-03-05 | 2005-09-15 | Mitsubishi Kagaku Bio-Clinical Laboratories Inc | 細胞中ａｔｐの定量法 |
| JP4546115B2 (ja) * | 2004-03-05 | 2010-09-15 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 細胞中ａｔｐの定量法 |
| EP2058398A1 (en) | 2007-11-09 | 2009-05-13 | Nipro Corporation | Production of recombinant human hemoglobin using pichia yeast |
| JP2012063348A (ja) * | 2010-08-16 | 2012-03-29 | Arkray Inc | ヘモグロビンの分析方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3925665B2 (ja) | 2007-06-06 |
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