JPH08278239A - バイオロジカル・マテリアルの結合法 - Google Patents
バイオロジカル・マテリアルの結合法Info
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Abstract
る従来の方法を改良する。 【解決手段】 本発明は、バイオロジカル・マテリアル
を固相に結合する方法であって、バイオロジカル・マテ
リアルを含有する試料液を内側輪郭A17を有する試料
容器Aに供給する工程、および試料容器に構造体Cを導
入する工程、からなり、前記構造体が多孔性マトリック
スC11によって試料容器に対してシールされ、試料液
が多孔性マトリックスを通過して構造体Cに入るように
試料容器の内側輪郭に合致する輪郭を有することからな
る結合法を提供する。
Description
マテリアルを固相に結合する方法および多孔性マトリッ
クスとほかの機能的要素を連結するための構成要素から
なる構造体に関する。
環境に対して不利に影響しうる汚染を能動的に避けるよ
う、とくに注意深く行うことが必要である。このことは
とくに有害な液体ばかりではなく、成分の分析の際に用
いられるかまたは生成する液体にもあてはまる。
には分析するのと同じ研究室で行われるかまたは分析す
るのと同じ部屋で行われることすらもある。たとえば、
エアロゾールを用いるばあいは、しばしば試料成分で環
境をひどく汚染することとなる。これによりほかの試料
成分の分析は次々と妨げられる。とくに、医学的および
臨床的診断の分野で成分を分析するばあいでは、1つの
誤った結果が、患者にとって恐るべき結果の数々を導く
可能性がある。
比較的高度な特異性のために診断手段として近年導入さ
れた。核酸、とくに検出すべき核酸の含有量はきわめて
小さく、一方同一試料中には類似の配列を有する核酸お
よび測定を妨げるほかの成分が存在するので、これら試
験を行うことは相当な技術的挑戦である。経験によれ
ば、近年ますます一般的になっている増幅手段は、試験
される或る核酸配列の存在に依存してそれと同一の核酸
を多量に生産するために用いられていることがわかって
いる。これは、個々の核酸をも検出させるほど試験の感
度を著しく改良する。
う危険は、環境からの試料の汚染がたった1つの一本鎖
の核酸で起こりうるということである。すなわち、偽の
陽性結果がでる危険が生じるのである。したがって、核
酸試験を用いるばあい、すでに特別に効果的であるとさ
れている方法で、汚染の発生、すなわち試料または反応
混合物からの環境への核酸の放出を回避することが必要
である。
製するばあい、液体が入口開口から注入され、1または
数回の処理段階を行ったのちに出口開口から再び除去さ
れる容器中で、試料液およびそれに含まれる分析すべき
成分を処理に付する方法が近年用いられている。前記容
器は液体から成分を分離するためのマテリアルを含むカ
ラムの形態で商業的に入手可能であり、たとえばキアゲ
ン(Qiagen)社製のQlAamp(登録商標)Kitがあげられ
る。これら容器は別の容器に入っており、液体が漏れる
ばあいはこの2つ目の容器に放出されることになり、環
境には放出されない。しかしながら、このような液体処
理は複雑であり、かつ対応する(corresponding)2つ
目の容器を必要とする。さらに、これら容器は液体を2
つ目の容器に移すためには遠心分離に付されることとな
る。
おいて知られている欠点を回避するために、一般に知ら
れている、固相へバイオロジカル・マテリアルを結合す
る方法を部分的にまたは完全に改良することが本発明の
目的である。
ル・マテリアルを固相に結合する方法であって、バイオ
ロジカル・マテリアルを含有する試料液を内側輪郭A1
7を有する試料容器Aに供給する工程、および試料容器
に構造体Cを導入する工程、からなり、前記構造体が多
孔性マトリックスC11によって試料容器に対してシー
ルされ、試料液が多孔性マトリックスを通過して構造体
Cに入るように試料容器の内側輪郭に合致する輪郭を有
することからなる結合法を提供する。
き試料容器から取り出されるばあい、前記多孔性マトリ
ックスC11がバイオロジカル・マテリアルと結合可能
であるばあい、前記バイオロジカル・マテリアルが核酸
であるばあい、試料容器Aから構造体Cが取り出される
前に、残留試料液を除去するばあい、前記構造体Cを、
結合したバイオロジカル・マテリアルを遊離する容器中
に引き続いて導入するばあい、前記構造体Cが、試料容
器Aと構造体Cを環境に対してエアゾール−タイトにシ
ールする蓋の助けにより、試料容器Aに導入されるばあ
い、前記試料容器Aから蓋Bを取り除くのに必要な力
が、構造体Cから蓋Bを取り除くのに必要な力より小さ
いばあい、前記構造体Cまたは容器Dが破壊されるかま
たは構造体Cから蓋Bを取り除くのに必要な力より大き
い力を適用することのみにより容器Dから構造体Cを取
り出すことができるように、容器Dに構造体Cを位置づ
ける手段を有するばあいが好ましい。
アルを結合することのできる多孔性マトリックス、およ
び蓋と前記構造体を少なくとも部分的に覆う容器Dを取
り付けることのできる構成要素C13、C15からなる
中空構造体を提供する。
液体を通過させる多孔性マトリックスC11により、容
器の方向に面する側を閉じられてなるばあい、前記マト
リックスC11が、リングC18の助けにより構造体の
内側C14に位置づけられるばあい、ならびに前記マト
リックスC11が圧縮されうるばあいが好ましい。
(inner contour)を有する試料容器にバイオロジカル
・マテリアルを含む試料液を供給し、そののち、多孔性
マトリックスの助けにより試料容器に対しシールされ、
かつ試料容器の外側輪郭(outer contour)に合致する
(match)内側輪郭をも有する中空構造体(hollow stru
ctural form)を前記試料容器に導入し、試料液が直ち
に多孔性マトリックスを通過して構造体に入ることがで
きる、固相にバイオロジカル・マテリアルを結合させる
方法である。
・マテリアルを結合しうる多孔性マトリックス、蓋およ
び構造体の少なくとも一部分をおおう容器を取り付ける
ための構成要素(components)を含む構造体でもある。
いずれのバイオロジカル・マテリアルでも可能である。
前記試料は、医学的および/または臨床的診断または分
子生物学の分野に存在するような試料の成分をとくに含
む。成分は低分子または高分子の成分である。低分子の
成分は、2000ダルトン(D)より小さい分子量のハ
プテンまたは抗原を含む。高分子の成分は、とくにバイ
オポリマー、さらにはアミノ酸またはヌクレオチド成分
からなる成分を含む。前記成分は、とくに免疫学的に活
性なタンパク質、たとえば抗原や抗体、および核酸があ
げられる。本発明は、核酸の単離にとくに適する。
イオロジカル・マテリアルを含む試料液の供給である。
前記試料液は、内側輪郭A17、好ましくは滑らかな内
側輪郭を有する試料容器Aに含まれることが好ましい。
試料容器の内側は中空シリンダの形状であるばあいがと
くに好ましい。
結合に適した形状で試料容器に導入されうるかまたは未
変性の(native)試料液を調製段階に付した結果でありう
るかのいずれかである。
て核酸を含有する試料液の2つの調製法を説明する。
2〜3はバイオロジカル・マテリアルを固相に結合する
本発明の方法からなる核酸の単離方法を示す図、図4は
本発明の方法に用いられる試料容器の断面説明図、図5
は本発明の方法に用いられる蓋の断面説明図、図6は本
発明の方法に用いられる溶離容器の断面説明図、および
図7は本発明の方法に用いられるスタンプの断面説明図
である。
胞から核酸を遊離させるために、細胞壁を溶解する試薬
を用いて前記消化容器中で未変性の試料液を処理する。
続いて、望ましくない試料成分を任意に分離したのち
に、核酸を含有する試料液を試料容器Aに入れる。
液を試料容器に入れ、そののちに細胞から核酸を遊離さ
せる試薬を加える。このばあいには、核酸も試料液に自
由に接近することができる。バイオロジカル・マテリア
ルを調製するために必要な反応段階は、技術文献により
当業者には既知である。
リックスC11を通って構造体Cに入るような方法で、
バイオロジカル・マテリアルを含有する試料液は構造体
Cと接触する。前記構造体はその中に試料液が入るよう
に中空状である。構造体は中空シリンダの形状を有する
ことが好ましいが、試料容器に対向する端部は、多孔性
マトリックスにより閉じられている。試料容器から離れ
た側の端部は、蓋を取り付けるための構成要素を備え
る。構造体の外側の形状は、構造体を試料容器に導入で
きるように、試料容器の内側の形状に合致している。好
ましい態様では、構造体の外側輪郭は、構造体がピスト
ンのように試料容器の内側を動くように、試料容器の内
側輪郭に対してしっかりと付勢されている。
液がそれを通過できるように多孔性である。望ましくな
い試料成分が構造体Cへ浸透することを避けるために、
第1の機能においては、多孔性マトリックスをフィルタ
ーとして用いることができる。望ましくない成分は、た
とえば前述の細胞溶解において破砕されなかった細胞壁
残余物ばかりではなく、細胞の固定化に用いる磁性粒子
(magnetic particle)をも含む。この試料液が多孔性マ
トリックスを通過すると、試料液からこれら成分が除去
される。このばあい、バイオロジカル・マテリアルは試
料液中に残留することができる。第2の機能において
は、多孔性マトリックスそれ自体をすでにバイオロジカ
ル・マテリアルを結合するために、担体として用いるこ
とができる。これを成し遂げるために、結合させるべき
バイオロジカル・マテリアルに対して高親和性を有する
マトリックスが選択される。選択されるこのマトリック
スの表面に依存して、多孔性マトリックス(担体)とバ
イオロジカル・マテリアル(リガンド)とのあいだの結
合を、非特異的結合または特異的結合のいずれかとする
ことが可能となる。マトリックスがその表面に抗体を含
むばあいは、試料液がマトリックスを通過すると、その
抗体に対して作られた抗原はマトリックスに結合する
(固定化)。たとえば、紙のようなセルロースは、免疫
学的に活性な物質の結合のための多孔性マトリックスと
してとくに好都合であることは証明されている。核酸
は、ガラスフリース(fleece)をマトリックスとして用い
ることにより(配列非特異的な固定化)または結合させ
るべき核酸と相補的な核酸が結合するような多孔性マト
リックス(配列特異的な固定化)を用いることにより、
固定化することもできる。
び非共有結合を含む。好ましくは、生物学的相互作用、
たとえば免疫学的相互作用による非共有結合である。
-type)マトリックスであるかまたは粒子型マトリック
スのいずれかでありうる。粒子型マトリックスは、試料
液が粒子型マトリックスの孔に入ることができるよう
に、たとえばフィルターによって構造体内に位置されな
ければならない。このばあい、フィルターは粒子型マト
リックスをフィルター内に閉じ込めるために用いる。好
ましいばあいは、多孔性マトリックスがフリース型マト
リックスのばあいである。また、数種の成分からなるマ
トリックス(たとえば、さまざまな度合いのたわみ性
(a varing degreeof flexibility)を有するフリース
を用いることも可能である。マトリックスは多孔性の性
質を有するため、とくに効果的に反応させるように、た
とえば液体成分をマトリックスに結合させるように、液
体はゆっくりとマトリックスを通過する。
に取り付けられる。たとえば、試料容器から離れた側で
マトリックスを注入することができ、リングの助けによ
り所定の位置に固定することができる。加えて、マトリ
ックスを構造体の中にシールすることもできる。しかし
ながら、好ましい態様では構造体の試料容器に対向する
側に、好ましくは、構造体の内壁に沿ってあらかじめ取
り付けられているリングに、マトリックスは含まれる。
続いて重なったヘリは、マトリックスがリングと縮んだ
縁のあいだの位置に固定されるように内側に向かって縮
む(crimp)。
郭において環状の周辺突出部により、試料容器から離れ
た側にマトリックスは保持される。とくにもっとも好ま
しい態様では、マトリックスおよび後に残る(remainin
g)構造体を損傷することなしに折れることができるよ
うに、前記突出部(projection)の厚さが選択される。
ることが好ましい。本発明の圧縮性マトリックスは、ス
タンプ型装置(stamp-type device)の助けにより、圧
力が加えられると、マトリックスの外容積(outer volu
me)が減少するマトリックスである。したがって、孔の
大きさも減少し、マトリックスに含まれる液体はこれら
孔から押し出される。
をエアゾール−タイト(aerosol-tight)にシールする蓋
の助けにより、構造体Cは試料容器Aに挿入される。合
致する輪郭を備えることにより、試料液は多孔性マトリ
ックスを通り、構造体の中へ入らざるをえなくなる。よ
って、バイオロジカル・マテリアルは多孔性マトリック
スと結合する。続いて、バイオロジカル・マテリアルに
より精製された試料液は構造体および/または試料容器
から除去される。試料容器から離れた側で、たとえばピ
ペッティングによって、構造体から残留液を除去するこ
とにより、これは成し遂げられうる。しかしながら、試
料容器Aから残留液を除去(たとえば、吸引することに
より)し、この過程で構造体に入った残留液が多孔性マ
トリックスを通過し、試料容器に入ることが好ましい。
回通過させるだけではバイオロジカル・マテリアルの全
量を完全に結合させるのに不十分である、これらバイオ
ロジカル・マテリアルにとくに利点を示す。本発明のデ
ザインでは、試料液を多孔性マトリックスに別に2回通
過させることができる。これは、構造体を、たとえば試
料液で満たされていない一部の試料容器に戻し(retrac
ting)、それを再び液体で満たされているその試料容器
に挿入することにより、成し遂げられる。これにより、
固定化されたバイオロジカル・マテリアルの収量を増加
させることが可能となる。
したのち、依然と存在しているかもしれないほかのすべ
ての残留汚染物を除去するために、マトリックスを洗浄
液で処理することが可能である。本発明によれば、構造
体が試料容器内に依然と存在するばあいに、これは成し
遂げられる。試料容器と構造体の両方をエアゾール−タ
イトにシールする蓋を選択することによって、構造体に
入りうる汚染エアゾールの量は減少する。構造体および
試料容器のとくに好都合な処理のために、試料容器Aか
ら蓋Bを取り外すのに必要な力は、構造体Cから蓋Bを
取り外すのに必要な力より小さくすべきである。蓋に加
えられる圧力がこれら2種の構成要素に対して異なると
いう点でこれは達成できる。前記圧力は対応する嵌着要
素(snap-in element)を備えることにより、調節する
ことができる。
リックスに結合すれば、そのマテリアルは、試料容器A
内かまたは前記試料容器Aから構造体Cを取り出したあ
とのいづれかにさらに処理することができる。
リアルの多孔性マトリックスへの結合を解離することを
含む。しかしながら、バイオロジカル・マテリアルが多
孔性マトリックスに結合しているばあい、バイオロジカ
ル・マテリアルを直接検出することも可能である。
試料容器へ構造体を挿入する段階の2つの段階を実行す
る順番は、原則的には希望通りに選ぶことができる。第
1の選択枝では、構造体を試料容器に挿入し、続いて試
料液をそこにいれる。液体を構造体の内側に満たすこと
ができるばかりではなく、試料容器にも満たすことがで
きる。好ましいばあいでは、試料液はまず、試料容器に
導入され、続いて構造体が試料容器に導入される。
に通過させる、たとえばカラム・マテリアル、または遠
心分離によって試料液を多孔性膜に通過させることを基
本とする方法とは対照的に、本発明の方法は、かなり少
量のエアロゾールしか発生しないという利点を有する。
また遠心分離および吸引はかなり複雑な手順となる。本
発明の方法によれば、既知の方法より、より効果的な方
法で操作段階を自動化することが可能である。試料液が
多孔性マトリックスを数回通過することができること
は、本発明のさらなる重要な利点である。
体は試料容器に対向する側に多孔性マトリックスC11
を有する中空シリンダであることが必須である。前記マ
トリックスは、リングC18とその縮んだ縁(crimped
edge)により、その位置に固定される。さらに、溶離容
器では、蓋および/または構造体を取り付けるための環
状の保持手段(circumferential holding means)C1
5、C13も見られる。好ましい方法では、構造体はそ
の内部に別の付加的手段を取り付けるための付加手段、
たとえばスタンプを装着するための嵌着ノッチ(snap-i
n notch)C17なども含む。構造体は外側輪郭C12
および内側輪郭C16を有する。構造体内部における中
空空間はC14として示す。リングC18は構造体から
分離可能であり、所望の分離点(breaking point)が内
側輪郭に沿って設けられるように示されている。マトリ
ックスC11は圧縮性を有する物質であることが好まし
い。圧縮は構造体に挿入されるスタンプEの助けにより
成し遂げられる。圧縮されたマトリックスは、スタンプ
Eとスタンプをくぼみに嵌入させる外側輪郭の好適な突
起部の助けにより、所定の位置に固定する。溶離容器D
の内側輪郭に対して、環状のエッジC19をシールする
縁(sealing lip)として用いることができる。このよ
うにして、構造体の外側輪郭C12と溶離容器の内側輪
郭のあいだで、本発明の方法に用いられるために調製さ
れた溶離液が漏れるのを防ぐ。試料容器Aの内側輪郭に
対して、試料液を多孔性マトリックスC11に完全に通
過させるための同様の機能を、前記シールする縁は有す
ると仮定できる。
の特別な具体例では、以下の操作段階を実施する(図2
〜3参照)。
胞が結合するマテリアルと細胞−含有試料液とを試料容
器A中でインキュベートする。これを成し遂げるために
は、前記マテリアルは細胞表面に対する特異的な結合特
性、たとえば表面抗原に対する抗体を固定化する特性を
有するかまたは吸着体でなくてはならない(A16、図
示せず)。しかし、液体がマテリアルを通過する際に、
たとえば試料容器から取り出す際に、細胞を保持するろ
過特性をマテリアルに与えることも可能である(A1
5、図示せず)。
r)、ベッカ・フレイシャー(BeccaFleisher)、デパート
メント・オブ・モレキュラー・バイオロジー、バンダー
ビルト・ユニバーシティ、ナッシュビル、テネシー州(D
epartment of Molecular Biology, Vanderbilt Univers
ity, Nashville, Tennessee)により編集されたメソッズ
・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology)1
71、バイオメンブレンズ/パート・アール、トランス
ポート・セオリー、セル・アンド・モデル・メンブレン
ズ(Biomembranes/Part R Transport theory:Cell and
Model Membrenes)などから、多孔性マトリックス(担
体)の表面に細胞を固定化する条件は、専門家に知られ
ている。
積極的および消極的な保護を確保するため、試料容器は
蓋Bで試料容器を閉じているのが好ましい。
する一方で、核酸を単離することになっている細胞を、
その細胞がマテリアルに結合している容器中に保持す
る。細胞−結合マトリックスが粒子型マトリックスであ
るばあい、マテリアルが磁性を帯びており、外部から磁
場を試料容器に適用することにより、細胞が保持でき
る。前記磁場は、液体を除去する際に試料容器中に粒子
型マトリックスが保持されるように充分強くなくてはな
らない。液体は異なる方法で除去することが可能であ
る。たとえば、入口開口A10とは空間的に離れた出口
開口A11を通して液体を除去することが可能である。
前記出口開口が試料容器のより低い部分に位置し、かつ
保持細胞より下方に位置しているならば、たとえば、低
い(minor)真空を適用することにより、液体を流出させ
ることができる。これを遂行するために、そのような低
圧を発生させるバルブを出口開口に備えてもよい。
去するためには、1または数回の洗浄段階を行うことが
可能である。これを達成するために、洗浄液を試料容器
内に満たす。前記洗浄液は、細胞−結合マテリアルの表
面への細胞の結合に本質的に影響を及ぼさず、汚染をで
きる限り溶解する。
プロトコールまたは核酸用洗浄キットプロトコールなど
から専門家に知られている。それらは細胞がマテリアル
とどのように結合するかに基本的に依存する。
ち、精製され、濃縮された細胞を、細胞から核酸を遊離
するのに好適な溶解液と接触させる。この溶解液の試薬
は固定化細胞の種類に大きく依存する。細胞が細菌であ
るばあい、細胞壁を消化するための溶解液は、プロテイ
ナーゼKを含むことが好ましい。随意には、反応混合物
を加熱もしくは冷却ならびに撹拌することにより溶解を
助けることも可能である。磁性を帯びた粒子を細胞−結
合マテリアルとして用いるならば、磁石の助けにより混
合することもできる。加えて、試料容器を振とうするこ
とにより溶液を混合することも可能である。いったん消
化が完了すれば、単離すべき核酸は溶液中自由に容易に
えられる。
るために、蓋で反応容器を閉じることが好ましい。溶解
の完了後、蓋は対応する(corresponding)機械装置の助
けにより取り除く。続いて、外側輪郭C12が試料容器
の内側輪郭A17に合致する構造体Cを、細胞の消化産
物と核酸との混合物を含有する試料容器内へ導入する。
この構造体は中空状であり、構造体の内側は多孔性マト
リックスにより試料容器と反応混合物とから分離されて
いる。試料容器を閉じるのに適した構成要素(閉塞要
素)B10を含む蓋Bの構成要素(操作要素)B11の
助けにより、構造体Cの導入を完了することが好まし
い。このばあい、蓋を閉じたままで構造体は蓋の助けに
より取り上げられ(II)、試料容器に導入される(II
I)。この操作のあいだに、反応混合物はフィルターC
11を横切って構造体の中空空間C14へ入ることがで
きる(IV)。フィルターを備えることにより、中空空間
中に大きな粒子が入るのを防ぐことが可能である。フィ
ルターがすでに核酸結合特性を有するばあいは、反応混
合物が通過するあいだ、核酸はすでにフィルターに結合
することができる。このばあいは、フィルター・マテリ
アルないしフィルター材(filter material)を含むガ
ラス繊維を選択する方が都合がよい。
位置している出口開口A11を通じて試料容器から流出
させることにより、残っている溶解反応混合物をAおよ
びCからなる装置から除去する。こうして、構造体の中
空体C14に入った溶液もまた、フィルターがもはやほ
とんど液体を含まないように除去する。続いて、構造体
Cを依然と試料容器中に残しておく(所定の位置に嵌入
させている)一方で、この時点まで用いた蓋Bを取り除
く(V)。
eceive)溶離容器Dを用意する。必要ならば、この容器
上に備えられていることがある蓋を取り除く(VI)。構
造体Cを溶離容器Dに移す前に、たとえばピペッティン
グにより溶離液を溶離容器に供給するのが好ましい。溶
離液の組成は、フィルターC11中のマテリアルにどの
ように核酸が結合しているかに依存する。溶離液は、固
定化した核酸をマテリアルから溶離させる、すなわちそ
こから遊離させる試薬を含む。最初に溶離容器を閉じる
ために用いられている蓋Bは、直ちに、構造体付きの試
料容器A上におく(VII)。
は、蓋の助けにより構造体Cを取り出す(VIII)。蓋と
構造体の結合体を続いて溶離容器に導入する(IX)。好
ましい方法では、溶離容器Dは構造体の位置を固定する
ための手段(C13k、図示せず)を含む。前記手段に
より、前記構造体を取り出すためには構造体Cもしくは
容器Dを破壊しなければならないか、または構造体Cか
ら蓋Bをのぞくのに必要な力に勝る力を適用しなければ
ならない。本発明は、溶離容器から構造体を取り出すこ
とを提案しない。
すでに供給していた溶離液はフィルターC11に入り、
個体状マトリックスから固定化している核酸を遊離させ
る。調製した溶離溶液の量により、フィルターのみに溶
離液が含浸するかまたは溶離液が遊離した核酸とともに
中空体C14に入るかのいずれかになる。核酸の完全な
溶離のためには、構造体の外側輪郭に対してできる限り
しっかり付勢されるように溶離容器の内側輪郭をきめる
べきである。
の結合体から蓋Bを取り除く(X)。前記蓋Bはスタン
プEを取り上げ(take up)(XI)、そして前記スタンプ
Eを構造体Cの中空体中に導入する(XII)ために用い
られる。
ィルターに存在する液体が、接触圧力面(contact pres
sure surface)に位置している開口を通過してスタンプ
の内側に入るするように、スタンプをフィルターに対し
て押す。少なくとも前述の圧力のかかっている範囲にお
いて、接触圧力面の外側輪郭が構造体Cの内部輪郭に合
致するばあいに、この操作はとくに有効である。スタン
プEは、この位置に、たとえば嵌入により、固定するこ
とが好ましい。このように形成された装置は、蓋によっ
て比較的よく密閉されるので、核酸を含有する溶液を装
置に貯えておくことが可能である。
を取り除き(XIII)、スタンプの内側の開口を経て、た
とえばピペッティングによって所望の量を取り出す(XI
V)。続いて、蓋を元の位置においてもよい。
ル・マテリアルを結合することのできる多孔性マトリッ
クスC11、および蓋と少なくとも部分的に構造体を囲
む容器Dを取り付けるための構成要素C12、C13を
含む中空構造体である。構造体の取扱いを改良し、個々
のモジュールの相互作用を容易にするため、構成要素C
12、C13は嵌着型(Shape-in type)の要素であるこ
とが好ましい。
とにより簡単な方法で製造できる。基部(base)はポリ
プロピレンのようなプラスチックから作成するのが好ま
しい。
に説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定される
ものではない。
ューブ(外径=6.75mm,内径=6.0mm、高さ
=40.4mm、ノボレン(登録商標、Novolen)11
00ユーシーエックス(UCX)BASF社(ドイツ)
製、鋳型に注入することにより製造する)である。上部
入口開口は、蓋を構造体に可逆的に(reversibly)連結
するように、その外壁に嵌着縁(snap-in lip)C15
を備えている。別の嵌着縁C13は最初の嵌着縁から約
6mm下に位置する。それは、溶離容器Dに構造体を非
可逆的に(irreversibly)位置づけるために用いられ
る。構造体の内側に押し出しスタンプEを非可逆的に位
置せしめるために、嵌着ノッチC17が内壁の上部入口
開口に備えられている。
リースで閉じる(直径=7.0mm、高さ=1.5〜
3.0mm)。
壁に連結されるリングC18の助けにより、ガラス繊維
フリースを上方に向けて位置づける。それは底から、縮
んだ縁を経て位置づけられている。取りはずす(tear o
ff)ことのできる環状のリングは死容積(dead volum
e)を最小限にするのに都合がよい。ガラス繊維フリー
スは以下の必要条件を満たす。
に固定する。押し出し(pressing)装置でガラス繊維フリ
ースを押し出すばあいに、リングははずれ(break of
f)、その動きを最小限にするべきである。
器Dのあいだをシールする縁C19が外部表面に設備さ
れている。
II(Longitudinal Standard II)、ベーリンガー・マン
ハイム社製 結合用緩衝液 キアゲンAL1/AL2(Qiagen AL1/
AL2)、(4部分/1部分),キアゲン社製 洗浄用緩衝液 キアゲンAW 緩衝液、キアゲン社製 溶離用緩衝液 10mMトリス緩衝液、pH 9.0 試料容器A 試料容器の蓋B ガラスフリースC11からなる多孔性マトリックスを有
する構造体C 溶離容器D 溶離容器の蓋E 構造体の圧縮スタンプF 試料液の調製 試料 200μl(6μlのロンギチュー
ディナル・スタンダードIIを溶解したPBS緩衝液) プロテイナーゼK 25μl 結合用緩衝液 200μl(AL1およびAL2を
4+1の割合で混合する) エタノール 210μl 全量 各回分(batch) 635μl
ーゼK溶液および200μlの結合用緩衝液で試料容器
Aを満たす。試料容器Aは、試料容器の蓋Bで閉じる。
密閉された容器中で液体を混合する。そののち、混合物
を70℃で10分間インキュベートし(細胞の消化)、
そののち冷却相(cooling phase)により、3分で20
℃まで冷却する。試料容器Aを開け、210μlのエタ
ノールを加える。試料容器Aを閉じ、溶液を混合する。
を有する構造体Cをその支持体から取り出すために試料
容器の蓋Bを用いる。入口開口部を通して液体を満たし
た試料容器内に、ガラスフリース・マトリックスを有す
る構造体を導入する。導入の際に、試料容器Aに存在す
る液体は底部からガラスフリースを通過する。自由に移
動する核酸が直ちにガラスフリース・マトリックスに結
合する。つぎの段階では、構造体Cに存在する液体を底
部に向かって流出させる。ガラスフリースを再び通過し
た液体およびまだ結合していない核酸をマトリックスに
固定化する。
lの洗浄用緩衝液で2度洗浄する。マトリックスに存在
する緩衝液はガラスフリースを通じて流出させる。続い
て、マトリックスを50℃、3分間、精製した核酸と乾
燥させる。試料容器の蓋Bを取り除く。
体Cを試料容器Dから200μlの溶離用緩衝液の入っ
た調製した溶離用緩衝液に移す。溶離用緩衝液で核酸を
ガラスフリースマトリックスから遊離させる。核酸は部
分的にマトリックス上に位置する。
より導入することにより、核酸溶液の死容積を最小限に
するために構造体のマトリックスを圧縮する。
結果を測定した。
離液
本発明の方法からなる核酸の単離方法を示す図である。
本発明の方法からなる核酸の単離方法を示す図である。
図である。
る。
図である。
図である。
Claims (13)
- 【請求項1】 バイオロジカル・マテリアルを固相に結
合する方法であって、 バイオロジカル・マテリアルを含有する試料液を内側輪
郭(A17)を有する試料容器(A)に供給する工程、
および試料容器に構造体(C)を導入する工程、からな
り、前記構造体が多孔性マトリックス(C11)によっ
て試料容器に対してシールされ、試料液が多孔性マトリ
ックスを通過して構造体(C)に入るように試料容器の
内側輪郭に合致する輪郭を有することからなる結合法。 - 【請求項2】 前記構造体(C)が引き続き試料容器か
ら取り出されることを特徴とする請求項1記載の結合
法。 - 【請求項3】 前記多孔性マトリックス(C11)がバ
イオロジカル・マテリアルと結合可能であることを特徴
とする請求項1記載の結合法。 - 【請求項4】 前記バイオロジカル・マテリアルが核酸
であることを特徴とする請求項1または2記載の結合
法。 - 【請求項5】 試料容器(A)から構造体(C)が取り
出される前に、残留試料液を除去することを特徴とする
請求項1記載の結合法。 - 【請求項6】 前記構造体(C)を、結合したバイオロ
ジカル・マテリアルを遊離する容器中に引き続いて導入
することを特徴とする請求項1記載の結合法。 - 【請求項7】 前記構造体(C)が、試料容器(A)と
構造体(C)を環境に対してエアゾール−タイトにシー
ルする蓋の助けにより、試料容器(A)に導入されるこ
とを特徴とする請求項6記載の結合法。 - 【請求項8】 前記試料容器(A)から蓋(B)を取り
除くのに必要な力が、構造体(C)から蓋(B)を取り
除くのに必要な力より小さいことを特徴とする請求項7
記載の結合法。 - 【請求項9】 前記構造体(C)または容器(D)が破
壊されるかまたは構造体(C)から蓋(B)を取り除く
のに必要な力より大きい力を適用することのみにより容
器(D)から構造体(C)を取り出すことができるよう
に、容器(D)に構造体(C)を位置づける手段を有す
ることを特徴とする請求項8記載の結合法。 - 【請求項10】 バイオロジカル・マテリアルを結合す
ることのできる多孔性マトリックス、および蓋と前記構
造体を少なくとも部分的に覆う容器(D)を取り付ける
ことのできる構成要素(C13、C15)からなる中空
構造体。 - 【請求項11】 前記構造体が、液体を通過させる多孔
性マトリックス(C11)により、容器の方向に面する
側を閉じられてなることを特徴とする請求項10記載の
構造体。 - 【請求項12】 前記マトリックス(C11)が、リン
グ(C18)の助けにより構造体の内側(C14)に位
置づけられることを特徴とする請求項10記載の構造
体。 - 【請求項13】 前記マトリックス(C11)が圧縮さ
れうることを特徴とする請求項10記載の構造体。
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