NO316686B1 - Fremgangsmate for, og innretning til, binding av et biologisk materiale til en fast fase, samt kombinasjon av et hult formlegeme og en probeholder - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for, og innretning til, binding av et biologisk materiale til en fast fase, samt kombinasjon av et hult formlegeme og en probeholder, fremgangsmåte for binding av et biologisk materiale til en fast fase, ved: preparering av en probevæske inneholdende det biologiske materiale i en probebeholder (A) med en indre kontur (A17) og innføring i probebeholderen (A) av et hult formlegeme (C) som er lukket mot probebeholderen med en for binding av det biologiske materiale egnet porøs matriks (Cl 1), slik at probevæske trenger inn i formlegemet (C) gjennom den porøse matriks (CI I), idet konturen (Cl2) av formlegemet (C) er avstemt slik etter den indre kontur (A 17) av probebeholderen (A), at når formlegemet (C) innføres i probebeholderen (A), blir probevæsken som har trengt igjennom den porøse matriks tvunget in i formlegemets (C) indre, mens det biologiske materiale kan bindes til den porøse matriks, og fjerning av probevæsken som er trengt inn i formlegemet (C).

Oppfinnelsen angår også ombinasjon av et hult formlegeme (C) inneholdende en porøs matriks (Cll) egnet for binding av et biologisk materiale, og en probebeholder (A), hvor den porøse matriks (Cll) lukker formlegemet mot probebeholderen (A), og konturen (Cl2) av formlegemet (C) er avstemt slik etter den indre kontur (A 17) av probebeholderen (A) at ved innføring av formlegemet (C) i probebeholderen (A) blir probevæsken som har trengt gjennom den porøse matriks, tvunget inn i formlegemets (C) indre.

På mange anvendelsesområder fordrer behandlingen av væsker spesiell omhu med henblikk på en aktiv unngåelse av dannelse av kontamineringer som kan utøve en skadelig innflytelse på omgivelsene. Dette gjelder spesielt for giftige væsker, men imidlertid også for væsker som vanligvis akkumuleres under analyse av innholdsstoffer. Som regel utføres nemlig behandlingstrinn for forberedelse av en probevæske i det samme laboratorium, eller sågar det samme rom, som selve analysen. Gjennom f.eks. dannelse av aerosoler under behandlingen blir omgivelsene ofte så sterkt kontaminert med f.eks. probebestanddeler at analysen av innholdsstoffer i andre prober blir forfalsket. Et falsk analyseresultat kan spesielt ved analysen av innholdsstoffer i den medisinske, hhv. kliniske diagnostikk, få forferdelige følger for pasientene.

Analyser som beror på påvisning av nukleinsyrer i en probe er i den senere tid, på grunn av deres forholdsvis høye oppnåelige spesifisitet, angitt som diagnosehjelpemidler. Disse tester representerer imidlertid, på grunn av det vanligvis lave innhold av nukleinsyrer og spesielt nukleinsyrer som skal påvises under samtidig tilstedeværelse av nukleinsyrer med lignende sekvenser, så vel som andre innholds stoffer som merkbart kan forstyrre nukleinsyrebestemmelsene, en betydelig teknisk utfordring. Det har vist seg at amplifikasjonsfremgangsmåtene som er blitt mer og mer populære i den senere tid, ved hvilke det i en reaksjon avhengig av tilstedeværelsen av en helt bestemt nukleinsyresekvens som skal påvises kan fremstilles et stort antall identiske nukleinsyrer, vesentlig kan forbedre følsomheten av testene, slik at ofte kan endog enkelte nukleinsyrer påvises. Den høye oppnåelige følsomhet av påvisningen har imidlertid også som følger at kontamineringer (forurensninger) av andre prober med selv kun én enkelt nukleinsyre fra omgivelsene kan føre til et positivt analyseresultat, og således simuleres et positivt analyseresultat. Av denne grunn må det for nukleinsyretester utføres spesielt effektive tiltak for å unngå dannelse av kontamineringer, dvs. lekkasje av nukleinsyrer fra én probe eller en reaksjonsblanding til omgivelsene.

Ved prepareringen av prober for analyse av innholdsstoffer, spesielt nukleinsyrer, er det i den senere tid i økende omfang anvendt fremgangsmåter ved hvilke probevæsken og innholdsstoffer inneholdt deri, eller isolert derfra, underkastes behandling i en beholder, ved hvilken væsken innføres i beholderen gjennom en innløpsåpning og væsken fjernes fra beholderen etter ett eller flere behandlingstrinn gjennom en utløpsåpning. Slike beholdere er tilgjengelige på markedet i form av søyler som f.eks. inneholder materialer for atskillelse av innholdsstoffer fra væsken, slik som QIAamp-settet fra firmaet Qiagen. Denne beholder befinner seg i en annen beholder, slik at eventuelt unnslippende væske strømmer ut i denne beholder og ikke i omgivelsene. Denne type behandling av væsker er imidlertid kostbar og nødvendig-gjør en tilsvarende andre beholder. Disse beholdere plasseres dessuten i sentrifuger for å sentrifugere væsken over i den andre beholder.

I EP-A-0 378 353 og EP-A-0 508 010 beskrives innretninger for opptak av biologiske væsker, og det redegjøres også for binding av bestemte analytter fra probevæsken til en i innretningen tilstedeværende matriks. Som også ved den foreliggende oppfinnelse blir probevæsken gjennom innføring av et hult væsketett, avstengende formlegeme i probebeholderen presset ut av probebeholderen gjennom den i det hule formlegeme innbragte matriks og inn i formlegemets indre, slik at det oppnås en binding av analyttene til matriksen. I motsetning til ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen foretas utskillelsen av den gjennom matriksen pressede probevæske ved de i EP-A-0 378 353 og EP-A-0 508 010 beskrevne fremgangsmåter ved avskruing av den del av det hule formlegeme som inneholder probevæsken.

I US patentskrift nr. 5 124 041 beskrives en innretning for binding av biomolekyler til en membran. Tilsetningen av den væskeformige probe foretas her ovenfra. I motsetning til i innretningen ifølge oppfinnelsen foretas ingen overføring av en i en beholder foreliggende probe til det indre av et nøyaktig avpasset formlegeme

ved innføring av dette formlegeme i probebeholderen.

I US patentskrift nr. 4 083 788 beskrives en innretning for utvinning av blodserum ved fraskillelse av de koagulerte blodceller ved sentrifugering. I motsetning til i innretningen ifølge oppfinnelsen blir det intet biologisk materiale som skal renses, bundet til noen porøs matriks.

Formålet for foreliggende oppfinnelse var delvis eller fullstendig å forbedre de kjente fremgangsmåter for binding av biologisk materiale på en fast fase, med henblikk på de kjente ulemper i kjent teknikk.

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for binding av et biologisk materiale til en fast fase, ved: preparering av en probevæske inneholdende det biologiske materiale i en probebeholder (A) med en indre kontur (A 17) og innføring i probebeholderen (A) av et hult formlegeme (C) som er lukket mot probebeholderen med en for binding av det biologiske materiale egnet porøs matriks (Cll), slik at probevæske trenger inn i formlegemet (C) gjennom den porøse matriks (Cll), idet konturen (Cl 2) av formlegemet (C) er avstemt slik etter den indre kontur (Al7) av probebeholderen (A), at når formlegemet (C) innføres i probebeholderen (A), blir probevæsken som har trengt igjennom den porøse matriks tvunget in i formlegemets (C) indre, mens det biologiske materiale kan bindes til den porøse matriks, og fjerning av probevæsken som er trengt inn i formlegemet (C), kjennetegnet ved at probevæsken som er trengt inn i formlegemet gjennom den porøse matriks (Cll), fjernes ved påsetting av et vakuum ved utløpsåpningen (All).

Foreliggende oppfinnelse angår dessuten en kombinasjon av et hult formlegeme (C) inneholdende en porøs matriks (Cll) egnet for binding av et biologisk materiale, og en probebeholder (A), hvor den porøse matriks (Cll) lukker formlegemet mot probebeholderen (A), og konturen (Cl2) av formlegemet (C) er avstemt slik etter den indre kontur (Al 7) av probebeholderen (A) at ved innføring av formlegemet (C) i probebeholderen (A) blir probevæsken som har trengt gjennom den porøse matriks, tvunget inn i formlegemets (C) indre, kjennetegnet ved at probebeholderen (A) har en utløpsåpning (All) som er tilsluttet en vakuuminnretning som gjør det mulig å fjerne probevæsken som er trengt inn i formlegemet (C) gjennom den porøse matriks (Cl 1), ved påsetting av et vakuum ved utløpsåpningen (Al 1).

Et biologisk materiale ifølge foreliggende oppfinnelse kan være ethvert biologisk materiale. Spesielt handler det om innholdsstoffer i prober som forekommer i den medisinske, hhv. kliniske diagnostikk eller i molekylærbiologien. Innholdsstof-fene er enten lav- eller høymolekylære bestanddeler. Lavmolekylære bestanddeler er f.eks. haptener eller antigener med en molekylvekt mindre enn 2 000 D. Høymolekyl-ære bestanddeler er fortrinnsvis biopolymerer, spesielt slike som er oppbygget av aminosyrer eller nukleotidbyggestener. Spesielt handler det om immunologisk aktive proteiner som antigener og antistoffer og nukleinsyrer. Den foreliggende fremgangsmåte er spesielt egnet til isolering av nukleinsyrer. Grunnlaget for utøvelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er prepareringen av en probevæske som inneholder det biologiske materiale. Dette inneholdes fortrinnsvis i en probebeholder

(A) som oppviser en indre kontur (A 17). Denne indre kontur er fortrinnsvis glatt. Et spesielt foretrukket tilfelle er at probebeholderen oppviser en hul sylindrisk indre

form.

Probevæsken kan enten innføres i probebeholderen i en allerede egnet form for binding av det biologiske materiale, men den kan imidlertid også være resultatet av preparingstrinn fra en opprinnelig probevæske. F.eks. kan det her beskrives to alternative muligheter for preparering av nukleinsyreholdige materialer inneholdende probevæsker. I én utførelsesform behandles en opprinnelig probevæske i en dekomponeringsbeholder med et reagens som lyserer cellevegger for frigivelse av nukleinsyrer fra celler inneholdende disse. Deretter fylles, evt. etter atskillelse av uønskede probebestanddeler, den nukleinsyreholdige probevæske i probebeholderen

(A). 1 en andre utførelsesform som er foretrukket, fylles den opprinnelige probevæske i probebeholderen og først deretter tilsettes reagenser for frigivelse av nukleinsyrene

fra cellene. Også i dette tilfelle foreligger nukleinsyrene frie i probevæsken. Reak-sjonstrinnene som fører til en preparering av det biologiske materiale er kjent for fagpersonen fra faglitteraturen.

Probevæsken inneholdende det biologiske materiale bringes nå i kontakt i probebeholderen (A) med formlegemet (C), slik at probevæsken presses gjennom den porøse matriks (Cl 1) inn i formlegemet (C). Formlegemet er hult, slik at probevæsken kan trenge inn i det. Formlegemet har fortrinnsvis en hul sylindrisk form hvorved enden som peker mot probebeholderen er lukket ved hjelp av den porøse matriks og enden som peker bort fra probebeholderen oppviser oppbygningselementer for å feste et lokk. Den ytre form av formlegemet er avstemt etter den indre form av probebeholderen slik at formlegemet kan anbringes i probebeholderen. Fortrinnsvis passer den ytre kontur av et formelement tett til den indre kontur av probebeholderen, slik at formlegemet opptrer som en kolbe som beveger seg i en probebeholder.

Matriksen (Cl 1) er porøs, slik at probevæsken kan trenge gjennom den.

Ved dette er det mulig å anvende den porøse matriks som et filter for å forhindre at uønskede probebestanddeler trenger inn i formlegemet (C). Ved uønskede bestanddeler kan det f.eks. handle om partikkel formede bestanddeler, f.eks. rester av cellevegger, som ikke er blitt ødelagt av en foregående lyse av cellene, men imidlertid også magnetpartikler som anvendes for immobilisering av cellene. I dette tilfelle, når probevæsken trenger gjennom den porøse matriks, vil probevæsken atskilles fra disse bestanddeler. Det biologiske materiale i dette tilfelle forblir i probevæsken. I et annet tilfelle kan selve den porøse matriks anvendes for binding av det biologiske materiale. Ved dette velges en matriks som oppviser en affinitet overfor det biologiske materiale. Det er også mulig med både en uspesifikk og en spesifikk binding, alt etter de valgte matriksoverflater. Dersom matriksen på overflatene f.eks. inneholder antistoffer, så kan antigener som antistoffene er rettet mot, bindes til matriksen (immobil i seres) under gjennomtrengingen av probevæsken gjennom matriksen. For bindingen av immunologisk aktive stoffer har spesielt cellulose, f.eks. papir, vist seg som gunstige som en porøs matriks for binding av immunologiske aktive stoffer. En immobilisering av nukleinsyrer er f.eks. mulig ved at det som matriks anvendes glassvatt (sekvens uspesifikk immobilisering) eller et porøst materiale til hvilket det er bundet en nukleinsyre som er komplementær med nukleinsyren som skal bindes (sekvens spesifikk immobilisering).

Ved den porøse matriks kan det handle om vattaktige matrikser, men også partikkelformige matrikser når disse, f.eks. ved hjelp av et filter, blir lokalisert i formlegemet slik at probevæsken får anledning til å trenge inn i porene i den partikkelformige matriks. I et foretrukket tilfelle er den porøse matriks en vattformet matriks. Det kan også handle om en matriks som består av flere komponenter (f.eks. forskjellige faste vattmaterialer). Porøsiteten av matriksen bevirker en langsom strømning av væske gjennom matriksen slik at en reaksjon, f.eks. binding av innholdsstoffer i væsken på matriksen, er spesielt effektiv.

Denne matriks kan festes i formlegemet på kjent måte. Matriksen kan f.eks. innføyes i formlegemet fra siden av formlegemet som vender bort fra probebeholderen, og fikseres i den forutbestemte situasjon, f.eks. med hjelp av en holderring. For ytterligere festing av matriksen kan denne dessuten innsveises i formlegemet. Fortrinnsvis blir matriksen imidlertid innført i formlegemet fra siden som vender mot probebeholderen, fortrinnsvis inntil en på forhånd installert holderring langs inner-veggen av formlegemet og i forbindelse med denne en utstikkende kant, gir en slik indre omslutting at matriksen fikseres mellom holderringen og falsekanten.

Spesielt foretrukket holdes matriksen fast på siden som vender fra probebeholderen ved hjelp av et ringforming omsluttende utspring i den indre kontur av formlegemet. Helt spesielt foretrukket blir dette utspring valgt med en materialstyrke slik at det kan brekkes av uten å ødelegge matriksen og det øvrige formlegeme.

Den porøse matriks er dessuten spesielt foretrukket komprimerbar. Under komprimerbar skal det ifølge foreliggende oppfinnelse forstås en matriks som, ved utøvelse av et trykk ved å presse inn en stempelformet anordning, medfører at det ytre volum av matriksen forminskes og derved at porestørrelsen blir mindre, slik at opprinnelig væske inneholdt i matriksen presses ut fra matriksen.

I en foretrukket utførelsesform innføres formlegemet (C) i probebeholderen (A) ved hjelp av et lokk som er lukket aerosoltett i retning mot omgivelsene. Gjennom konturer som er tilpasset til hverandre tvinges probevæsken til å trenge gjennom den porøse matriks og inn i formlegemets indre rom. Det biologiske materiale blir derved bundet til den porøse matriks. Probevæsken som er renset med henblikk på det biologiske materiale fjernes deretter fra formlegemet og/eller probebeholderen. Dette kan f.eks. utføres ved at restvæsken fjernes, hhv. avpipetteres, gjennom siden av formlegemet som vender bort fra probebeholderen. Det er imidlertid foretrukket at restvæsken (A) fjernes (f.eks. avsuges) fra probebeholderen, og ved denne prosedyre presses restvæsken som er trengt inn i formlegemet gjennom den porøse matriks og inn i probebeholderen.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse har spesielle fordeler, spesielt for slike biologiske materialer for hvilke en engangs gjennomtrenging gjennom den porøse matriks fremdeles ikke er tilstrekkelig til fullstendig binding av hele mengden av det biologiske materiale. Det er nemlig mulig med konstruksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse, ved tilbaketrekking av formlegemet, f.eks. i en del av probebeholderen som ikke er fylt av probevæske, og på nytt innføring i en del av probebeholderen som er fylt med probevæske, å oppnå to ytterligere gjennom-trenginger av probevæsken gjennom den porøse matriks. Dette kan forhøye utbyttet av immobilisert biologisk materiale.

Etter fjerning av resten av probevæsken fra porene i matriksen kan, for å oppnå en eventuell nødvendig fjerning av ytterligere resterende forurensninger, matriksen behandles med en vaskeløsning. Dette kan utføres ifølge foreliggende oppfinnelse når formlegemet fremdeles befinner seg i probebeholderen. Gjennom valg av et lokk som lukker både probebeholderen og også formlegemet aerosoltett, reduseres inntrengingen av kontaminerende aerosoler i formlegemet. For å oppnå en spesielt fordelaktig behandling av formlegemet og probebeholderen er kraften for å løsne lokket (B) fra probebeholderen (A) mindre enn kraften for å løsne lokket (B) fra formlegemet (C). Dette kan f.eks. oppnås ved at lokkets trykk mot de begge komponenter har forskjellig styrke. Trykket kan moduleres ved anbringelse av rasterelementer.

Ved anbringelse av rasterelementer på formlegemet (C) og probebeholderen (A) kan det oppnås at lokket kan fjernes uten at formlegemet løsner fra probebeholderen.

Når det biologiske materiale foreligger i bundet form på den porøse matriks kan det enten viderebearbeides i probebeholderen (A) eller først etter fjerning av formlegemet (C) fra probebeholderen (A). Under en viderebearbeidelse er det spesielt ment opphevelse av bindingen av det biologiske materiale på den porøse matriks. Det er imidlertid også mulig å påvise det biologiske materiale direkte i bundet

form på den porøse matriks.

For å fjerne formlegemet (C) fra probebeholderen (A) benyttes fortrinnsvis et ytterligere lokk (B) som lukker formlegemet aerosoltett i retning av omgivelsene, hvorved kraften for å løsne formlegemet (C) fra probebeholderen (A) er mindre enn kraften hvormed lokket holder fast formlegemet (C). Formlegemet kan innføres i en beholder (D) hvor det festes slik at det fortrinnsvis kun kan fjernes fra beholderen

(B) under ødeleggelse av formlegemet (C) eller beholderen (D), eller med en kraft som er større enn kraften som fordres for å løsne lokket (B) fra formlegemet (C). 1

beholderen (D) kan reaksjonene for å oppheve bindingen av det biologiske materiale gjennomføres.

Rekkefølgen av de to trinn med preparering av probevæsken i probebeholderen (A) og innføring av et formlegeme i probebeholderen, kan prinsipielt ombyttes. I en første mulighet kan formlegemet først anbringes i probebeholderen og probevæsken kan fylles i denne. Dette kan foregå både i det indre rom av formlegemet og også i probebeholderen. Det er imidlertid foretrukket at probevæsken først befinner seg i probebeholderen og deretter probebeholderen innføres i formlegemet.

I motsetning til fremgangsmåter hvorved en probevæske suges gjennom en porøs matriks, f.eks. et søylemateriale, eller hvorved probevæsken sentrifugeres gjennom en porøs matriks, har fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse den fordel at det dannes betydelig mindre mengder aerosoler, og sentrifugering og avsug-ingstrinn er dessuten ganske kompliserte prosedyrer. Automatiseringen av arbeidsfor-løpet er likeledes bedre mulig med fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse enn med de kjente fremgangsmåter. Muligheten for å la probevæsken strømme gjennom den porøse matriks flere ganger representerer likeledes en betydelig frem-gangsmåtefordel.

Figur 1 viser formlegeme ifølge foreliggende oppfinnelse. Det handler her vesentlig om en hul, sylindrisk beholder som på en side som vender mot probebeholderen oppviser en porøs matriks (Cll). Denne festes til formlegemet gjennom klammerringen (Cl8) og kravekanten. De omkransende holdeanordninger (Cl5 og Cl3) for å feste et lokk, hhv. for å feste formlegemet i en elueringsbeholder, er dessuten vist. Formlegemet inneholder videre fortrinnsvis midler for å feste ytterligere midler i det indre av formlegemet, f.eks. et innrastingsspor (Cl7) for festing av et

stempel. Formlegemet har en ytre kontur (Cl2) og en indre kontur (Cl6). Hulrommet inne i formlegemet er betegnet med Cl4. Klammerringen (Cl8) er her vist i en form i hvilken den er utformet for å kunne brekkes løs fra formlegemet ved at den er forsynt med bestemte bruddsteder langs den indre kontur. Ved matriksen (Cll) handler det fortrinnsvis om et komprimerbart materiale som kan sammentrykkes ved hjelp av et stempel (E) som innføres i formlegemet. Fikseringen av matriksen i komprimert form

utføres fortrinnsvis ved at stempelet (E) festes ved hjelp av egnede utspring på den ytre kontur og innrastes i sporet (Cl7). Den omkretsende kant (Cl9) kan anvendes som tetningskant mot den indre kontur av en elueringsbeholder (D). Ved dette forhindres det at eventuelt foreliggende elueringsvæske i stort omfang kommer mellom den ytre kontur (Cl2) av formlegemet og den indre kontur av elueringsbeholderen. Denne funksjon kan tetningskanten også oppfylle for den mest mulig fullstendige gjennomtrenging av probevæsken gjennom den porøse matriks (Cll), med henblikk på den indre kontur av probebeholderen (A).

I en spesiell utførelsesform av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for opparbeidelse av nukleinsyreholdige probeløsninger gjennomføres de følgende arbeidstrinn (se figur 2). I et første trinn (I) inkuberes en celleholdig probevæske i en probebeholder (A) med et materiale som cellene, fra hvilke nukleinsyrer skal utvinnes, er bundet til. For dette kan dette materiale enten oppvise spesifikke bindingsegenskaper for overflatene av cellene, f.eks. ved immobilisering av antistoffer mot overflateantigener eller et absorpsjonsmateriale (A 16, ikke vist), men det kan imidlertid også foreligge som et materiale med filteregenskaper (A 15, ikke vist) gjennom hvilket cellene tilbakeholdes når væsken trenger gjennom materialet, f.eks. fjernes fra probebeholderen. Betingelser for immobilisering av celler på overflater er kjent for fagfolk, f.eks. fra Methods in Enzymology vol. 171, Biomembranes/Part R Transport Theory: Cell and Model Membranes, redigert av Sidney Fleischer, Becca Fleischer, Department of Molecular Biology, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee.

Under inkubasjonen er probebeholderen fortrinnsvis lukket med et lokk

(B) for å sikre aktiv, hhv. passiv, kontamineringsbeskyttelse.

I et ytterligere trinn fjernes væsken fra probebeholderen mens celler fra

hvilke nukleinsyrer skal isoleres forblir i probebeholderen i bundet tilstand på materialet. Dersom det ved det cellebindende materiale handler om partikkelformede materialer kan det også oppnås en tilbakeholdelse ved at materialet er magnetisk og at det pålegges et ytre magnetfelt på probebeholderen som er så sterkt at det partikkelformede materiale tilbakeholdes i probebeholderen når væsken fjernes. Fjerningen av væsken kan utføres på forskjellige måter. Væsken kan f.eks. fjernes gjennom en utløpsåpning (All) som er romlig atskilt fra innløpsåpningen (A 10). Hvis utløpsåp-ningen ligger i den nedre del av probebeholderen og under de tilbakeholdte celler kan væsken, f.eks. ved anvendelse av et lett vakuum, avsuges. For dette kan f.eks. utløps-åpningen være forsynt med en ventil som åpner seg ved påleggelse av undertrykk.

For omfattende fjerning av eventuelt forstyrrende probebestanddeler fra celler kan det anvendes ett eller flere vasketrinn. Herved fylles probebeholderen med en vaskeløsning som eventuelle forurensninger løser seg i, men som imidlertid ikke har vesentlig innflytelse på bindingen av cellene til overflaten av det cellebindende materiale. Slike vaskeløsninger er kjent for fagfolk, f.eks. fra cellesepareirngsproto-koller, hhv. fra tilsvarende rensingssettprotokoller for nukleinsyrer. De er vesentlig innrettet etter typen av binding av cellene til materialet.

Etter at eventuelt den siste vaskeløsning er fjernet fra probebeholderen

(A) bringes de rensede, anrikede celler i kontakt med en egnet lysisvæske for frigjør-ing av nukleinsyrene fra cellene. Reagensene i denne lysisløsning retter seg etter typen

av de immobiliserte celler. Når cellene er bakterieceller inneholder lysisløsningen fortrinnsvis proteinase K for nedbrytning av celleveggen. Om ønskelig understøttes

lysisbehandlingen ved oppvarming, hhv. avkjøling, så vel som blanding av reaksjonsblandingen. Når det ved cellebindende materialer handler om magnetiske partikler kan blandingen også utføres ved hjelp av magneter. En blanding ved omrøring av probebeholderen er dessuten også mulig. Ved slutten av denne oppslutning foreligger nukleinsyrene som skal isoleres frie i løsningen.

Også under lysis er reaksjonsbeholderen fortrinnsvis lukket med et lokk for å forhindre kontamineringer fra omgivelsene. Etter slutten av lysis fjernes lokket fortrinnsvis med hjelp av en egnet mekanisk anordning. I probebeholderen, som inneholder en blanding av cellenedbrytningsprodukter og nukleinsyrer, innføres det deretter et formlegeme (C) hvis ytre kontur (Cl2) er avstemt etter den indre kontur (A 17) av probebeholderen. Dette formlegeme er hult og lukket i retning mot probebeholderen og reaksjonsblandingen ved hjelp av et filter (Cll). Innføringen av formlegemet (C) utføres fortrinnsvis ved hjelp av oppbygningselement (Bil) av lokket (B) som dessuten inneholder et oppbygningselement (B10) som er egnet til lukking av probebeholderen. I dette tilfelle gripes formlegemet med lokket (II) og innføres i probebeholderen samtidig med lukkingen av probebeholderen. Under denne prosedyre presses dessuten reaksjonsblandingen gjennom filteret (Cl 1) og inn i hulrommet (Cl4) i formlegemet. Ved hjelp av filteret kan det på den ene side forhindres at store partikler trenger inn i hulrommet, og på den andre side, når filteret har nukleinsyre-bindende egenskaper, kan det oppnås en binding av nukleinsyrene på filteret allerede under gjennomtrengingen av reaksjonsblandingen. I dette tilfelle er det formålstjenelig å velge et glassholdig filtermateriale.

I et neste trinn fjernes den dannede lysisreaksjonsblanding fra anordningen bestående av A og C, f.eks. ved avsuging gjennom en underliggende utløps-åpning (Al 1) i probebeholderen. Løsningen som er presset inn i hulrommet (Cl4) i formlegemet fjernes også, slik at filteret inneholder så lite rester av væske som mulig. Det hittil anvendte lokk (B) fjernes deretter, hvorved formlegemet (C) deretter forblir i probebeholderen (innrastet) (V).

Samtidig eller deretter anbringes en elueringsbeholder (D) for å inne- holde formlegemet (C). Et lokk som eventuelt befinner seg på denne beholder fjernes (VI). Før overføring av formlegemet (C) i elueringsbeholderen (D) anbringes fortrinnsvis en elueringsløsning i elueringsbeholderen, f.eks. ved pipettering. Sammen-setningen av elueringsløsningen retter seg etter typen av binding av nukleinsyren til materialet i filteret (C). Løsningen inneholder reagenser som virker ved å eluere, dvs. løse, de immobiliserte nukleinsyrer fra materialet. Lokket (B) som opprinnelig stenger elueringsbeholderen festes til probebeholderen (A) med formlegemet (C) (VII).

For å fjerne formlegemet (C) fra probebeholderen (A) fjernes formlegemet (C) med lokket (B) (VIII). Kombinasjonen av lokk og formlegeme innføres deretter i elueringsbeholderen (IX). Fortrinnsvis inneholder formlegemet (C) et middel (Cl3, ikke vist) for å feste formlegemet i elueringsbeholderen (D), som bevirker at formlegemet kun kan fjernes fra beholderen (D) ved ødeleggelse av formlegemet (C) eller beholderen (D), eller med en kraft som er større enn kraften som fordres for å løsne lokket (B) fra formlegemet (C). Det er ikke tilsiktet at formlegemet skal fjernes fra euleringsbeholderen.

Under innsetningen av formlegemet (C) i elueringsbeholderen trenger den anbrakte elueringsløsning inn i filteret (Cl 1) og løser de immobiliserte nukleinsyrer fra den faste matriks. Alt etter mengden av den appliserte elueringsløsning fuktes filteret med elueringsløsning, eller elueringsløsningen med de oppløste nukleinsyrer presses inn i det hule legeme (Cl4). For at elueringen av nukleinsyrene skal forløpe mest mulig fullstendig bør den indre kontur av elueringsbeholderen anpasses med mulig tett på den ytre kontor av formlegemet.

I et etterfølgende trinn fjernes lokket (B) fra kombinasjonen av formlegeme (C) og elueringsbeholder (D) (X). Dette utføres for å påføre et stempel (E)

(XI) og innføre dette i hulrommet i formlegemet (C) (XII). Dette lokk inngriper innenfra i stempelet (E). Stempelet blir presset så kraftig mot filteret (Cl 1) at væsken presses ut fra filteret gjennom en åpning som befinner seg på trykkflaten inn i et indre rom av stempelet. Denne prosedyre er spesielt effektiv når trykkflaten i dens ytre kontur, i det minste i det område hvor utpressingen finner sted, er anpasset til den indre kontur av formlegemet (C). Stempelet (E) kan fortrinnsvis fikseres i denne stilling, f.eks. ved innrastering. Fordi den således dannede anordning er forholdsvis godt lukket ved hjelp av lokket kan den nukleinsyreholdige løsning oppbevares i anordningen.

For å ta ut en ønsket mengde nukleinsyreløsning kan lokket fjernes (XIII) og den ønskede mengde kan tas ut fra det indre rom i stempelet gjennom en åpning, f.eks. ved en pipettering (XIV). Lokket kan deretter på nytt påsettes.

Foreliggende oppfinnelse angår også et hult formlegeme inneholdende en porøs matriks (Cll) som er egnet for binding av et biologisk materiale, og oppbyg ningselementer (Cl2, Cl3) for å feste et lokk og en beholder (D) som i det minste delvis omslutter formlegemet. Oppbygningselementene (Cl2 og Cl3) er fortrinnsvis rasterelementer som forhøyer håndterbarheten av formlegemet og letter samspillet mellom de enkelte, anvendte moduler.

Formlegemet ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles på enkel måte ved hjelp av sprøytestøpetekniske fremgangsmåter. Grunnlegemet består fortrinnsvis av syntetiske materialer, som f.eks. materialene av polypropylentype. Figur 1 viser formlegemet ifølge foreliggende oppfinnelse i lengdesnitt. Figur 2 viser en fremgangsmåte for isolering av nukleinsyrer som omfatter fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for binding av et biologisk materiale til en fast fase.

Foreliggende oppfinnelse belyses nærmere ved hjelp av de følgende eksempler:

Eksempel 1

Det eksempelvise formlegeme ifølge foreliggende oppfinnelse er et sylinderformet lite kunststoffrør (ytre diameter = 6,75 mm, indre diameter = 6,0 mm, høyde er 40,4 mm, Novolen 1100 UCX, fremstilt ved hjelp av sprøytestøping), hvis øvre innløpsordnings ytre vegg oppviser en innrastingskant (C15) for reversibel kobling av et lokk til formlegemet. En ytterligere innrastingskant (Cl3) befinner seg ca. 6 mm under den første innrastingskant. Den anvendes for irreversibel fiksering av formlegemet i elueringsbeholderen (D). På den øvre innløpsåpnings indre vegg befinner det seg et innrastingshakk (C17) for irreversibel fiksering av utpressingsstempel E i det indre av formlegemet.

Utløpsåpningen (= rørbunnen) lukkes med glassull (diameter = 7,0 mm, høyde 1,5 til 3,0 mm).

Glassullen festes ovenfor ved hjelp av en avtakbar ring (Cl 8) som er forbundet tre steder med den indre vegg av røret, og nedenfra ved hjelp av en flensekant. Den avtakbare omkransende ring er fordelaktig for å minimalisere total-volumet. Den oppfyller følgende fordringer: Øvre fiksering av de ett eller to lag glassull; ved utpressing av glassullen med utpressingsutstyret fjernes ringen og minimaliserer således mellomrommet. På den ytre overflate befinner det seg tetnings-kanter (Cl9) som tilveiebringer tetning mellom formlegemet og probebeholder (A), hhv. elueringsbeholder (D).

Eksempel 2

Biologiske materialer/ kjemikalier/ anordninger

Probemateriale: Lengdestandard II, Fa. Boehringer Mannheim

Bindingsbuffer: Qiagen AL 1/AL 2 (4 deler/1 del), Fa.

Qiagen

Vaskebuffer: Qiagen AW-buffer, Fa. Qiagen

Elueringsbuffer: 10 mM tris-buffer, pH 9,0

Probebeholder (A)

Probebeholderlokk (B)

Formlegeme (C) med en porøs matriks av glassull (Cll)

Elueringsbeholder (D)

Elueringsbeholderlokk (E)

Utpressingsstempel-formlegeme (F)

Sammensetning av probeløsninger

Probe: 200 il (6 il lengdestandard II oppløst i

PBS-buffer)

Protease K: 25 il

Bindingsbuffer: 200 il (AL 1 og AL 2-buffer blandet i

forholdet 4+1)

Etanol: 210 il

Samlet volum

Pr. porsjon 635 il

Utførelse av eksemplene

Probebeholder (A) fylles med 200 il probe, 25 il proteinase K-løsning og 200 il bindingsbuffer. Probebeholderen (A) lukkes med probebeholdelokket (B). Væskene blandes i den lukkede beholder. Deretter utføres inkubasjon ved 70 °C i 10 minutter (dekomponering av cellene) etterfulgt av avkjøling til 20 °C i 3 minutter. Probebeholderen (A) åpnes og det tilsettes 210 il etanol. Probebeholderen (A) lukkes og løsningen blandes.

Probebeholderen (A) åpnes. Probebeholderlokket (B) henter formlegemet

(C) med en porøs matriks fra mottakeren. Formlegemet med glassullmatriksen innføres i probebeholderen fylt med væske gjennom inngangsåpningen. Væsken som

foreligger i probebeholderen (A) strømmer gjennom glassullen nedenfra under innfør-ingsprosedyren. De fritt bevegelige nukleinsyrer bindes til glassullmatriksen. I det neste trinn blir væsken som befinner seg i formlegemet (C) avsugd nedenfra. Ved dette strømmer væsken på nytt gjennom glassullen og nukleinsyre som fremdeles ikke er bundet blir fiksert på matriksen.

Glassullmatriksen renses to ganger med 500 il vaskebuffer. Buffer-løsningen som befinner seg over matriksen suges gjennom glassullen. Matriksen med de rensede nukleinsyrer tørkes deretter ved 50 °C i 3 minutter. Probebeholderlokket

(B) kastes.

Formlegemet (C) med nukleinsyrene overføres ved hjelp av elueringsbeholderlokket (E) fra probebeholderen (D) over i en preparert elueringsbuffer ved hjelp av 200 il elueringsbuffer. Elueringsbufferen løser nukleinsyrene fra glassullmatriksen. Nukleinsyreløsningen står delvis over matriksen.

Matriksen i formlegemet blir i et ytterligere trinn komprimert ved innføring av utpressingsstempel-formlegemet (F) med elueringsbeholderlokket (E) for å minimalisere dødvolumet av nukleinsyreløsningen.

Nukleinsvreutbvtte

Forsøkene utføres med to forskjellige nukleinsyreprobekonsentrasjoner. De følgende resultater er oppført nedenfor:

Forsøksrekke 1:

Probekonsentrasjon: 6 ig nukleinsyre/ 200 il elueringsløsning

Forsøksrekke 2:

Probekonsentrasjon: 20 ig nukleinsyre/ 200 il elueringsløsning

Referanseliste for fieursymboler

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for binding av et biologisk materiale til en fast fase, ved: preparering av en probevæske inneholdende det biologiske materiale i en probebeholder (A) med en indre kontur (Al7) og innføring i probebeholderen (A) av et hult formlegeme (C) som er lukket mot probebeholderen med en for binding av det biologiske materiale egnet porøs matriks (Cl 1), slik at probevæske trenger inn i formlegemet (C) gjennom den porøse matriks (Cll), idet konturen (Cl 2) av formlegemet (C) er avstemt slik etter den indre kontur (Al7) av probebeholderen (A), at når formlegemet (C) innføres i probebeholderen (A), blir probevæsken som har trengt igjennom den porøse matriks tvunget in i formlegemets (C) indre, mens det biologiske materiale kan bindes til den porøse matriks, og fjerning av probevæsken som er trengt inn i formlegemet (C),karakterisert vedat probevæsken som er trengt inn i formlegemet gjennom den porøse matriks (Cll), fjernes ved påsetting av et vakuum ved utløpsåpningen (AU).

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat formlegemet (C) deretter fjernes fra probebeholderen (A).

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert vedat det biologiske materiale er en nukleinsyre.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat formlegemet (C) deretter anbringes i en beholder (D), i hvilken det bundne, biologiske materiale frigjøres.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert vedat formlegemet (C) anbringes i probebeholderen (A) ved hjelp av et lokk som lukker probebeholderen (A) og formlegemet (C) aerosoltett mot omgivelsene.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert vedat kraften for å løsne lokket (B) fra probebeholderen (A) er mindre enn kraften som skal til for å løsne lokket (B) fra formlegemet (C).

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert vedat formlegemet oppviser midler (Cl 2) for å fiksere formlegemet (C) i beholderen (D), hvilke midler bevirker at formlegemet kun kan fjernes fra beholderen (D) ved ødeleggelse av formlegemet (C) eller beholderen (D), eller med en kraft som er større enn kraften som fordres for å løsne lokket (B) fra formlegemet (C).

8. Kombinasjon av et hult formlegeme (C) inneholdende en porøs matriks (Cl 1) egnet for binding av et biologisk materiale, og en probebeholder (A), hvor den porøse matriks (Cll) lukker formlegemet mot probebeholderen (A), og konturen (Cl 2) av formlegemet (C) er avstemt slik etter den indre kontur (A 17) av probebeholderen (A) at ved innføring av formlegemet (C) i probebeholderen (A) blir probevæsken som har trengt gjennom den porøse matriks, tvunget inn i formlegemets (C) indre,karakterisert vedat probebeholderen (A) har en utløpsåpning (All) som er tilsluttet en vakuuminnretning som gjør det mulig å fjerne probevæsken som er trengt inn i formlegemet (C) gjennom den porøse matriks (Cl 1), ved påsetting av et vakuum ved utløpsåpningen (All).

9. Kombinasjon ifølge krav 8', karakterisert vedat matriksen (C11) er fiksert i det indre rom (C14) av formlegemet ved hjelp av en avbrytbar omløpende flens (C18).

10. Kombinasjon ifølge krav 8, karakterisert vedat matriksen (Cl 1) er komprimerbar.