DE19512360A1 - Verfahren zur Bindung eines biologischen Materials - Google Patents
Verfahren zur Bindung eines biologischen MaterialsInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bindung eines biologischen
Materials an eine Festphase sowie ein hierfür geeigneter Formkörper, der eine poröse
Matrix und Bauteile zur Verbindung mit weiteren Funktionsteilen aufweist.
In vielen Anwendungsgebieten erfordert die Behandlung von Flüssigkeiten besondere Sorg
falt im Hinblick auf eine aktive Vermeidung der Entstehung von Kontaminationen, die einen
schädlichen Einfluß auf die Umgebung ausüben könnten. Dies gilt insbesondere für giftige
Flüssigkeiten, jedoch auch für üblicherweise während Analysen von Inhaltsstoffen an
fallende Flüssigkeiten. In der Regel werden nämlich Behandlungsschritte zur Vorbereitung
einer Probenflüssigkeit für die Analyse in demselben Labor oder sogar Raum vorgenommen,
wie die Analyse selbst. Zum Beispiel durch während der Behandlung entstehende Aerosole
wird die Umgebung oft so stark z. B. mit Probenbestandteilen kontaminiert, daß die Ana
lyse von Inhaltsstoffen anderer Proben dadurch verfälscht wird. Ein falsches Analyseergeb
nis kann insbesondere bei der Analyse von Inhaltsstoffen in der medizinischen bzw.
klinischen Diagnostik für den Patienten schreckliche Folgen haben.
Analysen, die auf dem Nachweis von Nukleinsäuren in einer Probe beruhen, wurden in
jüngerer Zeit wegen ihrer relativ hohen erreichbaren Spezifität als Diagnosehilfsmittel ange
führt. Diese Tests stellen jedoch wegen des üblicherweise geringen Gehalts an Nuklein
säuren und insbesondere der nachzuweisenden Nukleinsäuren bei gleichzeitiger Anwesen
heit von Nukleinsäuren ähnlicher Sequenz sowie anderer Inhaltsstoffe, die Nukleinsäurebe
stimmungen empfindlich stören können, eine erhebliche technische Herausforderung dar. Es
hat sich herausgestellt, daß die in letzter Zeit immer populärer werdenden Amplifikations
verfahren, mit denen in einer Reaktion, abhängig von der Anwesenheit einer ganz bestimm
ten, nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz eine Vielzahl identischer Nukleinsäuren herge
stellt werden können, die Empfindlichkeit der Tests wesentlich verbessern können, so daß
manchmal sogar einzelne Nukleinsäuren nachgewiesen werden können. Die hohe erreich
bare Empfindlichkeit der Nachweise hat jedoch auch zur Folge, daß Kontaminationen
(Verunreinigungen) von anderen Proben mit selbst nur einer einzigen Nukleinsäure aus der
Umgebung zu einem positiven Analyseergebnis führen kann und so ein positives Analyse
ergebnis vorgetäuscht wird. Aus diesem Grund muß für Nukleinsäuretests eine besonders
effektive Vermeidung bereits der Entstehung von Kontaminationen, d. h. der Austritt von
Nukleinsäuren aus einer Probe oder einem Reaktionsgemisch in die Umgebung, betrieben
werden.
Bei der Vorbereitung von Proben zur Analyse von Inhaltsstoffen, insbesondere Nuklein
säuren, werden in jüngerer Zeit in vermehrten Umfang Verfahren eingesetzt, bei denen die
Probenflüssigkeit und darin enthaltene oder daraus isolierte Inhaltsstoffe in einem Gefäß
einer Behandlung unterzogen werden, bei der eine Flüssigkeit durch eine Einlaßöffnung in
das Gefäß eingebracht wird und die Flüssigkeit nach einem oder mehreren Behandlungs
schritten durch eine Auslaßöffnung aus dem Gefäß entfernt wird. Solche Gefäße sind auf
dem Markt in Form von Säulen erhältlich, die beispielsweise Materialien zur Abtrennung
von Inhaltsstoffen aus der Flüssigkeit enthalten, wie der QIAamp Kit der Firma Qiagen.
Diese Gefäße befinden sich in einem Gefäß, so daß eventuell austretende Flüssigkeit in
dieses Gefäß austritt und nicht in die Umgebung. Diese Art der Behandlung von Flüssigkei
ten ist jedoch aufwendig und benötigt ein entsprechendes zweites Gefäß. Darüber hinaus
werden diese Gefäße in Zentrifugen eingesetzt, um die Flüssigkeit in das zweite Gefäß zu
schleudern.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war, es die derzeit bekannten Verfahren zur Bindung
es biologischen Materials an eine Festphase im Hinblick auf im Stand der Technik be
kannte Nachteile teilweise oder vollständig zu verbessern.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bindung eines biologischen Materials an
eine Festphase durch Bereitstellung einer das biologische Material enthaltenden Proben
flüssigkeit in einem Probengefäß mit einer inneren Kontur und Einbringen eines gegen das
Probengefäß mit einer porösen Matrix verschlossenen, eine auf die innere Kontur abge
stimmte äußere Kontur aufweisenden und hohlen Formkörper in das Probengefäß, so daß
Probenflüssigkeit durch die poröse Matrix in den Formkörper eindringt.
Außerdem ist Gegenstand der Erfindung ein hohler Formkörper, enthaltend eine zur Bin
dung eines biologischen Materials fähige poröse Matrix und Bauelemente zur Befestigung
eines Deckels und eines den Formkörper zumindest teilweise umfassenden Gefäßes.
Biologisches Material im Sinne der Erfindung kann jedes biologische Material sein. Insbe
sondere handelt es sich um Inhaltsstoffe von Proben, wie sie in der medizinischen bzw.
klinischen Diagnostik oder in der Molekularbiologie vorkommen. Die Inhaltsstoffe sind
entweder nieder- oder hochmolekulare Bestandteile. Niedermolekulare Bestandteile sind
beispielsweise Haptene oder Antigene mit einem Molekulargewicht von weniger als
2.000 D. Hochmolekulare Bestandteile sind insbesondere Biopolymere, insbesondere
solche, die aus Aminosäuren oder Nukleotidbausteinen aufgebaut sind. Insbesondere
handelt es sich um immunologisch aktive Proteine, wie Antigene und Antikörper, und
Nukleinsäuren. Besonders geeignet ist das vorliegende Verfahren zur Isolierung von
Nukleinsäuren.
Grundlage für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Bereitstellung
einer das biologische Material enthaltenden Probenflüssigkeit. Diese ist bevorzugt in einem
Probengefäß (A) enthalten, welches eine innere Kontur (A 17) aufweist. Diese innere Kontur
ist bevorzugt glatt. Ein besonders bevorzugter Fall ist, daß das Probengefäß eine hohlzylin
drische Innenform aufweist.
Die Probenflüssigkeit kann entweder in schon für die Bindung des biologischen Materials
geeigneter Form in das Probengefäß eingegeben werden, sie kann jedoch auch das Ergebnis
von Vorbereitungsschritten einer ursprünglichen Probenflüssigkeit sein. Beispielhaft seien
an dieser Stelle zwei alternative Möglichkeiten für die Bereitstellung von nukleinsäurehalti
ges Material enthaltenden Probenflüssigkeiten beschrieben. In einer Ausführungsform wird
eine ursprüngliche Probenflüssigkeit in einem Aufschlußgefäß zur Freisetzung von Nuklein
säuren aus dieser enthaltenden Zellen mittels eines die Zellwände lysierenden Reagenzes be
handelt. Anschließend wird, gewünschtenfalls nach Abtrennung unerwünschter Probenbe
standteile, die nukleinsäurehaltige Probenflüssigkeit in das Probengefäß (A) eingefüllt. In
einer zweiten Ausführungsform, welche bevorzugt ist, wird die ursprüngliche Proben
flüssigkeit in das Probengefäß eingefüllt und erst dann Reagenzien zur Freisetzung der
Nukleinsäuren aus den Zellen zugegeben. Auch in diesem Fall liegen die Nukleinsäuren frei
in der Probenflüssigkeit vor. Die Reaktionsschritte, die zu einer Bereitstellung des biolo
gischen Materials führen, sind dem Fachmann aus der Fachliteratur bekannt.
Die das biologische Material enthaltende Probenflüssigkeit wird nun im Probengefäß (A)
mit dem Formkörper (C) so in Kontakt gebracht, daß Probenflüssigkeit durch die poröse
Matrix (C 11) in den Formkörper (C) eindringt. Der Formkörper ist hohl, so daß die
Probenflüssigkeit in ihn eindringen kann. Bevorzugt hat der Formkörper eine hohlzylin
drische Form, wobei das auf das Probengefäß hindeutende Ende durch die poröse Matrix
verschlossen ist und das vom Probengefäß wegdeutende Ende Bauelemente zur Befestigung
eines Deckels aufweist. Die äußere Form des Formkörpers ist auf die innere Form des
Probengefäßes so abgestimmt, daß der Formkörper in das Probengefäß eingebracht werden
kann. Bevorzugt liegt die äußere Kontur des Formkörpers eng an der inneren Kontur des
Probengefäßes an, so daß der Formkörper sich wie ein im Probengefäß bewegender Kolben
verhält.
Die Matrix (C 11) ist porös, so daß die Probenflüssigkeit durch sie hindurchdringen kann.
Hierdurch ist es möglich, die poröse Matrix wie einen Filter zu verwenden, um das Eindrin
gen unerwünschter Probenbestandteile in den Formkörper (C) zu vermeiden. Bei den uner
wünschten Bestandteilen kann es sich beispielsweise um partikuläre Bestandteile handeln,
z. B. Reste von Zellwänden, die bei einer vorangegangenen Lyse der Zellen nicht zerstört
wurden, jedoch auch Magnetpartikel, die zur Immobilisierung der Zellen verwendet worden
sind. In diesem Fall findet beim Durchtritt der Probenflüssigkeit durch die poröse Matrix
eine Abreicherung der Probenflüssigkeit an diesen Bestandteilen statt. Das biologische
Material kann in diesem Fall in der Probenflüssigkeit verbleiben. In einer zweiten Funktion
kann die poröse Matrix selbst schon zur Bindung des biologischen Materials verwendet
werden. Hierzu wird eine Matrix gewählt, die eine Affinität zu dem zu bindenden biolo
gischen Material aufweist. Es ist sowohl eine unspezifische als auch eine spezifische Bin
dung möglich, je nach gewählter Oberfläche der Matrix. Enthält die Matrix an ihrer Ober
fläche beispielsweise Antikörper, so können während des Durchtritts der Probenflüssigkeit
durch die Matrix Antigene, gegen die der Antikörper gerichtet ist, an der Matrix gebunden
(immobilisiert) werden. Für die Bindung von immunologisch aktiven Stoffen hat sich als
poröse Matrix insbesondere Cellulose, z. B. Papier, als günstig erwiesen. Eine Immobilisie
rung von Nukleinsäuren ist beispielsweise dadurch möglich, daß als Matrix ein Glasfaser
vlies (sequenzunspezifische Immobilisierung) oder ein poröses Material, an dem eine
Nukleinsäure, welche zu der zu bindenden Nukleinsaure komplementär ist, gebunden ist
(sequenzspezifische Immobilisierung), verwendet wird.
Bei der porösen Matrix kann es sich um vliesartige Matrizes handeln, aber auch um partiku
läre Matrizes, wenn diese wiederum, z. B. durch Filter, so im Formkörper lokalisiert sind,
daß die Probenflüssigkeit Gelegenheit hat, in die Poren der partikulären Matrix einzudrin
gen. Im bevorzugten Fall handelt es sich bei der porösen Matrix um eine vliesförmige
Matrix. Es kann sich auch um eine aus mehreren Komponenten (z. B. unterschiedlich festen
Vliesen) handeln. Die Porosität der Matrix bewirkt ein langsames Durchströmen der Matrix
durch die Flüssigkeit, so daß eine Reaktion, z. B. Binding von Inhaltsstoffen der Flüssigkeit
an die Matrix, besonders effektiv ist.
Diese Matrix kann auf bekannte Weise in dem Formkörper befestigt werden. Beispielsweise
kann sie von der dem Probengefäß abgewandten Seite des Formkörpers in den Formkörper
eingefügt und, z. B. mit Hilfe eines Halterings, an der vorbestimmten Position fixiert wer
den. Für eine weitere Befestigung der Matrix kann diese zusätzlich in dem Formkörper ein
geschweißt werden. Bevorzugt wird die Matrix jedoch von der dem Probengefäß zuge
wandten Seite in den Formkörper eingebracht, bevorzugt bis zu einem vorinstallierten
Haltering entlang der Innenwand des Formkörpers und anschließend der überstehende Rand
so nach innen umgebördelt, daß die Matrix zwischen Haltering und Bördelkante fixiert ist.
Besonders bevorzugt wird die Matrix auf der dem Probengefäß abgewandten Seite durch
einen ringförmig umlaufenden Vorsprung in der inneren Kontur des Formkörpers festgehal
ten. Ganz besonders bevorzugt ist dieser Vorsprung in der Materialstärke so gewählt, daß
er ohne Zerstörung der Matrix und des übrigen Formkörpers abgebrochen werden kann.
Die poröse Matrix ist außerdem besonders bevorzugt komprimierbar. Unter komprimierbar
wird im Sinne der Erfindung eine Matrix verstanden, aus welcher bei Ausüben eines
Druckes durch Aufdrücken eines stempelförmigen Gerätes sich das äußere Volumen der
Matrix verkleinert und darüber hinaus sich die Porengröße verringert, so daß ursprünglich
in der Matrix enthaltene Flüssigkeit aus der Matrix herausgedrückt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Formkörper (C) mit Hilfe eines den Form
körper in Richtung auf die Umgebung aerosoldicht verschließenden Deckels in das Proben
gefäß (A) eingeführt. Durch aufeinander abgestimmte Konturen wird der Durchtritt der
Probenflüssigkeit durch die poröse Matrix in den Innenraum des Formkörpers erzwungen.
Hierbei wird das biologische Material an der porösen Matrix gebunden. Danach wird die im
Hinblick auf das biologische Material abgereinigte Probenflüssigkeit aus dem Formkörper
oder/und dem Probengefäß entfernt. Dies kann beispielsweise dadurch geschehen, daß die
Restflüssigkeit durch die dem Probengefäß abgewandte Seite des Formkörpers entnommen,
z. B. abpipettiert, wird. Bevorzugt ist jedoch, daß die Restflüssigkeit aus dem Probengefäß
(A) entnommen (z. B. abgesaugt) wird und bei diesem Vorgang die in den Formkörper
eingedrungene Restflüssigkeit durch die poröse Matrix in das Probengefäß dringt.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat besonders für solche biologischen Materialien be
sondere Vorteile, bei denen ein einmaliger Durchtritt durch die poröse Matrix noch nicht
zur vollständigen Bindung der Gesamtmenge des biologischen Materials ausgereicht hat. Es
ist nämlich mit der erfindungsgemäßen Konstruktion möglich, durch Zurückziehen des
Formkörpers, z. B. in einen Teil des Probengefäßes, der nicht von Probenflüssigkeit ange
füllt ist, und erneutes Einbringen in den mit Probenflüssigkeit gefüllten Teil des Probenge
fäßes, zwei nochmalige Durchtritte der Probenflüssigkeit durch die poröse Matrix zu er
reichen. Dies kann die Ausbeute an immobilisiertem biologischem Material erhöhen.
Nach Entfernen der restlichen Probenflüssigkeit aus den Poren der Matrix kann, um eine
eventuell erforderliche Entfernung weiterer zurückgebliebener Verunreinigungen zu er
reichen, die Matrix mit einer Waschlösung behandelt werden. Dies kann erfindungsgemäß
bevorzugt dann geschehen, wenn der Formkörper sich noch in dem Probengefäß befindet.
Durch Wahl eines Deckels, welcher sowohl das Probengefäß als auch den Formkörper aero
soldicht verschließt, wird der Eintrag von kontaminierenden Aerosolen in den Formköper
reduziert. Um eine besonders zweckmäßige Behandlung des Formkörpers und des Proben
gefäßes zu erreichen, ist die Kraft zur Lösung des Deckels (B) vom Probengefäß (A) ge
ringer als die Kraft zur Lösung des Deckels (B) von dem Formkörper (C). Dies kann bei
spielsweise dadurch erreicht werden, daß der Anpreßdruck des Deckels auf die beiden
Komponenten unterschiedlich stark ist. Der Anpreßdruck kann durch das Vorsehen von
Rastelementen moduliert werden.
Darüber hinaus kann durch Vorsehen von Rastelementen an dem Formkörper (C) und dem
Probengefäß (A) erreicht werden, daß der Deckel entfernt werden kann, ohne daß sich der
Formkörper aus dem Probengefäß löst.
Sofern das biologische Material in an die poröse Matrix gebundener Form vorliegt, kann es
entweder noch in dem Probengefäß (A) oder erst nach Entfernung des Formkörpers (C) aus
dem Probengefäß (A) weiter bearbeitet werden. Unter einer Weiterbearbeitung wird insbe
sondere die Aufhebung der Bindung des biologischen Materials an die poröse Matrix ver
standen. Es ist jedoch auch möglich, das biologische Material direkt in an die poröse Matrix
gebundener Form nachzuweisen.
Zur Entfernung des Formkörpers (C) aus dem Probengefäß (A) wird bevorzugt ein weite
rer, den Formkörper in Richtung auf die Umgebung aerosoldicht verschließender Deckel
(B)benutzt, wobei die Kraft zur Lösung des Formkörpers (C) aus dem Probengefäß (A)
geringer ist als die Kraft, mit der der Deckel den Formkörper (C) festhält. Der Formkörper
kann daraufhin in ein Gefäß (D) eingebracht werden, wo er so befestigt ist, daß er bevor
zugt nur unter Zerstörung des Formkörpers (C) oder des Gefäßes (D) oder mit einer Kraft,
die größer ist als die Kraft, die zur Lösung des Deckels (B)vom Formkörper (C) erforder
lich ist, aus dem Gefäß (D) entfernt werden kann. Im Gefäß (D) können die Reaktionen zur
Aufhebung der Bindung des biologischen Materials durchgeführt werden.
Die Reihenfolge der beiden Schritte Bereitstellung der Probenflüssigkeit in dem Probenge
fäß (A) und des Einbringens eines Formkörpers in das Probengefäß ist prinzipiell vertausch
bar. In einer ersten Möglichkeit kann zunächst der Formkörper in das Probengefäß einge
bracht werden und daraufhin die Probenflüssigkeit eingefüllt werden. Dies kann sowohl in
den Innenraum des Formkörpers als auch in das Probengefäß geschehen. Bevorzugt ist je
doch der Fall, daß die Probenflüssigkeit sich zunächst im Probengefäß befindet und an
schließend der Formkörper in das Probengefäß eingeführt wird.
Gegenüber Verfahren, die auf einem Durchsaugen einer Probenflüssigkeit durch eine poröse
Matrix, z. B. ein Säulenmaterial, oder auf Zentrifugation der Probenflüssigkeit durch eine
poröse Matrix beruhen, hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß deutlich
weniger Aerosole gebildet werden und Zentrifugation und Absaugschritte sind außerdem
recht komplexe Vorgänge. Die Automation der Arbeitsabläufe ist mit dem erfindungsge
mäßen Verfahren ebenfalls besser möglich als mit den bekannten Verfahren. Die Möglich
keit, die Probenflüssigkeit mehrmals durch die poröse Matrix fließen zu lassen, stellt eben
falls einen großen Verfahrensvorteil dar.
In Fig. 1 ist ein erfindungsgemäßer Formkörper gezeigt. Es handelt sich hier um ein im
wesentlichen hohlzylindrisches Gefäß, welches auf der einem Probengefäß zugewandten
Seite eine poröse Matrix (C 11) aufweist. Diese wird durch den Haltering (C 18) und die
Bördelkante im Formkörper fixiert. Darüber hinaus sind die umlaufenden Haltemittel (C 15
und C 13) zur Befestigung eines Deckels bzw. zur Befestigung des Formkörpers in einem
Elutionsgefäß erkennbar. Bevorzugt enthält der Formkörper weiterhin Mittel zur Fixierung
weiterer Mittel in seinem Inneren, z. B. eine Einrastkerbe (C 17) für die Fixierung eines
Stempels. Der Formkörper hat eine Außenkontur (C 12) und eine Innenkontur (C 16). Der
Hohlraum im Inneren des Formkörpers ist mit C 14 bezeichnet. Der Haltering (C 15) ist hier
in einer Form gezeigt, in der er von dem Formkörper durch Vorsehen von Sollbruchstellen
entlang der inneren Kontur abbrechbar gestaltet ist. Bei der Matrix (C 11) handelt es sich
bevorzugt um ein komprimierbares Material, welches mit Hilfe eines in den Formkörper
eingeführten Stempels (E) zusammengedrückt werden kann. Die Fixierung der Matrix in
komprimierter Form geschieht bevorzugt durch Fixierung des Stempels (E) über geeignete
Vorsprünge auf der Außenkontor und Einrasten in die Einkerbung (C 17). Der umlaufende
Rand (C 19) kann als Dichtlippe gegenüber der Innenkontur eines Elutionsgefäßes (D) ver
wendet werden. Hierdurch wird verhindert, daß eventuell vorgelegte Elutionsflüssigkeit in
größerem Umfang zwischen die Außenkontur (C 12) des Formkörpers und die Innenkontur
des Elutionsgefäßes gerät. Dieselbe Funktion kann die Dichtlippe auch für den möglichst
vollständigen Durchtritt der Probenflüssigkeit durch die poröse Matrix (C 11) im Hinblick
auf die Innenkontur des Probengefäßes (A) erfüllen.
In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Aufarbei
tung nukleinsäurehaltiger Probenlösungen, werden folgende Arbeitsschritte durchgeführt
(siehe Fig. 2). In einem ersten Schritt (I) wird eine zellhaltige Probenflüssigkeit in einem
Probegefäß (A) mit einem Material inkubiert, an welches die Zellen gebunden werden, aus
denen Nukleinsäuren gewonnen werden sollen. Hierzu kann dieses Material entweder
spezifische Bindeeigenschaften für die Oberfläche der Zellen aufweisen, z. B. durch
Immobilisierung von Antikörpern gegen Oberflächenantigene oder ein Absorbermaterial
(A 16, nicht gezeigt), es kann jedoch auch ein Material mit Filtereigenschaften (A 15, nicht
gezeigt) vorgesehen sein, durch welches die Zellen zurückgehalten werden, wenn die
Flüssigkeit durch das Material durchtritt, z. B. aus dem Probengefäß entfernt wird. Bedin
gungen für die Immobilisierung von Zellen an Oberflächen sind dem Fachmann bekannt,
z. B. aus Methods in Enzymology Vol. 171, Biomembranes/Part R Transport Theory: Cell
and Model Membranes, Edited by Sidney Fleischer, Becca Fleischer, Department of
Molecular Biology, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee.
Während der Inkubation ist das Probengefäß bevorzugt durch einen Deckel (B) ver
schlossen, um aktiven bzw. passiven Kontaminationsschutz zu gewährleisten.
In einem weiteren Schritt wird die Flüssigkeit aus dem Probengefäß entfernt, während
Zellen, deren Nukleinsäuren isoliert werden sollen, in an das Material gebundenem Zustand
im Probengefäß zurückbleiben. Sofern es sich bei dem zellbindenden Material um partiku
läre Materialien handelt, kann ein Zurückhalten auch dadurch erreicht werden, daß das
Material magnetisch ist und ein Magnetfeld von außen an das Probengefäß angelegt wird,
welches so stark ist, daß das partikuläre Material im Probengefäß zurückbleibt, wenn die
Flüssigkeit entfernt wird. Das Entfernen der Flüssigkeit kann auf verschiedenste Weise ge
schehen. Beispielsweise kann die Flüssigkeit durch eine räumlich von der Einlaßöffnung
(A 10) getrennte Auslaßöffnung (A 11) entfernt werden. Sofern die Auslaßöffnung im unte
ren Teil des Probengefäßes und unterhalb der zurückgehaltenen Zellen gelegen ist, kann die
Flüssigkeit, z. B. unter Anlegen eines leichten Vakuums, abgesaugt werden. Hierzu kann
beispielsweise an der Auslaßöffnung ein Ventil vorgesehen sein, welches sich durch Anlegen
von Unterdruck öffnet.
Zur weitergehenden Entfernung eventuell störender Probenbestandteile von den Zellen
können ein oder mehrere Waschschritte vorgesehen werden. Hierzu wird in das Probenge
fäß eine Waschflüssigkeit eingefüllt, in der sich eventuelle Verunreinigungen lösen, die je
doch die Bindung der Zellen an die Oberfläche des zellbindenden Materials nicht wesentlich
beeinträchtigen. Solche Waschlösungen sind dem Fachmann z. B. aus den Zellseparations
protokollen bzw. aus entsprechenden Reinigungskitsprotokollen für Nukleinsäuren bekannt.
Sie richten sich im wesentlichen nach der Art der Bindung der Zellen an das Material.
Nachdem gegebenenfalls die letzte Waschlösung aus dem Probengefäß (A) entfernt wurde,
werden die gereinigten, angereicherten Zellen mit einer geeigneten Lyseflüssigkeit zur Frei
setzung der Nukleinuren aus den Zellen in Kontakt gebracht. Die Reagenzien dieser
Lyselösung richten sich weitgehend nach der Art der immobilisierten Zellen. Sofern es sich
bei den Zellen um Bakterien handelt, enthält die Lyselösung bevorzugt Proteinase K zum
Abbau der Zellwand. Gewünschtenfalls wird die Lyse durch Erhitzen bzw. Abkühlen sowie
Mischen der Reaktionsmischung unterstützt. Sofern es sich bei dem zellbindenden Material
um magnetische Partikei handelt, kann die Mischung auch mittels Magneten vorgenommen
werden. Außerdem ist eine Mischung durch Schütteln des Probengefäßes möglich. Am
Ende dieses Aufschlusses liegen die zu isolierenden Nukleinsäuren frei in der Lösung vor.
Auch während der Lyse ist das Reaktionsgefäß bevorzugt durch einen Deckel verschlossen,
um Kontaminationen aus der Umgebung zu verhindern. Nach Ende der Lyse wird der
Deckel, bevorzugt mit Hilfe einer entsprechenden mechanischen Vorrichtung, entfernt. Da
nach wird in das Probengefäß, welches eine Mischung von Abbauprodukten der Zellen so
wie die Nukleinsäuren enthält, ein Formkörper (C) eingeführt, dessen äußere Kontur (C 12)
auf die innere Kontur (A 17) des Probengefäßes abgestimmt ist. Dieser Formkörper ist hohl
und in Richtung auf das Probengefäß und die Reaktionsmischung hin durch einen Filter
(C 11) verschlossen. Die Einführung des Formkörpers (C) erfolgt bevorzugt mit Hilfe eines
Bauelementes (B 11) des Deckels (B), der außerdem ein Bauelement (B 10) enthält, welches
zum Verschluß des Probengefäßes geeignet ist. In diesem Fall wird der Formkörper mit
dem Deckel ergriffen (II) und gleichzeitig mit dem Verschluß des Probengefäßes in das
Probengefäß eingeführt. Während dieses Vorgangs wird außerdem die Reaktionsmischung
durch den Filter (C 11) in den Hohlraum (C 14) des Formkörpers eindringen (IV). Durch das
Vorsehen des Filters können einerseits große Partikel an dem Eintritt in den Hohlraum ge
hindert werden und andererseits kann, wenn der Filter nukleinsäurebindende Eigenschaften
hat, schon während des Durchtritts der Reaktionsmischung eine Bindung der Nukleinsäuren
an den Filter erreicht werden. In diesem Fall ist es zweckmäßig, ein glasfaserhaltiges
Filtermaterial zu wählen.
In einem nächsten Schritt wird die verbleibende Lysereaktionsmischung aus der durch A
und C gebildeten Vorrichtung entfernt, z. B. durch Absaugen durch eine untenliegende
Auslaßöffnung (A 11) im Probengefäß. Auch die in den Hohlkörper (C 14) des Formkörpers
eingedrungene Lösung wird somit entfernt, so daß der Filter möglichst keine Flüssigkeits
reste mehr enthält. Danach wird der bisher verwendete Deckel (B) entfernt, wobei der
Formkörper (C) zunächst im Probengefäß verbleibt (eingerastet) (V).
Gleichzeitig oder anschließend wird ein Elutionsgefäß (D)zur Aufnahme des Formkörpers
(C) vorbereitet. Ein gegebenenfalls auf diesem Gefäß befindlicher Deckel wird entfernt (VI).
Bevorzugt wird vor Überführung des Formkörpers (C) in das Elutionsgefäß (D)eine Elu
tionslösung in das Elutionsgefäß vorgelegt, z. B. einpipettiert. Die Zusammensetzung der
Elutionslösung richtet sich nach der Art der Bindung der Nukleinsäuren an das Material im
Filter (C). Sie enthält Reagenzien, unter deren Einwirkung die immobilisierten Nuklein
säuren von dem Material eluiert, d. h. gelöst, werden. Der ursprünglich das Elutionsgefäß
verschließende Deckel (B) wird auf das Probengefäß (A) mit dem Formkörper (C) aufge
steckt (VII).
Zur Entnahme des Formkörpers (C) aus dem Probengefäß (A) wird der Formkörper (C) mit
dem Deckel (B) entfernt (VIII). Die Kombination aus Deckel und Formkörper wird an
schließend in das Elutionsgefäß eingeführt (IX). Bevorzugt enthält der Formkörper (C)
Mittel (C 13, nicht gezeigt) zur Fixierung des Formkörpers im Elutionsgefäß (D), die be
wirken, daß der Formkörper nur unter Zerstörung des Formkörpers (C) oder des Gefäßes
(D) oder mit einer Kraft, die größer ist als die Kraft die zur Lösung des Deckels (B) vom
Formkörper (C) erforderlich ist, aus dem Gefäß (D) entfernt werden kann. Eine Entfernung
des Formkörpers aus dem Elutionsgefäß ist nicht beabsichtigt.
Während des Eindringens des Formkörpers (C) in das Elutionsgefäß dringt die vorgelegte
Elutionslösung in den Filter (C 11) und die löst die immobilisierte Nukleinsäure von der
festen Matrix ab. Je nach Menge der vorgelegten Elutionslösung wird entweder nur der
Filter mit der Elutionslösung getränkt oder dringt die Elutionslösung mit den wieder ge
lösten Nukleinsäuren in den Hohlkörper (C 14) ein. Damit die Elution der Nukleinsäuren
möglichst vollständig verläuft, sollte die Innenkontur des Elutionsgefäßes möglichst dicht an
die Außenkontur des Formkörpers angepaßt sein.
In einem folgenden Schritt wird der Deckel (B) von der Kombination aus Formkörper (C)
und Elutionsgefäß (D) entfernt (X). Er wird benutzt, um einen Stempel (E) auftunehmen
(XI) und in den Hohlraum des Formkörpers (C) einzuführen (XII). Dieser Deckel greift von
innen in den Stempel (E). Der Stempel wird so kräftig gegen den Filter (C 11) gepreßt, daß
Flüssigkeit aus dem Filter durch eine in der Andrucksfläche befindliche Öffnung in einen
Innenraum des Stempels eindringt. Dieser Vorgang ist besonders effektiv, wenn die An
drucksfläche in ihrer äußeren Kontur zumindest in dem Bereich, in dem die Auspressung
stattfinden soll, an die innere Kontur des Formkörpers (C) angepaßt ist. Der Stempel (E)
kann bevorzugt in dieser Lage, z. B. durch Einrasten, fixiert werden. Da die so gebildete
Vorrichtung durch den Deckel relativ gut verschlossen ist, kann die nukleinsäurehaltige
Lösung in der Vorrichtung aufbewahrt werden.
Zur Entnahme einer gewünschten Menge an Nukleinsäurelösung kann der Deckel entfernt
(XIII) und über eine Öffnung des Innenraums des Stempels die gewünschte Menge ent
nommen, z. B. in einem Pipettiervorgang (XIV). Anschließend kann der Deckel wieder auf
gesetzt werden.
Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein hohler Formkörper enthaltend eine zur Bindung
eines biologischen Materials fähige poröse Matrix (C 11) und Bauelemente (C 12, C 13) zur
Befestigung eines Deckels und eines den Formkörper zumindest teilweise umfassenden Ge
fäßes (D). Die Bauelemente (C 12 und C 13) stellen vorzugsweise Rastelemente dar, die das
Handling des Formkörpers erhöhen und das Zusammenspiel der einzelnen verwendeten
Module erleichtern.
Der erfindungsgemäße Formkörper kann auf einfache Weise durch spritzgußtechnische Ver
fahren hergestellt werden. Der Grundkörper besteht hierzu bevorzugt aus Kunststoffe wie
beispielsweise die Kunststoffe vom Polypropylen-Typ.
In Fig. 1 ist ein erfindungsgemäßer Formkörper im Längsschnitt gezeigt.
In Fig. 2 ist ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren gezeigt, welches das erfin
dungsgemäße Verfahren zur Bindung eines biologischen Materials an eine Festphase bein
haltet.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:
Der beispielhafte erfindungsgemäße Formkörper ist ein zylinderförmiges Kunststoff-
Röhrchen (Außendurchmesser = 6,75 mm, Innendurchmesser = 6,0 mm, Höhe = 40,4 mm,
Novolen 1100 UCX, hergestellt durch Spritzguß), dessen obere Einlaßöffnungs-Außen
wandung eine Einrastlippe (C 15) aufweist zur reversiblen Kopplung eines Deckels mit dem
Formkörper. Eine weitere Einrastlippe (C 13) befindet sich ca. 6 mm unterhalb der ersten
Einrastlippe. Sie wird für die irreversible Fixierung des Formkörpers im Elutionsgefäß (D)
benötigt. An der oberen Einlaßöffnung-Innenwandung befindet sich eine Einrastkerbe (C 17)
zur irreversiblen Fixierung eines Auspreßstempels E im Innenraum des Formkörpers.
Die Auslaßöffnung (= Röhrchen-Boden) wird mit einem Glasfaservlies (Durchmesser =
7,0 mm, Höhe 1,5 bis 3,0 mm) verschlossen.
Das Glasfaservlies wird nach oben über einen, an drei Stellen mit der Innenwandung des
Tubes verbundenen abreißbaren Ring (C 18) und von unten über eine Bördelkante fixiert.
Zur Minimierung des Totvolumens ist der abreißbare, umlaufende Ring vorteilhaft. Er er
füllt folgende Anforderungen: obere Fixierung der ein oder zwei Lagen Glasfaservlies; beim
Auspressen des Glasfaservlieses mit dem Auspreßdevice soll er abreißen und somit den
Zwischenraum minimieren. An der äußeren Fläche befinden sich Dichtungslippen (C 19),
welche das Abdichten zwischen Formkörper und Probengefäß (A) bzw. Elutionsgefäß (D)
übernehmen.
Bezugszeichenliste
A Probengefäß
10 Einlaßöffnung
11 Auslaßöffnung
17 innere Form
19 Außenform
22 Element zur Fixierung von weiteren Funktionselementen
B Deckel
10 Bauelement zum Verschließen des Probengefäßes A
11 Bauelement zum Ergreifen des Formkörpers C
C Formkörper
11 poröse Matrix
12 äußere Kontur
13 Mittel zur Fixierung des Formkörpers im Elutionsgefäß
14 Hohlkörper
15 Mittel zur Befestigung eines Deckels
16 innere Kontur
17 Mittel zur Fixierung eines Stempels E, umlaufend
18 umlaufender Steg, abbrechbar
19 Rand
D Elutionsgefäß
12 Einrastkerbe
E Stempel
10 Andrucksfläche
11 Außenkontur
12 Innenraum
13 Öffnungen in der Andrucksfläche
14 Entnahmeöffnung
15 Dichtung
16 Einrastring
17 Aussparung
10 Einlaßöffnung
11 Auslaßöffnung
17 innere Form
19 Außenform
22 Element zur Fixierung von weiteren Funktionselementen
B Deckel
10 Bauelement zum Verschließen des Probengefäßes A
11 Bauelement zum Ergreifen des Formkörpers C
C Formkörper
11 poröse Matrix
12 äußere Kontur
13 Mittel zur Fixierung des Formkörpers im Elutionsgefäß
14 Hohlkörper
15 Mittel zur Befestigung eines Deckels
16 innere Kontur
17 Mittel zur Fixierung eines Stempels E, umlaufend
18 umlaufender Steg, abbrechbar
19 Rand
D Elutionsgefäß
12 Einrastkerbe
E Stempel
10 Andrucksfläche
11 Außenkontur
12 Innenraum
13 Öffnungen in der Andrucksfläche
14 Entnahmeöffnung
15 Dichtung
16 Einrastring
17 Aussparung
Claims (13)
1. Verfahren zur Bindung eines biologischen Materials an eine Festphase durch
- - Bereitstellung einer das biologische Material enthaltenden Probenflüssigkeit in einem Probengefäß (A) mit einer inneren Kontur (A 17) und
- - Einbringen eines gegen das Probengefäß mit einer porösen Matrix (C 11) ver schlossenen, eine auf die innere Kontur (A 17) abgestimmte Kontur (C 12) auf weisenden und hohlen Formkörpers (C) in das Probengefäß (A), so daß Proben flüssigkeit durch die poröse Matrix (C 11) in den Formkörper (C) eindringt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Formkörper (C) an
schließend aus dem Probengefäß (A) entfernt wird.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die poröse Matrix (C 11)
zur Bindung des biologischen Materials befähigt ist.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das biologische
Material eine Nukleinsäure ist.
5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die restliche Proben
flüssigkeit vor Entfernen des Formkörpers (C) aus dem Probengefäß (A) abgesaugt
wird.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Formkörper (C) an
schließend in ein Gefäß (D) eingebracht wird, in dem das gebundene biologische
Material freigesetzt wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Einbringen des
Formkörpers (C) in das Probengefäß (A) mittels eines das Probengefäß (A) und den
Formkörper (C) in Richtung auf die Umgebung aerosoldicht verschließenden Deckels
(B)vorgenommen wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Kraft zur Lösung des
Deckels (B) vom Probengefäß (A) geringer ist als die Kraft zur Lösung des Deckels
(B) von dem Formkörper (C).
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Formkörper
Mittel (C 12) zur Fixierung des Formkörpers (C) in dem Gefäß (D) aufweist, die be
wirken, daß der Formkörper nur unter Zerstörung des Formkörpers (C) oder des Ge
fäßes (D) oder mit einer Kraft, die größer ist als die Kraft, die zur Lösung des Deckels
(B)vom Formkörper (C) erforderlich ist, aus dem Gefäß (D) entfernt werden kann.
10. Hohler Formkörper, enthaltend eine zur Bindung eines biologischen Materials fähige
poröse Matrix (C 11) und Bauelemente (C 13 und C 15) zur Befestigung eines Deckels
und eines den Formkörper zumindest teilweise umfassenden Gefäßes (D).
11. Formkörper nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß er auf die für das Gefäß
vorgesehene Seite hin mittels einer flüssigkeitsdurchlässigen porösen Matrix (C 11)
verschlossen ist.
12. Formkörper nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix (C 11) mit
Hilfe eines abbrechbaren umlaufenden Steges (C 18) in dem Innenraum (C 14) des
Formkörpers fixiert ist.
13. Formkörper nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix (C 11)
komprimierbar ist.
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1995112360 DE19512360A1 (de) | 1995-04-01 | 1995-04-01 | Verfahren zur Bindung eines biologischen Materials |
ES96104920T ES2181819T3 (es) | 1995-04-01 | 1996-03-28 | Procedimiento para la fijacion de un material biologico. |
DE59609585T DE59609585D1 (de) | 1995-04-01 | 1996-03-28 | Verfahren zur Bindung eines biologischen Materials |
EP96104920A EP0734768B1 (de) | 1995-04-01 | 1996-03-28 | Verfahren zur Bindung eines biologischen Materials |
NO19961270A NO316686B1 (no) | 1995-04-01 | 1996-03-29 | Fremgangsmate for, og innretning til, binding av et biologisk materiale til en fast fase, samt kombinasjon av et hult formlegeme og en probeholder |
JP08078899A JP3096422B2 (ja) | 1995-04-01 | 1996-04-01 | バイオロジカル・マテリアルを除去するための方法 |
US08/617,698 US6017698A (en) | 1995-03-31 | 1996-04-01 | Method of binding a biological material |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1995112360 DE19512360A1 (de) | 1995-04-01 | 1995-04-01 | Verfahren zur Bindung eines biologischen Materials |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19512360A1 true DE19512360A1 (de) | 1996-10-02 |
Family
ID=7758608
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1995112360 Withdrawn DE19512360A1 (de) | 1995-03-31 | 1995-04-01 | Verfahren zur Bindung eines biologischen Materials |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19512360A1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102004058828A1 (de) * | 2004-10-28 | 2006-06-14 | Directif Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur parallelen Aufbereitung von Biopolymeren |
-
1995
- 1995-04-01 DE DE1995112360 patent/DE19512360A1/de not_active Withdrawn
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE102004058828A1 (de) * | 2004-10-28 | 2006-06-14 | Directif Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur parallelen Aufbereitung von Biopolymeren |
DE102004058828B4 (de) * | 2004-10-28 | 2010-08-19 | Progen Biotechnik Gmbh | Vorrichtung und Verfahren zur parallelen Aufbereitung von Biopolymeren |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8127 | New person/name/address of the applicant |
Owner name: ROCHE DIAGNOSTICS GMBH, 68305 MANNHEIM, DE |
|
8141 | Disposal/no request for examination |