JP3130449B2 - サンプル中の核酸を処理する装置 - Google Patents

サンプル中の核酸を処理する装置

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、サンプル中の核酸を処
理する装置および該装置を操作するシステムに関する。
【０００２】
【従来の技術】核酸の分析においては、臨床化学および
臨床免疫学と比較すると、サンプル調製がきわめて重要
な役割をはたす。ポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第
４，６８３，１９５号明細書参照）や転写反応に基づく
増幅操作のような増幅操作が前述の分析の一部をなすば
あい、サンプル調製はとくに重要なステップである。核
酸の分析法は理論的に３つのステップに分けることがで
きる。すなわち、サンプルからえられる核酸を使用され
うるようにし、妨害サンプル成分から分離するサンプル
調製のステップ、つぎに核酸量を増加する増幅ステッ
プ、および生成した核酸を検出する検出ステップであ
る。
【０００３】最近では、核酸の分析のための有用な試
験、たとえば血液からのＨＩＶの検出は、化学的および
物理学的な一連の操作すべてを必要としている。それら
は遠心分離、デカンテーション、抽出を含む。このサン
プル調製の結果は、沈殿した核酸であり、この沈殿した
核酸は、増幅反応でのさらなる処理のために、のちに再
度溶解されている。
【０００４】欧州特許出願公開第０３８９０６３号明細
書には、サンプル調製ののちに核酸をゲルに結合すると
いう特別の変法が記載されている。また、この操作はサ
ンプル液体からゲル粒子を分離するためにいくつかの遠
心分離のステップからなっている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】核酸用サンプルを分析
するばあいの特有の問題は、空気を介する外部からのコ
ンタミネーションの危険であり、あるいはこの処理のた
めに用いられる装置によって持ち越される、外来の核酸
によるコンタミネーションの危険である。さらに、前述
の方法も、サンプル容器を繰り返し開閉しなければなら
ないので、とくにコンタミネーションを受けやすい。
【０００６】欧州特許第０３８１５０１号明細書には、
核酸の増幅と増幅産物の検出のための装置が記載されて
おり、そこでは増幅用の反応チャンバへサンプル標品が
ピペットで注入されている。増幅が完了すると、液体は
検出チャンバへと移送され、そのあいだ環境との接触は
排除されている。この装置は、増幅と検出のあいだのコ
ンタミネーションを避けるのに適しているかも知れない
が、欧州特許第０３８１５０１号明細書に記載の発明
は、核酸はいつもＰＣＲに直接用いられるわけではな
く、核酸を調製するステップにも付されなければならな
いということを無視している。
【０００７】したがって、先行技術の欠点を避け、とく
にコンタミネーションのない、単純な、核酸の処理のた
めの装置を提供することが本発明の目的である。
【０００８】
【課題を解決するための手段および作用】したがって、
本発明の主題はサンプルからの核酸の処理のための装置
であり、その装置は、サンプル調製のための第１の反応
チャンバと、核酸の増幅のための第２の反応チャンバと
からなる、サンプルから核酸を処理するための装置であ
って、該第１の反応チャンバと第２の反応チャンバとが
制御可能な輸送経路を介して接続され、該第１の反応チ
ャンバがサンプルから核酸を分離する磁気粒子を含み、
該輸送経路が３方分配エレメントを含み、該輸送経路の
うちの第１の経路および第２の経路が第１および第２の
反応チャンバのそれぞれに導かれ、該輸送経路のうちの
第３の経路が廃棄物の輸送のために確保され、該第２の
反応チャンバおよび第３の経路のそれぞれが、サンプル
の輸送を制御するための真空用連結ピースに接続され、
前記３方分配エレメントが、サンプル中の他のサンプル
成分から核酸を分離し第２の反応チャンバへ輸送するこ
とを許し、かつ前記３方分配エレメントが、精製された
核酸が第２の反応チャンバに運ばれるように、他のサン
プル成分が第２の反応チャンバに輸送されることを妨
げ、前記第１の反応チャンバに、非磁気相から磁気相を
分離するための磁気分離器が設けられ、前記第１の反応
チャンバおよび第２の反応チャンバのそれぞれが加熱さ
れることができることを特徴とする装置である。
【０００９】本発明の基礎をなす根本的な着想は、とく
に有利な方法でひとつの簡単な装置で行なわれるべき
の、サンプル調製のステップと核酸増幅のステップとを
結びつけることである。かかるステップの連結は今日に
至るまで記述されたことがない。
【００１０】核酸は、本発明において理解されるよう
に、一本鎖、二本鎖または多重鎖(multiple-strand)の
ＤＮＡおよびＲＮＡの両方のいかなるタイプの核酸をも
含む。これらの核酸はいかなる種類のサンプルに含有さ
れてもよく、とくに液体サンプルに含有されるのがよ
い。サンプルという用語は、物質の混合物と理解されう
るものを意味する。本発明の装置にそれらを使用する前
に、サンプルはある処理に付されてもよく、またはその
ままの状態、たとえば血液や尿のような体液の形態で直
接用いられてもよい。
【００１１】核酸の処理を必要とする異なる種類の方法
が存在する。それらは、核酸を含む有機体による感染を
検出するために必要であるような、サンプル中の核酸の
検出の方法を含む。しかしながら、いくつかの処理ステ
ップは、有機体の遺伝的状態を測定するための方法で行
なうこともできる。これらの方法のすべてには、一連の
処理ステップが必要である。核酸は、混合物の成分のな
かでもごく小さい部分を構成しているだけなので、他の
サンプル成分から核酸を分離することがしばしば必要で
ある。所望の分離または精製の程度は、処理全体のなか
で意図される用途に依存する。
【００１２】核酸の増幅は、核酸の処理において一般的
に知られているステップである。ポリメラーゼ連鎖反応
のように、核酸の増幅のためのいくつかの変法が存在す
る。核酸の増幅とは、基本的にin vitroでの増幅を意味
する。しかしながらin vivoでの増幅もまた原理的には
考えられる。
【００１３】本発明の主題は、ひとつの単一の装置にお
いて処理ステップの両方を結びつけることである。この
方法では、核酸は第１の反応チャンバの中で他のサンプ
ル成分から分離され、そして核酸は第２の反応チャンバ
の中で増幅される。本発明にしたがって、液体が一定時
間に第１から第２の反応チャンバへと輸送されるように
形成される、共通の輸送経路を介して両方の反応チャン
バが接続される。
【００１４】第１の反応チャンバにおいて核酸を分離す
る処理ステップは、用いられるサンプルの種類に依存し
て下記のステップにさらに分けることが可能な複合的な
操作である。これらのサブステップは、本発明にしたが
って互いに接続される１個以上の反応チャンバで行なわ
れてもよい。前記処理ステップは以下のサブステップか
らなることが可能である。
【００１５】（ａ）固体のまたは粘性のあるサンプルを
液化する。 （ｂ）細胞または細胞のコンパートメントのような核酸
を含有するコンパートメントを、一般に知られている適
切な方法により分離する。 （ｃ）細胞または細胞のコンパートメントのような、核
酸を含有するコンパートメントを適切な方法により増幅
する（たとえば、欧州特許出願公開第０２６０２８０号
明細書にしたがう）。 （ｄ）前述のコンパートメントから核酸を遊離する。 （ｅ）他のサンプル成分、とくには種々の増幅方法にお
いて阻害効果を有するもの、たとえばポリメラーゼ阻害
剤、から核酸を分離する。
【００１６】本発明にしたがえば、第１の反応チャンバ
におけるこれらの処理ステップのどれも遠心分離を含ま
ない。先行技術には可能な方法が記載され、酵素的分解
反応、免疫的吸着または被覆された磁気粒子の使用のよ
うな異なる固相系を有するさまざまな免疫化学的な方法
を含んでいる。核酸を分離することのできる方法は、フ
ィルタ材料への核酸の保持、反応チャンバ中に含まれる
シリカゲルまたはガラス粒子のような吸着体への核酸の
（非特異的な）固定化、または親和性材料のような生物
学的に特異的な吸着体への核酸の生物学的に特異的な固
定化を含む。このばあい、固相において根本的に相補的
な核酸とハイブリッドを形成するための核酸の性質が利
用されてもよい。
【００１７】核酸はまた、第１の反応チャンバ内におい
てクロマトグラフィーの操作により分離されてもよい。
核酸の分離とは別に、核酸のための付加的な処理のステ
ップ、たとえば核酸を含む細胞の濾過、これらの細胞の
溶解、または核酸の標識もまた第１反応チャンバ内にお
いて行なわれてもよい。本発明にしたがえば、ひとつの
ステップにおいて第１の反応チャンバ内で、欧州特許出
願公開第０３８９０６３号明細書にしたがって核酸の溶
解および固定化を行なうことが可能である。第１の反応
チャンバ中において行なわれる処理によって、加熱エレ
メントを反応チャンバに近接して設けてもよい。これは
細胞の溶解においてとくに可能である。
【００１８】前述のすべての方法においては、核酸の増
幅よりも先にコンタミネーションの危険と偽陽性の結果
をうる危険性がかなり高い。また、サンプル調製のため
に記述されるプロセスは全く多岐にわたる。本発明の重
要な主題は、したがって、高価でなく、モジュール式の
使い捨てのプラスチック製品を使用することであり、こ
のプラスチック製品は基本的に閉鎖系において多段階の
工程に用いうる。したがって装置自身はコンタミネーシ
ョンの危険なしに、少なくとも一つの反応チャンバ中に
試薬を加えることを許容する、いくつかの開口を設け
た、基本的に閉鎖系として存在する。本発明の第一の観
点において、前記装置は多数の応用および使用に用いら
れる多様な反応容器である。
【００１９】他のサンプル成分からの核酸の分離は、増
幅された核酸が前記反応チャンバに残る一方、他のサン
プル成分をともなう液体が第１の反応チャンバから取り
除かれるときに終わる。これを実現するために第１の反
応チャンバは、第１の反応チャンバへのサンプル採取の
開口のみならず追加の開口を、好ましくは前記反応チャ
ンバの底の、より低い部分に有し、そしてそれは以下、
バルブ開口と称する。好ましい方法でこのバルブ開口は
閉じられる。第１の反応チャンバにおいて前記サンプル
が利用可能になると普通すぐに前記バルブ開口は閉じら
れる。核酸から他のサンプル成分を分離するためにバル
ブ開口は必要とされるだけできるだけ長いあいだ開けら
れ、そして他のサンプル成分が取り除かれる。
【００２０】本発明において理解されるように、密閉す
るもの(closure)は、とくにバルブによる密閉であり、
そしてそのバルブによる密閉は第１の反応チャンバを外
側から真空にすることによって開けうるものである。第
１の反応チャンバ中の圧力に関して、より低い圧力を作
用させることによってそのサンプル成分は取り除かれ
る。もしこれらの成分がそれ以上の処理に付されないな
らそれらは捨てられ、好ましくは廃棄物用コンテナへと
輸送される。
【００２１】反応チャンバを満たすための開口、それは
好ましくは反応チャンバの上部の部分にあるが、コンタ
ミネーションの高い危険のゆえに自動的に操作できる適
当なふたによって閉じられねばならず、閉じるために必
要な見合った圧力補償(corresponding presure compens
ation)を与える必要がある。以下、本発明にしたがった
解決策を記述する。
【００２２】続いて、調製された核酸は、たとえば他の
サンプル成分から分離され、そして第２の反応チャンバ
へと輸送され、そこでそれらは増幅される。第１の反応
チャンバと第２の反応チャンバのあいだでさらなる精製
または、他の処理ステップのために追加の反応チャンバ
を有することもまた可能である。核酸は第１の反応チャ
ンバから溶液中に溶解することによって取り出される。
核酸の固定化の種類によって、試薬こう配をつけること
により、脱離を起こす物質により、または置換により、
これは達成することができる。好ましいプロセスは欧州
特許出願公開第０３８９０６３号明細書からとくに知ら
れる。
【００２３】核酸を含む液体は輸送経路を経て第２の反
応チャンバへと輸送される。本発明にしたがえば、この
輸送経路は制御しうることが好ましい。輸送経路が含ん
でいる制御しうる手段は、核酸を含む溶液が第２の反応
チャンバへと運ばれ、他のサンプル成分を含んでいる液
体を運ばないことを確保することを意味する。この制御
しうる手段はたとえば従来の３方コックという手段によ
って実現することができ、第１および第２の経路は第１
および第２のチャンバへとそれぞれ導かれており、第３
の経路は廃棄する経路である。他のサンプル成分をとも
なう液体が輸送経路を通って輸送されるべきときに、分
配エレメントは第１反応チャンバからの経路を廃棄経路
へと結びつけている。核酸を含んでいる溶液が第２反応
チャンバへと移送されるべきときに分配エレメントは第
１の反応チャンバからの経路が第２の反応チャンバへの
経路と接続されるように切りかえられる。液体の流れを
分ける追加的な可能性が知られている。分配エレメント
は好ましくは中央制御ユニットを介して制御され、その
結果、試薬の第１の反応チャンバへの追加、他の試薬成
分をともなう液体または核酸を含む溶液の輸送の誘導、
または分配エレメントの位置あわせを組み合わせること
ができる。
【００２４】増幅反応に用いられる第２の反応チャンバ
は、核酸溶液を追加するのに先立つか、または第２の反
応チャンバ中の核酸を含む溶液にこれらの試薬が開口を
経て加えられるかによって必要な試薬を含んでいる。好
ましい方法でコンタミネーションの危険を減少させるた
めのその開口は外部から閉じることができ、かつすべて
の増幅条件が調整されたのち直ちに閉じられる。のちに
さらなる試薬の追加が必要なばあい、この開口は再度開
けることができる。核酸の増幅の別の公知の可能性はた
とえば欧州特許出願公開第０２００３６２号明細書によ
ればＰＣＲである。この可能性が適用されるとき、第２
の反応チャンバは、すべての温度変化をそこで急速に実
現することができるように、好ましくは形成される。
【００２５】増幅反応ののち、反応混合物は第２の反応
チャンバ内でさらなる反応を実行するためにとどまるこ
とができ、または反応混合物はそこから除去されうる。
これは前述の閉じることのできる開口によってか、また
は第１の反応チャンバになされたと同様に第２の開口の
ための設備が設けられうる。
【００２６】核酸検出試験のために、たとえばドイツ特
許出願公開４３４４７４２号明細書に記載されるように
第２の反応チャンバにおいて、または追加の容器、たと
えば第３の反応チャンバの中へと移したのちに検出を実
行することができる。
【００２７】本発明の装置の個々の部品は原理的には知
られており、または容易に製造することができる。たと
えばそれらはチューブ(tube)を含んでおり、その底に低
い圧力をかけることによって開けることのできるバルブ
が備えつけられている。このばあいは、切り口を設けた
ゴム製の、唇の形をしたシーリングリップ(rubber seal
ing lip)であり、その中央が低い圧力の方向に伸び、チ
ューブの底の外部への排出の開口が露出される。低い圧
力をかけるのが終ったらそのゴム製シーリングリップ
は、はじめの位置へと急速にひき戻され外部への開口を
閉じる。
【００２８】前記チューブはプラスチックまたはガラス
製のような適した材料から作製することができる。前記
ゴム製シーリングリップは弾性ゴムまたは匹敵する弾性
材料から作製することができる。その材料は負の低い圧
力をかけて開けること、およびその逆もできる高い弾力
性のあるものでなければならない。
【００２９】製造は２つのステップにおいて達成するこ
とができる。すなわち、 （ａ）その底端部に突出部を設け、対応する形状をした
底面を提供するため射出成形という手段によってプラス
チックを加工する。 （ｂ）溶解法(melting process)で、その端にひだづけ
または、ふちまげ(crimp)した前記ゴム製シーリングリ
ップをはめこみ、このようにして前記底面に前記ゴム製
シーリングリップを取り付ける。
【００３０】制御しうる輸送経路は筒状部材を用いるこ
とができ、硬質のプラスチック製パイプであることも可
能である。分配エレメントは従来の３方分配エレメント
を用いることができる。第２の反応チャンバは実際には
試薬分析計から知られるいかなるチューブでも用いるこ
とができる。とくに有利な方法はバルブのような動く部
品または分配エレメントを除き、発明の装置が１個の単
一の部品に形成されることである。これは射出成形プロ
セスにおいて実施することができる。
【００３１】本発明の装置の利点は使いすて装置として
形成することができる点であり、すなわち核酸の分離お
よびその増幅ののち、および増幅された核酸を取り出し
たのちその装置は廃棄される。
【００３２】本発明の装置の別の可能な実施態様は、実
施されるべき処理の種類、用いられるサンプルの種類お
よび望ましい処理の種類によって、いかなる望ましい方
法ででも結合することのできる個別モジュールによって
装置が構成されることを提案できる。本発明において用
いられるモジュールは処理ステップのために備えられる
装置であるということを意味しており、そしてこのモジ
ュールは一連の処理ステップをたどるための他の装置に
簡単な方法で接続され組合わされることができる。本発
明の一観点において、装置は根本的に同一のデザインを
有するスナップ留め(snap-on)式のモジュールからな
り、それゆえそれは多段階の反応を許容する。この点に
ついて同一のデザインは、少なくとも２個のモジュール
が類似の外形形状を有しており、かつ排出開口をシール
する閉じブタを開けるための同一の原理を特徴とするこ
とを根本的に意味している。モジュールの反応チャンバ
の内容物に関して、モジュールの使用により大きな違い
がありうる。１個のモジュールは、たとえばフィルタフ
リース(filter fleece)を含みうるし、別の１個は細胞
の溶解のための試薬を含みうるし、しかもさらに別の１
個は細胞または核酸の固定化のための材料を含みうる。
この点に関して、スナップ留め式モジュールという用語
は、１個のモジュールの排出開口は別のモジュールの吸
入開口に、迅速にかつ液をもらさない(liquid-tight)方
法でとりつけることができるという意味で用いられてい
る。モジュールは反応チャンバおよび閉じブタの外側か
ら真空操作によって開けることのできる、液をもらさな
い閉じブタを有するものである。核酸を分離するため
に、モジュールはこの分離に必要な全ての材料および試
薬を含み、そしてまた増幅反応に必要な特有の試薬をも
含む。反応モジュールは分配モジュールを経て互いに結
合されることができる。分配モジュールは反応モジュー
ルと廃棄コンテナ、輸送経路と分配エレメントとを接続
するエレメントを含む。
【００３３】装置の内部において気体および、とくに液
体を輸送することは毛細管力または低圧／真空操作のど
ちらかを介して確保される。低圧の使用が好ましい。こ
れを達成するために廃棄物用コンテナおよび／または第
２の反応チャンバにわずかに低い圧力をかける。
【００３４】本発明の目的を達成するために、本発明の
装置はサンプル調製のための第１の反応チャンバと、輸
送経路を介して前記第１の反応チャンバと接続された、
核酸の増幅のための第２の反応チャンバとからなること
を特徴とする。
【００３５】前記装置が、少なくとも１つの試薬を少な
くとも１個の反応チャンバの中へと加えるために、コン
タミネーションの危険なしにいくつかの位置に開口され
うる密閉されたシステムであることが好ましい。
【００３６】サンプル調製として、サンプルの液化、核
酸の濃縮、核酸の放出、および連続する核酸の増幅を妨
害する物質からの核酸の分離のそれぞれのステップから
なる複数のステップまたはそれの結合が選択されてなる
ことが好ましい。
【００３７】前記第２の反応チャンバが、前記反応チャ
ンバからの反応混合物を除去するための開口を有してな
ることが好ましい。
【００３８】第１の反応チャンバが核酸を固定化する手
段を含んでなることが好ましい。
【００３９】前記輸送経路が、３方分配エレメントを含
み、１つの経路が前記第１および第２の反応チャンバの
それぞれに導かれており、第３の経路が廃棄物の輸送の
ために確保されてなることが好ましい。
【００４０】少なくとも１個の前記反応チャンバが加熱
されうることが好ましい。
【００４１】前記第２の反応チャンバが増幅反応のため
の試薬の添加用の開口を有してなることが好ましい。
【００４２】前記密閉されたシステムが使い捨てのモジ
ュールからなることが好ましい。
【００４３】前記密閉されたシステムが、本質的に同じ
デザインを有し、ともに差しこまれ、前記モジュールが
多段階の反応操作を可能とするいくつかのモジュールか
らなることが好ましい。
【００４４】低圧をかけることにより、少なくとも１個
の前記反応チャンバが空にされうることが好ましい。
【００４５】少なくとも１個の前記反応チャンバが、非
磁気相から磁気相を分離するための磁気分離器を備えて
なることが好ましい。
【００４６】密閉されたシステムが広い範囲の応用の多
様な反応容器として用いられることが好ましい。
【００４７】また本発明の装置は、核酸を処理するシス
テムにも適用しうる。
【００４８】前記核酸を処理するシステムは、１個また
はいくつかの、請求項１記載の装置からなる反応チャン
バからなることが好ましい。
【００４９】前記核酸を処理するシステムは、１個また
はいくつかの、第１および／または第２の反応チャンバ
に近接して位置づけられうる磁石を有する。
【００５０】またさらに、本発明の装置は、処理チャン
バと、閉じブタに真空操作することによって外部から開
けうる液をもらさない閉じブタとからなるモジュールに
も適用しうる。
【００５１】その場合、当該モジュールの閉じブタは、
前記処理チャンバの底に取り付けられたバルブであるこ
とが好ましい。
【００５２】
【実施例】以下、添付図面にしたがって本発明の装置を
説明する。
【００５３】図１（ａ）、（ｂ）は本発明の装置の製造
に用いることのできるモジュールを示す説明図である。
その図は、閉じることのできる底部の排出開口を設けた
反応チャンバ用のユニバーサルモジュール１を示してお
り、当該排出開口はそれぞれ、その閉じられた状態およ
び開いている状態で示されている。好ましい実施態様に
おいてユニバーサルモジュールはいくつかの排出開口３
と切り込みをつけられたゴム製シーリングリップ４を設
けた底２を有している。
【００５４】図１（ｃ）は、排出開口３を設けた底２、
および、スロット５を設けたゴム製シーリングリップ４
の上面図である。低圧をかけるばあい、ゴム製シーリン
グリップ４はこのようにしてスロット５を伸長させ、排
出開口３を解放する。図１（ｅ）は通気孔６を備えた、
上面開口部のためのフタの断面図である。図１（ｆ）と
図１（ｇ）に示された実施態様は、図１（ｆ）に示され
たペーパーフリースディスク７と図１（ｇ）に示され
た、切り込みをつけられたゴム製シーリングリップ８と
いうコンタミネーション防護部材が備えられている。
【００５５】図１（ｈ）は第１の反応チャンバのための
突出１０、廃棄物用コンテナのための突出１２、および
連続する配置における第２の反応チャンバ１４を備えら
れた第２のモジュール用の突出１３を設けられた分配エ
レメント９を示している。開口１５は、そこから試薬を
追加することができ、フタ１９を保持している。
【００５６】図１（ｉ）は第１の反応チャンバ１１およ
び第２の反応チャンバ１４、廃棄物用コンテナ１６、第
１および第２の反応チャンバのための加熱エレメント１
７、および第２の反応チャンバと廃棄物用コンテナのた
めの真空の発生に関する接続部品である真空用連結エレ
メント１８を有する本発明の装置を示している。図示さ
れたようにフタ１９は第２の反応チャンバの近辺にある
分配エレメント上に設けられる。スロットは第２の反応
チャンバへと、核酸の増幅のための試薬を追加させるこ
とを可能にするのに用いることができる。さらに、磁石
２０は（たとえば非磁気相から粒子を）たとえば免疫吸
着体という手段によって前述の細胞増幅(cell amplific
ation)のための増幅反応のあいだ、または、そののちに
磁気粒子を分離するのに用いることができることを示し
ている。
【００５７】平面配置におけるほかの実施態様が図１
（ｊ）に示されている。この図において分配エレメント
２１は溶液を分配エレメント中のフタの部分にまとめて
入れている。毛細管２２は第１の反応チャンバ１１中の
バルブが閉じられているときに第２の反応チャンバ１４
中に低圧を発生させることにより、第１の反応チャンバ
から第２の反応チャンバの中へと反応溶液を移すのに役
立つ。種々の反応中で生じうるいかなる廃棄物をも底部
の排出開口３を経て直接捨てることができる。図１
（ｉ）に示されたように加熱エレメントと磁気分離器を
含むことがまた可能である。
【００５８】図２は免疫的な細胞吸着のために用いられ
るべき標準モジュールからなるコンタミネーションのな
い反応チャンバの変更可能なデザインの他の例を示して
いる。図示された例において、フタ１９はモジュールを
閉め切っている。排出口となる突出１２、１３は真空に
されるので、圧力を補償するための追加の通気孔６がた
とえなくともモジュールからの液体の移送がすみやかに
終了するであろう。
【００５９】図３は免疫的吸着のための試薬を備えたモ
ジュールと、核酸の増幅反応を実行するためのモジュー
ルの結合をあらわす図式的な表現の図である。結合がう
まく適合しているなら本発明にしたがったモジュールは
それぞれの処理ステップに適用することができ、図１
（ａ）ないし図１（ｊ）に示されるように、単純な基本
モジュールからなる万能のシステムを与えるように見合
った(corresponding)加熱エレメントと磁気分離器を設
けることができる。
【００６０】図４は全血から核酸をサンプル調製し増幅
する、本発明の装置を示している。反応モジュール２３
中において溶解が実行される。必要な細胞は粗いフィル
タ２４をとおして残っている組織から分離される。その
細胞は通気孔６における圧力補償によって免疫吸着体２
５に付着される。その細胞はｐＨ２ないし３の範囲で緩
衝液とともに溶出し、その懸濁液は反応が行なわれるチ
ャンバ２６の中へと移され、そこで細胞が溶解される。
溶解物の全体はガラスフリースを含有するモジュール２
７の中へと移される。ついで核酸はこのフリースに吸着
される一方、他のすべてのサンプル成分が濾過液中に残
り、廃棄物とともに捨てられる。低イオン強度の緩衝液
とともに除去されたのち、核酸を含む液体が、増幅用の
チャンバ１４の中へと移される。前述の装置内において
液体の輸送は１個の単一の分配エレメント２８である多
重経路バルブ(multi-path valve)の手段によって低圧を
かけることによって通風という手段によって実現され
る。
【００６１】図５はエチレンジアミン四酢酸含有血液の
処理のための単一ユニット装置を示す。液体は廃棄物用
フリース２９の作用によって輸送される（重力とともに
作用する毛細管力によって）。プレインキュベーション
たとえば、酵素的液化および前述の溶血が第１の容器で
あるモジュール２３で起こる。このあとに免疫吸着体２
５が続く。そこで、核酸はそのとき、あとに続くガラス
フリースを含有するモジュール２７を経て固定化され、
他のサンプル成分から分離される。続いて、核酸を含む
溶液は増幅チャンバ１４の中へと移される。このばあ
い、分配エレメント２８は３方コックである。
【００６２】図６は、ＤＮＡまたはＲＮＡの検出のため
にＨＩＶを含有する全血を処理するための概略図であ
る。詳細については、図１についての記述で述べてい
る。さらに磁石２０が第１のモジュールに備えられてい
る。そのうえ、図は、増幅された核酸が従来技術の試験
管３０に移され、そこで検出が行なわれることを示して
いる。この図については実施例１により詳細に記載す
る。
【００６３】本発明の装置は、液体をピペットで注入す
る装置、請求項１の装置に続いて配設される装置および
請求項１の装置中の気体または液体の輸送を制御する装
置を含む、核酸処理用システムに適用することができ
る。液体をピペットで注入するのに用いられる装置はテ
ーキャン（Tecan、製造者名）によって製造されるよう
な従来のピペット装置を用いることができる。これらの
器具を用いて、サンプルおよび試薬貯蔵容器から核酸を
含有するサンプル液、および、できるかぎりすべての必
要な試薬の両者を本発明の装置の中へと移すことが可能
である。本発明の装置では、輸送は好ましくは低圧をか
けることによって制御される。これを達成するため、本
装置の接続開口部は低圧を発生することのできる部材に
連結されている。分配エレメントおよび／または低圧シ
ステムを制御することにより、個々の反応チャンバから
の液体の輸送を所望に応じて継続することが可能とな
る。
【００６４】本発明の別の主題は、つぎに示すステップ
においてサンプルから核酸を分離し、増幅する方法であ
る。
【００６５】−第１反応チャンバに核酸を固定化する。 −制御された輸送経路により、固定化された核酸から他
のサンプル成分を除去する。 −核酸を固定化し、核酸を含む液体を、制御しうる輸送
経路により第２の反応チャンバへと移す。 −第２の反応チャンバ内で核酸を増幅する。
【００６６】本発明の利点は、高度に融通のきくモジュ
ールの使用、コンタミネーションを最小にする可能性、
核酸の分析におけるサンプル調製の増幅の自動化を含
む。モジュールは、好ましくは使い捨て部品として設計
される。しかしながら、本発明のもっとも重要な利点
は、サンプル調製および増幅の際の、遠心分離を排除し
たことである。以下の実施例により、より詳細に本発明
を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるもの
ではない。
【００６７】実施例１ａ 全血中のＨＩＶ−ＤＮＡの測定（図６） ヒト抗体（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル
ズ（Boehringer Mannheim Biochemicals）社製、カタロ
グ番号８８１１７１）およびストレプタビジン−磁気粒
子（streptavidin-magnetic particle）（ダイナル（Dy
nal）社製、オスロ、ノルウェー）および全血からのＨ
ＩＶ−ＤＮＡを含む細胞を、ビオチン化抗ヘルパーＴ細
胞／ＣＤ４(anti-T-helper cells/CD4)によって、反応
用のモジュールであるユニバーサルモジュール１中にて
懸濁し、ついでインキュベートして第１の磁石２０を介
して保持する。真空用連結エレメント１８を介して廃棄
物用コンテナ１６を真空にすることによって、過剰の全
血を洗浄し、除去することができる。
【００６８】適切な緩衝系たとえば、ロルフス(Rolfs)
ら著（「ＰＣＲ、クリニカル・ダイアグノスティックス
・アンド・リサーチ(PCR：Clinical Diagnostics and R
esearch)」、スプリンガー・バーラッグ(Springer Verl
ag)発行（１９８２）８４頁およびそれ以降）にしたが
って、１％ローレス(Laureth)12または０．５％トウィ
ーン20を含む緩衝系にプロテイナーゼＫを添加するかま
たは、アンダーソン著（「ダイアグノスティック・モレ
キュラ・バイオロジー、プリンシパルズ・アンド・アプ
リケーションズ(Diagnostic Molecular Biology-Princi
pals and Applications)」、デー・エイチ・パーシング
(D.H.Persing)、ティー・エフ・スミス(T.F.Smith)、エ
フ・シー・テンオーバ(F.C.Tenover)およびティー・ジ
ェイ・ホワイト(T.J.White)編、アメリカン・ソサエテ
ィ・オブ・マイクロバイオロジー(American Society of
Microbiology)、インターナショナル・スタンダード・
ブック・ナンバー（ＩＳＢＮ）１−５５５８１−０５６
−Ｘ（１９９３）１９７〜２０２頁）にしたがって、ド
デシル硫酸ナトリウムを用いて適切な緩衝系にプロテイ
ナーゼＫを添加すると、第１の加熱エレメント１７の熱
処理によってまず、細胞は再懸濁され、溶解する。磁石
２０を介して磁気粒子を保持し、真空用連結エレメント
１８を真空にしたのち、反応混合物を反応モジュールで
あるチャンバ１４に移すことができる。
【００６９】続いて、ＰＣＲ試薬を自動的に開くフタ１
９を経て添加し、欧州特許出願公開第３２４４７４号明
細書にしたがって反応モジュールであるチャンバ１４の
加熱エレメント１７を介した熱サイクルを用いてＤＮＡ
を増幅することができる。そののち、プライマーがハイ
ブリダイゼーションする位置のあいだのＰＣＲ増幅産物
に相補的な、ビオチン化ＤＮＡ捕捉プローブを添加し、
反応モジュールであるチャンバ１４の加熱エレメント１
７を介して加熱することによりハイブリダイゼーション
を行なう。続いて、真空用連結エレメント３１を真空に
し、ＥＳ分析器（ベーリンガー・マンハイム・ゲーエム
ベーハー(Boehringer Mannheim GmbH)製、カタログ番号
１６０２８４５）を用いて、ストレプタビジン（ＳＡ）
で被覆された（ＥＳ）試験管(tube)３０（ベーリンガー
・マンハイム・ゲーエムベーハー製、カタログ番号１６
０２８４５）での検出反応に全反応混合物を付し、そし
てその結果を評価する。
【００７０】実施例１ｂ 欧州特許出願公開第３８９０６３号明細書にしたがっ
て、非特異的にＤＮＡを吸収する、シリカゲルを有する
ＧｕＳＣＮ緩衝液(silica gel with GuSCN buffer)と、
ＰＣＲ試薬とを置換するこの変法は、２段階の方法を提
案する。この方法を開始する前に、反応に用いるチャン
バ１４中に見合ったフィルタ層を挿入し、真空用連結エ
レメント３２を真空にすることにより過剰の物質を除去
する。低濃度の塩からなる緩衝液(low salt buffer)
（ブーム（Boom)ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・
マイクロバイオロジー（Journal of Clinical Microbio
logy)第２８巻３号（１９９０）４９６頁にしたがい、
１０ｍＭ トリス−塩酸塩−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０））により、核酸をシリカゲルから溶出し、引き
続きＰＣＲを行ない、他の中間のモジュールにおいてハ
イブリダイゼーションおよび検出を行なう（実施例１ａ
参照）。
【００７１】実施例２ 全血中のＨＩＶ−ＲＮＡの測定（図６） ロルフスら著（「ＰＣＲ、クリニカル・ダイアグノステ
ィック・アンド・リサーチ」、スプリンガー・バーラッ
グ発行（１９９２））にしたがって、ユニバーサルモジ
ュールにて全血を溶血に付す。続いて、ＳＡで被覆され
た磁気ビーズ（製造者は実施例１と同一）を介して、ビ
オチン化された抗ｇｐ１２０抗体（ヒツジ）（アールト
・バイオ・リージェンツ・リミテッド(Aalto Bio Reage
nts Ltd.)製、ダブリン、アイルランド）を加えること
によってウイルス粒子を分離する。そののち、それらを
実施例１ａまたは１ｂにしたがって処理するが、ここで
は、ウィルバー(Wilber)ら著、「ダイアグノスティック
・モレキュラ・マイクロバイオロジー、プリンシパルズ
・アンド・アプリケーションズ」、ディー・エイチ・パ
ーシング、ティー・エフ・スミス、エフ・シー・テンオ
ーバおよびティー・ジェー・ホワイト編、アメリカン・
ソサエティ・オブ・マイクロバイオロジー、インターナ
ショナル・スタンダード・ブック・ナンバー（ＩＳＢ
Ｎ）１−５５５８１−０５６−Ｘ（１９９３）３２７〜
３３１頁にと一致するよう、ＰＣＲとＲＮＡの増幅のた
めのＲＴ−ＰＣＲとを置き換える。
【００７２】実施例３ 組織の処理 レビン(Lewin)ら著、「メソッズ・イン・エンザイモロ
ジー(Methods in Enzymology)」第１７１巻、「バイオ
メンブレンズ(Biomembranes)」、エス・フライシェル
(S.Fleischer)およびビー・フライシェル(B.Fleischer)
編、アカデミック・プレス(Academic Press)発行、４４
４頁およびそれ以降、にしたがって、プロナーゼ−ＥＤ
ＴＡ法またはコラーゲナーゼ−プロナーゼ−ＥＤＴＡ法
により、反応モジュールであるユニバーサルモジュール
１において加熱エレメント１７によって３７℃まで熱処
理することにより、組織を個々の細胞にする。ガルシア
−ペレッツ(Garcia-Perez)ら著、「メソッズ・イン・エ
ンザイモロジー」第１７１巻、「バイオメンブレン
ズ」、エス・フライシェルおよびビー・フライシェル
編、アカデミック・プレス発行、５８１頁、にしたがう
特異的にビオチン化した細胞表面マーカーおよび磁気粒
子（製造者は実施例１と同一）によって、実施例１ａま
たは１ｂにしたがうＰＣＲに添加される特定の細胞を単
離し、精製する。
【００７３】実施例４ マイコバクテリア(mycobacteria)の診断のための唾液の
消化 ロルフスら著、（「ＰＣＲ、クリニカル・ダイアグノス
ティック・アンド・リサーチ」、スプリンガー・バーラ
ッグ発行（１９９２）７４頁およびそれ以降、に記載さ
れた方法による液化のために、唾液をＮ−アセチル−Ｌ
−システイン／水酸化ナトリウム溶液とともに、反応モ
ジュールであるユニバーサルモジュール１に加える。反
応は、加熱エレメント１７によってわずかに加熱するこ
とにより促進することができる。ガルシア・ペレッツら
著、「メソッズ・イン・エンザイモロジー」第１７１
巻、「バイオメンブレンズ」、エス・フライシェルおよ
びビー・フライシェル編、アカデミック・プレス発行５
８１頁、にしたがって作製されるマイコバクテリアの表
面マーカーに対する特異的ビオチン化抗体およびストレ
プタビジンで被覆された磁気粒子（製造者は実施例１と
同一）を用いることによって、原書の引用例に記載され
ている遠心分離のステップに取って代わることができ
る。そののち、特定の細胞を単離し、実施例３と同様に
処理する。
【００７４】実施例５ ＨＩＶ−ＤＮＡの検出における細胞単離用カラムクロマ
トグラフィー ＨＩＶを含むサンプルを添加する前に、反応モジュール
であるユニバーサルモジュール１にストレプタビジン結
合ブロモシアン活性化セファロース（ベーリンガー・マ
ンハイム社製のストレプタビジン、カタログ番号１０９
７６７９、「イムンヘミシェ・キャラクテリジールング
・デア・アーテーペー−シンセターゼ・フォン・エー・
コリカー１２(Immunchemische Charakterisierung der
ATP-Synthetase von E. coli K 12)」ゲー・ビエンハウ
ス、学位論文、ユニバーシティ・オブ・チュービンゲン
(G.Bienhaus, Dissertation, University of Tuebinge
n)６６頁（１９８０）に記載の方法）を充填する。つい
で実施例１ａにしたがって試薬を加える。反応が完了す
ると、ユニバーサルモジュール１に対応するフィルタ層
を挿入して、ゴム製シーリングリップの部分から真空と
することにより過剰の物質を分離する。
【００７５】実施例６ ＰＣＲに代わるＮＡＳＢＡの使用 ＰＣＲの代わりにＮＡＳＢＡ法（キャンジーン（Cangen
e）（出願人）、米国特許第５，１３０，２３９号明細
書）を用いることもまた可能であり、この方法において
は反応モジュールであるチャンバ１４にとりつけられた
加熱エレメント１７によって一定の温度が生じている。
【００７６】実施例７ ガラスフリースに代わるイオン交換クロマトグラフィー ガラスフリースに代わるイオン交換クロマトグラフィー
の変法１ｂのかわりにドイツ特許第４１３９６６４号明
細書にしたがって核酸を単離する、イオン交換クロマト
グラフィーを用いることもまた可能である。
【００７７】
【発明の効果】本発明の利点は、高度に融通のきく、モ
ジュールの使用、コンタミネーションを最小にする可能
性、核酸の分析におけるサンプル調製の増幅の自動化を
含む。モジュールは、好ましくは使い捨て部品として設
計される。しかしながら、本発明のもっとも重要な利点
は、サンプル調製の増幅の際に、遠心分離を排除したこ
とである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の装置を概略的に示す説明図である。
（ａ）ないし（ｇ）、（ｈ）および（ｊ）は装置の各部
分、（ｉ）は各部分を組立てた全体をそれぞれ示す説明
図である。
【図２】本発明のユニバーサルモジュールを概略的に示
す説明図である。
【図３】本発明のユニバーサルモジュール２個を接続し
た状態を概略的に示す説明図である。
【図４】本発明の単一ユニット装置を概略的に示す説明
図である。
【図５】本発明の単一ユニット装置を概略的に示す説明
図である。
【図６】本発明の装置を概略的に示す図１の拡大詳細図
である。
【符号の説明】 １ ユニバーサルモジュール ２ 底 ３ 排出開口 ４ ゴム製シーリングリップ ５ スロット ６ 通気孔 ７ ペーパーフリースディスク ８ スロットを設けたゴム製シーリングリップ ９、２１、 ２８ 分配エレメント １０、１２、 １３ 突出 １１、１４、 ２６ チャンバ １５ 開口 １６ 廃棄物用コンテナ １７ 加熱エレメント １８、３１、 ３２ 真空用連結エレメント １９ フタ ２０ 磁石 ２２ 毛細管 ２３、２７ モジュール ２４ 粗いフィルタ ２５ 免疫吸着体 ２９ 廃棄物用フリース ３０ 試験管
フロントページの続き (72)発明者 ゲルハルト ビーンハウス ドイツ連邦共和国、デー−82407 ヴィ ーレンバッハ、カルヴェンデルシュトラ ーセ １ (72)発明者 ハンス ランゲ ドイツ連邦共和国、デー−68623 ラン ペルトハイム、レーメルシュトラーセ 99デー (56)参考文献 特開 平１−201156（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−501959（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−507613（ＪＰ，Ａ) 国際公開93／22058（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 1/00 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 サンプル調整のための第１の反応チャン
    バと、核酸の増幅のための第２の反応チャンバとからな
    る、サンプルから核酸を処理するための装置であって、
    該第１の反応チャンバと第２の反応チャンバとが制御可
    能な輸送経路を介して接続され、該第１の反応チャンバ
    がサンプルから核酸を分離する磁気粒子を含み、該輸送
    経路が３方分配エレメントを含み、該輸送経路のうちの
    第１の経路および第２の経路が第１および第２の反応チ
    ャンバのそれぞれに導かれ、該輸送経路のうちの第３の
    経路が廃棄物の輸送のために確保され、該第２の反応チ
    ャンバおよび第３の経路のそれぞれが、サンプルの輸送
    を制御するための真空用連結ピースに接続され、前記３
    方分配エレメントが、サンプル中の他のサンプル成分か
    ら核酸を分離し第２の反応チャンバへ輸送することを許
    し、かつ前記３方分配エレメントが、精製された核酸が
    第２の反応チャンバに運ばれるように、他のサンプル成
    分が第２の反応チャンバに輸送されることを妨げ、前記
    第１の反応チャンバに、非磁気相から磁気相を分離する
    ための磁気分離器が設けられ、前記第１の反応チャンバ
    および第２の反応チャンバのそれぞれが加熱されること
    ができることを特徴とする装置。
  2. 【請求項２】 前記装置が使い捨てのモジュールからな
    る請求項１記載の装置。
  3. 【請求項３】 前記第１の反応チャンバおよび第２の反
    応チャンバのいずれかがフタによって閉じられうる請求
    項１記載の装置。
  4. 【請求項４】 前記装置が、免疫学的吸着または核酸の
    分解のための仕切を含む第３の反応チャンバをさらに含
    んでなる請求項１記載の装置。
  5. 【請求項５】 前記第３の反応チャンバが加熱手段を含
    んでなる請求項４記載の装置。
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