JPH08259603A - 部分ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖の合成方法 - Google Patents
部分ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖の合成方法Info
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- JPH08259603A JPH08259603A JP7060862A JP6086295A JPH08259603A JP H08259603 A JPH08259603 A JP H08259603A JP 7060862 A JP7060862 A JP 7060862A JP 6086295 A JP6086295 A JP 6086295A JP H08259603 A JPH08259603 A JP H08259603A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】アセチル基以外の置換または無置換のアシル基
またはカーバメート基でアミノ基が保護されているキト
サン小糖とＮ−アセチルキトサン小糖との混合物を酵素
的糖転移反応に付し、その生成物を選択的に脱アシル化
することを特徴とする部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ
糖の合成方法；および、置換または無置換のアシル基ま
たはカーバメート基でアミノ基が保護されているキトサ
ン小糖を酵素的糖転移反応に付し、その生成物を脱アシ
ル化することを特徴とするキトサンオリゴ糖の合成方法
を提供する。 【効果】所望のアセチル化度や最大分子量（重合度）を
有する目的生成物を、高収率で位置・立体選択的に合成
しうる方法である。
またはカーバメート基でアミノ基が保護されているキト
サン小糖とＮ−アセチルキトサン小糖との混合物を酵素
的糖転移反応に付し、その生成物を選択的に脱アシル化
することを特徴とする部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ
糖の合成方法；および、置換または無置換のアシル基ま
たはカーバメート基でアミノ基が保護されているキトサ
ン小糖を酵素的糖転移反応に付し、その生成物を脱アシ
ル化することを特徴とするキトサンオリゴ糖の合成方法
を提供する。 【効果】所望のアセチル化度や最大分子量（重合度）を
有する目的生成物を、高収率で位置・立体選択的に合成
しうる方法である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、部分Ｎ−アセチルキト
サンオリゴ糖およびキトサンオリゴ糖の合成方法に関す
る。
サンオリゴ糖およびキトサンオリゴ糖の合成方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】Ｎ−アセチルグルコサミンがβー１,４
−結合した多糖であるキチンは、βーグルカンと並ぶ病
原真菌の細胞壁主成分として知られている。そのキチン
のＮ−脱アセチル体である部分Ｎ−脱アセチルキチンや
キトサンの糖断片はエンドウエリシター活性を示すこと
が見いだされており、これまでに（＋）−２−ヒドロキ
シピサチン、（＋）−α,２',４,４'−テトラヒドロキ
シヒジドロカルコン、４,４'−ジヒドロキシー２'−メ
トキシカルコン、（−）−４',７−ジヒドロキシフラバ
ノンなどが抗微生物活性化合物として単離されている
（小林ら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７７
−７８（１９９３）；小林ら，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓ
ｃｈ．，４９ｃ等）。また、精製したキトサンオリゴ糖
二〜六糖とその部分Ｎ−アセチル化糖についてエリシタ
ー活性を検討した結果、部分Ｎ−アセチルキトサン六糖
に顕著な活性が見いだされ注目を浴びている（小林ら，
ＸＶ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｔａｎｉｃａ
ｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，ｐ３８
３，Ｙｏｋｏｈａｍａ（１９９３））。
−結合した多糖であるキチンは、βーグルカンと並ぶ病
原真菌の細胞壁主成分として知られている。そのキチン
のＮ−脱アセチル体である部分Ｎ−脱アセチルキチンや
キトサンの糖断片はエンドウエリシター活性を示すこと
が見いだされており、これまでに（＋）−２−ヒドロキ
シピサチン、（＋）−α,２',４,４'−テトラヒドロキ
シヒジドロカルコン、４,４'−ジヒドロキシー２'−メ
トキシカルコン、（−）−４',７−ジヒドロキシフラバ
ノンなどが抗微生物活性化合物として単離されている
（小林ら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７７
−７８（１９９３）；小林ら，Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓ
ｃｈ．，４９ｃ等）。また、精製したキトサンオリゴ糖
二〜六糖とその部分Ｎ−アセチル化糖についてエリシタ
ー活性を検討した結果、部分Ｎ−アセチルキトサン六糖
に顕著な活性が見いだされ注目を浴びている（小林ら，
ＸＶ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｔａｎｉｃａ
ｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ，ｐ３８
３，Ｙｏｋｏｈａｍａ（１９９３））。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】部分Ｎ−アセチルキト
サンオリゴ糖は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（Ｇｌ
ｃＮＡｃ）とグルコサミン残基（ＧｌｃＮ）からなるヘ
テロオリゴ糖である。この高重合度オリゴ糖の合成法と
して酸加水分解法や酵素加水分解法が考え得るが、これ
らの方法は収率が極めて低く実用的ではない。そこで、
位置・立体選択的で高収率である部分Ｎ−アセチルキト
サンオリゴ糖の合成法を開発することを目的として研究
を重ねた結果、発明者らは本願で開示する合成法を発明
するに至った。
サンオリゴ糖は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（Ｇｌ
ｃＮＡｃ）とグルコサミン残基（ＧｌｃＮ）からなるヘ
テロオリゴ糖である。この高重合度オリゴ糖の合成法と
して酸加水分解法や酵素加水分解法が考え得るが、これ
らの方法は収率が極めて低く実用的ではない。そこで、
位置・立体選択的で高収率である部分Ｎ−アセチルキト
サンオリゴ糖の合成法を開発することを目的として研究
を重ねた結果、発明者らは本願で開示する合成法を発明
するに至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本願では、アセチル基以
外の置換または無置換のアシル基またはカーバメート基
でアミノ基が保護されているキトサン小糖とＮ−アセチ
ルキトサン小糖との混合物を酵素的糖転移反応に付し、
その生成物を選択的に脱アシル化することを特徴とする
部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖の合成方法を開示す
る。
外の置換または無置換のアシル基またはカーバメート基
でアミノ基が保護されているキトサン小糖とＮ−アセチ
ルキトサン小糖との混合物を酵素的糖転移反応に付し、
その生成物を選択的に脱アシル化することを特徴とする
部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖の合成方法を開示す
る。
【０００５】この合成方法における「アセチル基以外の
置換または無置換のアシル基またはカーバメート基でア
ミノ基が保護されているキトサン小糖」と「Ｎ−アセチ
ルキトサン小糖」の使用比率は、目的生成物に望まれる
アセチル化度により１：３〜３：１の間で設定すること
ができる。Ｎ−アセチルキトサン小糖の使用比率を高く
すれば目的生成物のアセチル化度は高くなり、逆にＮ−
アセチルキトサン小糖の使用比率を低くすれば目的生成
物のアセチル化度は低くなる。他の反応条件を固定して
おけば、使用比率とアセチル化度の関係をグラフ化する
ことができ、それによって所望のアセチル化度を有する
目的生成物を合成することが可能になる。また、Ｎ−ア
セチルキトサン小糖の使用比率を高くすれば目的生成物
の最大分子量が大きくなることが確認されているので、
使用比率を制御することにより所望の最大分子量を有す
る目的生成物を合成することも可能である。
置換または無置換のアシル基またはカーバメート基でア
ミノ基が保護されているキトサン小糖」と「Ｎ−アセチ
ルキトサン小糖」の使用比率は、目的生成物に望まれる
アセチル化度により１：３〜３：１の間で設定すること
ができる。Ｎ−アセチルキトサン小糖の使用比率を高く
すれば目的生成物のアセチル化度は高くなり、逆にＮ−
アセチルキトサン小糖の使用比率を低くすれば目的生成
物のアセチル化度は低くなる。他の反応条件を固定して
おけば、使用比率とアセチル化度の関係をグラフ化する
ことができ、それによって所望のアセチル化度を有する
目的生成物を合成することが可能になる。また、Ｎ−ア
セチルキトサン小糖の使用比率を高くすれば目的生成物
の最大分子量が大きくなることが確認されているので、
使用比率を制御することにより所望の最大分子量を有す
る目的生成物を合成することも可能である。
【０００６】「アセチル基以外の置換または無置換のア
シル基またはカーバメート基でアミノ基が保護されてい
るキトサン小糖」のアシル基として、アセチル基以外の
置換または無置換のアシル基を広く用いることができ
る。ただし、ここで用いるアシル基は後に行う選択的脱
アシル化反応の際に脱アシル化しうるものでなければな
らない。そのようなアシル基として、フッ素、塩素、臭
素、ヨウ素などのハロゲン原子などで置換された炭素数
１−６のアシル基（但し、無置換のアセチル基を除く）
を挙げることができる。その中でも、モノクロロアセチ
ル基、ジクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基な
どが後に脱アシル化しやすい点で好ましい。最も好まし
いのは、構造的にアセチル基に類似しており糖転移効率
が良いモノクロロアセチル基である。また、カーバメー
ト基としては、−ＣＯＯＣＨ3、−ＣＯＯＣＨ2ＣＣ
ｌ3、−ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＯＯＣＨ＝ＣＨ2、
−ＣＯＯＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2を例示することができる。
シル基またはカーバメート基でアミノ基が保護されてい
るキトサン小糖」のアシル基として、アセチル基以外の
置換または無置換のアシル基を広く用いることができ
る。ただし、ここで用いるアシル基は後に行う選択的脱
アシル化反応の際に脱アシル化しうるものでなければな
らない。そのようなアシル基として、フッ素、塩素、臭
素、ヨウ素などのハロゲン原子などで置換された炭素数
１−６のアシル基（但し、無置換のアセチル基を除く）
を挙げることができる。その中でも、モノクロロアセチ
ル基、ジクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基な
どが後に脱アシル化しやすい点で好ましい。最も好まし
いのは、構造的にアセチル基に類似しており糖転移効率
が良いモノクロロアセチル基である。また、カーバメー
ト基としては、−ＣＯＯＣＨ3、−ＣＯＯＣＨ2ＣＣ
ｌ3、−ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｃｌ、−ＣＯＯＣＨ＝ＣＨ2、
−ＣＯＯＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2を例示することができる。
【０００７】本合成方法で用いるＮ−置換キトサン小糖
は、２〜３個のＮ−置換グルコサミン残基がβー１,４
−結合したものである。Ｎ−置換キトサン小糖は、当業
者に既知の方法に従ってキトサン小糖塩酸塩を置換また
は無置換のアシルハライドと反応させることによって得
ることができる。
は、２〜３個のＮ−置換グルコサミン残基がβー１,４
−結合したものである。Ｎ−置換キトサン小糖は、当業
者に既知の方法に従ってキトサン小糖塩酸塩を置換また
は無置換のアシルハライドと反応させることによって得
ることができる。
【０００８】「酵素的糖転移反応」は、Ｎ−置換キトサ
ン小糖を糖転移させる酵素の存在下で行う。例えば、β
ー１，４で立体特異的・位置選択的に糖転移させるリゾ
チーム（とくにニワトリ卵白リゾチーム）などを用いる
ことができる。リゾチームはキトサンオリゴ糖には作用
しないため、キトサンオリゴ糖のアミノ基をあらかじめ
保護して「アセチル基以外の置換または無置換のアシル
基またはカーバメート基でアミノ基が保護されているキ
トサン小糖」にしてから糖転移反応に供する。糖転移反
応によって、１分子中に複数種のアミノ保護基が存在す
るＮ−置換キトサンオリゴ糖が生成する。反応は、一般
に酢酸緩衝液、アセトン−酢酸緩衝液、硫酸アンモニウ
ム−酢酸緩衝液などの緩衝液中において、約４０℃〜約
６０℃で行う。この際、アセトン系の緩衝液を用いると
目的生成物のアセチル化度がほぼ出発物質の混合比率に
対応したものとなり、硫酸アンモニウム系の緩衝液を用
いるとアセチル化度が出発物質の混合比率よりもやや低
くなる。
ン小糖を糖転移させる酵素の存在下で行う。例えば、β
ー１，４で立体特異的・位置選択的に糖転移させるリゾ
チーム（とくにニワトリ卵白リゾチーム）などを用いる
ことができる。リゾチームはキトサンオリゴ糖には作用
しないため、キトサンオリゴ糖のアミノ基をあらかじめ
保護して「アセチル基以外の置換または無置換のアシル
基またはカーバメート基でアミノ基が保護されているキ
トサン小糖」にしてから糖転移反応に供する。糖転移反
応によって、１分子中に複数種のアミノ保護基が存在す
るＮ−置換キトサンオリゴ糖が生成する。反応は、一般
に酢酸緩衝液、アセトン−酢酸緩衝液、硫酸アンモニウ
ム−酢酸緩衝液などの緩衝液中において、約４０℃〜約
６０℃で行う。この際、アセトン系の緩衝液を用いると
目的生成物のアセチル化度がほぼ出発物質の混合比率に
対応したものとなり、硫酸アンモニウム系の緩衝液を用
いるとアセチル化度が出発物質の混合比率よりもやや低
くなる。
【０００９】「選択的脱アシル化」は、複数種のアミノ
保護基のうちアセチル基のみを残して他のアシル基を脱
保護する反応である。この選択的脱アシル化は、化学的
方法により行ってもよいし、酵素的方法により行っても
よい。グリコシル結合の解裂を避け効率的に脱保護を行
うために、塩基加水分解、接触水素添加、金属還元など
の方法を用いるのが好ましい。
保護基のうちアセチル基のみを残して他のアシル基を脱
保護する反応である。この選択的脱アシル化は、化学的
方法により行ってもよいし、酵素的方法により行っても
よい。グリコシル結合の解裂を避け効率的に脱保護を行
うために、塩基加水分解、接触水素添加、金属還元など
の方法を用いるのが好ましい。
【００１０】上記の合成方法は、部分Ｎ−アセチルキト
サンオリゴ糖を位置・立体選択的に簡便に合成できる点
で優れている。また、所望のアセチル化度や最大分子量
（重合度）を有する目的生成物を得ることが可能である
ため、その有用性は極めて高い。さらに上記の部分Ｎ−
アセチルキトサンオリゴ糖の合成方法は、完全に脱アシ
ル化したキトサンオリゴ糖の合成方法として応用するこ
とができる。すなわち、置換または無置換のアシル基ま
たはカーバメート基でアミノ基が保護されているキトサ
ン小糖を酵素的糖転移反応に付し、その生成物を脱アシ
ル化することによってキトサンオリゴ糖を合成すること
ができる。この方法において出発物質として用いるＮ−
置換キトサン小糖は単一種であっても複数種であっても
よく、これらのアミノ保護基は酵素的糖転移反応後の脱
アシル化により完全に脱保護される。使用する酵素反応
や条件は、部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖の合成方
法の場合と同様に設定することができる。このため、部
分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖の合成装置をそのまま
キトサンオリゴ糖の合成装置として用いることができる
点で極めて有益である。
サンオリゴ糖を位置・立体選択的に簡便に合成できる点
で優れている。また、所望のアセチル化度や最大分子量
（重合度）を有する目的生成物を得ることが可能である
ため、その有用性は極めて高い。さらに上記の部分Ｎ−
アセチルキトサンオリゴ糖の合成方法は、完全に脱アシ
ル化したキトサンオリゴ糖の合成方法として応用するこ
とができる。すなわち、置換または無置換のアシル基ま
たはカーバメート基でアミノ基が保護されているキトサ
ン小糖を酵素的糖転移反応に付し、その生成物を脱アシ
ル化することによってキトサンオリゴ糖を合成すること
ができる。この方法において出発物質として用いるＮ−
置換キトサン小糖は単一種であっても複数種であっても
よく、これらのアミノ保護基は酵素的糖転移反応後の脱
アシル化により完全に脱保護される。使用する酵素反応
や条件は、部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖の合成方
法の場合と同様に設定することができる。このため、部
分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖の合成装置をそのまま
キトサンオリゴ糖の合成装置として用いることができる
点で極めて有益である。
【００１１】これらの方法により合成した部分Ｎ−アセ
チルキトサンオリゴ糖やキトサンオリゴ糖には、すぐれ
た植物エリシター活性、植物培養細胞を用いた有用二次
代謝物生産における生合成系活性化作用、抗菌・抗カビ
活性、動物細胞抗腫瘍活性等の生理活性がある。とくに
重合度６以上のオリゴ糖には強い活性が見いだされてお
り、本願で開示した合成方法はこれらのオリゴ糖の効率
的で立体選択的な合成法として大いに産業上の利用価値
がある。
チルキトサンオリゴ糖やキトサンオリゴ糖には、すぐれ
た植物エリシター活性、植物培養細胞を用いた有用二次
代謝物生産における生合成系活性化作用、抗菌・抗カビ
活性、動物細胞抗腫瘍活性等の生理活性がある。とくに
重合度６以上のオリゴ糖には強い活性が見いだされてお
り、本願で開示した合成方法はこれらのオリゴ糖の効率
的で立体選択的な合成法として大いに産業上の利用価値
がある。
【００１２】
【実施例】以下に実施例および試験例を挙げて具体的に
説明する。
説明する。
【００１３】実施例１：部分Ｎ−アセチルキトサンオリ
ゴ糖の合成 水１００ｍｌとトリエチルアミン３０．３ｍｌ（２１５
ｍｍｏｌ）との混合液に溶解したキトサン三糖塩酸塩
２．６ｇ（４．２ｍｍｏｌ）を氷冷し、２〜５℃に保っ
た。この溶液に無水モノクロロ酢酸１７．３ｇ（１０１
ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液５０ｍｌを滴下し
た。１５分間撹拌した後、混合液を水２リットルで希釈
し、活性炭カラムに供した。カラムを水３リットルで洗
浄した後、アセトン２リットルで溶出した。アセトン溶
出液を減圧濃縮乾固することにより、Ｎ−モノクロロア
セチルキトサン三糖２．１７ｇ（３．０ｍｍｏｌ、収率
７１％）を得た。
ゴ糖の合成 水１００ｍｌとトリエチルアミン３０．３ｍｌ（２１５
ｍｍｏｌ）との混合液に溶解したキトサン三糖塩酸塩
２．６ｇ（４．２ｍｍｏｌ）を氷冷し、２〜５℃に保っ
た。この溶液に無水モノクロロ酢酸１７．３ｇ（１０１
ｍｍｏｌ）の１，４−ジオキサン溶液５０ｍｌを滴下し
た。１５分間撹拌した後、混合液を水２リットルで希釈
し、活性炭カラムに供した。カラムを水３リットルで洗
浄した後、アセトン２リットルで溶出した。アセトン溶
出液を減圧濃縮乾固することにより、Ｎ−モノクロロア
セチルキトサン三糖２．１７ｇ（３．０ｍｍｏｌ、収率
７１％）を得た。
【００１４】キトサン三糖塩酸塩９８８ｍｇ（１．６ｍ
ｍｏｌ）を５０％メタノール−水２０ｍｌに溶解し、こ
の溶液にバイオラッドＡＧ１−ｘ８（ＨＣＯ3 -）１０ｍ
ｌ（２５ｍｅｑ）を加え、氷冷し２〜５℃に保った。こ
れに無水酢酸２．５ｍｌ（２５．５ｍｍｏｌ）を滴下
し、氷冷下で２．５時間撹拌した。その後、濾過により
バイオラッドＡＧ１−ｘ８（ＨＣＯ3 -）を濾別し、濾液
を減圧濃縮乾固することによりＮ−アセチルキトサン三
糖７２３ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ、収率７５％）を得た。
ｍｏｌ）を５０％メタノール−水２０ｍｌに溶解し、こ
の溶液にバイオラッドＡＧ１−ｘ８（ＨＣＯ3 -）１０ｍ
ｌ（２５ｍｅｑ）を加え、氷冷し２〜５℃に保った。こ
れに無水酢酸２．５ｍｌ（２５．５ｍｍｏｌ）を滴下
し、氷冷下で２．５時間撹拌した。その後、濾過により
バイオラッドＡＧ１−ｘ８（ＨＣＯ3 -）を濾別し、濾液
を減圧濃縮乾固することによりＮ−アセチルキトサン三
糖７２３ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ、収率７５％）を得た。
【００１５】表１に示す濃度のＮ−モノクロロアセチル
キトサン三糖（化合物１）とＮ−アセチルキトサン三糖
（化合物２）を、０.１７％のニワトリ卵白リゾチーム
を含む緩衝液に加えて糖転移反応に付した。実施番号１
−３については５０％アセトン−０.１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４.０）中で４０℃１１２時間反応させ、実施番
号４−６については１５％飽和硫酸アンモニウム−０.
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４.０）中で６０℃５２時間反応
させた。反応により生成したＮ−置換キトサンオリゴ糖
を分離し、５Ｎ水酸化ナトリウムを用いて４０℃で２０
分間処理することによりモノクロロアセチル基を除去し
た。生成した部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖を1Ｈ
ＮＭＲ分析したところ図１に示すチャートが得られ、β
ー１,４−糖転移が起きていることが確認された（５０
０ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ中９０℃）。このチャートのＮ−アセ
チルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）とグルコサミン
残基（ＧｌｃＮ）のアノメリックプロトン シグナルの
面積を比較することによって、Ｎ−アセチル化度を決定
した。また、得られた部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ
糖の分子量を、完全Ｎ−アセチル化後に２,５−ジヒド
ロキシ安息香酸をマトリックスとするＭＡＬＤＩ ＴＯ
Ｆ ＭＳ分析に供することにより測定した。結果は以下
の表１に示すとおりであった。
キトサン三糖（化合物１）とＮ−アセチルキトサン三糖
（化合物２）を、０.１７％のニワトリ卵白リゾチーム
を含む緩衝液に加えて糖転移反応に付した。実施番号１
−３については５０％アセトン−０.１Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ４.０）中で４０℃１１２時間反応させ、実施番
号４−６については１５％飽和硫酸アンモニウム−０.
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４.０）中で６０℃５２時間反応
させた。反応により生成したＮ−置換キトサンオリゴ糖
を分離し、５Ｎ水酸化ナトリウムを用いて４０℃で２０
分間処理することによりモノクロロアセチル基を除去し
た。生成した部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖を1Ｈ
ＮＭＲ分析したところ図１に示すチャートが得られ、β
ー１,４−糖転移が起きていることが確認された（５０
０ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ中９０℃）。このチャートのＮ−アセ
チルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ）とグルコサミン
残基（ＧｌｃＮ）のアノメリックプロトン シグナルの
面積を比較することによって、Ｎ−アセチル化度を決定
した。また、得られた部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ
糖の分子量を、完全Ｎ−アセチル化後に２,５−ジヒド
ロキシ安息香酸をマトリックスとするＭＡＬＤＩ ＴＯ
Ｆ ＭＳ分析に供することにより測定した。結果は以下
の表１に示すとおりであった。
【００１６】
【表１】 この結果は、５０％アセトン−酢酸緩衝液を用いた場合
は出発物質の混合比率に対応したＮ−アセチル化度が得
られ、Ｎ−アセチルキトサン三糖の比が大きいほど最大
重合度が大きくなることを示している。得られたオリゴ
糖をクロマトグラフィー分析に供した結果、七糖以上の
オリゴ糖が主成分であることが確認された。
は出発物質の混合比率に対応したＮ−アセチル化度が得
られ、Ｎ−アセチルキトサン三糖の比が大きいほど最大
重合度が大きくなることを示している。得られたオリゴ
糖をクロマトグラフィー分析に供した結果、七糖以上の
オリゴ糖が主成分であることが確認された。
【００１７】実施番号２で得られた部分Ｎ−アセチルキ
トサンオリゴ糖３ｍｇの１．５ｍｌ水溶液に１０％亜硝
酸水溶液０．５ｍｌと３３％酢酸水溶液０．５ｍｌを加
え、室温で２時間静置した。これに炭酸水素ナトリウム
飽和水溶液を加え中和した後、ＳＢＨ１０ｍｇを加え
た。室温で３時間撹拌した後、過剰のＳＢＨを氷酢酸に
より分解し、続いて１０％酢酸−メタノールで３回、メ
タノールで４回で洗浄し、減圧濃縮操作を行うことによ
って、ＳＢＨの分解物であるホウ酸をメチルエステルと
して除去した。得られた生成物をＡＰＩ−ＭＳ、ＨＰＬ
Ｃで分析した結果、表２に示すように重合度１−４のＮ
−アセチルグルコサミンセグメントが存在することが確
認された。
トサンオリゴ糖３ｍｇの１．５ｍｌ水溶液に１０％亜硝
酸水溶液０．５ｍｌと３３％酢酸水溶液０．５ｍｌを加
え、室温で２時間静置した。これに炭酸水素ナトリウム
飽和水溶液を加え中和した後、ＳＢＨ１０ｍｇを加え
た。室温で３時間撹拌した後、過剰のＳＢＨを氷酢酸に
より分解し、続いて１０％酢酸−メタノールで３回、メ
タノールで４回で洗浄し、減圧濃縮操作を行うことによ
って、ＳＢＨの分解物であるホウ酸をメチルエステルと
して除去した。得られた生成物をＡＰＩ−ＭＳ、ＨＰＬ
Ｃで分析した結果、表２に示すように重合度１−４のＮ
−アセチルグルコサミンセグメントが存在することが確
認された。
【００１８】
【表２】 実施例２：キトサンオリゴ糖の合成 ０.１７％のニワトリ卵白リゾチームを含む緩衝液に、
Ｎ−モノクロロアセチルキトサン三糖（３４ｘ１０-3ｍ
ｏｌ／ｌ）を加えて以下の表３に示す条件下で糖転移反
応に付した。実施番号７および１０については０.１Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ４.０）、実施番号８については５０
％アセトン−酢酸緩衝液（ｐＨ４.０）、実施番号９お
よび１１については１５％飽和硫酸アンモニウム−酢酸
緩衝液（ｐＨ４.０）を用いた。反応により生成したＮ
−モノクロロアセチルキトサンオリゴ糖の白色沈殿を分
離し、５Ｎ水酸化ナトリウムを用いて４０℃で２０分間
処理することによりモノクロロアセチル基を除去した。
生成したキトサンオリゴ糖を1Ｈ ＮＭＲ分析したところ
図２に示すチャートが得られ、βー１,４−糖転移が起
きていることが確認された（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ中９
０℃）。また、生成したキトサンオリゴ糖の重合度を、
２,５−ジヒドロキシ安息香酸をマトリックスとするＭ
ＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳにより測定した。結果は以下の表
３に示すとおりであった。
Ｎ−モノクロロアセチルキトサン三糖（３４ｘ１０-3ｍ
ｏｌ／ｌ）を加えて以下の表３に示す条件下で糖転移反
応に付した。実施番号７および１０については０.１Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ４.０）、実施番号８については５０
％アセトン−酢酸緩衝液（ｐＨ４.０）、実施番号９お
よび１１については１５％飽和硫酸アンモニウム−酢酸
緩衝液（ｐＨ４.０）を用いた。反応により生成したＮ
−モノクロロアセチルキトサンオリゴ糖の白色沈殿を分
離し、５Ｎ水酸化ナトリウムを用いて４０℃で２０分間
処理することによりモノクロロアセチル基を除去した。
生成したキトサンオリゴ糖を1Ｈ ＮＭＲ分析したところ
図２に示すチャートが得られ、βー１,４−糖転移が起
きていることが確認された（５００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ中９
０℃）。また、生成したキトサンオリゴ糖の重合度を、
２,５−ジヒドロキシ安息香酸をマトリックスとするＭ
ＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳにより測定した。結果は以下の表
３に示すとおりであった。
【００１９】
【表３】 この結果は、反応温度を６０℃に上げ、反応系に硫酸ア
ンモニウムを添加することによって収率が向上すること
を示している。また、得られたオリゴ糖をクロマトグラ
フィー分析に供した結果、七糖以上のオリゴ糖が主成分
であることが確認された。
ンモニウムを添加することによって収率が向上すること
を示している。また、得られたオリゴ糖をクロマトグラ
フィー分析に供した結果、七糖以上のオリゴ糖が主成分
であることが確認された。
【００２０】試験例：エンドウエリシター活性の検討 上記実施例１の実施番号４、５、６で得られた部分Ｎ−
アセチルキトサンオリゴ糖と、上記実施例２の実施番号
１１で得られたキトサンオリゴ糖を、それぞれ６.２５
から１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で以下の手順でエンド
ウ上胚軸エンドエリシターアッセイに供した。
アセチルキトサンオリゴ糖と、上記実施例２の実施番号
１１で得られたキトサンオリゴ糖を、それぞれ６.２５
から１００μｇ／ｍｌの濃度範囲で以下の手順でエンド
ウ上胚軸エンドエリシターアッセイに供した。
【００２１】７０％エタノールで５分、５％過酸化水素
で滅菌したエンドウ種子を、φ２５ｘ２００ｍｍの試験
管中にて０．１％塩化マグネシウム、ジェランガム０．
２％固形培地上２４℃、暗黒で１０日間無菌的に生育さ
せた。エンドウ実生の上胚軸から無菌的に約５ｍｍの長
さの切片を切り出し、あらかじめオートクレーブ滅菌
（１２１℃、５分）したサンプル水溶液１ｍｌに浸漬し
た。これを２４℃、暗黒下で垂直回転培養した。７２時
間後、メタノール５ｍｌを加え、ソニックで１０分間抽
出した。抽出液を減圧濃縮乾固し、メタノール５００μ
ｌに溶解し、５０μｌをＨＰＬＣ分析に供し、誘導され
たピサチン量を定量した。
で滅菌したエンドウ種子を、φ２５ｘ２００ｍｍの試験
管中にて０．１％塩化マグネシウム、ジェランガム０．
２％固形培地上２４℃、暗黒で１０日間無菌的に生育さ
せた。エンドウ実生の上胚軸から無菌的に約５ｍｍの長
さの切片を切り出し、あらかじめオートクレーブ滅菌
（１２１℃、５分）したサンプル水溶液１ｍｌに浸漬し
た。これを２４℃、暗黒下で垂直回転培養した。７２時
間後、メタノール５ｍｌを加え、ソニックで１０分間抽
出した。抽出液を減圧濃縮乾固し、メタノール５００μ
ｌに溶解し、５０μｌをＨＰＬＣ分析に供し、誘導され
たピサチン量を定量した。
【００２２】アッセイ結果は図３に示すとおりであっ
た。実施番号４および５の部分Ｎ−アセチルキトサンオ
リゴ糖は６．２５〜１２.５μｇ／ｍｌですでに有意な
（＋）−ピサチン誘導活性を示し、２５μｇ／ｍｌで上
胚軸褐変化誘導活性が確認された。また、実施番号１１
のキトサンオリゴ糖は５０μｇ／ｍｌにおいて（＋）−
ピサチン誘導活性を示し、１００μｇ／ｍｌで上胚軸褐
変化誘導活性を示した。
た。実施番号４および５の部分Ｎ−アセチルキトサンオ
リゴ糖は６．２５〜１２.５μｇ／ｍｌですでに有意な
（＋）−ピサチン誘導活性を示し、２５μｇ／ｍｌで上
胚軸褐変化誘導活性が確認された。また、実施番号１１
のキトサンオリゴ糖は５０μｇ／ｍｌにおいて（＋）−
ピサチン誘導活性を示し、１００μｇ／ｍｌで上胚軸褐
変化誘導活性を示した。
【００２３】同様にしてインゲン子葉に対するエリシタ
ー活性をファイトアレキシンであるキービトンの蓄積量
を指標にアッセイした結果を図４に示した。実施番号４
および５の部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖は強い活
性を示したが、実施番号１１のキトサンオリゴ糖はほと
んど活性を示さなかった。
ー活性をファイトアレキシンであるキービトンの蓄積量
を指標にアッセイした結果を図４に示した。実施番号４
および５の部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖は強い活
性を示したが、実施番号１１のキトサンオリゴ糖はほと
んど活性を示さなかった。
【図１】合成部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖の1Ｈ
ＮＭＲ分析結果（実施例１）を示す。
ＮＭＲ分析結果（実施例１）を示す。
【図２】合成キトサンオリゴ糖の1Ｈ ＮＭＲ分析結果
（実施例２）を示す。
（実施例２）を示す。
【図３】部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖およびキト
サンオリゴ糖の濃度と（＋）−ピサチン誘導活性の関係
を示す（試験例）。
サンオリゴ糖の濃度と（＋）−ピサチン誘導活性の関係
を示す（試験例）。
【図４】部分Ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖およびキト
サンオリゴ糖の濃度と（＋）−キービトン誘導活性の関
係を示す（試験例）。
サンオリゴ糖の濃度と（＋）−キービトン誘導活性の関
係を示す（試験例）。
Claims (3)
- 【請求項１】Ｎ−アシルキトサンオリゴ糖（但し、アシ
ル基は置換されていてもよく、アシル基の一部はアセチ
ル基である）のアセチル基以外のアシル基を選択的に脱
アシル化することを特徴とする部分Ｎ−アセチルキトサ
ンオリゴ糖の合成方法。 - 【請求項２】アセチル基以外の置換または無置換のアシ
ル基またはカーバメート基でアミノ基が保護されている
キトサン小糖とＮ−アセチルキトサン小糖との混合物を
酵素的糖転移反応に付し、その生成物を選択的に脱アシ
ル化することを特徴とする部分Ｎ−アセチルキトサンオ
リゴ糖の合成方法。 - 【請求項３】置換または無置換のアシル基またはカーバ
メート基でアミノ基が保護されているキトサン小糖を酵
素的糖転移反応に付し、その生成物を脱アシル化するこ
とを特徴とするキトサンオリゴ糖の合成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7060862A JPH08259603A (ja) | 1995-03-20 | 1995-03-20 | 部分ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖の合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7060862A JPH08259603A (ja) | 1995-03-20 | 1995-03-20 | 部分ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖の合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08259603A true JPH08259603A (ja) | 1996-10-08 |
Family
ID=13154629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7060862A Pending JPH08259603A (ja) | 1995-03-20 | 1995-03-20 | 部分ｎ−アセチルキトサンオリゴ糖の合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08259603A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106008750A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-10-12 | 上海宇昂水性新材料科技股份有限公司 | 一种低分子量壳聚糖的制备方法 |
| CN114544788A (zh) * | 2020-11-25 | 2022-05-27 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种不同乙酰化位点壳寡糖异构体的色谱分离方法 |
-
1995
- 1995-03-20 JP JP7060862A patent/JPH08259603A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106008750A (zh) * | 2016-07-29 | 2016-10-12 | 上海宇昂水性新材料科技股份有限公司 | 一种低分子量壳聚糖的制备方法 |
| CN114544788A (zh) * | 2020-11-25 | 2022-05-27 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种不同乙酰化位点壳寡糖异构体的色谱分离方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060531 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20061004 |