JPH08225463A - ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の可溶化方法 - Google Patents

ボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の可溶化方法

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JPH08225463A
JPH08225463A JP7333413A JP33341395A JPH08225463A JP H08225463 A JPH08225463 A JP H08225463A JP 7333413 A JP7333413 A JP 7333413A JP 33341395 A JP33341395 A JP 33341395A JP H08225463 A JPH08225463 A JP H08225463A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】本発明はボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の可溶
化方法を提供することを目的とする。 【解決手段】本発明のボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の
可溶化方法は、ボルデテラ属細菌培地中で生成する蛋白
質抗原を可溶化するにあたり、上記蛋白質抗原を沈殿又
は凍結乾燥品の形で、１重量％未満の界面活性剤を添加
したpH8.3〜11.6の炭酸塩緩衝液中で可溶化することを
特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は無細胞ワクチンを得るこ
とを目的とするボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の可溶化
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び解決すべき課題】ボルデテラ属細菌、
例えば百日咳菌（ボルデテラ・パータッシス(Bordetell
apertusis)、パラ百日咳菌（ボルデテラ・パラパータッ
シス(Bordetellaparapertusis)及び気管支敗血症菌（ボ
ルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetellabronchiseptic
a)の培養により、F-HA（線状血球凝集素(FilamentousHe
magglutin)を産生し得ることは公知である。また、百日
咳菌の培養により蛋白質外毒素:パータッシス毒素[LPF
又はLPF-HA（白血球増多症促進因子-血球凝集素:Leukoc
ytosis Promoting Factor Hemagglutin)とも呼ばれる]
も生ずる。
【０００３】ボルデテラ属細菌は公知の病原菌である。
特に、百日咳菌は百日咳の病原菌であることまたその工
業的培養が百日咳ワクチンの産生に利用されていること
は公知である。
【０００４】また、パータッシス毒素抗原及びF-HAが無
細胞の百日咳ワクチンの組成物中で有利に使用し得るこ
とは公知である。
【０００５】パータッシス毒素の精製は一般にアフィニ
テイー・クロマトグラフィーによる精製工程を包含して
いる。
【０００６】アフィニテイークロマトグラフィーの担体
からのパータッシス毒素の溶出は、一般に、高濃度の塩
及び/又はカオトロピック薬剤又は変性剤例えば塩化マ
グネシウム、尿素、チオシアン酸ナトリウム又はカリウ
ム、グアニジン塩酸塩などを含んでいる緩衝液によって
行われる。しかしながら、これらの物質の存在下におい
て得られた有効成分はそのままではワクチンの調製に利
用できない。従って、毒素含有溶出液について、更に、
カオトロピック薬剤の完全な除去及び/又は塩濃度の低
減を目的とする補足的工程を行わなければならない。こ
の補足的工程は例えば徹底的な透析又はゲル濾過を行う
ことからなる（例えば米国特許第4,500,639号明細書及
び欧州特許出願第0140386号明細書参照）。
【０００７】そのほかに、これらの溶出方法の利用には
一般に有効成分の部分的かつ非可逆的な不溶化が伴う。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は特殊な緩衝溶液
を利用するパータッシス毒素の可溶化に関する。この緩
衝液を利用することにより、アフィニテイークロマトグ
ラフィー担体からパータッシス毒素を溶出させ得る。該
緩衝液を利用することにより単一の工程でかつ高い収率
でパータッシス毒素を溶出させ、従って、また精製し得
る。更に、上記緩衝液に界面活性剤を添加したものを利
用することにより、パータッシス毒素及びF-HAの損失を
伴うことなしに、これらを可溶化できる。この緩衝液は
またパータッシス毒素の無毒化(detoxification)法にお
いて溶媒の役割を果し、アナトキシンを溶液中に維持す
ることもできる。
【０００９】そのほか、通常用いられる緩衝液とは異な
って、本発明の特殊な緩衝液はワクチン製剤と両立でき
る。換言すれば、この緩衝液中に溶解している抗原は直
接ワクチンの調製に利用できる。
【００１０】従って本発明は、ボルデテラ属細菌培地中
で生成する蛋白質抗原を可溶化するにあたり、上記蛋白
質抗原を沈殿又は凍結乾燥品の形で、１重量％未満の界
面活性剤を添加したpH8.3〜11.6の炭酸塩緩衝液中で可
溶化することを特徴とするボルデテラ属細菌の蛋白質抗
原の可溶化方法を提供することを目的とする。
【００１１】この種の緩衝液は従来の方法、例えばアル
カリ金属（アルカリ金属はナトリウム又はカリウムであ
る）の重炭酸塩（炭酸水素塩）と炭酸塩との混合物の水
溶液を調製するか又はアルカリ金属（ナトリウム又はカ
リウム）水酸化物の水溶液とアルカリ金属炭酸水素塩の
水溶液との混合により調製し得る。炭酸塩緩衝液のモル
濃度は0.025〜0.5Mであることが望ましい。
【００１２】本発明に用いられる炭酸塩緩衝液は界面活
性剤として例えばトウィーン80(Tween 80、ポリオキシ
エチレン(20)モノオレイン酸ソルビタンの商品名）のご
とき非イオン系界面活性剤を含むことができる。
【００１３】緩衝液中の界面活性剤の濃度は通常、１重
量％未満、多くの場合、0.5 重量％未満である。
【００１４】本発明に従って炭酸塩緩衝液を用いること
により以下に述べる通りの利点が得られる。
【００１５】炭酸塩緩衝液はアフィニテイークロマトグ
ラフィー担体からパータッシス毒素を溶出させることが
できる。クロマトグラフィーにかける液体はボルデテラ
属細菌培地の上澄液でもよく、パータッシス毒素が富化
されているフラクションでもよい。
【００１６】無細胞ワクチンにおいてはパータッシス毒
素を使用する場合には、予め無毒化処理例えばホルモー
ル又はグルタルアルデヒドを用いる処理を行う必要があ
ることは公知である。無毒化は特にマウスのリンパ球増
多症導入の効果、ヒスタミンに対する鋭敏化、ADP-リボ
シルトランスフェラーゼ活性、CH0（チャイニーズハム
スター卵巣）細胞に及ぼす細胞病原効果などを排除する
ことを目的とする。
【００１７】この種の無毒化、例えばホルモールによる
無毒化は毒素を不溶化し、これが均質な精製された調剤
の取得を困難にする（例えば米国特許第4455297号明細
書参照）。
【００１８】場合により界面活性剤を添加した炭酸塩緩
衝液を使用することにより、溶液中での無毒化処理の実
施及び得られたアナトキシンを溶液中に維持することが
可能になる。
【００１９】最後に、前述した通りアナトキシンパータ
ッシスの炭酸塩緩衝液中の溶液は、直接、無細胞ワクチ
ンの調製に使用し得る。
【００２０】更に、炭酸塩緩衝液（場合によりトウィー
ン80のごとき非イオン系界面活性剤を添加したもの）は
F-HAを溶液とするのに有利に作用する。
【００２１】ボルデテラ属細菌の培地中で生成する蛋白
質抗原は、培地上澄液又はパータッシス毒素が富化され
ているフラクションを、パータッシス毒素を固定し得る
クロマトグラフィー固体担体と接触させ、次に毒素を該
固体担体から、pH8.3〜11.6の炭酸塩緩衝液により溶出
することにより精製し得る。
【００２２】特殊な実施形式においては、pHを６〜８、
望ましくは７に調節した後に、培地上澄液又はパータッ
シス毒素が富化されているフラクションを、パータッシ
ス毒素に対して親和力のあるグリコプロテイン、特に、
アシアログリコプロテイン（例えばアシアロフェチュイ
ン）を固体クロマトグラフィー担体に結合したものと接
触させる。使用するクロマトグラフィー担体の量は出発
溶液の容積及び/又は精製すべきフラクション中のパー
タッシス毒素の濃度によって変動する。接触は２〜30℃
のカラム内温度において行われる。
【００２３】パータッシス毒素に対して親和力のあるグ
リコプロテインは公知である：例えばハプトグロビン、
フェチュインなどが挙げられる。しかしながら、アフィ
ニテイー・クロマトグラフィーを、予め脱シアル酸(des
ialylation)処理を施したこれらの蛋白質に行うことが
好ましい；この脱シアル酸処理は公知の方法に従って穏
和な酸性加水分解によって行われる（例えばSpiroほ
か、J.Biol.chem.1974,249,5704-5717参照）。
【００２４】グリコプロテイン又は脱シアル酸処理した
グリコプロテイン（アシアログリコプロテイン）の結合
(coupling)は公知の方法に従って行うことができる。担
体はアフィニテイー・クロマトグラフィーにおいて通常
用いられる従来の任意の固体担体であり得る。
【００２５】担体は特にセルロース誘導体、架橋デキス
トラン、アガロースゲル又はセファロース4B(Sepharose
-4B)などの多糖類(polyosidique)誘導体又はIBF社(Indu
strtie Biologique Rrancaise)から市販のトリスアクリ
ル(Trisacryl)などのアクリル誘導体基質の担体であ
る。
【００２６】グリコプロテインは例えばCNBrで活性化さ
れた担体を用いて担体上に固定できる。
【００２７】担体はまた架橋DEAEデキストランで被覆し
た多孔質シリカ担体であり得る。例えばDEAEデキストラ
ンで被覆したスフェロシル(Spherosil)が使用できる。
【００２８】溶出後、パータッシス毒素は、例えば飽和
濃度の50〜80％の硫酸アンモニウムにより沈殿させるか
又は直接に無毒化工程で処理することができる。
【００２９】かくして精製した毒素は硫酸アンモニウム
を用いて生成させた沈殿又は凍結乾燥品の形で保存し得
る。沈殿又は凍結乾燥品はトウィーン80のごとき界面活
性剤を約0.05〜0.5％の最終濃度で含有し得る、pH8.3〜
11.6のかつモル濃度が25mMを越える炭酸塩緩衝液、望ま
しくはトウィーン80を0.05％含有する、pH9.6、100mMの
炭酸塩緩衝液（以下、緩衝液CTW という）に溶解させる
ことができる。
【００３０】残存硫酸アンモニウム又は凍結乾燥担体を
除去する目的で、温度２〜30℃の倍数の容積の同じ緩衝
液に対して、溶液の透析を４〜72時間の持続時間行う。
緩衝液の組成により完全な可溶化ができる。溶液は孔径
0.22μmの膜で濾過できる。これにより、無菌環境中で
の無毒化工程又は有効成分の完全な可溶化が必要である
か又はこれを容易にする化学的又は生物学的実験の実施
を行うことを可能にするという利点が得られる。
【００３１】パータッシス毒素の無毒化が行われる場合
には一般に毒素について用いられる方法と同様にして行
われる。無毒化の方法は上述した通りの炭酸塩緩衝液で
あって、望ましくは、毒素の可溶化と無毒化工程の実施
中、該毒素を溶液中に維持することに有利に作用する界
面活性剤を含有する炭酸塩緩衝液中にで行われる。かく
して無毒化工程の収率は100％に近いものとなる。用い
られる無毒化剤は例えばホルモール又はグルタルアルデ
ヒドである。
【００３２】例えば、温度４〜40℃において行われ得る
無毒化の後に、痕跡の無毒化剤の全てを除去する目的
で、アナトキシン含有溶液を緩衝液CTWに対して透析に
かけることのできる。かくして得られたアナトキシンは
溶液中の残留し、孔径0.22μmの滅菌膜で濾過でき、か
くして、ワクチン製剤に包含させることができるものと
なる。
【００３３】上記の通り、本発明において使用するため
の炭酸塩緩衝液はボルデテラ属細菌の培地上澄液から単
離される別の蛋白質：H-FAの完全な可溶化を可能にす
る。
【００３４】F-HAの可溶化工程における該緩衝液の使用
により、パータッシス毒素の場合について述べた種々の
利点、即ち、特に有効成分を損失することなしに0.22μ
m膜での滅菌濾過工程に着手し得るという利点が得られ
る。この形でのF-HAは直接ワクチン製剤中に包含させる
ことができる。
【００３５】例えば硫酸アンモニウムによる沈殿の形で
保存されたF-HAはパータッシス毒素について前述した方
法に従って再溶解される。沈殿を遠心分離し、緩衝液CT
Wに溶解し、室温又は４〜８℃の温度で４〜72時間透析
する。緩衝液CTWはF-HAを完全に可溶化できる。
【００３６】本発明はまたアナトキシン・パータッシス
及びF-HAから選ばれた有効成分の少なくとも１種を含有
しかつ該有効成分が上記の通り炭酸塩緩衝液、特に、緩
衝液CTWのごとき界面活性剤を含有する炭酸塩緩衝液中
に溶解されている無細胞百日咳ワクチンにも関する。
【００３７】アナトキシンパータッシス及びF-HAは炭酸
塩緩衝液中の溶液として直接ワクチン製剤中に包含させ
ることができる。ワクチンはアナトキシンを単独で又は
アナトキシンとF-HAとの所望の比率の混合物として含有
できる。ワクチンの最終pH値を７〜８に修正する目的で
緩衝生理学的食塩水（緩衝液PBS)若干量濃酸溶液で酸性
にしたものを添加する。添加量は製剤中に存在する炭酸
塩緩衝液の量及びモル濃度により変動する。その場合、
有効成分の濃度は必要量の緩衝液PBSを添加して所望値
に修正する。この段階において混合物に他の抗原（例え
ば、ジフテリア抗原、破傷風抗原、小児麻痺抗原、血友
病抗原等）、メチルチオラート又はフェノキシエタノー
ルのごとき防腐剤及びアルミナゲル又は燐酸カルシウム
のごとき添加剤を添加し得る。
【００３８】
【実施例】以下に本発明の実施例を示す実施例１ （参考例） アフィニテイー・クロマトグラフィーによるパータッシ
ス毒素の精製 a)パータッシス毒素のアフィニテイー担体への吸着 30リッター発酵槽中で培養した百日咳菌フェーズIの細
胞懸濁液の遠心分離及び濃縮後に得られたパータッシス
毒素富化フラクションを、流量６ml/cm2/時で、アシア
ロフェチュインと結合させたSepharose 4Bクロマトグラ
フィー担体120ml を収容している直径４cmのカラムに通
送した。Sepharose 4Bは下記のようにしてアシアロフェ
チュインと結合させた。
【００３９】CNBrで活性化したSepharose 4B(Pharmacia
社）30gを１mM HCl ６リッター中で約15分間膨潤させ
た。ついでゲルを１mM HCl ６リッターで３回洗浄し
た。アシアロフェチュイン１mg/ml、NaHCO3 0.1M及びNa
Cl 0.5Mを含んでいる溶液400mlをゲルに添加した。
【００４０】この混合物を+４℃において穏和に攪拌し
ながら１夜、反応させた。エタノールアミン５M 溶液(p
H 8.0)125mlを混合物に加えた。室温に４時間保持した
後、ゲルを順次、NaCl１Mを含有する0.1M酢酸ナトリウ
ム緩衝液(pH4.0)500ml、次にNaCl１Mを含有する50mMト
リス−HCl緩衝液(pH7.5)500mlで洗浄した。この洗浄サ
イクルを３回反復した。
【００４１】引続いてゲルを1/10000(w/v)の濃度のマー
チオレート(Merthiolate) のごとき防腐剤の存在下で50
mMトリス−HCl 緩衝液(pH7.5) 500mlで３回洗浄した。
【００４２】アフィニテイー・クロマトグラフィーにお
いて結合剤として用いるアシアロフェチュインは下記の
ようにして調製した。
【００４３】フェチュイン(Sigma社フェチュインIII
型）の水溶液を0.05N H2SO4により80℃において１時間
加水分解した。加水分解後、遊離シアル酸を除去する目
的で溶液を複数の蒸留水浴に対して+4℃において24時間
透析した。アシアロフェチュイン溶液は排除限界(Seuil
de coupure)が10000に等しい膜を備えた限外濾過によ
り濃縮することができた。
【００４４】シアル酸の除去は加水分解の前又は後の蛋
白質上のシアル酸の特殊比色定量により検査した。
【００４５】b)パータッシス毒素の溶出 ゲルをカラムの２倍の容積の50mMトリス−HCl緩衝液(pH
7.5)を使用して、即ち、278nmの紫外線吸収が全く消失
するまで洗浄し、次にカラムと同容積の、1MNaClを含有
する50mMトリス−HCl緩衝液(pH7.5)で洗浄した。パータ
ッシス毒素は100mM 炭酸塩緩衝液(pH9.6)400mlで溶出し
た。
【００４６】炭酸塩緩衝液は下記のようにして調製し
た。0.1M NaHCO3溶液500mlに0.1M Na2CO3溶液を最終pH
9.5となるまで添加した：添加したNa2CO3溶液は約250ml
であった。
【００４７】かく得られた炭酸塩緩衝液を孔径0.22μm
の膜で濾過し、+4℃で保存した。
【００４８】カラム出口で捕集したフラクションの光学
的濃度及び赤血球凝集活性を測定した。有効成分含有フ
ラクション、即ち、コレステロールにより抑止されない
強い赤血球凝集活性を有するものを捕集した。
【００４９】引続いて、パータッシス毒素は最終濃度が
飽和濃度の70％に相当する硫酸アンモニウムにより沈殿
させた。
【００５０】かくして精製したパータッシス毒素は強い
リンパ球増多症を誘発し、マウス１匹当り、0.04μgの
投薬量でマウスCFW をヒスタミンに対して鋭敏化させ
た。CHO細胞上にクラスター生成を誘発する毒素の性能
は65000〜260000cpu/μg程度の比活性により特徴づけら
れる。
【００５１】物理−化学的検査及び生物学活性（偶発的
汚染物質、DNA、RNA、糖類の比色法定量；内毒素比率の
定量；SDS 媒体中又は酸性媒体中の電気泳動など）の結
果は、高度に精製された有効成分を含有する均質な最終
製剤に有利であるとを示した。 初めの培地上澄液中及
び最終沈殿中のパータッシス毒素含有量の分析結果は90
％を越える精製収率を示した。
【００５２】実施例２ 種々の緩衝液中のパータッシス毒素の溶解及びその後の
滅菌濾過の比較試験。硫酸アンモニウムによる沈殿の形
のパータッシス毒素を2.6mg/ml含有する懸濁液1.2mlを
採取し、10000 x g で10分間遠心分離した。上澄液を除
き、残渣を緩衝液CTW ４mlに溶解し、同じ緩衝液に対し
て透析した。毒素溶液を孔径0.22μmの膜で濾過した。
濾過の前及び後の溶液の蛋白質濃度をロウリー(Lowry)
法に従った定量法により測定した。測定結果は濾過収率
（濾過後の毒素の濃度/濾過前の毒素の濃度）x 100；又
は緩衝液CTW中の濾過収率を任意に100％とし、これに対
して算出した相対百分率で表した。結果を表Ｉに示す。
【００５３】 実施例３（参考例） パータッシス毒素の無毒化 a)ホルモールによる無毒化 硫酸アンモニウムによる沈殿の形のパータッシス毒素を
５mg/ml含有する懸濁液２ml(即ち、パータッシス毒素10
mg) を10000xg で15分間遠心分離した。上澄液を除き、
残渣を緩衝液CTW 10mlに溶解した。
【００５４】溶液を緩衝液CTW ２リッターに対して+4℃
において一夜透析した。透析の終了時に溶液を孔径0.22
μmの膜で濾過した。溶液についてLowryの方法に従って
蛋白質定量を行い、緩衝液CTWを加えて蛋白質濃度を0.4
mg/mlとした。0.4mg/mlの毒素溶液23mlに、緩衝液CTW中
のリシンの１M 溶液1.22ml及びホルモールの37％溶液
0.265mlを加えた。21時間、+4℃に保持した。引続いて
痕跡のホルモールの全てを除去する目的で反応混合物を
緩衝液CTWに対して+4℃において48時間透析した。引続
いてアナトキシンを孔径0.22μmの膜で滅菌濾過した。
この形のアナトキシンパータッシスをワクチン製剤中に
包含させることができる。
【００５５】b)グルタルアルデヒドによる無毒化 緩衝液CTW中のパータッシス毒素500mg/mlの溶液を前記
の通り調製した。グルタルアルデヒド0.10％を含む緩衝
液CTW ５mlを毒素溶液に加えた。
【００５６】無毒化は+4℃〜40℃の種々の温度で実施で
きる；グルタルアルデヒドの存在下における毒素の保温
時間は温度によって変動する。例えば混合物を+4℃で48
時間保持することができる。
【００５７】保温後に緩衝液CTW 中のリシンの１M溶液1
80μlを混合物に加え、溶液を緩衝液CTWに対して+4℃に
おいて48時間透析した。透析後にアナトキシンパータッ
シスを孔径0.22μmの膜で濾過した。この形でアナトキ
シンをワクチン製剤中に包含させることができる。
【００５８】実施例４ 炭酸塩緩衝液によるF-HAの可溶化 この実施例で使用するF-HAはSATO Y,COWELL J.L.,SATO
H.,BURSTYND.G 及びMANCLARK C.R.“Separation and Pu
rification of the Hemagglutins fromBordetella pert
usis”Infect.and Immun,.1983,41,1,313-320に記載の
方法に従って調製した。
【００５９】F-HAは飽和濃度の70％の硫酸アンモニウム
による沈殿の形で保存した。
【００６０】a)硫酸アンモニウムによる沈殿の形のF-HA
1.2mg/mlの懸濁液25mlを30000 x gで20分間遠心分離し
た。上澄液を除き、残渣を緩衝液CTW 30mlに溶解した。
【００６１】溶液を緩衝液CTWに対して+4℃において一
夜透析した。溶液を孔径0.22μmの膜で濾過した。F-HA
はこの形でワクチン製剤中に包含させることができる。
【００６２】b)孔径0.22μmの膜での滅菌濾過収率の比
較試験 硫酸アンモニウムにより沈殿させたF-HAの5.88mg/ml懸
濁液450μlを採取し、10000 x gで10分間遠心分離し
た。上澄液を除去した。
【００６３】残渣を緩衝液３mlに溶解し、同じ緩衝液に
対して透析した。F-HA溶液を孔径0.22μmの膜で濾過し
た。濾過の前及び後の溶液の蛋白質濃度をLowryによる
定量法により測定し、結果をは濾過収率（濾過後の毒素
の濃度/濾過前の毒素の濃度）x 100；又は緩衝液CTW中
の濾過収率を任意に100％とし、これに対して算出した
相対的収率で表した。結果を表ＩIに示す。
【００６４】 実施例５（参考例） 無細胞百日咳ワクチンの調製 精製した抗原−アナトキシンパータッシス及びF-HAを含
有している無細胞百日咳ワクチンを下記の方法で調製し
た。
【００６５】緩衝液CTW中に溶解した両抗原を別個に孔
径0.22μmの膜で濾過して滅菌し、例えばLowry の方法
に従って比色定量によりそれらの濃度を測定した。
【００６６】有効成分をそれぞれ50μg/ml含有している
無細胞百日咳ワクチン１リッターを調製する目的で、無
菌状態で下記の溶液を混合した。
【００６７】 −緩衝液CTW中のアナトキシンパータッシス 0.38mg/mlの溶液 132 ml −緩衝液CTW中のF-HAの1.1mg/mlの溶液 46 ml −50mM HCl含有、緩衝生理学的食塩水（PBS) 202 ml −水酸化アルミニウム溶液（Al 10mg/ml) 20 ml −マーチオレート１％(w/v)含有PBS 10 ml −PBS を加えて 1リッター このワクチン調剤は下記の諸特性を示した： −アナトキシンパータッシス 50μg/ml −F-HA 50μg/ml −アルミニウム 200μg/ml −pH 7.6 −浸透 265mosm/kg −マーチオレート 1/10000

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ボルデテラ属細菌培地中で生成する蛋白
    質抗原を可溶化するにあたり、上記蛋白質抗原を沈殿又
    は凍結乾燥品の形で、１重量％未満の界面活性剤を添加
    したpH8.3〜11.6の炭酸塩緩衝液中で可溶化することを
    特徴とするボルデテラ属細菌の蛋白質抗原の可溶化方
    法。
  2. 〔請求項２〕 炭酸塩緩衝液はアルカリ金属炭酸水素塩
    と及びアルカリ金属炭酸塩との混合物である、請求項１
    に記載の方法。
  3. 〔請求項３〕 炭酸塩緩衝液は0.025〜0.5Mのモル濃度
    である、請求項１又は２に記載の方法。
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