JPS61171432A - 免疫原性蛋白質またはペプチド複合体からなるワクチン - Google Patents

免疫原性蛋白質またはペプチド複合体からなるワクチン

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JPS61171432A
JPS61171432A JP60233152A JP23315285A JPS61171432A JP S61171432 A JPS61171432 A JP S61171432A JP 60233152 A JP60233152 A JP 60233152A JP 23315285 A JP23315285 A JP 23315285A JP S61171432 A JPS61171432 A JP S61171432A
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adsorbent
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エドウアルド コーエン ベウベリイ
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アントニウス ルドビクス バン ウエゼル
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗原性蛋白質またはペプチドに由来する免疫
原注複合体からなるワクチンに関する。
発明の背景 人および動物の免疫のために、抗原として精製された細
菌およびビールスの膜蛋白質、または合成ペプチド、お
よび組換えDNA技術により製造された蛋白質の使用は
、全細胞またはその1部の使用にまさるある種の利点を
提供する。即ち、精製された蛋白質の使用は、望ましく
ないたとえばパイロジエンa反応を生じる成分の排除を
許容する。
更に、蛋白質は、それらが−可能な限り排他的に −望
ましい免疫原性質を所有し、そして更に同遺伝子型変化
を示さないように選択しうる。しかしながら、高度に精
製された膜蛋白質、特に細菌外膜蛋白質およびビールス
外皮糖蛋白質は、それらが一般的に低い免疫原活性しか
所有しないという欠点を有している。
抗原性蛋白質は、清浄剤と複合体を形成しうろことが知
られている。清浄剤は、蛋白質を可溶化するのに役立っ
ている。それら蛋白質清浄剤複合体のあるものは、実験
的免疫原として使用されてきた。即ち、ジャーナル・オ
プ・ジェネラル・バイooジー(、T、Gen、Vir
ol 、)、64.1557〜1569(1983)中
には、パラインフルエンゾロ型ビールスの蛋白質サブユ
ニットワクチンが記載されており、それはトリトン(T
riton) X −100を含有するワクチンを包含
している。この保父は清浄剤不言蛋白質を超える清浄剤
複合体のどのような利点も指摘していない。
EP−A−90660は、ナイセリア・ゴノロエアエ(
Heisseria gonorrhoeae)の主要
外膜から蛋白質重を分離しそして精製する方法、および
それから製造されたワクチンに関するものである。この
方法は、清浄剤からなる特異可溶化剤の便用を包含して
いる。すべての清浄剤は、ワクチンにおける蛋白質の使
用の前に非常に注意深く除去されている。
FR−A−2446111(フランス特許出願第790
1301号)は、デオキシコール酸ナトリウム、リゾチ
ームおよびKDTAナトリウムを抽出剤として使用する
、微生物からの抗原性複合体の抽出のための方法を記載
している。デオキシコール酸ナトリウムは、ワクチン中
に残留する。
発明の要約 抗原性蛋白質およびペプチドの免疫原活性は、屑〈べき
ことには、もしもそれらが吸着された清浄剤複合体の形
におけるものであるならば改善されることが見出された
。蛋白質またはペプチドを清浄剤と複合体化することに
より得られる免疫原活性の改善は、吸着剤上への清浄剤
複合体の吸着により、非複合体化蛋白質またはペプチド
が吸着剤上に吸者されたとき観察される効果から期待さ
れるよりはかなりより強力に増η口する。かくして、清
浄剤と吸着剤との組合せは、真の相乗効果をもたらす。
従って、本発明は、抗原性蛋白質またはペプチド、f#
浄剤および吸着剤からなるワクチンに関する。
“抗原性蛋白質またはペプチド(antigenicp
rotein or peptide)”なる表現は、
抗原性の蛋白質性生成物、たとえば糖蛋白質およびポリ
サッカライド−蛋白質結合体を包含するものと理解され
るべきである。
詳細な記述および好ましい態様 本発明は、ナイセリア・tノロエアエ (Ne1θ5eria gonorrhoeae)、ナ
イ−tCす7−)’=7ギチジx (Neigseri
a meningitidis)、ヘモフィルス−イン
フルエンザx (Haemophilus 1nflu
enzas)に由来する外膜蛋白質の吸着された清浄剤
複合体により、そしてまた麻疹糖蛋白質の吸着された清
浄剤複合体により王に説明される。しかしながら、本発
明はそれらに限定されない。
良い結果は、特に淋菌または髄膜炎菌に由来するボリン
(POrine )蛋白質で得られた。それら外膜蛋白
質は他の免疫原注蛋白質にまさる利点を有しており、そ
れはそれらが膜中に多波に存在しているからである。た
とえば、ナイセリア・ゴノロエアエのボリン蛋白質PI
は、外膜上に存在する蛋白質の約50%にのぼる。災に
、PIがすべての髄膜炎菌株甲に存在し、そして最小の
同遺伝子型変化を示すことは利点である。また、分子の
1部分が膜から突出しており、それで抗体と反応するこ
とが可能である〇 血清型1髄膜炎菌PI、5および9の抗血清は、かなり
の交叉反応性を示すようであった。従って、蛋白質成分
が多数の異った血清型、たとえば血清型1.5および9
に由来する髄膜炎菌PIの混合物である吸着された蛋白
質複合体をワクチン中に合体させるのが有利である。ワ
クチンが9種の血in型のすべてのPIと反応する抗体
の形成を誘導する結果となる。
本発明に従うワクチン中に存在する清浄剤の性質は臨界
的でない。清睡剤は、双性イオン性、カチオン性、アニ
オン性またはノニオン性清浄剤でありうる。
適当な双性イオン性(ベタイン)清浄剤の例は、ツビツ
pジエント(zwittergents) 、fsとえ
ばz6−14とまた呼ばれ、その化学名が5−CN−テ
トラデシル−N、N−ジメチル−アンモニオ)−ゾロパ
ン−1−スルホネートであるツビツタジエント3−14
、ならびにより短かいかまたはより長い炭化水素鎖を有
するその誘導体、たとえばZ3−10、Z3−12、Z
3−16およびz3−18である。更に、N−ラウロイ
ル−ずルコシン(ずルコシル)を、適当な双性イオン注
清浄剤として示しうる。
セトリモニウムブロマイド(CTAB )が適当なカチ
オン性清浄剤の例であり、そしてジオクチルナトリウム
スルホサクシネー) (DONS)、ナトリウムドデシ
ルスルホネート(SDS)およびデオキシコール酸ナト
リウム(DOO)が有効なアニオン性清浄剤として示さ
れうる。適当な中性またはノニオン性清浄剤は、たとえ
ばn−オクチルグルコシド、トリドアX−100、ライ
−y (Tween) 2 Q、ツイーン80、ブリジ
(Brij) 52、ブリジ58およびミルジ(M7r
j) 45である。
清浄剤に対する抗原性蛋白質またはペプチドの比率は、
吸着された蛋白質またはペプチド/清浄   (剤複合
体の免疫原性質に影響を与える。この比率の一般的規則
は、最も高い免疫原性を与える比率が使用した特定の蛋
白質またはペプチド、そして特定の清浄剤に依ヶして変
化するらしいので与える−とができない。最適比率は様
々の比率で抗原お、ヒび清浄剤を含有する1連のワクチ
ンの免疫原活性を試験することにより容易に決定しうる
。たとえば、髄膜炎菌PI外膜蛋白質の場合、マウスに
おける免疫原活性は、清浄剤がZ3−14であるとき約
1:5から1 : 2.5までの蛋白質:清浄剤比率(
W/W )で、清浄剤がオクチルグルコシドまたはDO
Cであるとき1:5の比率で、そして清浄剤がC!TA
Bであるとき1:1から1 : 0.6までの比率で最
適であるように思われる。
本発明に従うワクチン中の抗原性蛋白質が淋菌外膜蛋白
jiItPI、または淋菌OMPのPIの混合物である
とき、最良の結果は、清浄剤としてz3−10、z3−
14、N−ラウロイルずルコシン、デオキシコール酸ナ
トリウム、トリトンx−ioO、ツイーン20およびブ
リジ58で得られた。3群、15型CP1.16)髄膜
炎菌外膜蛋白質の組合せで使用される好ましい清浄剤は
、Z3−14およびデオキシコール酸ナトリウムである
本発明のワクチンにおいて便用される吸着剤は、ワクチ
ンに一般的に使用される吸着剤である。そのような吸着
剤の例は、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムお
よびリン酸カルシウムである。
リン酸アルミニウムが好ましい。
以下の実施例は、本発明を更に詳細に説明するためのも
のである。
例1 淋菌菌株B2(血清型1)、03(血清型5)およびF
6(血清型9)を常法で生育させた。培養物を56℃で
60分間加熱することにより不活性化させた。細菌を遠
心分離の後に凍結乾燥した。
細胞不言培養液を外膜複合体(OM(! )の製造に便
用し、そして精製PIは凍結乾燥した細菌から製造した
細胞不言培養液をアミコン(Amicon)中空繊維カ
ートリッジ(HloPlo)上で80倍に濃縮した。濃
縮物を遠心分離(10,[]OOX、? ;20分間)
して、残留細菌かあれば除云した。OMCを遠心分!(
2時r’dl; 100.000x、? )L、4vツ
トを300 mM NaCJ −50mM )リス、p
H7,2中に懸〜し、再び遠心分離(2時間; 100
.OOX、1し、そしてペレットを最後に蒸留水に懸濁
して、2■/ゴの蛋白濃度を得た。
PIの精製 単離方法は、ブレーク(Blake )およびコ9ット
シュリツヒ(Gotschlich)により蛋白質■の
ために便用された方法〔ジャーナル・オブ・エキスペリ
メンタル・メデイシン(J、Exp、Med、 )、1
59.452〜462(1984))&C基^た。凍結
乾燥した淋菌(乾燥型!2.5&)を、総容量25〇−
における0、5M塩化カルシウム中の3− (N−テト
ラデシル−N、N−ジメチルアンモニオ)−グロバンー
1−スルホネート(Z 5−14 ) 2.5gでpi
−14,0にお^て抽出した。1時間後に、無傷のm廁
および破片を遠心分離(20分間、io、oo。
X、M)した。もしも必要ならば上澄液の−を希H(J
で4.0に再調節し、そしてエタノールを20係の濃度
1で加えた。30分後に、沈澱した物質を遠心分離(2
0分間、10.000x、9)により除去した。上澄液
を限外濾過(アミコン中空繊維HIDX50)により1
50m1m濃縮し:5QmM5Qx −1Q myt 
KDTA−0,05%(W/v) z 3−14、p)
18.0(バッファーA)150−を加え、そして容量
を半分に減少させ;この操作を5回繰返してCacj□
およびエタノールの除去を完全にした。その後、蛋白質
溶液を、バッファーAで平衡化したDFjAK−セファ
ロースカラム(50x 1.8cWL)に適用した。蛋
白質をバッファーA中の0.0から0.6 NaCjま
での線状グラジェント(2X400−)で、50m/時
間の流速において溶出した。
結果な第1図に示す。両分を8DB−PAGFiにより
分析し、そしてPI言有両分をためた。この生成物は部
分精製PIと呼ばれる。
部分精製PIを、50 mM −)リス−200mMN
aCJ−i Q mM KDTA−0,05% (W/
V)Z 5−14、−7.2で予め平衡化したセファク
リルB−500カラム(80×5.6cm)に適用した
。カラムを50−7時間の流速で溶出した。結果を第2
図に示す。PI含有画分をため、そして防腐剤として0
.02%(W/V )ナトリウムアチドを加えて4°C
0で貯蔵した。この段階で得られた生成物は、精製PI
と呼ばれる。
分析方法 蛋白質は、ペターメン(peterson) (アナリ
チカル・バイオケミストリー(Anal、 Bioch
em、)、リー、646〜356(1977))により
変形され、ジャーナル・オデ・バイオロジカル・ケミス
トリー(J、Blol、C+hem、)、193.26
5〜275(1951)に記載されたローリ−(LOW
r7)の方法により、標準としてウシ血清アルブミンで
決定した。ケトデンキシオクタノエート(KDO)は、
カルカニス(Karkhanis)等の方法〔アナリチ
カル・バイオケミストリー(Anal、Biochem
、 )、85.595〜601(1978)]に従い、
標準としてKDOを使用して検定した。8D8−PAG
Eは、レムリー(La0mm1i)により記載〔ネーチ
ュア(Nature)、227.680〜685 (1
970))された如くに遂行した。
生物学的活性 家兎における発熱性試験のために、ヨーロッパ薬局方■
、53〜61頁(1971)のプロトコールを使用した
IT、+工8A方法 血清検体の抗体水準の決定のために、マイクロタイター
プレートを、Q、i 5 M Na(Jで希釈したOM
Cで、10μg/−の蛋白濃度に被僅した。
ELISAの引続く工程は、インフエクシャス・イミュ
/Hジー(工nfect、工mmun、)、40.36
9〜380 (1983)中に記載された如く遂行した
。工gG抗体水準は随意(arbitrar7)抗体単
位で表わした。
Z!t−14を富有するバッファー中の精製PIを80
%エタノールで沈澱させた。蛋白質ペレットを80%エ
タノールで1回洗滌して、残留Z3’−14を除去した
。蛋白質ペレット(100μg)ニ0.9%(w/v)
 NaCJ中の清浄剤の10my/m浴液0.05−を
加え;16時間のインキュベーショ70間の後、0.9
 % (W/V) NaCJ浴液0.95−を加え、そ
して検体を簡単に超音波処理(60秒間、60W)した
。免疫処置の前に、検体を次の最終濃度に希釈した:蛋
白質:5μg/−;清浄剤:25 pg/ wl ; 
NaCJ :  91111/ wd。若干の検体には
、A1PO4懸濁液を最終濃度0.5μg/−に加えた
マウスの免疫 無作為飼育マウス8匹からなる群に、Pニー洗浄剤複合
体0.5−を腹腔内(1,1)、)注射した。4週間後
に、マウスを出血させ、そしてためた血清の抗体水準な
IT、+ISAにエリ決定した。
結果 PIは、細菌懸濁物から、CaCl2の存在において、
Z!1−14によりp)44.0で効果的に可溶化され
た。細菌1.9(乾燥重量)当り1gのZ3−14を、
蛋白質的100qの可溶化のために使用した020%エ
タノール沈澱工程の後、エタノールおよびcaC12を
上置液から限外濾過により除去した。
蛋白質を引続いてDI!1AK−セファロースカラムに
適用し、そしてNa(Jグラジェントで溶出した(第1
図)。部分精製PIが、0.4モルにおいて対称注ぎ−
クとして浴出した。リポポリサッカライド(LPS)の
溶出プロフィルをまた、KDOの検定により決定した。
第1図は、KDOビークの頂上がPIぎ−クのそれに先
んすることを示している。
しかしながら、両成分の完全な分離は、このカラム上で
は達成しえなかった。引続くセファクリルS−300上
のrル透過クロマトグラフィは、両成分のさらに先の分
割を提供した(第2図)。
PIは対称注ぎ−ク(画分64から68まで)として溶
出し、若干の低分子量蛋白質および大量のりボボリサツ
カライドを含有する第2のピークが引続^た。8DS−
PAGE分析は、第1のピークが基本的に純粋なPIで
あることを明らかにした。
細菌2.5IC乾燥重量)から出発して、PI収量は通
常20から5011IIまでの間であった。表Aは、 
  す蛋白質およびKDOについての言及を包合し、典
型的精製方法の結果の要約を示す。
精製I’mの分析および生物学的活性 部分精製PIのKDOi量は、15から50μgKDO
/■蛋白質の間にあった。セファクリルS−300上更
に精製の後、この値は6から7ggKDO/wq蛋白質
までに減少した。PIの分子量を!+4.0GOと推定
して、これは蛋白質に対するKDOのモル比が1に相当
する。精製PIは、家兎体重1′にg当り25 ngの
蛋白質用址において発熱性−試験を通過した。
3種の異った条件において、PIによるマウスにおける
抗体の誘導を試験した。それら条件は、(a) Z 3
−14中の精製px、(b)z3−14がオクチルグル
コシドにより1を換された製剤、および(0)清浄剤な
しのPIであった。1回の注射の後に得られ、ためた血
清検体を、均一なOMCが抗原としての役割を果たすE
iLI8Aで試験した。第6図は、各種検体の相対抗体
水準を示す。両方の清滌剤が精製PIの免疫原活性を著
しく高めることは明らかである。Z3−14およびオク
チルグルコシドを含有する製剤の闇に有意の差は観察さ
れなかった。しかしながら、清浄剤の不存在において、
Plは劣った免疫原であった。そこで、Plの免疫原活
性に対する他の洗浄剤の影響を試験した。
表Bは免疫実験の結果を示す。
表B マウスにおける、淋菌PI外膜蛋白質の免疫原力ナシ 
       6,3     0.4簀 z3−10    55.4      n、t。
Z3−12    30.4      n、t。
z 3−14    45.3     6.9Z 3
−16    17.5      n、t。
Z3−18    32.3      n、t。
すゞルコシル     85.7       n+t
CTAB        14.8      1.0
DONS        26.4      1.4
SDS         36.8       n−
t。
DOO52,On、t。
オクチルグルコシド   38,8       13
.6トリトンX−10062,I        n、
t。
ツイーン20       48.4        
n、t。
ツイーン80       37.On、t。
ブリジ52    17.I      n、t。
ブリジ58    45.9      n、t。
ミルジ45     27.I       n、t。
骨n、t、=試験せず 免疫原組成:蛋白質    5μg/++を清浄剤  
 25μg/d AiP04   500μg /1w Na(J      9w/v 用量=0.5−腹腔内 1群8匹 試験したすべての清浄剤は、Plの免疫原活性を高めた
。この効果は、蛋白質−清浄剤複合体をAJlPo、に
吸着させたとき相乗的に増7JI]した。
蛋白質−清浄剤比率の影響を4種の清浄剤で試験した(
表C参照)。
表C マウスにおける、吸着された淋菌Pl外膜蛋白質の免疫
原力価に対する蛋白質−清浄剤比率の影響清浄剤   
  比率(蛋白if[/清浄剤(w/w ) )1:5
  1:2.5  1:1.25 1:0.62L体単
位 z 3−14   170.8 174.5 170.
5 108.7オクチルグルコシド  116.2  
 74.8   44.9   27.8DOC147
,4101,572,597,30TAB      
   31.9   79,9    77.7   
99.0清浄剤なしの対照:  24.2 免疫原組成二PI蛋白質=    5μg/−清浄剤:
      3.12〜25μg/−Mpo4  : 
     500μg/dNa(J  :      
  9mA/1rLt用量二0.5−腹腔内 1群8匹 試験した最低清浄剤濃度において、4種の清浄剤すべて
が抗体応答を高めた。Z3−14、オクチルグルコシド
およびデオキシコレートの場合において、刺激効果は最
高清浄剤水準において増加した。清浄剤CTABでは、
反対の効果が観察された。
例2 髄膜炎菌菌株H44/76[B:15:Pl、16 レ
ビュー・オブ・インフエクシャス・テ1シーズ(Rev
、 1nfect、 Di8.)、7.504〜510
(1985))を、培養器中で培養した。培養物を56
′Cで60分間加熱することにより不活性化した。遠心
分離の後、細菌をため、そして凍結乾燥した。細胞不言
培養液を、OMOの製造のために使用した。
OMOの製造、ならびにクラス1および3のOMFの組
合せの精製を、例1に提示した方法に従い遂行した。
分析法および生物活性 分析法および発熱活性の測定は、例1に記載した如くで
あった〇 抗体の検定 KL工SA技術およびウェスタン・プロッティング技術
(Western blottingtechniqu
e)の両方について、OMOを抗体の検定のための抗原
として使用した。EL工SA技術は、例1に記載した如
くに遂行した。ウェスタン°ブロッティング技術は、各
種外膜蛋白質をニトロセルロース紙に移し、そしてマウ
スからの血清検体、マウスエga 1 +2に対するパ
ーオキシダーゼ結合抗体、および基質と連続インキュベ
ートすることにより行った。
無作為飼育マウス8匹からなる群に、遊離状態およびu
po4に吸着の両方で、各種清浄剤ミセル中にまたは凝
集物として存在するOMF組合せを腹腔内に注射した。
各種OMP−清浄剤ミセルの製造は、例1に記載した如
くに行った。
結果 OMF組合せの特徴づけ OMCおよび精製OMFの組合せを5DS−PAGEに
より分析し、それは精製OMF組合せが −クラス1お
よび3のOMFに加えて一少量の77 KdOMFおよ
びクラス4 OMFを含有することを明らかにした。
精製OMF組合せのKDO含量は、蛋白質1■当り約5
0μgKDoであった。組合せは家兎体重1ゆ当り25
 ngの蛋白質用量において、発熱性試験な通過した。
マウスの群に、異った条件においてOMF組合せを注射
した(表り参照)。1回の注射で得られ、ためた血清検
体を、KL工SAおよびウェスタン・プロッティングで
試験した。結果を表D(KL工SA)およびI!4図(
ウェスタン・プロッティング)に示す。表りは、各檀清
浄剤(よる組合せの免疫原   1活性の少ない刺激お
よび清浄剤に吸着剤を加えることによる著しい刺激を示
している。
表D マウスにおける、髄膜炎菌3群、15型(Pl、16)
外膜蛋白質組合せの免疫原力価に対する清浄剤および/
’−Q PO4の添加の効果。抗体はEL工SA技術で
検定した。
ナシ        8.7     n、t。
z3−14    11.9    1.2DOC18
,01,3 オクチルグルコシド   12.7      2.2
トリトンX−10010,5n、t。
”n、t、 =試験せず 免疫原の組厄および用量、表B参照 第4図において、クラス1および3のOMFは、それぞ
れaおよびbo)位置に帝として現われた。
この図は、DOOおよびAuPO4の組合せが、他の組
合せと異って、OMF組合せと一緒での注射後に、クラ
ス6のOMFに幻する抗体を刺激しうろことを示してい
る。
第4図中のレーンは、次の生成物に関するものである: 1、蛋白質+A1PO4 2、蛋白質中23−14 +AfPO46、蛋白質中2
3,14 4、 蛋白質+DOO+ /’uPO45、蛋白質+D
OO 6、蛋白質中オクチルグルコシド+A1.PO4Z 蛋
白質中オクチルグルコシド 8、 蛋白質中トリドアX −100+AfP0゜9 
対照n(非免疫処理群) 例6 髄膜炎菌菌株Ma19(ジャーナル・オプ・インフエク
シャx−デジーズ(J、 1nfect、 Dis、)
、Lス9,147〜153(1974)]およびヘモフ
ィルス書インフルエンデエ(Haemophiluθ□
                         
             □1nfluenzas 
) b W lflg 7 Aステルダム〔アムステル
大学、パンアルフエy%±(Dr、L、 van Al
phen)により提供された〕を培養器中で培養した。
培養物を56°Cで30分間加熱することにより不活性
化した。遠心分離の後、細胞不言培養液を髄膜炎精製髄
膜炎菌C一群ポリサッカライド(Ps)は、細胞不言培
養液から、ダブリュー・エイチ・オー・テクノロジー・
レポート(W H00Techn、 Rep、)Ber
、 594.50〜75(1967)中に記載された如
くに製造した。ヘモフィルス・インフルエンザより型O
MFは、例1に記載した方法に従い精製した。ツビッタ
ジエン)3−14中&Cおff6C−詳PSとへモフィ
ルス・インフルエンザよりgの結合のための条件および
結合体の精製は、結合体化の後に反応を停止させなかっ
た相違を有して、g−ヘ17  (13θuvery)
等によりイン7エクシヤス・イミュノロジー(工nfe
ct、工mmun、)、40,39〜45(1983)
中に記載された如くに行った口分析法 蛋白質は、例1に記載した如くに決定した。 C一群p
sは、スベンネルホk ム(svennerhoxm)
の方法〔ビオキミカ・工・ビオフィジ力・アクタ(Bi
ochem、 Biophys、Aeta)、24.6
04、(1957))により、標準としてN−アセチル
ニューラミン酸で検定した。
C一群PSの抗体は、イン7エクシヤス・イミュノロジ
ー(工nfect、工mmun、)、40.669〜3
80(1983)に記載された如くに、EI、工8Aで
検定した。
マウスの群に、例1に記載した如くに、結合体を、洗清
剤と共におよびそれなしで、そしてAJ、PO4と共に
およびそれなしで注射した。免疫原は、例1に記載した
如くに製造した。用量は、C−″詳PS2.5μgにの
ぼった。
結果 結合体の個々の成分および結合体の特徴づけN I! 
C一群psti、C一群P S ニツイテノWHO(F
)最低要求〔ダブリュ・エイチ・オー・テクノロジー・
レポート(W HOTech、 Rap、 )、ser
、 594.50〜75(1967)]に、]0−アセ
チルが検出できなかったことを除き適合した。ヘモフィ
ルス・インフルエンザ二m1lLllCパンアルフェア
tl±(Dr、 van Alphen)から提供され
た〕および精製OMPは5D8−PAGEにより分析し
た。精製OMFは蛋白質bcを官有した〔ジャーナル・
オデ・バクテリオロジ−(J、 BaCteriOl、
)、155.878〜885(1983))。結合体は
、はぼ等量のpsと蛋白質とから構成されていた。
マウスの群に、各種条件において結合体を注射した(表
E参照)。1回の注射で優られ、ためた血清検体を、K
L工SAで試験した(表E)。結果は、清浄剤および吸
着剤の組合せが、結合体のps酸成分対する抗体応答に
相乗的に作用することを示している。
表E マウスにおける、C詳髄膜炎菌ポリサッカライV/ヘモ
フイルス・インフルエンザエ外i蛋白質結合体の免疫原
力価に対する清浄剤およびA1PO4添加の効果 −050,7 z 3−14      3.1      0.1デ
ルコシル     29     0.9DOO3,3
0,4 CTAB         2.5     1.2例
4 エドモンストン(Eamonston ) 株麻疹ビー
ルスの斑変種(plaque variant)を、ミ
クロタイター培地中のペロ細胞(verO0(311)
中で製造した。ビールス懸濁液を濾過し、そしてアミコ
ン中空繊維(HloXloo)限外濾過により濃縮した
。ビールスP、膚白寅な、10 mM −トリx −H
rJ PH7,8,150mMNacz、600mMK
Cl−10,1LQM MgfJ2.2%(V/Vlト
リトトリ−100および1mMフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド中で可溶化しりしジャーナル・オプ・ジ
ェネラル・パイロロジ−(J、 gθn、 Vir+)
1.)、65.655〜666(1984)’:]。可
溶化および限外濾過(100,000X 、9.60分
間)の後、融解蛋白質を上澄液からアフイニテイクロマ
トグラフイにより除去した。この終末において、融解蛋
白質に対するモノクロナール抗体は、セファロース4B
に共有的に結合していた。融解蛋白質を、23 mMト
リス−HCL pj(7,8,1mM ]flDTAお
よび0.1 %(w/v)オクチルグルコシド中の5 
M NH,SONを使用することにより脱着させた。精
製された融解蛋白質を官有するNH,SON 浴出液の
ためた両分を透析した。透析した画分な蛋白質につき検
定し〔アナリチカル・バイオケミストリー(Anal、
Biochem、 )、72.248(1976)]、
5DEI−PAGEにより分析しく例1参照)、そして
−70°Cで貯蔵した◎KLISA法 マウスから、製剤を含有する各種融解蛋白質の注射後に
得られた血清検体を、KL工SAで検定した。ミクロタ
イター・プレートは、次の工程の後に得られた精製し、
不活性化した麻疹ビールスで被覆した:a)ビールス懸
濁液の濾過、b)懸濁液の濃縮、C)セファロース0n
−6B上、lI!!!濁液のデル濾過、d)6−ヒトロ
キシデロビオン酸ラクトンでのビールス懸濁液の不活性
化および凍結乾燥。
再構成されたg濁液を、赤血球を溶解するその力価につ
き試験した。この実験の結果は、懸濁液が赤血球の溶解
において完全に活性であったことを示している。
マウスの免疫 マウスの詳の免疫処理を、例1に記載した如くに遂行し
た。マウスに、Z3−14ミセル中に存在するかまたは
普通の(plain)および吸着された   (状態に
おける凝集物としての融解蛋白質を注射した。免疫原は
、例1に記載した如くに製造した。
注射敵は、蛋白質2.5μgであった。
結果 精製融合蛋白質の特徴づけ ビールス懸濁液、トリトンx−ioo処理後の上澄液お
よび精製融解蛋白質の5DS−PAGE分析は、精製融
解蛋白質製剤が殆んど排他的にこの蛋白質から構成され
ていることを明らかにした。ヘムアグルチニンは検出で
きなかった。
精製融解蛋白質の免疫原活性 マウスの群に、精製融解蛋白質、およびAAPO4との
組会せおよび吸着剤なしにおけるZ6−14ミセルとし
ての融解蛋白質を注射した。1回の注射後に得られ、た
めた血清検体を、KL工SAで試験した。この試験の結
果を第5図に示し、そして組合せ清浄剤および吸着剤は
融解蛋白質による抗体応答に対し相乗的に作用すること
を示している。
第5図において、′F″は、融解蛋白質を意味している
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明の蛋白質のDEAR−セファロースカ
ラムクロマトグラフィの溶出曲線を示し;第2図は、第
1図に示したクロマトグラフィにより得られた部分精製
PIのセファクリルS−600カラムクロマトグラフイ
の溶出曲線を示し;第3図は、精製PIの免疫原活性に
及ぼす清浄剤z3−14およびオクチルグルコシドの影
響を示し; 第4図は、本発明の蛋白質と清浄剤および(または)吸
着剤の組合せのウェスタン・プロッティングの結果を示
し、 第5図は、融解蛋白質それ自体、ならびに融解蛋白質と
清浄剤および(または)吸着剤の組合せのELXBkの
結果を示す。

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)1種もしくはそれ以上の抗原性蛋白質またはペプ
    チド、清浄剤および吸着剤からなる、ワクチン。
  2. (2)抗原性蛋白質が淋菌外膜蛋白質PIである、特許
    請求の範囲第1項のワクチン。
  3. (3)抗原性蛋白質が多数の異つた血清型に由来する淋
    菌PIの混合物である、特許請求の範囲第1項のワクチ
    ン。
  4. (4)抗原性蛋白質がB群15型髄膜炎菌外膜蛋白質組
    合せである、特許請求の範囲第1項のワクチン。
  5. (5)抗原性蛋白質が髄膜炎菌C群ポリサッカライド/
    ¥ヘモフイルス¥・¥インフルエンザエ¥外膜蛋白質結
    合体である、特許請求の範囲第1項のワクチン。
  6. (6)抗原性蛋白質が麻疹ビールス融合蛋白質である、
    特許請求の範囲第1項のワクチン。
  7. (7)清浄剤が双性イオン性、カチオン性、アニオン性
    またはノニオン性清浄剤である、特許請求の範囲第1項
    のワクチン。
  8. (8)清浄剤がツビツタジエントZ3−10、ツビツタ
    ジエントZ3−14、N−ラウロイルザルコシン、デオ
    キシコール酸ナトリウム、トリトンX−100、ツウイ
    ーン20およびブリジ58からなる群から選択される、
    特許請求の範囲第2項または第3項のワクチン。
  9. (9)清浄剤がツビツタジエントZ−14およびデオキ
    シコール酸ナトリウムからなる群から選択される、特許
    請求の範囲第4項のワクチン。
  10. (10)吸着剤がリン酸アルミニウム、水酸化アルミニ
    ウムまたはリン酸カルシウムである、特許請求の範囲第
    1項のワクチン。
  11. (11)吸着剤がリン酸アルミニウムである、特許請求
    の範囲第10項のワクチン。
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DE3571551D1 (en) 1989-08-24

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