JPH08198900A - 毛髪特異抗体の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明は、化粧料に利用される毛髪に特異的に
結合する抗毛髪ケラチン抗体の精製方法を提供する。 【構成】毛髪に特異的に結合する抗体を得るのに際し、
架橋構造を有するヒト毛髪のケラチンタンパク繊維を液
体中で還元処理し、ついで不溶物を除いた溶液から還元
剤を除去することにより得られるケラチンポリマーを担
体とし、アフィニティークロマトグラフィーにより毛髪
特異抗体を含む試料より毛髪特異抗体を精製する毛髪特
異抗体の精製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、化粧料に利用される毛
髪に特異的に結合する抗毛髪ケラチン抗体の精製方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、抗体を利用した化粧料の研究がな
されている (特開平05−163123号公報）。抗体を用いる
化粧料は、抗体が蛋白質であること等から、毛髪を損傷
させず、また毛髪特異的であるため皮膚に対する刺激も
少ない等の利点を有する。

【０００３】ここで用いられる抗体は、血清、乳、卵か
ら得られるポリクローナル抗体であるため、エタノール
やカラム操作を用いて高純度に精製された抗体画分に
は、抗原特異抗体だけでなく、非特異抗体も含有され
る。そこで、特異抗体自身を毛髪へ効率的に結合させる
ためには、さらに特異抗体だけを単離して得られる毛髪
特異抗体画分を使用することが望ましい。

【０００４】従来、その毛髪特異抗体画分は、抗体画分
から毛髪由来の抗原を結合したアガロースゲルを用いた
アフィニティークロマトグラフィーを行うことによって
容易に得ることができる。しかしながら、この毛髪由来
の抗原を結合したアガロースゲルを作製するためには、
抗原が可溶化したものでなければならず、さらにアガロ
ースゲルは抗原を結合させるために予めＣＮＢｒ等で活
性化しておく必要がある。そのため、操作上煩雑かつ高
価なものになり、産業上用いるには高価な医薬品に制限
されており、化粧料に応用することはできなかった。さ
らに、アフィニティークロマトグラフィー使用時に、抗
原が担体から外れてしまい特異抗体中に混入するという
問題があった。

【０００５】そこで本発明者らは、上記課題を達成する
方法を鋭意検討した結果、架橋構造を有する毛髪のケラ
チンタンパク繊維を液体中で還元処理し、ついで不溶物
を除いた溶液から還元剤を除去することにより得られる
ケラチンポリマーを担体としたアフィニティークロマト
グラフィーを行なうことにより、上記目的が達成される
ことを見いだし、本発明を完成した。また、その際の毛
髪特異抗体は、毛髪由来のケラチンタンパク質のカルボ
キシメチル化物で免疫して得られる抗体であれば、回収
効率が良く、さらに安価に製造できることが確認され
た。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
目的とするところは、毛髪特異抗体を含む血清、乳、卵
から毛髪に対する特異抗体を精製する上で、安価でしか
も抗原の混入のない方法を提供するにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
の、本発明の請求項１は、毛髪特異抗体を含む血清、
乳、卵から毛髪特異抗体をアフィニティークロマトグラ
フィーを用いて精製する際に、その担体として架橋構造
を有する毛髪ケラチンタンパク繊維を液体中で還元処理
し、ついで不溶物を除いた溶液から還元剤を除去するこ
とにより得られるケラチンポリマーを用いる毛髪特異抗
体の精製方法である。

【０００８】また、本発明の請求項２は、毛髪特異抗体
が毛髪由来のケラチンタンパク質のカルボキシメチル化
物で免疫して得られる抗体であることを特徴とする請求
項１記載の毛髪特異抗体の精製方法である。

【０００９】以下、本発明について詳細に説明する。

【００１０】本発明に用いるケラチンの原料としては、
ヒト毛髪が挙げられる。

【００１１】そのケラチン原料からは還元剤を用いてケ
ラチンを抽出することができる。還元剤としては一般的
なもので良く、チオグリコール酸、メルカプトエタノー
ルや亜硫酸水素ナトリウムが用いられる。

【００１２】これら還元剤の濃度は、ケラチン含有物質
10 gに対して0.05-0.5モルが好ましい。

【００１３】ケラチン含有物質の還元処理に用いる溶媒
は、使用時の簡便さから水や緩衝液が用いられる。その
量は、ケラチン含有物質の溶媒に対する割合が0.５−１
０重量％程度が好ましい。

【００１４】また、ヒト毛髪はジスルフィド結合が開裂
しても水素結合のために、液体媒体に対する溶解性が十
分でない時がある。この様な場合は液体媒体中に尿素、
チオ尿素等のタンパク質変性剤：水酸化ナトリウム、ア
ンモニア等のアルカリ：塩化ナトリウム等の無機塩など
を溶解助剤として含有させ還元物の溶解性を付与した溶
液を用いるのが良い。

【００１５】このような溶解助剤は、その用量が多いほ
ど有効であるが、液体媒体に対する溶解性や後の還元剤
等の除去操作の効率を考慮して適当量が決定される。

【００１６】還元可溶化反応は中性でも良好な結果が得
られるが、望ましくはアルカリ性下、さらに望ましくは
pH10-11 で行なうことが好ましい。

【００１７】また、反応温度と反応時間は、還元反応が
完全に行なわれるように適宜組み合わせる。たとえば、
室温では3-6 時間、5 ℃では24-48 時間、40-60 ℃では
30分-2時間反応を行なえば十分である。

【００１８】このようにして得られた還元型ケラチン溶
液中の還元剤や溶解助剤等の除去処理の前に、溶液中に
存在している不溶物を予め遠心分離や濾過によって除去
しておく。

【００１９】不溶物の除去後、還元剤や溶解助剤等の除
去処理を行なう。還元剤の除去は、透析、膜濾過、電気
透析等の手段で行なう。この除去により還元型ケラチン
は、次第に酸化され、ジスルフィド結合が生じ白色のケ
ラチンポリマーが作製される。そこでこのケラチンポリ
マーを回収し、イオン交換水で洗浄する。このケラチン
ポリマー中のアミノ酸100 残基あたり、システインが0.
1-1.0 個、シスチンが5-20個含まれている。

【００２０】このケラチンポリマーはこのままでも使用
できるが、特異抗体の回収率の向上およびカラムへの充
填のしやすさという観点からは、粒径を小さくする必要
がある。粒径を小さくするためには水中でホモジナイザ
ーを用いる方法や、乾燥後に乳鉢等で粉砕する方法が用
いられる。

【００２１】乾燥後、粉砕したケラチンポリマーは、再
び水中にもどすことにより、膨潤したケラチンポリマー
になる。

【００２２】つぎに、この膨潤したケラチンポリマーを
カラムに充填する。カラムのサイズおよびゲルの量は、
特異抗体を含有する試料の量によって適宜調節される。
特異抗体の総量が100mg であれば、ケラチンポリマーは
10-1000mg であれば良い。好ましくは30-100mgである。

【００２３】ここで用いる毛髪特異抗体とは、毛髪およ
び毛髪由来抗原であるケラチン、さらにはカルボキシメ
チル化ケラチンで免疫した牛、馬、羊、山羊、ニワト
リ、ウサギ、から得た初乳や乳、卵、血清に含まれる毛
髪に特異的に結合する抗体である。

【００２４】また、カラムに添加する試料は、初乳や
乳、卵、血清のままでもよいが、カラム効率を考える
と、ある程度イオン交換カラムやエタノール、硫酸アン
モニウム（硫安）塩析で精製されたものが望ましい。

【００２５】つぎに、このカラムを用いて特異抗体の精
製を行なう。ケラチンポリマー充填カラムはリン酸緩衝
生理食塩水 (pH 7.4、ＰＢＳ）を用いて平衡化してお
く。流速は0.5ml/min 以下が望ましい。

【００２６】そこで、毛髪特異抗体含有試料の添加を行
う。試料のpHはあらかじめ中性付近に調整しておき、試
料をカラムに添加する。試料の添加は、カラムから流出
した液をさらにカラムにもどすといった循環方式が、抗
体をケラチンポリマーに吸着させるために好ましい。そ
の時間は1-24時間の範囲で行なわれる。反応は室温から
4 ℃の範囲で行うことができる。

【００２７】試料添加終了後、カラムをＰＢＳで洗浄す
る。洗浄は、溶出液にタンパクが検出されなくなるまで
行なう。十分に洗浄後、0.1M Glycine-HCl (pH 2.5) を
用いて特異抗体をケラチンポリマーから脱離させる。回
収された特異抗体含有画分のpHは低くなっているので、
抗体の失活を防ぐためにトリス緩衝溶液を用いて中性付
近までもどしておく。この操作により、毛髪特異抗体は
90% 以上の回収率で得ることができる。また、単位タン
パクあたりの抗体活性 (比活性) は、最初の試料の特異
抗体含量にもよるが、約３倍から1000倍まで上げること
ができる。

【００２８】この方法を用いた場合、回収された特異抗
体含有画分にはケラチンタンパクの混入はない。また、
このカラムは繰り返し用いることができ、カラムの耐久
性として少なくとも約100 回は連続して用いることがで
きる。

【００２９】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれらの実施例により限定されるもの
ではない。

【００３０】実施例１ 抗カルボキシメチル化ケラチン
抗体の調製 Ａ．抗原（カルボキシメチル化ケラチン）の調製 男性の健常毛髪５g と女性の健常毛髪５g とを混合し、
２％ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム（３
Ｅ．Ｏ．）水溶液にて洗浄した。洗浄した健常毛髪を２
５００mlの、８Ｍ尿素及び０．２Ｍ２−メルカプトエタ
ノールを含有する０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．
２）中で５０℃窒素バブリング下にて１時間撹拌し、テ
フロンホモジナイザーを用いてすりつぶした。上記の抽
出操作を繰り返し、得られた抽出液を１，０００×Ｇで
３０分間遠心することで不溶物を除き、毛髪ケラチン抗
原抽出液を得た。これに２００g のモノヨード酢酸（予
め４００g のトリスを溶かした溶液７６０mlに溶かす）
溶液を加え、室温遮光下で１時間撹拌反応させた。７ml
の２−メルカプトエタノールを加えて反応を止め、充分
量の水に対して透析し、５μｍのフィルターを通し、不
溶物を除去し毛髪ケラチン抗原水溶液を得た（６リット
ル）。さらに、この液４容量部に０．５Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（pH４．２）１容量部を添加し（pH４．２にな
る様に酢酸で調整）、毛髪ケラチンを等電点沈澱させ
た。１０，０００×Ｇで１０分間遠心し、上清部を除
き、沈澱物を集めた。その沈澱物を生理食塩水に溶解さ
せ、０．２μｍのフィルターを通して除菌し、さらに限
外濾過膜にて濃縮してカルボキシメチル化ケラチンを得
た（蛋白質として２．６g ）。

【００３１】Ｂ．牛の免疫化 上記で調製したカルボキシメチル化ケラチン抗原溶液の
蛋白質濃度を生理食塩水にて２０mg/ml に調整し、その
溶液とフロインドの完全アジュバントを１：１の容量割
合で混合して油中水型のエマルジョンを作製した。出産
２か月前の妊娠ホルスタイン牛２頭の首に１頭当たり
５．０mlの前記エマルジョンを皮下投与した。その後１
０日間隔で、フロインドの不完全アジュバントで作製し
た初回免疫と同量の抗原を含んだエマルジョンを、皮下
あるいは筋注にて投与し免疫化した（１〜３回目；皮下
投与、４〜５回目；筋注）。

【００３２】Ｃ．抗体の採取と精製 上記抗原を免疫した牛の初乳を出産直後より３日間補集
した。クリームセパレーターを用いて、初乳より脂肪層
を除き、脱脂乳を得た。このようにして得られた脱脂乳
から、以下のような方法にて抗体の分画精製を行った。
すなわち、脱脂乳に０．１Ｎ塩酸を添加してpH４．５に
調整し、カゼインを沈澱させた。沈澱物を濾布にて荒く
除いた後、２，５００×Ｇの連続遠心操作にて上清を得
た。得られた上清を中和した後、３３％飽和になるよう
に硫安を加え、抗体を塩析させた。２，５００×Ｇの連
続遠心操作にて沈澱部を集め、ＰＢＳに溶解した。この
硫安塩析操作を繰り返した。得られた溶液を１０mMＰＢ
Ｓ（pH７．５）に対して透析し、同緩衝液にて平衡化し
た２リットルのＤＥＡＥセルロースカラム（ＤＥ−５
２，ワットマン製）に５回に分けて適用した。同緩衝液
にて、未吸着の蛋白を洗い流した後、５０mM塩化ナトリ
ウム含有の同緩衝液にて抗体を溶出させ、この画分を集
めた（抗体として２００g ）。この画分の抗体純度は９
０％以上であった。

【００３３】Ｄ．対照抗体の調製 免疫化しない牛の初乳からも本手法と同様に抗体を精製
し、これを対照抗体とした。なお、比較例に使用した対
照抗体は、ＤＥＡＥ−セルロースカラムで精製した、純
度９０％以上のものである。

【００３４】実施例２ ケラチンポリマーの調製 ヒト毛髪20g を3%β−メルカプトエタノールと1mM EDTA
を含む8M尿素水溶液 (600ml) に浸漬し、10% 水酸化カ
リウムでpHを10.5にした。ついで脱気操作を行なったの
ちに密閉した。室温で3 時間攪拌し還元を行なった後、
6N HClでpHを中性に戻し、テフロン・ガラスホモジナイ
ザーを用いてすり潰した。ついで、12,000 r.p.m、4 ℃
で30分間遠心分離を行ない740ml の上清を得た。つぎ
に、還元剤を除去するために透析膜を用い、10 Lのイオ
ン交換水に対して３時間×３回透析操作を行なった。そ
の結果、白色のケラチンポリマーを得ることができた。
結果として、ヒト毛髪20g から10.0g の乾燥ケラチンポ
リマーを得ることができた。アミノ酸分析を行なった結
果、アミノ酸100 残基あたりシステインを0.7 個、シス
チンが15.2個含まれていた。

【００３５】実施例３( ケラチンポリマーカラムの作
製) 実施例２で得られたケラチンポリマーを80℃の乾燥器で
24時間乾燥させた。乾燥ケラチンポリマーを乳鉢で粉砕
後、1gをＰＢＳに懸濁させ、5 時間放置した。つぎに、
このケラチンを1.0 ×10 cm のカラムに流し込み、ＰＢ
Ｓを0.5ml/minの流速で2 時間流すことにより、平衡化
した。

【００３６】実施例４ (アフィニティークロマトグラフ
ィーによる毛髪特異抗体の回収) つぎに、このカラムを用いて特異抗体の精製を行なっ
た。実施例３で作製したカラムに、実施例１で作製した
純度９０％以上の免疫および非免疫精製抗体をＰＢＳで
1mg/mlに調整し300ml を循環させながらそれぞれ適用し
た。その後、溶出液にタンパクが検出されなくなるまで
カラムをＰＢＳで洗浄した。洗浄後、0.1MGlycine-HCl
(pH 2.5) を用いて特異抗体をケラチンポリマーから脱
離させた。回収した特異抗体含有画分にTris緩衝液を添
加してpHを中性にした。回収した免疫特異抗体含有画分
には添加試料の90% の特異抗体が回収された。それと比
較して非免疫精製抗体はゲルに特異的に吸着しなかっ
た。得られた特異抗体の比活性は、約100 倍に増加し
た。また、この操作を100 回行なったが、回収率や比活
性の上昇に変化はなかった。さらに、回収された特異抗
体には、カラムの担体であるケラチンポリマーの混入
は、全く見られなかった。

【００３７】

【発明の効果】本発明によれば、毛髪特異抗体を含む血
清、乳、卵から毛髪に対する特異抗体を精製する上で、
毛髪由来のケラチンポリマーを担体としたアフィニティ
クロマトグラフィーを行うことにより、安価でしかも抗
原の混入のない方法を提供することができる。そして、
ヒト毛髪由来のケラチンポリマーに毛髪特異抗体を吸着
させ、非特異抗体を除去することにより、血清、乳、卵
から毛髪特異抗体を安価に精製できる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 毛髪特異抗体を含む血清、乳、卵から毛
   髪特異抗体をアフィニティークロマトグラフィーを用い
   て精製する際に、その担体として、架橋構造を有する毛
   髪ケラチンタンパク繊維を液体中で還元処理し、ついで
   不溶物を除いた溶液から還元剤を除去することにより得
   られるケラチンポリマーを用いる毛髪特異抗体の精製方
   法。
2. 【請求項２】 毛髪特異抗体が毛髪由来のケラチンタン
   パク質のカルボキシメチル化物で免疫して得られる抗体
   であることを特徴とする請求項１記載の毛髪特異抗体の
   精製方法。