JPH08173173A - フェニルピルビン酸の製造方法 - Google Patents
フェニルピルビン酸の製造方法Info
- Publication number
- JPH08173173A JPH08173173A JP32001794A JP32001794A JPH08173173A JP H08173173 A JPH08173173 A JP H08173173A JP 32001794 A JP32001794 A JP 32001794A JP 32001794 A JP32001794 A JP 32001794A JP H08173173 A JPH08173173 A JP H08173173A
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- Japan
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- phenylpyruvic acid
- phenylalanine
- microorganism
- reaction
- culture
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- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 アクロモバクター属に属する微生物の菌体も
しくは菌体処理物をＬ−フェニルアラニンに作用せし
め、生成するフェニルピルビン酸を採取することを特徴
とするフェニルピルビン酸の製造方法。 【効果】 本発明によれば、Ｌ−フェニルアラニンより
安価かつ簡便にフェニルピルビン酸を製造することがで
きる。
しくは菌体処理物をＬ−フェニルアラニンに作用せし
め、生成するフェニルピルビン酸を採取することを特徴
とするフェニルピルビン酸の製造方法。 【効果】 本発明によれば、Ｌ−フェニルアラニンより
安価かつ簡便にフェニルピルビン酸を製造することがで
きる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はフェニルピルビン酸の製
造方法に関する。フェニルピルビン酸は種々の医薬品の
合成中間体として有用である。
造方法に関する。フェニルピルビン酸は種々の医薬品の
合成中間体として有用である。
【０００２】
【従来技術と問題点】フェニルピルビン酸の化学的製造
法としては、触媒量のエタノールアミン存在下でベンズ
アルデヒドとヒダントインを反応させる方法（特公平5-
37134）が知られている。しかし、この方法は操作が煩
雑で収率が低いという問題点を有している。一方、酵素
的製造法としては、Ｌ−フェニルアラニンにモルガネラ
属（Bioseparation No.2,p147,1991）、シュードモナス
属（特開昭57-146573）、プロテウス属（Journal of Ba
cteriology Vol.121,No.2,p656,1975）に属する微生物
を作用させ、フェニルピルビン酸を製造する方法が知ら
れている。しかし、いずれの微生物を用いても生成物の
蓄積濃度が低いという問題点を有している。
法としては、触媒量のエタノールアミン存在下でベンズ
アルデヒドとヒダントインを反応させる方法（特公平5-
37134）が知られている。しかし、この方法は操作が煩
雑で収率が低いという問題点を有している。一方、酵素
的製造法としては、Ｌ−フェニルアラニンにモルガネラ
属（Bioseparation No.2,p147,1991）、シュードモナス
属（特開昭57-146573）、プロテウス属（Journal of Ba
cteriology Vol.121,No.2,p656,1975）に属する微生物
を作用させ、フェニルピルビン酸を製造する方法が知ら
れている。しかし、いずれの微生物を用いても生成物の
蓄積濃度が低いという問題点を有している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、安価
かつ簡便にフェニルピルビン酸を製造する方法を提供す
ることにある。
かつ簡便にフェニルピルビン酸を製造する方法を提供す
ることにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上述の事情
に鑑み検討を重ねた結果、アクロモバクター属に属する
微生物がＬ−フェニルアラニンをフェニルピルビン酸に
変換しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
に鑑み検討を重ねた結果、アクロモバクター属に属する
微生物がＬ−フェニルアラニンをフェニルピルビン酸に
変換しうることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、Ｌ−フェニルアラニ
ンをフェニルピルビン酸に変換する能力を有するアクロ
モバクター属に属する微生物の培養物、該培養物より分
離した微生物菌体または該微生物菌体の処理物を、Ｌ−
フェニルアラニンに作用せしめ、フェニルピルビン酸を
採取することを特徴とするフェニルピルビン酸の製造方
法に関するものである。
ンをフェニルピルビン酸に変換する能力を有するアクロ
モバクター属に属する微生物の培養物、該培養物より分
離した微生物菌体または該微生物菌体の処理物を、Ｌ−
フェニルアラニンに作用せしめ、フェニルピルビン酸を
採取することを特徴とするフェニルピルビン酸の製造方
法に関するものである。
【０００６】本発明で使用する微生物は、アクロモバク
ター属に属し、Ｌ−フェニルアラニンをフェニルピルビ
ン酸に変換しうる能力を有する微生物であればいずれを
用いてもよいが、具体的にはアクロモバクター・シクロ
クラスツATCC-15446を例示することができる。
ター属に属し、Ｌ−フェニルアラニンをフェニルピルビ
ン酸に変換しうる能力を有する微生物であればいずれを
用いてもよいが、具体的にはアクロモバクター・シクロ
クラスツATCC-15446を例示することができる。
【０００７】これらの微生物は、野生株または変異株の
いずれでもよいし、細胞融合もしくは遺伝子操作などの
遺伝学的手法により誘導される組み替え株等も用いるこ
とができる。
いずれでもよいし、細胞融合もしくは遺伝子操作などの
遺伝学的手法により誘導される組み替え株等も用いるこ
とができる。
【０００８】このような微生物の菌体を得るには、当該
微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。そのよ
うな培地には格別の制限はなく、通常の炭素源、窒素
源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常
の培地でよい。例えば、炭素源としては、上記微生物の
利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グル
コース、フルクトース、シュークロース、デキストリン
等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等
のアルコール類、フマール酸、クエン酸、酢酸、プロピ
オン酸等の有機酸類及びこれらの塩類、パラフィン等の
炭化水素類あるいはこれらの混合物を使用することがで
きる。
微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。そのよ
うな培地には格別の制限はなく、通常の炭素源、窒素
源、無機イオン、更に必要に応じ有機栄養源を含む通常
の培地でよい。例えば、炭素源としては、上記微生物の
利用可能であればいずれも使用でき、具体的には、グル
コース、フルクトース、シュークロース、デキストリン
等の糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロール等
のアルコール類、フマール酸、クエン酸、酢酸、プロピ
オン酸等の有機酸類及びこれらの塩類、パラフィン等の
炭化水素類あるいはこれらの混合物を使用することがで
きる。
【０００９】窒素源としては例えば、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム等の無機塩のアンモニウム塩、フ
マル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸
のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の
硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンステ
ィープリカー等の有機窒素化合物、あるいはこれらの混
合物を使用することができる。
ム、塩化アンモニウム等の無機塩のアンモニウム塩、フ
マル酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸
のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等の
硝酸塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンステ
ィープリカー等の有機窒素化合物、あるいはこれらの混
合物を使用することができる。
【００１０】他に無機塩、微量金属塩、ビタミン類等、
通常の培養に用いられる栄養源を適宜、混合して用いる
ことができる。また、培地には、Ｌ−フェニルアラニン
を添加することによってＬ−フェニルアラニンをフェニ
ルピルビン酸に変換する能力の高い菌体を得られる場合
がある。
通常の培養に用いられる栄養源を適宜、混合して用いる
ことができる。また、培地には、Ｌ−フェニルアラニン
を添加することによってＬ−フェニルアラニンをフェニ
ルピルビン酸に変換する能力の高い菌体を得られる場合
がある。
【００１１】培養条件にも格別の制限はなく、例えば、
培養pHは3.0-9.0、好ましくは、4.0-8.0、培養温度は20
-45℃、好ましくは25-40℃の範囲内で、その微生物の生
育に適した条件下5-120時間、好ましくは12-72時間程度
培養すれば良い。
培養pHは3.0-9.0、好ましくは、4.0-8.0、培養温度は20
-45℃、好ましくは25-40℃の範囲内で、その微生物の生
育に適した条件下5-120時間、好ましくは12-72時間程度
培養すれば良い。
【００１２】上記微生物をＬ−フェニルアラニンに作用
せしめる方法としては、かくして得られる微生物培養物
をそのまま用いる方法、微生物培養物から遠心分離等に
より菌体を分離し、これをそのままもしくは洗浄した
後、緩衝液、水等に再懸濁したものに、Ｌ−フェニルア
ラニンを添加し反応させる方法等がある。また、微生物
菌体の処理物としては、菌体破砕物、アセトン処理菌
体、凍結乾燥菌体、あるいは、これらの菌体あるいは菌
体処理物をポリアクリルアミドゲル法、カラギーナン
法、アルギン酸法等の公知の方法で固定化した菌体を用
いることができる。更に、微生物菌体処理物としては、
菌体抽出物もしくはこれより公知の方法を組み合わせて
精製取得した酵素も使用できる。
せしめる方法としては、かくして得られる微生物培養物
をそのまま用いる方法、微生物培養物から遠心分離等に
より菌体を分離し、これをそのままもしくは洗浄した
後、緩衝液、水等に再懸濁したものに、Ｌ−フェニルア
ラニンを添加し反応させる方法等がある。また、微生物
菌体の処理物としては、菌体破砕物、アセトン処理菌
体、凍結乾燥菌体、あるいは、これらの菌体あるいは菌
体処理物をポリアクリルアミドゲル法、カラギーナン
法、アルギン酸法等の公知の方法で固定化した菌体を用
いることができる。更に、微生物菌体処理物としては、
菌体抽出物もしくはこれより公知の方法を組み合わせて
精製取得した酵素も使用できる。
【００１３】菌体または菌体処理物の使用量は、所与の
反応の場合において目的とする効果を発揮する量（有効
量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な
予備実験により容易に求められるが、例えば、洗浄湿潤
菌体の場合、反応1dl当たり1ないし40gである。
反応の場合において目的とする効果を発揮する量（有効
量）であればよく、この有効量は当業者であれば簡単な
予備実験により容易に求められるが、例えば、洗浄湿潤
菌体の場合、反応1dl当たり1ないし40gである。
【００１４】Ｌ−フェニルアラニンはそのまま、あるい
は、水に溶解し、叉は反応に影響を与えないような有機
溶媒に溶解したり、界面活性剤等に分散させたりして、
反応始めから一括にあるいは分割して添加して用いても
良い。
は、水に溶解し、叉は反応に影響を与えないような有機
溶媒に溶解したり、界面活性剤等に分散させたりして、
反応始めから一括にあるいは分割して添加して用いても
良い。
【００１５】反応pHはpH3-9、好ましくはpH5-8、反応温
度は10-60℃好ましくは20-40℃の範囲で、1-120時間程
度、撹拌下あるいは静置下で行う。基質の使用濃度は特
に制限されないが、0.1%-10%程度が好ましい。
度は10-60℃好ましくは20-40℃の範囲で、1-120時間程
度、撹拌下あるいは静置下で行う。基質の使用濃度は特
に制限されないが、0.1%-10%程度が好ましい。
【００１６】反応によって生成蓄積したフェニルピルビ
ン酸は、イオン交換樹脂、合成吸着樹脂等の樹脂を用い
る方法や酸性条件下で沈澱せしめる方法等により、反応
終了混合物より分離採取することができる。
ン酸は、イオン交換樹脂、合成吸着樹脂等の樹脂を用い
る方法や酸性条件下で沈澱せしめる方法等により、反応
終了混合物より分離採取することができる。
【００１７】以下本発明を具体的に実施例にて説明する
が、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
が、本発明は実施例のみに限定されるものではない。
【００１８】なお実施例におけるＬ−フェニルアラニ
ン、フェニルピルビン酸の定量は、高速液体クロマトグ
ラフィー（カラム：YMC社製 AQ-312 ODS、溶離液：0.1
M NaH2PO4(pH 2.8に調整したもの):アセトニトリル=4:
1、流速：0.5ml/分、温度：30℃、検出：UV254nm）によ
り行った。
ン、フェニルピルビン酸の定量は、高速液体クロマトグ
ラフィー（カラム：YMC社製 AQ-312 ODS、溶離液：0.1
M NaH2PO4(pH 2.8に調整したもの):アセトニトリル=4:
1、流速：0.5ml/分、温度：30℃、検出：UV254nm）によ
り行った。
【００１９】実施例 Ｌ−フェニルアラニン0.25g、酵母エキス0.5g、ポリペ
プトン0.5g、(NH4)2SO40.25g、K2HPO4 0.15g、KH2PO4
0.05g、MgSO4・7H20 0.025g、FeSO4・7H2O 0.5mg、MnSO4・
4H2O 0.5mgを含む50mlの培地(pH 7.0)を500ml容振とう
フラスコに入れ、120℃で15分間殺菌した。
プトン0.5g、(NH4)2SO40.25g、K2HPO4 0.15g、KH2PO4
0.05g、MgSO4・7H20 0.025g、FeSO4・7H2O 0.5mg、MnSO4・
4H2O 0.5mgを含む50mlの培地(pH 7.0)を500ml容振とう
フラスコに入れ、120℃で15分間殺菌した。
【００２０】これにあらかじめブイヨン寒天培地で30℃
にて24時間培養したアクロモバクター・シクロクラスツ
ATCC-15446の菌体を一白金耳量接種し、30℃にて24時間
振とう培養した。培養後、培養物より菌体を遠心分離に
より集め、50mlの0.1M MES-NaOH緩衝液(pH5.0)にて洗浄
し、再び遠心分離により洗浄菌体を調製した。この湿菌
体1.0gをＬ−フェニルアラニン1.0gを含む0.1M MES-NaO
H緩衝液(pH5.0)に懸濁し50mlとし、31.5℃にて11時間反
応を行なった。
にて24時間培養したアクロモバクター・シクロクラスツ
ATCC-15446の菌体を一白金耳量接種し、30℃にて24時間
振とう培養した。培養後、培養物より菌体を遠心分離に
より集め、50mlの0.1M MES-NaOH緩衝液(pH5.0)にて洗浄
し、再び遠心分離により洗浄菌体を調製した。この湿菌
体1.0gをＬ−フェニルアラニン1.0gを含む0.1M MES-NaO
H緩衝液(pH5.0)に懸濁し50mlとし、31.5℃にて11時間反
応を行なった。
【００２１】反応収了後、フェニルピルビン酸の生成量
を測定したところ、1.8g/dlのフェニルピルビン酸が生
成していた。
を測定したところ、1.8g/dlのフェニルピルビン酸が生
成していた。
【００２２】さらに、該酵素反応液を遠心分離し、菌体
を除いた後、減圧濃縮を行い、10mlの反応上清液を得
た。この反応上清液にpH1.0になるまでHClを添加し、フ
ェニルピルビン酸を析出させた。析出したフェニルピル
ビン酸はろ過し、水で再結晶後、乾燥し、0.7gのフェニ
ルピルビン酸を得た。
を除いた後、減圧濃縮を行い、10mlの反応上清液を得
た。この反応上清液にpH1.0になるまでHClを添加し、フ
ェニルピルビン酸を析出させた。析出したフェニルピル
ビン酸はろ過し、水で再結晶後、乾燥し、0.7gのフェニ
ルピルビン酸を得た。
【００２３】
【発明の効果】本発明によれば、Ｌ−フェニルアラニン
よりフェニルピルビン酸を安価かつ簡便に製造すること
ができる。
よりフェニルピルビン酸を安価かつ簡便に製造すること
ができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 近藤 正義 佐賀県佐賀郡諸富町大字諸富津450番地 味の素株式会社九州工場内
Claims (1)
- 【請求項１】Ｌ−フェニルアラニンをフェニルピルビン
酸に変換する能力を有するアクロモバクター属に属する
微生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体また
は該微生物菌体の処理物を、Ｌ−フェニルアラニンに作
用せしめ、フェニルピルビン酸を採取することを特徴と
するフェニルピルビン酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32001794A JPH08173173A (ja) | 1994-12-22 | 1994-12-22 | フェニルピルビン酸の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32001794A JPH08173173A (ja) | 1994-12-22 | 1994-12-22 | フェニルピルビン酸の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08173173A true JPH08173173A (ja) | 1996-07-09 |
Family
ID=18116830
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32001794A Pending JPH08173173A (ja) | 1994-12-22 | 1994-12-22 | フェニルピルビン酸の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH08173173A (ja) |
-
1994
- 1994-12-22 JP JP32001794A patent/JPH08173173A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040427 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040921 |