JPH0797314A - 生物学的活性物質及び微粒子からなる組成物 - Google Patents

生物学的活性物質及び微粒子からなる組成物

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JPH0797314A JP6110886A JP11088694A JPH0797314A JP H0797314 A JPH0797314 A JP H0797314A JP 6110886 A JP6110886 A JP 6110886A JP 11088694 A JP11088694 A JP 11088694A JP H0797314 A JPH0797314 A JP H0797314A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 生物学的活性物質を孵化前に鳥類の卵に投与
するための方法に関する。 【構成】 外膜及び内膜によって規定される気室である
卵の一端を除いて膜間に液が存在するこれらの外膜及び
内膜を有する卵への注射に使用するのに適している微粒
子であって、両膜間の液を介して気室の反対側の卵末端
に移動するサイズ及び密度を有している微粒子、に担持
された生物学的活性物質を投与することを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は生物学的活性物質を鳥類に投与す
るための方法論に関し、特に孵化前の卵に活性物質を投
与することに関する。本発明はまた、この方法及び動物
に材料を供給するための他の方法を行うのに有用な微粒
子組成物、並びにこのような組成物を製造する方法に関
する。
【０００２】卵に注射することの魅力は従来から認識さ
れている。卵への注射の当初の目的は、ワクチンのため
の成長培地として卵を使用し、種々のワクチンを調製す
ることであった。その際には卵から採取されたワクチン
は要望通りに使用された。卵注射は毒性試験にも使用さ
れている。より最近では、結局は卵から孵化するトリに
対し、有益な又は治療学的に何らかの影響を与えるとい
う卵注射の目的がある。生きているトリではなく卵に注
射することの１つの利点は、注射の容易性に関係する。
卵は新生児のトリ又はそれよりも成長したトリに比べ、
固定し取り扱うことが効率的に行える。さらに、卵注射
には機械的な利便性に加え、生きているトリではなく胚
に接種でき、あるいは処置できるという特定の利点をも
明らかに有している。これらの利点は家禽産業におい
て、例えばニワトリ及び七面鳥にとって特に重要になっ
てきている。
【０００３】上記の目的及び他の目的をもって卵に注射
する魅力のために、幾つかの基本的な手法が試みられ
た。これらを一般に例示すれば、一種の加圧系を使用す
ることにより卵の殻を通して液を送るか、又は卵の殻に
開口を物理的に形成させ、次いで所望の液を添加するか
のいずれかがある。ある種の型の針の並びを使用する注
射は、このような目的で卵を物理的に開口させるための
基本的な手法の１つである。
【０００４】従来、所望の液は卵の気室(air cell)に、
又は卵黄嚢もしくは羊水に直接投与されていた。気室に
供給された液は卵の内膜を単に透過して近くの血管内に
移行する。この手法は、滅菌操作や滅菌器具が必要とな
るであろう装置を内膜に透過させる必要がないという利
点を有している。羊水への供給は、注射装置、通常は針
であるが、これが生存胚を傷付け、又は破壊してしまう
かもしれないという危険性をも招く。
【０００５】発育している胚に活性物質を投与すること
に関連するさらなる可能性ある問題はタイミングであ
る。特定の物質は発育の個々の段階で供給するのが最適
である。しかし、胚は別個の速度で発育する場合があ
る。つまり、１つの卵のための投与は発育の１７日目に
行うのが好ましい場合があるが、他の卵におけるタイミ
ングは１６日目又は１８日目が好ましいという場合があ
る。しかし、大量の数の卵を処置したい場合には、卵を
個々にモニターするのは実際的でない。また、活性物質
の中には長期の投与が望ましいものがあり、その際には
反復投与の日付を記録する必要がある。
【０００６】従って、先に提示した種々の組織に指向し
て卵に生物学的活性物質を投与するための方法が求めら
れている。例えば、このような方法があれば、都合良い
ことに単純であり、滅菌操作を行う必要がないであろ
う。さらに、この手法は好ましいことに、胚の種々の発
育速度に絡む問題が回避されており、その物質を反復投
与する必要がない。本発明はこのような要求を満足して
おり、従来の方法では達成できなかった利点を提供する
ものである。
【０００７】上述のように、本発明は、上記の方法及び
材料を動物に供給するための他の方法を実施するうえで
有用である微粒子組成物をも目的とする。微粒子は１ミ
クロンから２０００ミクロンまでのサイズ以上のサイズ
範囲の球形ポリマー粒子である。微粒子には、生物学的
活性物質が空洞内に均一に隔離されているマイクロカプ
セル、及び生物学的活性物質が微粒子全体に拡散されて
いる微小球が包含される。微粒子を調製するには、例え
ば溶媒留去、有機相分離、界面重合、エマルジョン重
合、及び噴霧乾燥などの多くの方法が使用できる。しか
し、ペプチド微粒子を調製するにはほんの２、３の方法
しか適用できない。多くのペプチドの物理化学的性質は
その微粒子生成を困難にしており、また微粒子に封入す
る際に不活性化を招く可能性がある。
【０００８】多くのポリマー、例えば多糖類、ポリエス
テル類及び非生体分解性合成ポリマーが微粒子のための
マトリックスとして使用されている。ペプチド類の微小
カプセル封入(microencapsulation)のための殆どの方法
ではポリエステル類、特にポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃ
ｏ−グリコリド）を使用している。ポリエステル類は生
体分解性又は生体腐食性であり、容易に入手でき、容易
に加工され、また非毒性であるので、この目的にとって
望ましい。
【０００９】乳酸及びグリコール酸の微小球は、多くの
ペプチドの取り扱いに適合している（若干の制限はある
ものの）溶媒留去法によって簡便に入手することができ
る。しかし、ペプチドを粒子形成させるうえで主要な障
害はペプチド分子の水溶性が高いことである。微小カプ
セル封入の典型的な方法はポリマー又は、エマルジョン
の親油性の相に対するそのペプチド化合物の親和性を基
礎にしている。その結果、ペプチドについての薬物のロ
ーディング（積載）は通常、従来使用されている溶媒留
去法の１０％以下でしかない。
【００１０】これらの問題を克服するためになされた従
来の努力には、二重エマルジョン手法の使用及び、シリ
コンオイルの添加によって誘発される相分離方法の使用
がこれまでは包含されていた。しかし、所望の速度で経
時的に放出する安定かつ活性な、ペプチドを封入する生
体分解性微粒子を調製するための方法は依然として要求
されている。
【００１１】本発明の１つの態様を簡単に説明すれば、
生物学的活性物質を卵に投与する方法であって、該物質
を含有する粒子担体を卵の気室に供給することを特徴と
する方法に関する。この粒子担体は内膜及び外膜（これ
らは球状端で気室を形成する）間を、気室から離れた位
置まで移動する。都合良いことに、生物学的活性物質は
経時的にこの担体から放出される。さらに、粒子担体は
孵化前にトリに取り込まれるので、若トリへのこの生物
学的活性物質の投与を続行して行うことができる。
【００１２】生物学的活性物質を卵に投与し、発育して
いる若トリにもさらに投与するための方法を提供するの
が本発明の１つの目的である。本発明のさらなる目的
は、容易に実施でき、滅菌手法を施す必要がなく、卵内
にある発育している胚に損傷を負わす危険が最小限に抑
えられている、生物学的活性物質を投与するための方法
を提供することである。また、本発明の別の目的は、発
育している胚に長期にわたって、そしてそれによって招
来される若トリに生物学的活性物質を供給することので
きる方法を提供することである。
【００１３】本発明のさらなる目的及び利点は以下に記
載する本発明の好ましい態様の説明から明らかであろ
う。
【００１４】図１及び図２はＧＨＲＨを積載（ローディ
ング）する微小球からのＧＨＲＨの放出速度を表すイン
ビトロ試験のグラフである。本発明の原理の理解を助け
るため、ここに好ましい態様を引用し、特定の用語を使
用してそれを説明する。しかし、それによって本発明の
範囲の限定を意図するものでなく、当業者が普通に想起
できる本発明の原理の改変、修飾及びさらには適用も包
含されると解釈されるべきである。
【００１５】本発明は生物学的活性物質を投与するため
の有益な方法を提供するものである。発育している胚及
びそれから招来される若トリに供給する形態にある１つ
又はそれ以上の生物学的活性物質を含有する粒子担体が
提供される。鳥類の卵には２つの主要な殻膜がある。卵
白の薄い層のみがこれらの内膜及び外膜を分離してお
り、これらの膜は分離して気室を形成している広い末端
を除いて隣接している。本発明の方法は一般に、粒子担
体を卵の気室に設置することを包含する。意外にも、粒
子担体は内膜及び外膜間を移動し、気室から卵の反対の
末端にまで移動することが見いだされた。
【００１６】特定の担体及び生物学的活性物質を選択
し、経時的に該物質が長期間放出されるようにする。胚
は発育して若トリとなるので、具体的な担体はそのトリ
において具現化される。従って、担体は卵に生物学的活
性物質を供給するため、及び卵からトリが孵化した後で
はそのトリに該生物学的活性物質を供給するために利用
される。長期に放出できれば、特定の時間に生物学的活
性物質を投与しなければならないという問題が回避され
る。例えば、生物学的活性物質を供給するための目標時
間が胚の発育速度に応じて胚日(embryonic day)１６−
１８（Ｅ１６−Ｅ１８）の範囲である場合、本発明に従
えば該物質はＥ１５日目に投与することができ、７日間
にわたる該物質の長期の放出により、確実に該物質が所
望の時間に利用可能となる。本発明は同様に、特に長期
の胎仔発育期に、とりわけ胎仔が操作に対して比較的感
受性である場合はその後期に該物質を存在させる必要の
ある場合の問題に取り組むものである。
【００１７】充分に知られているように、鳥類の卵には
内膜と外膜とが含まれ、それらの間では一端に気室が形
成されている。外膜は通常、比較的堅い殻の真下にあ
り、それは発育期の胚を保護している。内膜は多くの有
害な物質、例えば胚を感染しかねない細菌を選別するの
で、これも胚を保護するための手段を提供している。本
発明の方法は卵の内膜及び外膜間の気室に特定の担体を
設置することに関する。
【００１８】特定の担体を気室に投与すれば、顕著な利
便性が得られる。特定の担体を卵内のこの場所に設置す
るための方法及びそのための装置は容易に入手できる。
さらに、気室は容易に場所決めすることができるので、
注射などによる設置は信頼性を持ってかつ安全に行うこ
とができる。卵の内膜は破られないので、滅菌操作を施
す必要がない。胚を傷付ける危険性も存在しない。
【００１９】卵の気室に材料を供給するための種々の手
法は知られている。方法は重要でないが、卵の破壊が最
小限に抑えられることが好ましい。気室への直接注射が
好ましい。この目的には通常、普通は約１８−２２ゲー
ジの針が備え付けられた皮下注射用シリンジが適してい
る。気室に注射するには、卵に針を数ミリメーター注射
することが必要となるだけである。針を挿入する前に殻
に穴を予備的にパンチし又はドリルし、針の障害を回避
し又は和らげることができる。要すれば、卵の穴はにか
わ、ろうなどの適当な物質で再度、栓をすることがで
き、あるいは開口したままで置いておてもよい。
【００２０】本発明の利点は、高速自動注射系を用いて
使用するのに充分適合できる点である。このような系の
多くのものが現在入手可能であり、例えばＰａｕｌらに
発行された米国特許第５，１３６，９７９号、Lewisら
に発行された米国特許第５，０５６，４６４号、Hebran
kに発行された米国特許第４，６８１，０６３号及び第
４，９０３，６３５号、及びMillerに発行された米国特
許第４，０４０，３８８号、第４，４６９，０４７号及
び第４，５９３，６４６号に記載されている［これらは
すべて、ノースカロライナのEmbrex, Inc. に譲渡され
ている］。これらの特許の開示は引用によって本明細書
に包含される。これらの装置は比較的迅速に卵の気室に
材料を投与するためのものである。さらに、Paulらの特
許に記載されているような利用可能な装置は種々のサイ
ズ、形及び方向の卵に適応できる。イノボジェクト(Ｉ
ＮＯＶＯＪＥＣＴ)の名称で市販されているEmbrex，In
c．自動注射系は良好な成績をもって使用されている。
【００２１】本発明は広範な生物学的活性物質をトリ又
はトリの卵に供給するのに有用である。「トリ」なる用
語は、鳥類種、特に卵又は肉を商業的に得るための家禽
を包含するものである。従って、トリなる用語には具体
的には、ニワトリのめんどり、おんどり及び雄ガモ、七
面鳥、カモ、ガチョウ、ウズラ、及びキジが包含され
る。
【００２２】投与する活性物質には、使用する粒子担体
に適合しそれから放出され得る、胚又は若トリに投与す
るのが望ましいと思われるものが包含される。生物学的
活性物質には神経ペプチド、ペプチド様疑似物質、抗
原、遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ）、酵素、ホルモン、抗
生物質、及び他の種々の生化学的物質が包含され、これ
らは個々に単独で、又は組み合わせて使用され得る。さ
らに、試験研究が目的である場合、例えば毒性試験にお
いて化合物を試験する場合などに適したものも活性物質
に包含され得る。本発明は本質的には物理的現象とし
て、即ち特定の担体を設置し移動させるという形態で実
施されるので、選択される生物学的活性物質は重要でな
いことは理解されよう。
【００２３】このような生物学的活性物質は当業者に周
知であり、多くの文献及び特許に引用されている。例え
ば、Federicksenらに対して発行された米国特許第５，
１０６，６１７号には、孵卵後約１８日目に卵内にて(i
n ovo)投与する場合、インターロイキン−２を含有する
Ｔ細胞成長因子を投与することの利用が記載されている
［これを引用によって本明細書に包含させる］。Federi
cksenはさらに、生ワクチン、例えば七面鳥ヘルペスウ
イルスワクチン及びバーザル病(Bursal Disease)ワクチ
ン、ルカート(Lukert)株、並びに非複製ワクチン、例え
ば死滅ウイルス、ペプチド、タンパク質及び抗−イディ
オタイプ抗体の両者の、ワクチンのin ovo同時投与が記
載されている。ＰＣＴ出願である１９９１年８月２２日
公開のＷＯ９１／１２０１６には、生理学的に活性なペ
プチドの投与が報告されている。下垂体ペプチドを例示
すれば、成長ホルモン、チロトロピン、α−メラニン形
成細胞刺激ホルモン、プロラクチン、黄体形成ホルモ
ン、アデノコルチコトロピン、及びβ−エンドルフィン
などが挙げられる。視床下部放出ホルモンを例示すれ
ば、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、ゴナドトロ
ピン放出ホルモン、ソマトスタチン、コルチコトロピン
放出ホルモン、及び成長ホルモン放出ホルモンなどがあ
る。胃腸ペプチドとしては、血管作用性腸管ポリペプチ
ド、コレシストキニン、ガストリン、サブスタンスＰ、
ニュウロテンシン、グルカゴン、ボムベシン(bombesi
n)、セクレチン及びモチリン(motilin)などが例示され
る。
【００２４】他の種々の物質が知られており、永続的に
より多くのものが同定されている。Wieglandに対して発
行された米国特許第４，９１７，０４５号には、生理学
的に許容し得る有機シリコン化合物又はケイ酸を骨組織
の成長刺激に使用することが記載されている。免疫系の
刺激は、ジニトロフェニル化キーホール・リムペット(k
eyhole limpet)ヘモシアニン(ＤＮＰ−ＫＬＭ)又はデキ
ストラン（ＤＮＰ−Ｄ）のin ovo注射によって行うこと
ができる。「種々の分子形態の同一ハプテンによるin o
vo感作後における雛の遅延型過敏症の誘発(Elicitation
of delayed type hypersensitivity in chicks after
in ovo sensitization with differentmolecular forms
of the same hapten)」, O.Moriya；Y.Ichikawa, Micr
obiol.Immunol.;27(9) pp.779-785(1983)。ＮaＨＣＯ3
によって緩衝化した等張塩中、ヒツジ成長ホルモン（ｏ
ＧＨ）をＥ１１日のニワトリにin ovo投与すると、体
重、筋肉成長及び飼料効率が増大することが示された。
「ニワトリの発育及び脂肪組織の発達を改変するin ovo
成長ホルモン(In Ovo Growth Hormone Alters Growth
and Adipose Tissue Development of Chickens,)」 P.
S.Hargis, S.L.Pardue,A.M.Lee 及びG.W.Sandel, Growt
h, Development & Aging, 1989, 53, pp.93-99。
【００２５】in ovoに存在させるのが望ましい物質を開
示している他の多くの報告が文献として存在する。例え
ば、”雛の胚の発育における解剖学的及び胎生学的変化
に対するダイアジノンの作用(Effects of Diazinon on
the Anatomical and Embryological changes in the De
veloping Chick Embryo,)”J.H.Cho, C.E.Lee.,Res.Re
p.Rural Dev.Adm.(Suweon),32(3 Vet.)1990,pp.35-47
（Ｅ３日目におけるダイアジノン）；”ニワトリ胚のin
ovoにおける発育阻害物質としてのビリルビン及びヘム
(Bilirubin and Heme as Growth Inhibitors of Chicke
n Embryos In Ovo,)”R.Vassilopoulou-Sellin, P.Fost
er, C.O.Oyedeji, Pediatr.Res.,27(6)1990,pp.617-621
（ビリルビン及びヘム）；”Inovojectを用いるin ovo
マレーク予防接種のボイラー安全性試験(Boiler Safety
Studies of Marek's VaccinationIn Ovo Using the In
ovoject.)”C.M.Hoyle, R.P.Gildersleeve, Poult.Sc
i., 69(補１)1990,65頁(マレーク病ワクチン)；”卵孵
卵期における１つ又は幾つかのチロトロピン放出ホルモ
ンＴＲＨ注射後の雄性及び雌性ブロイラーの出生後発育
(Post-Natal Development of Male and Female Broiler
s After One or SeveralThyrotropin Releasing Hormon
e TRH Injections During Egg Incubation,）”J.C.Blu
m,M.R.Salichon, J.P.Vigneron, Arch.Gefluegelkd, 53
(6), 1989, pp.265-268(チロトロピン放出ホルモ
ン)；”ビオチン卵注射による七面鳥の卵の孵化率の増
大(Increased Hatchability of Turkey Eggs by Biotin
Egg Injection,)”E.J.Robel, V.L.Christensen, Poul
t.Sci., 65(補１)1986,p.112(ビオチン)などがある。こ
れらの文献はすべて、引用によって本明細書に包含され
る。
【００２６】生物学的活性物質は、適当な生体適合性
（生理学的に許容し得る）粒子担体に含有させる。担体
は種々の粒子物質のいずれであってもよく、本明細書で
は一般には「微小粒子」と呼び、例えば微小球、脂質小
胞、又はそれらの修飾型が包含される。微小球は通常、
シリカ、ガラス、種々の生体分解性の高分子ポリマー
（例えば、ポリラクチド及びポリグリコリドポリマー及
びそのコポリマー（共重合体）、ポリヒドロキシ酪酸、
セルロシクス、デンプン、炭水化物ガムなど）、又はタ
ンパク質（例えば、ゼラチン、アルブミン）から作成さ
れる。液体小胞（例えば、リポソーム）は卵に注射する
ための理想的な供給ビヒクルであるが、その理由は、液
体小胞は所望の適用及び生物学的活性物質に対応して作
成することができ、即ち種々の電荷（陰性、陽性、中
性）を加えて作成でき；リン脂質の正しい選択によって
卵膜に対して融合原性(fusagenic)にすることができ；
水溶性及び水不溶性化合物の両者を担持することがで
き；そして天然又は天然に存在する賦形剤を使用するこ
とができるからである。リポソームはリン脂質又は非リ
ン脂質のいずれであってもよい。好ましい非リン脂質リ
ポソームビヒクルは、マイクロ・ベシクラー・システム
ズ インコーポレイテッド(Micro Vesicular System,In
c)から製造され、「ノバゾーム(Novasome)小胞」と呼ば
れる数ラメラのリポソームであり、これは酸化に伴う問
題が最小限に抑えられている利点を有する。
【００２７】生物学的活性物質は既知の手法によって微
粒子に提供され、例えば形成期に粒子に取り込ませ、微
粒子への吸着時に取り込ませ、又は微粒子上への被覆の
際に取り込ませる。これらの態様による生物学的活性物
質の取り込みにより、活性物質は微粒子から経時的に供
給される態様で提供される。従って、特定の担体、及び
生物学的活性物質の取り込み方法を選択することによ
り、胚の発育期及び／又は孵化後の若トリの成育期に起
こり得る、所望の時間及び速度での活性物質の供給を行
うことができる。
【００２８】粒子は膜間の液と少なくとも同じ密度であ
るのが好ましい。高い密度では、粒子が卵の底端に移動
する速度に単純に影響する。膜間の液よりも低い密度の
粒子であれば、卵の逆転により液を介して上昇する原因
となり得るが、これは粒子密度を正しく選択したなら不
要である付加的な工程を要するので好ましくない。さら
には、気室の空間はガス交換を可能にしているので、こ
のことは胚を窒息死させるかもしれない。
【００２９】担体を含有する粒子材料のサイズは選択す
る材料及び他の因子によって変動する。微粒子のサイズ
は、微粒子が卵の内膜及び外膜間を移動できる大きさと
する。その結果、微粒子は気室によって空間にされた位
置に気室から移動し、粒子は孵化の際にトリに取り込ま
れる。微粒子は卵の内膜と外膜との間を自由に移動する
大きさであることが好ましい。例えば、微粒子の大きさ
は内膜と外膜の隣接部分間の典型的な距離よりも大きく
するべきでなく、好ましくはその距離の半分よりも大き
くないサイズである。典型的なサイズは約５−約５００
ミクロンである。好ましい微粒子サイズは約１２５−約
２５０ミクロンである。好ましいサイズは微粒子の型及
び種々の鳥類種における卵の内膜及び外膜間の距離によ
って変動することは理解されよう。
【００３０】生物学的に有効な量の活性物質を気室に導
入する。使用する活性物質の量は使用する活性物質及び
望む効果によって左右されることは理解されよう。因子
には量、所望の放出速度、濃度及び目的とする投与時
間、並びに当業者に周知の他の考慮事項などがある。同
様に、個々の担体の量は微粒子のサイズ、その微粒子に
よって含有される活性物質の量及び濃度、微粒子からの
活性物質の放出速度、及び他の通常の因子に応じて選択
される。
【００３１】さらに、生物学的活性物質を有する個々の
担体を卵に供給する時点を選択し、所望の結果を得る。
ここでも、タイミングは既知の因子、例えば投与する活
性物質、胚の発育段階、望む効果に左右される。これら
の因子は当業者に周知であり、種々の生物学的活性物質
を投与するための好ましい日は文献に記載されており、
又は特別な実験をすることなく決定することができる。
孵卵操作の１６日目など、特に好ましい日を望む場合
は、粒子担体をその日付けの１日又は２日前に通常は提
供する。これにより、生物学的活性物質が所望の日付け
で利用可能となり、さらに微粒子の放出速度及び、ピー
ク濃度に達成する時間を変化させることができる。
【００３２】粒子担体は最初に設置された気室から離れ
た位置にまで内膜及び外膜間で移動する。卵は少なくと
も気室に担体を供給した後に一定の時間だけ逆位に置
き、気室が上部となるようにするのが好ましい。この逆
位方向にするタイミングは微粒子を注射した直後であ
り、微粒子が気室の反対側の卵の底に移動するのを促進
するに充分な時間続ける。このような時間は持続的なの
が好ましいが、必ずしも必要でない。便宜上、投与する
タイミングは他の考慮事項に基づいて卵を正常に操作す
ることに調和させればよい。例えば、卵は一定の日数だ
け、通常ニワトリの場合は約１７日間インキュベーター
（保育器）中に維持させるのが普通であり、その間は卵
を定期的に動かす。次いで、その卵を孵卵器(hatcher)
に移すのが多く、その間は感知できる程度には卵を動か
さない。保育器から孵卵器への移動は個々の担体及び含
有された生物学的活性物質を卵に投与するのに便利なタ
イミングであることが多いことは理解されよう。しか
し、この投与時間は必須でなく、便宜という観点から選
択されるものであり、このタイミングの前後いずれの他
の投与時点でも許容することができる。
【００３３】大多数の化合物について好ましい投与日が
確定されている。胚又はその後の発育しているトリにて
生理学的活性物質が所望の生理学的応答を示すことがで
きるように、投与日を選択する。例えば、七面鳥の受精
卵の孵卵率はインキュベーションの約Ｅ２５日目に外因
性ピリドキシン（ビタミンＢ6）の有効量を投与するこ
とで増大するという報告がある。生理学的に活性なペプ
チド、例えば下垂体ペプチド、視床下部放出ホルモン、
及び消化性ペプチド、特に内分泌応答を誘発するもの
は、in ovoインキュベートの最後の四半期にニワトリに
投与すれば有益であると報告されている。種々の活性物
質についての望ましい投与日は当業者が選択することが
できる。選択する種々の活性物質についての好ましい投
与日は決定できる。
【００３４】本発明の説明のため、以下に実施例を記載
する。しかし、これらは本発明の限定を意図するもので
ない。
【００３５】本発明の実施方法を説明するために、乳酸
及びグリコール酸のランダム共重合体であるＤＬ−ラク
チド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＡ／ＰＧＡ）を使用して
微粒子を調製し、試験した。使用するＰＬＡ／ＰＧＡポ
リマーの１つはＰＬＡ：ＰＧＡが８５：１５の比率を有
し、内部粘度０．５８ｄＬ／ｇであり、分子量約９０，
９００ダルトンである。このポリマーはバーミンガム・
ポリマーズ，インコーポレイテッド(ＢＰＩ)[Birmingha
m Polymers, Incorporated]から入手され、乳酸及びグ
リコール酸のそれぞれの環状ダイマーのイオン性の開環
付加重合によって製造される。水に暴露すると、この脂
肪族ポリエステルはエステル結合の加水分解によって分
解し、生体適合性の産物である乳酸及びグリコール酸を
与える。８５：１５コポリマーの生体分解時間は表面
積、多孔度及び分子量に応じて変化するが、約５カ月で
あると報告されている。他の混合比のＰＬＡ／ＰＧＡは
２カ月から２４カ月の範囲の分解時間を有している。あ
るいは、分解時間が２カ月と報告されている５０：５０
ＰＬＡ／ＰＧＡポリマーも使用した。
【００３６】実施例１ 赤／緑染色ブランクＰＬＡ／ＰＧＡ微粒子の製造 ニワトリ卵にて評価するためにブランクＰＬＡ／ＰＧＡ
微粒子を調製した。微粒子の最初の組みはアメリカン・
シアナミド・カンパニー・カルコ・オイル・レッド(Ame
rican Cyanamid Company Calco Oil Red)Ｎ−１７００
色素によって染色し、第２の組みの微粒子は、これもAm
erican Cyanamid Companyから入手されるカルコ・ビク
トリア・グリーン・ベース色素(Calco Victoria Green
Base Dye)によって染色した。各微粒子の調製操作は実
質的に同じであった。３０℃のクロロホルム中のインヘ
レント粘度が０．５８ｄＬ／ｇであるＰＬＡ／ＰＧＡ
（８５／１５）［Ｍw＝９０，９００ダルトン、ＭN＝５
０，１００ダルトン］（ＢＰＩ）３ｇをジクロロメタン
約４０ml に溶解した。このポリマー溶液に少量の色素
を加えたが、それぞれの色素は油溶性であった。０．２
５％ｗ／ｖエアー・プロダクツ(Air Products)Ｖ−２０
５ポリ（ビニル・アルコール）を含有する脱イオン水２
５０ml 中にてその有機層を撹拌下にエマルジョン化
（乳化）した。撹拌を室温及び常圧下に１６時間続行
し、ジクロロメタンを完全に消失させた。減圧濾過によ
り微粒子を回収した。微粒子を減圧乾燥し、乾燥ふるい
によりサイズ分けした。
【００３７】実施例２ 黄染色したブランクＰＬＡ／ＰＧＡ微粒子の製造 ５０／５０ＰＬＡ／ＰＧＡ（ＢＰＩ）を使用し、ダルベ
ッコ(Dulbecco's)リン酸緩衝化食塩水溶液からの溶媒留
去の微粒子調製法により、黄染色したブランク微粒子を
製造した。ダルベッコリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)溶液
２５０ml にエアー・プロダクツＶ−２０５ポリ（ビニ
ル・アルコール）（ＰＶＡ）０．６２５ｇを加え、ＰＢ
Ｓ中、０．２５％のＰＶＡ溶液を調製した。ＰＶＡを室
温のＰＢＳに加え、撹拌下に５５℃に加熱して溶解を促
進させた。この溶液は使用する前に室温にまで冷却し
た。
【００３８】ＨＦＩＰ中、３０℃におけるインヘレント
粘度が０．４２ｄＬ／ｇであるＰＬＡ／ＰＧＡ（５０／
５０）［Ｍw＝２９，０００ダルトン、ＭN＝２０，００
０ダルトン］（ＢＰＩ）２．００ｇを塩化メチレン約４
０ml に溶解した。このポリマー溶液に、微量（０．１
ｇ以下）のＦＬＵＯＲＯＬ ＹＥＬＬＯＷ０８８，ＢＡ
ＳＦ＃２０５６７１を加え、ポリマー溶液を蛍光黄色に
染めた。このポリマー溶液の全量を、３００ＲＰＭで撹
拌しているＰＶＡ溶液の渦に加えた。撹拌を一晩続行
し、塩化メチレンを完全に留去させた。得られた黄色の
微粒子を減圧濾過により回収した。その微粒子をダルベ
ッコＰＢＳで数回洗浄し、次いでそれを乾燥装置内の乾
燥皿上に置き、減圧乾燥した。
【００３９】乾燥した微粒子１．９８ｇを回収し、それ
を以下のメッシュカット（米国標準）でふるい分けし
た： ＞６０メッシュ（＞２５０ミクロン）−微量（廃棄） ６０−１２０メッシュ（２５０ミクロン−１２５ミクロ
ン）−０．３４g ＜１２０メッシュ（＜１２５ミクロン）−１．６４ｇ
【００４０】実施例３ 染色した微粒子を使用し、in ovo注射後、インキュベー
ションの後期、及び孵化後における該粒子の局在性を視
覚化した。０．１５Ｍ ショ糖１００ml 中、実施例１に
より製造した６０−１２０メッシュの赤色微粒子５mｇ
をＥ１４日の胚含有卵の気室に注射した。３−５つの卵
をインキュベーションの期間中、毎日開口させた。さら
に、３−５匹の雛に対して孵化日に剖検を行い、さらに
次の生存３日間の毎日で剖検を行った。注射の２４時間
後にて殆どの微粒子は２つの膜間を移動して気室とは反
対側の卵の尖端又は尾部（底）の位置に達していた。こ
の微粒子は卵白液中に浸されており、高度に脈管化した
２つの薄膜間に位置していた。微粒子はインキュベーシ
ョンの期間中、この位置に留どまっていた。
【００４１】胚形成がインキュベーションの最終日（Ｅ
２１）に近付くにつれて、着色した粒子が内膜及び卵黄
嚢と共に腹部へのインターナライズを始めたようであっ
た。球形の微粒子の顕微鏡検査により、微粒子がインキ
ュベーションの週にわたってゆっくりと分解することが
示された。さらに、その形状は微粒子が融合したかのよ
うに経時的に不規則になり、大きくなっていった。孵化
したニワトリを剖検すると、微粒子は臍の回りの腹膜に
存在していることが見いだされた。生存３日後でさえ
も、無傷の重合体が有意な量で存在していた。
【００４２】無傷の生体分解性微粒子が孵化後にニワト
リにて同定されるという事実は、このようなin ovo形式
の投与が胚時期及び新生児(neonatal)時期に所望の化合
物を有効に放出できることを示唆している。実施例１に
て製造した６０−１２０メッシュの緑染色微粒子も同様
に、気室への注射後２４時間以内で２つの膜間を移動し
たが、その胚は色素の毒性のために４８時間以内に死亡
した。
【００４３】実施例４ 以下ではソマトゲニンと呼ぶ成長ホルモン放出ホルモン
（このソマトゲニンという名称はこの化合物に関してUn
ited States Adopted Names Council (USAN)に対し提案
されているものである）を使用し、非リン脂質のリポソ
ームも調製した。本明細書にて使用しているソマトゲニ
ンとは４−メチルヒップロイル（１）ブタＧＨＲＨ（２
−７６）−ＯＨであり、これは天然のブタＧＨＲＨ前駆
体の同族体である。この化合物は分子量８８４６．８９
ダルトンであり、その分子式はＣ379Ｈ624Ｎ127Ｏ118で
ある。ソマトゲニンの製造方法は、標題「超活性ＧＲＦ
同族体(Superactive GRF Analogs)」の１９９１年４月
２６日出願の米国特許出願番号０７／６９２，０９０に
記載されている。ソマトゲニンの構造は以下の通りであ
る：
【化１】
【００４４】アミノ酸組成は以下の通りである：
【表１】
【００４５】次の操作に従ってリポソームを調製した。
ポリオキシエチレン セチル エーテル（０．６９６
ｇ）、コレステロール・ヘミスクシネート（０．０７３
ｇ）、リン酸ジセチル（０．０５５ｇ）及び、０．０１
Ｍ 酢酸中のソマトゲニン（１０ml ＠約１mｇ/ml）を使
用し、負に帯電した脂質小胞を調製した。また、リン酸
ジセチルをセチル・トリメチルアンモニウム（０．０３
６ｇ）に置き換える以外は上記と同じ材料を使用して、
正に帯電したリポソームを調製した。
【００４６】脂質材料をまずビーカー中に入れ、約８０
℃に加熱した。ソマトゲニンを０．０１Ｍ 酢酸１０ml
中に溶解し、１mｇ/ml とした。３０cc シリンジ及び三
方ストップコックをホットプレート上で約８０℃に予め
暖めた。ソマトゲニン溶液も約８０℃に暖めた。次い
で、脂質及び水性成分を別個のシリンジに充填し、三方
ストップコックに正しい角度で設置した。脂質相をスト
ップコックを介して押し出すことで水相中に注射した。
次いで、材料を２分間可能な限り迅速に注入注出させ
た。次に、得られた材料をバキュテーナー管に移した
後、２５００rpmで２０分間遠心した（分離が起こらな
かった）。少量の試料（約１ml）を１０，０００rpmで
１５分間遠心したが、ここでも分離されなかった。この
材料をまとめ、以後の使用のために冷蔵庫で冷却した。
次いで、脂質小胞を卵の気室に注射し、これがＰＬＡ／
ＰＧＡ微粒子と同様に、卵内の２つの膜間で移動するこ
とが見いだされた。
【００４７】実施例５ ソマトゲニン／ＰＬＡ／ＰＧＡ（８５／１５）微粒子 ＰＬＡ／ＰＧＡ、８５／１５、ＢＰＩを使用し、ポリビ
ニルアルコール（ＰＶＡ）を含有するダルベッコリン酸
緩衝化食塩水（ＰＢＳ）からの溶媒留去の微小球製造手
法により、微小球を作成した。調製したばかりのダルベ
ッコＰＢＳ（ｗ／ｏ ＣaＣl2）２５０ml にエアー・プ
ロダクツ・エアーボル２０５ポリビニルアルコール(Air
Products Airvol 205 polyvinyl alcohol)１．０ｇを
加え、ＰＢＳ中、ＰＶＡの０．４％ｗ／ｖ溶液を調製し
た。室温の磁気撹拌によってＰＶＡをＰＢＳ中で分散さ
せ、その温度を４５℃に昇温し、ＰＶＡを完全に溶解さ
せた。ＰＶＡを含有するダルベッコＰＢＳ溶液は、室温
に戻してから使用する。
【００４８】クロロホルム中、３０℃のインヘレント粘
度が０．５８ｄＬ／ｇであるＰＬＡ／ＰＧＡ ８５／１
５（ＢＰＩ）［Ｍw＝９０，９００ダルトン、ＭN＝５
０，１００ダルトン］１．８０ｇを塩化メチレン約５０
ml 中に溶解した。このポリマー溶液に空気粉砕(air mi
lled)したソマトゲニン０．２０ｇを加えた。穏やかに
渦巻かせ、約１分間音波処理して、活性なソマトゲニン
を分散させて初期の粒子サイズにした。ポリマー溶液−
ソマトゲニン懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹拌ダルベッ
コＰＢＳの渦に加えた。撹拌速度は２７０−２８０rpm
であった。４００ml 容量パイレックスビーカー及び、
３羽根プロペラを備えたプラスチック撹拌ロッドを使用
し、それを得られた水中油エマルジョンに入れ、撹拌し
た。一晩撹拌を続行し、塩化メチレンを完全に蒸発し
て、次いで微小球を形成させ、減圧濾過によりそれを回
収した。得られた微小球を乾燥機内の乾燥皿に入れ、減
圧乾燥した。乾燥微粒子１．８０ｇ＋１．８５ｇ（３．
６５ｇ）を回収し、以下のメッシュカットでふるい分け
した： ＞６０メッシュ−微量 ６０−１２０メッシュ−２．６６ｇ ＜１２０メッシュ−０．９４ｇ まとめた生成物を検定すると、理論値１０％に対して
９．８％ｗ／ｗ（１０．２，９．４，９．７）の積載率
であった。
【００４９】実施例６ ソマトゲニン／ＰＬＡ／ＰＧＡ（８５／１５）微粒子 ＰＬＡ／ＰＧＡ、８５／１５、ＢＰＩを使用し、ポリビ
ニルアルコールを含有するダルベッコリン酸緩衝化食塩
水（ＰＢＳ）からの溶媒留去の微粒子製造手法により、
ソマトゲニンを含有する微粒子を調製した。ダルベッコ
ＰＢＳ（ｗ／ｏＣaＣl2）２５０ml にエアー・プロダク
ツ・エアーボル２０５ ポリビニルアルコール１．０２
ｇを加え、ＰＢＳ中、ＰＶＡの０．４％ｗ／ｖ溶液を調
製した。ＰＶＡを室温にてＰＢＳ中で分散させ、その温
度を４５℃に昇温し、溶解を容易にした。ＰＶＡを含有
するＰＢＳ溶液は室温に戻してから使用する。
【００５０】クロロホルム中、３０℃のインヘレント粘
度が０．５８ｄＬ／ｇであるＰＬＡ／ＰＧＡ ８５／１
５（ＢＰＩ）［Ｍw＝９０，９００ダルトン、ＭN＝５
０，１００ダルトン］１．７５ｇを塩化メチレン約５０
ml 中に溶解した。このポリマー溶液に空気粉砕したソ
マトゲニン０．２５ｇを加えた。穏やかに渦巻かせ、約
１分間音波処理して、活性なソマトゲニンを分散させて
初期の粒子サイズにした。ポリマー溶液−ソマトゲニン
懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹拌ダルベッコＰＢＳの渦
に加え、撹拌を一晩続行し、塩化メチレンを完全に蒸発
させた。得られた微粒子を減圧濾過により回収し、乾燥
機内の乾燥皿に入れ、減圧乾燥することで、乾燥微粒子
１．８１ｇを得、それを以下のメッシュカット（米国標
準）でふるい分けした： ＞６０メッシュ−なし ６０−１２０メッシュ−０．９６ｇ ＜１２０メッシュ−０．０８ｇ ６０−１２０メッシュカットを検定すると、１２．９％
ｗ／ｗソマトゲニンであった（理論値１２．５％）。
【００５１】実施例７ ソマトゲニン／ＰＬＡ／ＰＧＡ（８５／１５）微粒子 ＰＬＡ／ＰＧＡ、８５／１５、ＢＰＩを使用し、ポリビ
ニルアルコール（ＰＶＡ）を含有するダルベッコ・リン
酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）からの溶媒留去の微小球製造
手法により、ソマトゲニンを含有する微粒子を作成し
た。ダルベッコＰＢＳ（ｗ／ｏ ＣaＣl2）２５０ml に
エアー・プロダクツ・エアーボル２０５ポリビニルアル
コール１．０ｇを加え、ＰＢＳ中、ＰＶＡの０．４％ｗ
／ｖ溶液を調製した。室温にてＰＶＡをＰＢＳ中で分散
させ、その温度を４５℃に昇温し、溶解を補助した。こ
のＰＶＡを含有する溶液は室温に戻してから使用する。
【００５２】クロロホルム中、３０℃のインヘレント粘
度が０．５８ｄＬ／ｇであるＰＬＡ／ＰＧＡ ８５／１
５（ＢＰＩ）［Ｍw＝９０，９００ダルトン、ＭN＝５
０，１００ダルトン］１．５２ｇを塩化メチレン約５０
ml 中に溶解した。このポリマー溶液に空気粉砕したソ
マトゲニン０．５０ｇを加え、次いで穏やかに渦巻か
せ、約１分間音波処理して、活性なソマトゲニンを分散
させて初期の粒子サイズにした。ポリマー溶液−ソマト
ゲニン懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹拌ダルベッコＰＢ
Ｓの渦に加えた。４００ml 容量パイレックスビーカー
及び、３羽根撹拌子及びシャフトを使用し、それらを得
られた水中油エマルジョンに入れ、撹拌した。一晩撹拌
を続行し、塩化メチレンを完全に蒸発させる。減圧濾過
により微粒子を回収し、それを乾燥機内の乾燥皿に入
れ、減圧乾燥した。乾燥微粒子１．８０ｇを回収し、以
下のメッシュカット（米国標準）でふるい分けした： ＞６０メッシュ−なし ６０−１２０メッシュ−１．３０ｇ ＜１２０メッシュ−０．１７ｇ ６０−１２０メッシュカットを検定すると、２４．９％
ｗ／ｗソマトゲニン積載率であった（理論値２５％）。
【００５３】実施例８ ソマトゲニン／ＰＬＡ／ＰＧＡ（８５／１５）微粒子 ＰＬＡ／ＰＧＡ（８５／１５）ＢＰＩを使用し、ポリビ
ニルアルコール（ＰＶＡ）を含有するダルベッコＰＢＳ
からの溶媒留去の微小球製造手法により、ソマトゲニン
を含有する微粒子を作成した。調製したばかりのダルベ
ッコ・リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）（ｗ／ｏ ＣaＣ
l2）２５０ml にエアー・プロダクツＶ−２０５ＰＶＡ
１．０ｇを加え、ＰＢＳ中、ＰＶＡの０．４％ｗ／ｖ溶
液を調製した。室温にてＰＶＡをＰＢＳ中に分散させ、
その温度を４５℃に昇温し、溶解を補助した。この溶液
は室温に冷却してから使用する。なお、この溶液はＰＢ
Ｓ中、０．４％ｗ／ｖのＰＶＡを含有している。
【００５４】クロロホルム中、３０℃のインヘレント粘
度が０．５８ｄＬ／ｇであるＰＬＡ／ＰＧＡ ８５／１
５［Ｍw＝９０，９００ダルトン、ＭN＝５０，１００ダ
ルトン］１．５ｇを塩化メチレン約５０ml 中に溶解し
た。このポリマー溶液にミクロン程度に粉砕(micronize
d)したソマトゲニン０．５ｇを加えた。（すべてのガラ
ス製品及び撹拌子／シャフトはソマトゲニンと接触させ
る前にアセトニトリル中ですすいだ） 穏やかに渦巻か
せ、約１分間音波処理して（室温）、ソマトゲニンを分
散させて初期の粒子サイズにした。ポリマー溶液/ソマ
トゲニン懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹拌ダルベッコＰ
ＢＳの渦に加えた。撹拌を一晩続行し、ジクロロメタン
溶媒を完全に蒸発させる。減圧濾過により微粒子を回収
し、それを乾燥機内の乾燥皿に入れ、減圧乾燥した。乾
燥微粒子１．８４ｇを回収し、以下のメッシュカット
（米国標準）でふるい分けした： ＞６０メッシュ−０．８６ｇ（廃棄） ６０−１２０メッシュ−０．８６ｇ ＜１２０メッシュ−０．９４ｇ
【００５５】上記の工程を繰り返し、乾燥微粒子１．８
７ｇを得、それを以下のメッシュカット（米国標準）で
ふるい分けした： ＞６０メッシュ−微量（廃棄） ６０−１２０メッシュ−１．１０ｇ ＜１２０メッシュ−０．７１ｇ これらの粒子を検定し、以下の結果を得た： ６０−１２０メッシュ＝１５．７±２．１％積載率（ソ
マトゲニン） ＜１２０メッシュ＝１５．２±０．８％ｗ／ｗ積載率
（ソマトゲニン）
【００５６】実施例９ 実施例８の産物を使用し、in ovo注射試験のための試験
材料を以下のようにして調製した。次の処置（Ｔrt）材
料は以下のようにして調製した： ＴrtＡ： 対照としての水；
【００５７】ＴrtＢ： 精製水５０ml 中に分散され
た、水１００ml 当たりソマトゲニン６０mｇの濃度であ
るミクロン粉砕ソマトゲニンの分散液；
【００５８】ＴrtＣ： 精製水５０ml 中に分散され
た、水１００ml 当たりソマトゲニン６００mｇの濃度で
あるミクロン粉砕ソマトゲニンの分散液；
【００５９】ＴrtＤ： ２％ｗ／ｖカルボキシメチルセ
ルロース・ナトリウム(ＮaＣＭＣ３３０)５０ml 中に分
散された、ソマトゲニン６０mｇ／１００ml（積載時の
分散量）と等価で微粒子を含有している微粒子（ソマト
ゲニンＰＬＡ／ＰＧＡ、６０−１２０メッシュ）の懸濁
液；
【００６０】ＴrtＥ： ２％ｗ／ｖ ＮaＣＭＣ３３０
（５０ml）中に分散された、ソマトゲニン６００mｇ／
１００ml（積載時の分散量）と等価で微粒子を含有する
微粒子（ソマトゲニンＰＬＡ／ＰＧＡ、６０−１２０メ
ッシュ）の懸濁液；及び
【００６１】ＴrtＦ： ２％ｗ／ｖ ＮaＣＭＣ３３０
（５０ml）中に分散された、高用量ソマトゲニンＰＬＡ
／ＰＧＡ（ＴrtＥ）とおよそ等価であるブランク微粒子
（ＰＬＡ／ＰＧＡ、６０−１２０メッシュ）の分散液。
【００６２】上記の材料を卵の気室に注射すると、典型
的には数時間で各粒子は卵の底に移動した。孵卵率の減
少はいずれの処置においても認められなかった。
【００６３】実施例１０ クロロホルム中、３０℃のインヘレント粘度が０．５８
ｄＬ／ｇである８５／１５ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリ
コリド）［Ｍw＝９０，９００ダルトン、ＭN＝５０，１
００ダルトン］（バーミンガム・ポリマーズ，インコー
ポレイテッド）１．８ｇを塩化メチレン約５０ml 中に
溶解し、それにミクロン粉砕ソマトゲニン０．２ｇを加
え、１０％ソマトゲニン微小球を調製した。ポリマー溶
液/ソマトゲニン懸濁液を、ポリ（ビニルアルコール）
を含有するリン酸緩衝化食塩水中でエマルジョン化し
た。この水中油エマルジョンを約１６時間撹拌し、溶媒
を完全に留去した後、微小球を形成させた。減圧濾過に
より微小球を採取し、乾燥機内で減圧乾燥しサイズに応
じてふるい分ける。
【００６４】実施例１１ 実施例１０に従って調製した微粒子を使用し、ソマトゲ
ニンの取り込みの時間放出の関係を調べた。試験は、
０．１Ｎ 酢酸の流速２００ml／分の灌流を用いてイン
ビトロにより行った。これらの試験の結果を図１及び図
２に示す。結果は、微粒子が、含有していた活性物質を
経時的に放出し、さらにその放出速度は活性物質の積載
パーセンテイジによって制御されることを示している。
【００６５】上記のように本発明を説明し、詳細に記述
してきたが、これは単なる例示であり特徴の限定と考え
るべきでなく、これらは好ましい態様のみを示している
ものであり、本発明の範囲に属されるすべての変動及び
修飾を保護する意図のあることを理解すべきである。
【００６６】本発明は別の態様として、ポリエステルマ
トリックス及び、そのマトリックスに分散されている生
物学的に活性な水溶性ポリペプチド約５−約２５重量％
を含有する、生体適合性の生体分解性微粒子を含有する
組成物を提供する。本発明はさらなる別の態様として、
ポリエステルを有機溶媒に溶解し；そのポリエステル溶
液中に生物学的に活性な物質を懸濁し；該活性物質が不
溶性である水性媒質中に該懸濁液をエマルジョン化し；
そしてそのエマルジョンから溶媒を留去して微粒子を作
成することにより、生物学的に活性なペプチドを含有す
る微粒子を調製する。本発明の１つの利点は、ポリエス
テルに対して比較的高い比率のペプチドを有する微粒子
を簡便に調製できる点である。さらなる態様として、微
粒子を適当な液に懸濁し、それを生物に注射することを
特徴とする、生物学的に活性な物質を生物に投与する方
法に関する。
【００６７】本発明の目的は、生物学的に活性な物質、
例えばペプチドが生体分解性の生体適合性マトリックス
に取り込まれている微粒子を提供することである。さら
なる本発明の目的は、ペプチド物質を含有する微粒子の
製造方法であって、該活性物質を２５％まで積載させる
方法を提供することである。また、本発明は、インビボ
条件下にて、前もって決定できる速度で徐放的に放出さ
れるペプチド物質を含有している微粒子を提供すること
も目的としている。
【００６８】本発明のさらなる目的は、ペプチド物質を
含有する微粒子の製造方法であって、そのペプチドを不
安定にすることなく、破壊することなく又は不活化する
ことのない方法を提供することである。本発明の別の目
的は、マトリックスの性質を調節することによって微粒
子の放出特性を改変することのできる微粒子及び、その
ような微粒子の製造方法を提供することである。これら
の目的及び他の目的、利点及び特徴は、本発明に関連し
て以下に説明する好ましい態様の組成物及び方法から理
解されよう。
【００６９】図３−図６は、微粒子からの制御されたソ
マトゲニン放出の生物学的な成績を示すブタにおけるイ
ンビボ試験を表すグラフである。
【００７０】本発明の原理の理解を助けるため、ここに
好ましい態様を引用し、特定の用語を用いてこれを説明
する。しかし、これによって本発明の範囲が限定される
ものでなく、当業者ならば普通に想起できる本発明の原
理の改変、修飾及びさらには適用も包含されると理解す
べきである。
【００７１】本発明は、支持マトリックスとしてポリエ
ステル及び、含有される生物学的に活性な物質としてペ
プチドを含有する微粒子製剤を提供する。この微粒子
は、適当なかつ活性な形態でペプチドを取り込ませる溶
媒留去手法によって調製する。微粒子は生体分解性であ
り、ペプチドを制御して徐々に放出させる。薬物の放出
速度は、ペプチドの積載程度、生体分解性ポリマーの分
子量、及びある場合にはコポリマー成分の比率などの因
子を調節することによって制御される。本発明の微粒子
及び製造方法は、ペプチドが化学的に安定であり物理的
に安定であり（コンホメーション）かつ生物学的に活性
な状態を保っている製剤を提供できる点で従来のものと
明確に異なっている。本発明の方法はさらに、水溶性ポ
リペプチドを微粒子に取り込むための従来の溶媒留去手
法よりも、ポリマーに対するペプチドの比率を大きくす
ることができる。
【００７２】本発明の微粒子は、含有されるペプチドを
徐放的に放出することができる。微粒子を製造する方法
を行う結果として、生物学的に活性な化合物、例えばペ
プチドなどは組み立ての際にポリマーネットワーク内に
包嚢される。次いで、このペプチドはポリマーネットワ
ークの拡散によってマトリックスの分解時に経時的に、
ある限定された程度まで放出される。
【００７３】放出プロフィルは、種々のパラメーターの
適切な選択又は制御によって調節することができる。例
えば、放出特性はポリマーの組成、特にポリマーの型及
び比率；ポリマーの分子量；重量−平均分子量
（Ｍw）；数−平均分子量（Ｍn）に対する重量−平均分
子量（Ｍw）の比率、即ちＭw／Ｍnによって測定される
分子量範囲（即ち、多分散性）；微粒子のサイズ及び形
状；及びポリマーに対するペプチドの比率、即ち積載率
(loading)によって変動する。
【００７４】本発明の微粒子はポリエステル、例えばポ
リ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃ
ｏ−グリコリド）、ポリ（エスピロン−カプロラクト
ン）、ポリアミノ酸、ポリ（オルソエステル）、ポリ無
水物、ポリアルキルシアノアクリレートなどから製造す
ることができる。生体分解性及び／又は生体腐食性であ
り、分解して生体適合性の物質を与えるポリエステルは
いずれも利用可能である。
【００７５】本発明で使用するには、ポリラクチドが特
に好ましい。本発明の微粒子を調製するためのポリマー
材料は市販されている。ポリラクチドなる用語は、ポリ
マー及び、乳酸単独のポリマー、乳酸及びグリコール酸
のコポリマー及びこのようなコポリマーの混合物の混合
物、このようなポリマー及びコポリマーの混合物（ここ
に、該乳酸はラセミ体又は光学活性体のいずれでもよ
い）を包含する、一般的な意味で使用している。ＰＬＡ
／ＰＧＡなる用語は、乳酸及びグリコール酸の種々のコ
ポリマーを意味するものとして本明細書では使用してい
る。このポリマーの分子量範囲は約２９，０００ダルト
ンから約９０，９００ダルトンである。ラクチド単位と
グリコリド単位との比率は１００：０から５０：５０で
ある。例えば、使用される１つのＰＬＡ／ＰＧＡポリマ
ーはＰＬＡ：ＰＧＡが８５：１５、インヘレント粘度
０．５８ｄＬ／ｇ、分子量約９０，９００ダルトンを有
している。この具体的なポリマーはバーミンガム・ポリ
マーズ，インコーポレイテッド（ＢＰＩ）から入手さ
れ、これは、乳酸及びグリコール酸のそれぞれ環状ダイ
マーをイオン性開環付加重合することによって製造され
る。
【００７６】水に暴露させると、このポリエステルはエ
ステル結合の加水分解によって分解し、生体適合性の産
物を与える。例えば、好ましいＰＬＡ／ＰＧＡポリマー
は乳酸及びグリコール酸に分解される。８５：１５ Ｐ
ＬＡ／ＰＧＡコポリマーは、表面積、多孔度及び分子量
に応じて生体分解時間が約５カ月であると報告されてい
る。別の混同物であるＰＬＡ／ＰＧＡは分解時間が２カ
月から２４カ月である。５０：５０ＰＬＡ／ＰＧＡポリ
マーは、これも替わって利用したが、報告されている分
解時間は２カ月である。同様に本発明にて使用される他
のポリエステルは適当な生体適合性と分解時間とを有し
ている。
【００７７】本明細書に記載の方法によって調製される
微粒子は種々のペプチド物質の投与に使用するのに適し
ている。本発明の利点は、小さい生物学的に活性なポリ
ペプチドを含有する微粒子が提供される点である。一般
には、分子量１０，０００ダルトンまでのペプチドがポ
リペプチドと呼ばれ、１０，０００ダルトン以上の分子
量のペプチドはタンパク質と呼ばれる。過去における微
粒子を調製するための溶媒留去手法では、通常は低い積
載率の小さな水溶性ペプチドが製造されていたが、それ
はこのようなペプチドがこの工程では非適合性だったか
らである。通常は、１０％以下の積載率であると報告さ
れている。低い微粒子積載率では用量を正確にすること
ができない。しかし、このような制限があるにもかかわ
らず、溶媒留去手法はその容易性及び信頼性のために好
ましいものである。本発明の方法は、生物学的活性物質
が不溶性である水性媒質を使用するものであり、この工
程により、積載率が２５％までの微粒子が得られる。本
発明は、ポリペプチドを微粒子に積載率５−２５％で取
り込ませる簡便な方法の要求に見合うものである。
【００７８】本発明の製造方法を以下の実施例によって
説明する。一般には、ポリマー材料を適当な有機溶媒、
例えば塩化メチレン又はクロロホルムに溶解し、それに
生物活性な水溶性ペプチド、例えばソマトゲニンを加え
る。好ましくは、空気粉砕(air milling)によってソマ
トゲニンを粒子サイズに小さくしておく、米国特許第
５，０２１，５５４号を参照のこと（この適切な部分は
引用によって本明細書に包含される）。ポリマー溶液／
ペプチド懸濁液は元の粒子サイズになるまで音波処理す
るのが好ましい。次いで、得られた懸濁液を、生物活性
なペプチドが不溶性である適当な水性媒質、好ましくは
リン酸緩衝化食塩水中でエマルジョン化する。この媒質
には、ポリ（ビニルアルコール）、ドデシル硫酸ナトリ
ウム、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、メチル
セルロース又はゼラチンなどの安定化剤を含有させるこ
とができる。種々の賦形剤を約１０％までの濃度で加え
ることができる。賦形剤には例えば、ステアリン酸、ミ
リスチン酸、ラウリン酸などの脂肪酸があり、パルミチ
ン酸が好ましい。溶媒は留去して微粒子をその後に生成
させる。留去は撹拌によって補助することが好ましい。
得られた粒子は好ましくは減圧濾過によって採取する。
次いで、減圧下の乾燥機に入れ、使用に適したサイズに
ふるい分ける。
【００７９】本発明はポリペプチドに適用できるので、
以下に本発明の製造に使用できるポリペプチドを列挙す
るが、これは完全に網羅された列挙ではない： 成長ホ
ルモン放出因子、ソマトゲニン、オキシトシン、バソプ
レッシン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、表皮性
成長因子（ＥＧＦ）、プロラクチン、ルリベリン(lulib
erin)又は黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−Ｒ
Ｈ）、トランスホーミング成長因子、インスリン、ソマ
トスタチン、グルカゴン、インターフェロン、ガストリ
ン、テトラガストリン、ペンタガストリン、ウロガスト
リン、セクレチン、カルシトニン、エンケファリン類、
エンドルフィン類、アンジオテンシン類、レニン、ブラ
ジキニン、バシトラシン類、ポリミキシン類、コリスチ
ン類、チロシジン、グラミシジン類、及びそれらの合成
同族体及び修飾物及び薬学的に活性なそれらの断片。
【００８０】微粒子の採取の際には、ふるいによって所
望の範囲の粒子サイズを直接得ることができる。さら
に、得られた粒子は超遠心ミルなどによって粉砕するこ
とができる。微粒子は約２５０ミクロン以下のサイズに
するのが好ましく、より好ましくは約１２０から約２５
０ミクロンのサイズにする。
【００８１】得られた粒子は適当な液体と一緒に混合し
て投与する。微粒子は投与に適した既知の液体ビヒク
ル、例えば水、デキストロース溶液、グリセロール、又
は２％ｗ／ｖカルボキシメチルセルロース・ナトリウム
３３０（ＮaＣＭＣ）もしくはヒドロキシプロピルメチ
ルセルロース（ＨＰＭＣ）を含有する水中などに分散、
例えば懸濁し、微粒子が懸濁液から沈殿しないように粘
性を高めておく。粒子は生きている生物、例えばブタ又
は他の哺乳動物、又はニワトリもしくは七面鳥などの鳥
類に投与することができる。例えば、ソマトゲニン微粒
子製剤は懸濁液中に入れ、ブタの脇腹に皮下注射すれば
よい。微粒子製剤はトリに直接注射してもよいし、又は
上述のように卵の気室に注射してトリ胚に間接的に投与
することもできる。
【００８２】標的細胞又は組織に放出するために組み込
まれた薬物を含有する微粒子は単独で、又は目的の投与
経路や通常の製薬プラクティスに照らして好適に選択さ
れる適当な製薬的希釈剤、担体、賦形剤又はアジュバン
トとの混合物として投与できることは、当業者ならば理
解されよう。これらの不活性な製薬的に許容し得るアジ
ュバントは当業者に周知である。例えば、腸管外注射の
場合は、単位投与剤形を利用し、静脈内、筋肉内又は皮
下投与を行うことができ、腸管外投与では、要すれば等
張性を与える適当な溶質を含有していてもよい適当な滅
菌水性又は非水性溶液又は懸濁液を利用する。
【００８３】以下に具体的な実施例を挙げて本発明を説
明するが、これらは本発明の限定を意図するものではな
い。
【００８４】実施例１２ ＰＬＡ／ＰＧＡ（８５／１５）微粒子における１０％ソ
マトゲニン ＰＬＡ／ＰＧＡ、８５／１５、ＢＰＩを使用し、ポリビ
ニルアルコール（ＰＶＡ）を含有するダルベッコ(Dulbe
cco's)リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）からの溶媒留去の
微粒子製造手法により、微粒子を作成した。調製したば
かりのダルベッコＰＢＳ（ＣaＣl2無し）２５０ml にエ
アー・プロダクツ・エアーボル２０５ポリビニルアルコ
ール(Air Products Airvol 205 polyvinyl alcohol)
１．０ｇを加え、ＰＢＳ中、ＰＶＡの０．４％ｗ／ｖ溶
液を調製した。磁気撹拌によってＰＶＡをＰＢＳ中に室
温で分散させ、その温度を４５℃に昇温し、ＰＶＡを完
全に溶解させた。ＰＶＡを含有するダルベッコＰＢＳ溶
液は、室温に戻してから使用する。
【００８５】クロロホルム中、３０℃のインヘレント粘
度が０．５８ｄＬ／ｇであるＰＬＡ／ＰＧＡ ８５／１
５（ＢＰＩ）［Ｍw＝９０，９００ダルトン、ＭN＝５
０，１００ダルトン］１．８０ｇを塩化メチレン約５０
ml 中に溶解した。このポリマー溶液に空気粉砕(air mi
lled)したソマトゲニン０．２０ｇを加えた。穏やかに
渦巻かせ、約１分間音波処理して、活性なソマトゲニン
を分散させて初期の粒子サイズにした。ポリマー溶液−
ソマトゲニン懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹拌ダルベッ
コＰＢＳの渦に加えた。撹拌速度は２７０−２８０rpm
であった。４００ml 容量パイレックスビーカー及び、
３羽根プロペラを備えたプラスチック撹拌ロッドを使用
し、それを得られた水中油エマルジョンに入れ、撹拌し
た。一晩撹拌を続行し、塩化メチレンを完全に蒸発し
て、次いで微粒子を形成させ、減圧濾過によりそれを回
収した。得られた微粒子を乾燥機内の乾燥皿に入れ、減
圧乾燥した。乾燥微粒子１．８０ｇ＋１．８５ｇ（２つ
のバッチ、３．６５ｇ）を回収し、以下のメッシュカッ
トでふるい分けした： ＞６０メッシュ−微量 ６０−１２０メッシュ−２．６６ｇ ＜１２０メッシュ−０．９４ｇ まとめた生成物を検定すると、理論値１０％に対して
９．８％ｗ／ｗ（１０．２，９．４，９．７）の積載率
であった。
【００８６】実施例１３ ＰＬＡ／ＰＧＡ（８５／１５）微粒子における１２．５
％ソマトゲニン ＰＬＡ／ＰＧＡ、８５／１５、ＢＰＩを使用し、ポリビ
ニルアルコール（ＰＶＡ）を含有するダルベッコリン酸
緩衝化食塩水（ＰＢＳ）からの溶媒留去の微粒子製造手
法により、微粒子を作成した。ダルベッコＰＢＳ（Ｃa
Ｃl2無し）２５０ml にエアー・プロダクツ・エアーボ
ル２０５ポリビニルアルコール１．０２ｇを加え、ＰＢ
Ｓ中、ＰＶＡの０．４％ｗ／ｖ溶液を調製した。ＰＶＡ
をＰＢＳ中に室温で分散させ、その温度を４５℃に昇温
し、ＰＶＡを完全に溶解させた。ＰＶＡを含有するＰＢ
Ｓは、室温に戻してから使用した。
【００８７】クロロホルム中、３０℃のインヘレント粘
度が０．５８ｄＬ／ｇであるＰＬＡ／ＰＧＡ ８５／１
５（ＢＰＩ）［Ｍw＝９０，９００ダルトン、ＭN＝５
０，１００ダルトン］１．７５ｇを塩化メチレン約５０
ml 中に溶解した。このポリマー溶液に空気粉砕したソ
マトゲニン０．２５ｇを加えた。穏やかに渦巻かせ、約
１分間音波処理して、活性なソマトゲニンを分散させて
初期の粒子サイズにした。ポリマー溶液−ソマトゲニン
懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹拌ダルベッコＰＢＳの渦
に加え、撹拌を一晩続行して塩化メチレンを完全に蒸発
させた。減圧濾過により微粒子を回収し、得られた微粒
子を乾燥機内の乾燥皿に入れて減圧乾燥し、乾燥微粒子
１．８１ｇを得、それを以下のメッシュカット（米国標
準）でふるい分けした： ＞６０メッシュ−無し ６０−１２０メッシュ−０．９６ｇ ＜１２０メッシュ−０．０８ｇ ６０−１２０メッシュカットを検定すると１２．９％ｗ
／ｗソマトゲニンを示した（理論値：１２．５％）。
【００８８】実施例１４ ＰＬＡ／ＰＧＡ（８５／１５）微粒子における１５％ソ
マトゲニン ＰＬＡ／ＰＧＡ、８５／１５、ＢＰＩを使用し、ポリビ
ニルアルコール（ＰＶＡ）を含有するダルベッコＰＢＳ
からの溶媒留去の微粒子製造手法により、微粒子を作成
した。調製したばかりのダルベッコリン酸緩衝化食塩水
（ＰＢＳ)(ＣaＣl2無し）２５０ml にエアー・プロダク
ツＶ−２０５ＰＶＡ１．０ｇを加え、ＰＢＳ中、ＰＶＡ
の０．４％ｗ／ｖ溶液を調製した。ＰＶＡをＰＢＳ中に
室温で分散させ、その温度を４５℃に昇温させた。この
溶液は室温に戻してから使用した。この溶液はＰＢＳ
中、０．４％ｗ／ｖＰＶＡを含有していた。
【００８９】クロロホルム中、３０℃のインヘレント粘
度が０．５８ｄＬ／ｇであるＰＬＡ／ＰＧＡ ８５／１
５（ＢＰＩ）［Ｍw＝９０，９００ダルトン、ＭN＝５
０，１００ダルトン］１．５ｇを塩化メチレン約５０ml
中に溶解した。このポリマー溶液にマイクロ粒子化し
たソマトゲニン０．５ｇを加えた。穏やかに渦巻かせ、
約１分間音波処理（室温）して、ソマトゲニンを分散さ
せ、初期の粒子サイズにした。ポリマー溶液／ソマトゲ
ニン懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹拌ダルベッコＰＢＳ
の渦に加えた。撹拌を一晩続行し、塩化メチレンを完全
に蒸発させた。減圧濾過により、微粒子を回収し、それ
を乾燥機内の乾燥皿に入れ、減圧乾燥した。乾燥微粒子
１．８４ｇを回収し、以下のメッシュカット（米国標
準）でふるい分けした： ＞６０メッシュ−０．０１ｇ（廃棄） ６０−１２０メッシュ−０．８６ｇ ＜１２０メッシュ−０．９４ｇ
【００９０】上記の工程を繰り返し、乾燥微粒子１．８
７ｇを得、それを以下のメッシュカット（米国標準）で
ふるい分けした： ＞６０メッシュ−微量（廃棄） ６０−１２０メッシュ−１．１０ｇ ＜１２０メッシュ−０．７１ｇ これらの粒子の検定結果は以下の通りである： ６０−１２０メッシュ＝１５．７±２．１％積載率（ソ
マトゲニン） ＜１２０メッシュ＝１５．２±０．８ｗ／ｗ積載率（ソ
マトゲニン）
【００９１】実施例１５ ＰＬＡ／ＰＧＡ（８５／１５）微粒子における２５％ソ
マトゲニン ＰＬＡ／ＰＧＡ、８５／１５、ＢＰＩを使用し、ポリビ
ニルアルコール（ＰＶＡ）を含有するダルベッコリン酸
緩衝化食塩水（ＰＢＳ）からの溶媒留去の微粒子製造手
法により、微粒子を作成した。ダルベッコＰＢＳ（Ｃa
Ｃl2無し）２５０ml にエアー・プロダクツ・エアーボ
ル２０５ポリビニルアルコール１．０ｇを加え、ＰＢＳ
中、ＰＶＡの０．４％ｗ／ｖ溶液を調製した。ＰＶＡを
ＰＢＳ中に室温で分散させ、その温度を４５℃に昇温さ
せて溶解を補助した。ＰＶＡを含有するこの溶液は室温
に戻してから使用した。
【００９２】クロロホルム中、３０℃のインヘレント粘
度が０．５８ｄＬ／ｇであるＰＬＡ／ＰＧＡ ８５／１
５（ＢＰＩ）［Ｍw＝９０，９００ダルトン、ＭN＝５
０，１００ダルトン］１．５２ｇを塩化メチレン約５０
ml 中に溶解した。このポリマー溶液に空気粉砕したソ
マトゲニン０．５０ｇを加え、そして穏やかに渦巻か
せ、約１分間音波処理（室温）して、活性ソマトゲニン
を分散させ、初期の粒子サイズにした。ポリマー溶液／
ソマトゲニン懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹拌ダルベッ
コＰＢＳの渦に加えた。４００ml 容量パイレックスビ
ーカー及び、３羽根プロペラを備えたプラスチック撹拌
子及びシャフトを使用し、それを得られた水中油エマル
ジョンに入れ、撹拌した。一晩撹拌を続行し、塩化メチ
レンを完全に蒸発させた。得られた微粒子を減圧濾過に
より回収し、それを乾燥機内の乾燥皿に入れ、減圧乾燥
した。乾燥微粒子１．８０ｇを回収し、以下のメッシュ
カット（米国標準）でふるい分けした： ＞６０メッシュ−無し ６０−１２０メッシュ−１．３０ｇ ＜１２０メッシュ−０．１７ｇ ６０−１２０メッシュカットを検定すると、２４．９％
ｗ／ｗソマトゲニンの積載率であった（理論値：２５
％）。
【００９３】実施例１６ ＰＬＡ／ＰＧＡ（５０／５０）微粒子における２５％ソ
マトゲニン ＰＬＡ／ＰＧＡ、５０／５０、ＢＰＩを使用し、ポリビ
ニルアルコール（ＰＶＡ）を含有するダルベッコリン酸
緩衝化食塩水（ＰＢＳ）からの溶媒留去の微粒子製造手
法により、微粒子を作成した。調製したばかりのダルベ
ッコＰＢＳ（ＣaＣl2無し）２５０ml にエアー・プロダ
クツ・エアーボル２０５ポリビニルアルコール１．０ｇ
を加え、ＰＢＳ中、ＰＶＡの０．４％ｗ／ｖ溶液を調製
した。ＰＶＡを磁気撹拌によってＰＢＳ中に室温にて分
散させ、その温度を４５℃に昇温させて溶解を行った。
ＰＶＡを含有するこのダルベッコＰＢＳ溶液は室温に戻
してから使用した。
【００９４】クロロホルム中、３０℃のインヘレント粘
度が０．４２ｄＬ／ｇであるＰＬＡ／ＰＧＡ ５０／５
０（ＢＰＩ）［Ｍw＝２９，０００ダルトン、ＭN＝２
０，０００ダルトン］１．５０ｇを塩化メチレン約５０
ml 中に溶解した。このポリマー溶液に空気粉砕したソ
マトゲニン０．５０ｇを加えた。穏やかに渦巻かせ、約
１分間音波処理して、活性ソマトゲニンを分散させ、初
期の粒子サイズにした。このポリマー溶液／ソマトゲニ
ン懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹拌ダルベッコＰＢＳの
渦に加えた。撹拌速度は２７０−２８０rpmであった。
４００ml 容量パイレックスビーカー及び、３羽根プロ
ペラを備えたプラスチック撹拌ロッドを使用し、それを
得られた水中油エマルジョンに入れ、撹拌した。一晩撹
拌を続行し、塩化メチレンを完全に蒸発させ、次いで微
粒子を形成させ、得られた微粒子を減圧濾過により回収
した。それを乾燥機内の乾燥皿に入れ、減圧乾燥した。
乾燥微粒子１．９２ｇを回収し、以下のメッシュカット
（米国標準）でふるい分けした： ＞６０メッシュ−微量（廃棄） ６０−１２０メッシュ−１．１１ｇ ＜１２０メッシュ−０．７７ｇ
【００９５】実施例１７ ポリ（ＤＬ−ラクチド）微粒子における１０％ソマトゲ
ニン ポリ（ＤＬ−ラクチド）ＰＬＡ／ＰＧＡ、８５／１５、
ＢＰＩを使用し、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を含
有するダルベッコリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）からの
溶媒留去の微粒子製造手法により、ソマトゲニンを含有
する微粒子を作成した。ダルベッコＰＢＳ（ＣaＣl2無
し）２５０ml にエアー・プロダクツ・エアーボル２０
５ポリビニルアルコール１．０ｇを加え、ＰＢＳ中、Ｐ
ＶＡの０．４％ｗ／ｖ溶液を調製した。ＰＶＡをＰＢＳ
中に室温にて分散させ、その温度を４５℃に昇温させて
溶解を補助した。ＰＶＡを含有するこの溶液は室温に戻
してから使用した。
【００９６】クロロホルム中、３０℃のインヘレント粘
度が０．３４ｄＬ／ｇであるポリ（ＤＬ−ラクチド）
（ＢＰＩ）［Ｍw＝３８，３００ダルトン、ＭN＝２４，
３００ダルトン］１．８０ｇを塩化メチレン約５０ml
中に溶解した。このポリマー溶液に空気粉砕したソマト
ゲニン０．２０ｇを加え、そして穏やかに渦巻かせ、約
１分間音波処理して活性ソマトゲニンを分散させ、初期
の粒子サイズにした。このポリマー溶液／ソマトゲニン
懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹拌ダルベッコＰＢＳの渦
に加えた。４００ml 容量パイレックスビーカー及び、
プラスチック３羽根撹拌子及びシャフトを使用し、それ
を水中油エマルジョンに入れ、撹拌した。一晩撹拌を続
行し、塩化メチレンを完全に蒸発させた。得られた微粒
子を減圧濾過により回収し、それを乾燥機内の乾燥皿に
入れ、減圧乾燥した。乾燥微粒子１．６８ｇを回収し、
以下のメッシュカット（米国標準）でふるい分けした： ＞６０メッシュ−０．０２ｇ ６０−１２０メッシュ−１．３６ｇ ＜１２０メッシュ−０．１８ｇ
【００９７】実施例１８ ポリ（カプロラクトン）微粒子における１０％ソマトゲ
ニン ポリ（カプロラクトン）、ＢＰＩを使用し、ポリビニル
アルコール（ＰＶＡ）を含有するダルベッコリン酸緩衝
化食塩水（ＰＢＳ）からの溶媒留去の微粒子製造手法に
より、ソマトゲニンを含有する微粒子を作成した。ダル
ベッコＰＢＳ（ＣaＣl2無し）２５０ml にエアー・プロ
ダクツ・エアーボル２０５ポリビニルアルコール１．０
ｇを加え、ＰＢＳ中、ＰＶＡの０．４％ｗ／ｖ溶液を調
製した。ＰＶＡをＰＢＳ中に室温にて分散させ、その温
度を４５℃に昇温させて溶解を補助した。ＰＶＡを含有
するこの溶液は室温に戻してから使用した。
【００９８】クロロホルム中、３０℃のインヘレント粘
度が１．２７ｄＬ／ｇであるポリ（カプロラクトン）
（ＢＰＩ）［Ｍw＝１４３，３００ダルトン、ＭN＝８
３，０００ダルトン］１．８０ｇを塩化メチレン約５０
ml 中に溶解した。このポリマー溶液に空気粉砕したソ
マトゲニン０．５０ｇを加え、そして穏やかに渦巻か
せ、約１分間音波処理して活性ソマトゲニンを分散さ
せ、初期の粒子サイズにした。このポリマー溶液／ソマ
トゲニン懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹拌ダルベッコＰ
ＢＳの渦に加えた。４００ml 容量パイレックスビーカ
ー及び、プラスチック３羽根撹拌子及びシャフトを使用
し、それを水中油エマルジョンに入れ、撹拌した。一晩
撹拌を続行し、塩化メチレンを完全に蒸発させた。得ら
れた微粒子を減圧濾過により回収し、それを乾燥機内の
乾燥皿に入れ、減圧乾燥した。乾燥微粒子１．８５ｇを
回収し、以下のメッシュカット（米国標準）でふるい分
けした： ＞６０メッシュ−微量 ６０−１２０メッシュ−１．２７ｇ ＜１２０メッシュ−０．５８ｇ
【００９９】実施例１９ ポリ（カプロラクトン）−パルミチン酸（１％）微粒子
における１０％ソマトゲニン ポリ（カプロラクトン）を使用し、ポリビニルアルコー
ル（ＰＶＡ）を含有するダルベッコリン酸緩衝化食塩水
（ＰＢＳ）からの溶媒留去の微粒子製造手法により、ソ
マトゲニンを含有する微粒子を作成した。ダルベッコＰ
ＢＳ（ＣaＣl2無し）２５０ml にエアー・プロダクツ・
エアーボル２０５ポリビニルアルコール１．０ｇを加
え、ＰＢＳ中、ＰＶＡの０．４％ｗ／ｖ溶液を調製し
た。ＰＶＡをＰＢＳ中に室温にて分散させ、その温度を
４５℃に昇温させて溶解を補助した。ＰＶＡを含有する
この溶液は室温に戻してから使用した。
【０１００】ポリカプロラクトン、低分子量、ポリサイ
エンシーズ(Polysciences)１．７８ｇを塩化メチレン約
５０ml 中に溶解した。このポリマー溶液にパルミチン
酸０．０２ｇを加えた。ポリマー−脂肪酸のこの溶液に
空気粉砕したソマトゲニン０．２０ｇを加え、そして穏
やかに渦巻かせ、約１分間音波処理して活性ソマトゲニ
ンを分散させ、初期の粒子サイズにした。このポリマー
溶液／ソマトゲニン懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹拌ダ
ルベッコＰＢＳの渦に加えた。４００ml 容量パイレッ
クスビーカー及び、プラスチック３羽根撹拌子及びシャ
フトを使用し、それを水中油エマルジョンに入れ、撹拌
した。一晩撹拌を続行し、塩化メチレンを完全に蒸発さ
せた。得られた微粒子を減圧濾過により回収し、それを
乾燥機内の乾燥皿に入れ、減圧乾燥した。乾燥微粒子
１．８９ｇを回収し、以下のメッシュカット（米国標
準）でふるい分けした： ＞６０メッシュ−０．０３ｇ ６０−１２０メッシュ−１．１５ｇ ＜１２０メッシュ−０．７４ｇ
【０１０１】実施例２０ ポリ（カプロラクトン）−パルミチン酸（５％）微粒子
における１０％ソマトゲニン ポリ（カプロラクトン）を使用し、ポリビニルアルコー
ル（ＰＶＡ）を含有するダルベッコリン酸緩衝化食塩水
（ＰＢＳ）からの溶媒留去の微粒子製造手法により、ソ
マトゲニンを含有する微粒子を作成した。ダルベッコＰ
ＢＳ（ＣaＣl2無し）２５０ml にエアー・プロダクツ・
エアーボル２０５ポリビニルアルコール１．０ｇを加
え、ＰＢＳ中、ＰＶＡの０．４％ｗ／ｖ溶液を調製し
た。ＰＶＡをＰＢＳ中に室温にて分散させ、その温度を
４５℃に昇温させて溶解を補助した。ＰＶＡを含有する
この溶液は室温に戻してから使用した。
【０１０２】ポリ（カプロラクトン）、低分子量、ポリ
サイエンシーズ(Polysciences)１．７０ｇを塩化メチレ
ン約５０ml 中に溶解した。このポリマー溶液にパルミ
チン酸０．１０ｇを加えた。ポリマー−脂肪酸のこの溶
液に空気粉砕したソマトゲニン０．２０ｇを加え、そし
て穏やかに渦巻かせ、約１分間音波処理して活性ソマト
ゲニンを分散させ、初期の粒子サイズにした。このポリ
マー溶液／ソマトゲニン懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹
拌ダルベッコＰＢＳの渦に加えた。４００ml容量パイレ
ックスビーカー及び、プラスチック３羽根撹拌子及びシ
ャフトを使用し、それを水中油エマルジョンに入れ、撹
拌した。一晩撹拌し、塩化メチレンを完全に蒸発させ
た。得られた微粒子を減圧濾過により回収し、それを乾
燥機内の乾燥皿に入れ、減圧乾燥した。乾燥微粒子１．
９３ｇを回収し、以下のメッシュカット（米国標準）で
ふるい分けした： ＞６０メッシュ−０．０１ｇ ６０−１２０メッシュ−１．０６ｇ ＜１２０メッシュ−０．８２ｇ
【０１０３】実施例２１ ポリ（カプロラクトン）−パルミチン酸（１０％）微粒
子における１０％ソマトゲニン ポリ（カプロラクトン）を使用し、ポリビニルアルコー
ル（ＰＶＡ）を含有するダルベッコリン酸緩衝化食塩水
（ＰＢＳ）からの溶媒留去の微粒子製造手法により、ソ
マトゲニンを含有する微粒子を作成した。ダルベッコＰ
ＢＳ（ＣaＣl2無し）２５０ml にエアー・プロダクツ・
エアーボル２０５ポリビニルアルコール１．０ｇを加
え、ＰＢＳ中、ＰＶＡの０．４％ｗ／ｖ溶液を調製し
た。ＰＶＡをＰＢＳ中に室温にて分散させ、その温度を
４５℃に昇温させて溶解を補助した。ＰＶＡを含有する
この溶液は室温に戻してから使用した。
【０１０４】ポリ（カプロラクトン）、低分子量、ポリ
サイエンシーズ(Polysciences)１．６０ｇを塩化メチレ
ン約５０ml 中に溶解した。このポリマー溶液にパルミ
チン酸０．２０ｇを加えた。ポリマー−脂肪酸のこの溶
液に空気粉砕したソマトゲニン０．２０ｇを加え、そし
て穏やかに渦巻かせ、約１分間音波処理して活性ソマト
ゲニンを分散させ、初期の粒子サイズにした。このポリ
マー溶液／ソマトゲニン懸濁液を、ＰＶＡを含有する撹
拌ダルベッコＰＢＳの渦に加えた。４００ml容量パイレ
ックスビーカー及び、プラスチック３羽根撹拌子及びシ
ャフトを使用し、それを水中油エマルジョンに入れ、撹
拌した。一晩撹拌し、塩化メチレンを完全に蒸発させ
た。得られた微粒子を減圧濾過により回収し、それを乾
燥機内の乾燥皿に入れ、減圧乾燥した。乾燥微粒子１．
９１ｇを回収し、以下のメッシュカット（米国標準）で
ふるい分けした： ＞６０メッシュ−微量 ６０−１２０メッシュ−１．１７ｇ ＜１２０メッシュ−０．６９ｇ
【０１０５】実施例２２ ソマトゲニン濃度の出力プロフィルに対する効果 上述の実施例に従って製造した微粒子を使用し、種々の
ＰＬＡ／ＰＧＡ微粒子濃縮物におけるソマトゲニン（Ｌ
Ｙ２９３４０４）濃度の効果を測定した。出力特性は、
尿の尿素窒素排泄とフィニッシング・ブタ(finishing s
wine)における血清成長ホルモンとによって測定した。
ナノ−プュアＩＩ精製水(Nano-pure IIpurified water)
中、２％ｗ／ｖカルボキシメチルセルロース・ナトリウ
ム３３０（ＮaＣＭＣ）を使用し、微粒子製剤を懸濁液
中に入れた。得られた懸濁液を動物の脇腹に皮下注射し
た。以下の処置材料を調製した：
【０１０６】ＴrtＡ： 対照としての水；
【０１０７】ＴrtＢ： ２％ｗ／ｖＮaＣＭＣ３３０を
含有する水中の５％ソマトゲニンＰＬＡ／ＰＧＡ（８
５：１５）微粒子（６０−１２０メッシュ、ＭＷ＝９
０，９００、３０℃のクロロホルム中の粘性＝０．５８
ｄＬ／ｇ）の懸濁液であって、ソマトゲニン４２mｇ／
動物の用量を与える懸濁液；
【０１０８】ＴrtＣ： ２％ｗ／ｖＮaＣＭＣ３３０を
含有する水中の１０％ソマトゲニンＰＬＡ／ＰＬＧ（８
５：１５）微粒子（６０−１２０メッシュ、ＭＷ＝９
０，９００、３０℃のクロロホルム中の粘性＝０．５８
ｄＬ／ｇ）の懸濁液であって、ソマトゲニン４２mｇ／
動物の用量を与える懸濁液；
【０１０９】ＴrtＤ： ２％ｗ／ｖＮaＣＭＣ３３０を
含有する水中の２５％ソマトゲニンＰＬＡ／ＰＬＧ（８
５：１５）微粒子（６０−１２０メッシュ、ＭＷ＝９
０，９００、３０℃のクロロホルム中の粘性＝０．５８
ｄＬ／ｇ）の懸濁液であって、ソマトゲニン４２mｇ／
動物の用量を与える懸濁液。
【０１１０】この試験結果より、含有されるペプチドを
長期に放出する微粒子の効能が証明された。尿窒素の減
少は、微粒子からのソマトゲニン放出によって刺激され
る成長ホルモンの測定値である。図３に示されるよう
に、すべての微粒子処置ブタにおいて処置の最初の６日
間に排泄される尿の尿素窒素が減少した。減少は最も高
い積載率（２５％）の微粒子で最も大きく、最も低い積
載率（５％）の微粒子で最も小さかった。図４は微粒子
処置ブタの血清成長ホルモンの直接測定値を表している
が、これもさらに、ソマトゲニンが微粒子から経時的に
徐放していることを証明している。各図における垂線は
相対的な標準偏差を示している。
【０１１１】実施例２４ 種々のＰＬＡ／ＰＧＡ微粒子製剤におけるソマトゲニン
の出力プロフィル 上述の実施例に従って製造した微粒子を使用し、種々の
ＰＬＡ／ＰＧＡ微粒子製剤として投与した場合のソマト
ゲニン（ＬＹ２９３４０４）の出力特性を調べたが、こ
れはフィニッシング・ブタにおける尿の尿素窒素排泄及
び成長ホルモンの血清レベルによって測定した。Ｎano-
pure ＩＩ精製水中、２％ｗ／ｖカルボキシメチルセル
ロース・ナトリウム３３０（ＮaＣＭＣ）を使用し、微
粒子製剤を懸濁液中に入れた。得られた懸濁液を動物の
脇腹に皮下注射した。以下の処置材料を調製した：
【０１１２】ＴrtＡ： 対照としての水；
【０１１３】ＴrtＢ： ポジティブ対照としてのソマト
ゲニン（１日２回注射する３μg／kg／日）；
【０１１４】ＴrtＣ： ２％ｗ／ｖＮaＣＭＣ３３０を
含有する水中の１１．７％ソマトゲニンＰＬＡ／ＰＬＧ
（５０：５０）微粒子（６０−１２０メッシュ、ＭＷ＝
６０，７００）の懸濁液であって、ソマトゲニン２２．
６８mｇ／動物の用量を与える懸濁液；
【０１１５】ＴrtＤ： ２％ｗ／ｖＮaＣＭＣ３３０を
含有する水中の１１．４％ソマトゲニンＰＬＡ／ＰＬＧ
（５０：５０）微粒子（６０−１２０メッシュ、ＭＷ＝
２９，０００）の懸濁液であって、ソマトゲニン７．５
６mｇ／動物の用量を与える懸濁液；
【０１１６】ＴrtＥ： ２％ｗ／ｖＮaＣＭＣ３３０を
含有する水中の１１．４％ソマトゲニンＰＬＡ／ＰＬＧ
（５０：５０）微粒子（６０−１２０メッシュ、ＭＷ＝
２９，０００）の懸濁液であって、ソマトゲニン２２．
６８mｇ／動物の用量を与える懸濁液；
【０１１７】ＴrtＦ： ２％ｗ／ｖＮaＣＭＣ３３０を
含有する水中の１３．６％ソマトゲニンＰＬＡ／ＰＬＧ
（８５：１５）微粒子（６０−１２０メッシュ、ＭＷ＝
９０，９００）の懸濁液であって、ソマトゲニン７．５
６mｇ／動物の用量を与える懸濁液；
【０１１８】ＴrtＧ： ２％ｗ／ｖＮaＣＭＣ３３０を
含有する水中の１３．６％ソマトゲニンＰＬＡ／ＰＬＧ
（８５：１５）微粒子（６０−１２０メッシュ、ＭＷ＝
９０，９００）の懸濁液であって、ソマトゲニン２２．
６８mｇ／動物の用量を与える懸濁液。
【０１１９】図５及び図６に示されるように、１５日間
のすべての時点においてソマトゲニン注射した去勢ブタ
の尿の尿素窒素排泄は減少し、またＧＨの血清レベルは
上昇した。処置の最初の６日間では、すべての微粒子処
置ブタの尿の尿素窒素排泄は減少し、ＧＨの血清レベル
は上昇した。処置の約９日目には、尿の尿素窒素排泄及
びＧＨの血清レベルは基準線レベルに復帰した。
【０１２０】上記のように本発明を詳細に説明してきた
が、これらは単なる例示であって、本質的に制限するも
のでなく、好ましい態様のみが示され説明されていると
解すべきであり、本発明の範囲内にあるすべての変化及
び修飾をも保護されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 流速２００μl／分で０．１Ｎ 酢酸を灌流さ
せた際の、微粒子からのソマトゲニンの経時的放出のイ
ンビトロ試験結果を示すグラフである。
【図２】 流速２００μl／分で０．１Ｎ 酢酸を灌流さ
せた際の、種々の積載率を有する微粒子からのソマトゲ
ニンの経時的放出のインビトロ試験結果を示すグラフで
ある。
【図３】 種々の濃度のソマトゲニンを有するＰＬＡ／
ＰＧＡ微粒子における尿素窒素排泄を経時的に比較して
いるグラフである。
【図４】 種々の濃度のソマトゲニンを有するＰＬＡ／
ＰＧＡ微粒子における成長ホルモンの血清レベルを経時
的に比較しているグラフである。
【図５】 種々のＰＬＡ／ＰＧＡ微粒子製剤における尿
素窒素排泄を経時的に比較しているグラフである。
【図６】 種々のＰＬＡ／ＰＧＡ微粒子製剤における成
長ホルモンの血清レベルを経時的に比較しているグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 47/34 Ａ Ｄ (72)発明者 トーマス・ハリー・ファーガソン アメリカ合衆国46140インディアナ州グリ ーンフィールド、イースト・メイン1810番 (72)発明者 マーク・ルイス・ヘイマン アメリカ合衆国46250インディアナ州イン ディアナポリス、スーザン・ドライブ・イ ースト5740番 (72)発明者 ウィリアム・ウェブスター・トンプソン アメリカ合衆国46226−1542インディアナ 州インディアナポリス、オーバーブルッ ク・サークル5521番

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 外膜及び内膜が気室を形成している卵の
    一端を除いて膜間に液が存在しているこれらの外膜及び
    内膜を有する卵への注射に使用するのに適している微粒
    子であって、両膜間の液を介して気室の反対側の卵末端
    に移動するサイズ及び密度を有している微粒子。
  2. 【請求項２】 気室が上部になるように置いた卵の気室
    に注射するのに適している請求項１に記載の微粒子であ
    って、膜間の液と少なくとも同じ密度を有している微粒
    子。
  3. 【請求項３】 平均サイズが約５００ミクロン以下であ
    る請求項１又は請求項２に記載の微粒子。
  4. 【請求項４】 成長ホルモン放出因子、成長ホルモン放
    出因子の合成同族体、及び薬学的に活性なそれらの断片
    からなる群の中から選ばれる生物学的に活性な物質を供
    給するための請求項１から請求項３のいずれかに記載の
    微粒子。
  5. 【請求項５】 ポリラクチド重合体、ポリグリコリド重
    合体、及び乳酸及びグリコール酸の共重合体からなる群
    の中から選ばれる重合体を含有する、請求項１から請求
    項４までのいずれかに記載の微粒子。
  6. 【請求項６】 生物学的に活性な物質を含有する生体分
    解性ポリエステル微粒子の製造方法であって、 (a) ポリエステルを有機溶媒に溶解し、 (b) 工程(a)にて得られた溶液に水溶性の生物学的に活
    性な物質を加えて懸濁液を調製し、 (c) 工程(b)にて得られた懸濁液を、該物質が不溶であ
    る水性媒質中でエマルジョン化し、 (d) 得られたエマルジョンから溶媒を留去して微粒子
    を作成し、そして (e) 得られたエマルジョンを採取することを特徴とす
    る方法。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載の方法によって製造され
    る生体分解性のポリエステル微粒子組成物。
  8. 【請求項８】 生物学的に活性な物質が成長ホルモン放
    出因子、成長ホルモン放出因子の合成同族体、及び薬学
    的に活性なそれらの断片からなる群の中から選ばれる請
    求項７に記載の組成物。
  9. 【請求項９】 ポリエステルが乳酸単独の重合体、乳酸
    及びグリコール酸の共重合体、このような重合体の混合
    物、このような共重合体の混合物、又はこのような重合
    体及び共重合体の混合物からなる群の中から選ばれる請
    求項７又は請求項８に記載の組成物。
JP6110886A 1993-05-27 1994-05-25 生物学的活性物質及び微粒子からなる組成物 Withdrawn JPH0797314A (ja)

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