JPH07508415A - 新規のセロビオース・オキシダーゼ，酵素剤及び紙パルプ処理方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規のセロビオース・オキシダーゼ、酵素剤及び紙バルブ処理方法発明の分野 本発明は、新規のセロビオース・オキシダーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅｏｘｉｄ ａｓｅ）、そのセロビオース・オキシダーゼを含んで成る酵素剤及びそのセロビ オース・オキシダーゼを使用した紙バルブの漂白方法に関する。

発明の背景 製紙のための木チップの（Ｋｒａｆｔ　ｐｕｌｐｉｎｇとして知られた）化学バ ルブ化は、その木の中に存在するリグニンの９０−９８％を除去するための木チ ップのアルカリ・硫酸塩蒸煮（ａｌｋａｌｉｎｅ　５ｕｌｐｈａｔｅ　ｃｏｏｋ ｉｎｇ）ヲ含む。残った２−１Ｏ％のリグニンは、バルブに暗褐色を付与し、こ れはＵ■先光中は酸化により暗色になる傾向をもつ。白色バルブを得るためには 、それ故、バルブ中に存在するリグニンは、様々な漂白手順により除去されなけ ればならない。そのほとんどは、塩素又は二酸化塩素、オゾン、酸素又は過酸化 水素による処理を含む。

上記漂白工程において生成される化学物質の環境的な影響についての関心の増加 のため、バルブの酵素処理が、その工程において必要な漂白化学物質の量を減少 させながら、紙パルプからのリグニンの除去の視点をもって提案されてきた。例 えば、”Ｔｈｅ　ｔｈｉｒｄ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎ ｃｅ　ｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｕ１ｐ　ａｎｄ　 Ｐａｐｅｒｉｎｄｕｓｔｒｙ”、　Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、　１６−１９　Ｊｕｎ ｅ、　１９８６．　ｐｐ、　６７−６９を参照のこと。

これまでに記載された紙パルプの酵素処理は、はとんどが、酸性最適ｐＨをもツ ヘミセルラーゼにより、例えば、”４ｔｈ　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｙｍ ｐｏｓｉｕｍ　ｏｆ　Ｗｏｏｄ　ａｎｄ　Ｐｕｌｐｉｎｇ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ”、　Ｐａｒｉｓ、　２２−３０　Ａｐｒｌｌ、１９８７．　Ｖｏｌ、１．　ｐ ｐ、　１５１−１５４を参照のこと、又はトリコデルマ酸性ｐＨにおいて、ｐＨ ６未満の木バルブのｐＨ調整を必要としながら、行われてきた。

キシラナーゼ組成物も、漂白バルブの輝度を強化し、漂白のために並びに再生紙 の漂白において使用される化学物質の量を減少させるためのバルブ漂白工程にお いて、バルブ及び製紙産業において使１９８９、　ｐｐ、　１８７−１９１を参 照のこと。バルブ処理のためのアルカリ性キシラナーゼの使用については、Ｗｏ 　９１１０２８３９中に記載されている。

木においては、リグニンはキシランに結合している。キシラナーゼは、リグニン の増加した放出が漂白の間に生じるようにキシランの加水分解を触媒することが できる。他の酵素、セロビオース・オキシダーゼが、リグニン分解のために重要 であることが発見された。

ここで、それは、リグニンからの分解生成物に対するフェノール・オキシダーゼ の作用により形成されたフィノキシ基及びキノンを減少させ、これによりセロビ オース及び高級セロデキストリン（ｃｅｌｌｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ）をその対応 のラクトンに酸化する。ファネロカエート・１９７８、　ｐｐ、　１７１１８１ 中に記載されており、そしてさらに、Ｆ、　Ｆ。

Ｍｏｒｐｅｔｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　２２８．１９８５．　ｐｐ、　５ ５７−５６４により特徴付けされている、このセロビオース・オキシダーゼは、 ｐ１１５において最適ｐＩ（をもつことが分かっている。また、セロビオース・ オキシダーゼｐｐ、　３０９−３１（ｉ）、カエトミウム・セルロリティカム（ Ｃｈａｅｔｏｍｔｕｍｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）（Ｐ、　Ｆａｅｈｎｒｉ ｃｈ　ａｎｄ　Ｋ、ｌｒｒｇａｎｇ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。

の中にも発見されている。これらのセロビオース・オキシダーゼがセルロース分 解に関与すると信じられている。

発明の説明 本発明の目的は、アルカリ性条件下でバルブ漂白工程において使用されることが できるセロビオース・オキシダーゼを提供することである。

従って、本発明は、セロビオース・オキシダーゼ活性を示す酵素であって約９の ｐＨ及び約５０°Ｃの温度において少なくとも７０％の比活性をもつものに関す る。

本文脈中、用語”セロビオース・オキシダーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅｏｘｉｄ ａｓｅ）”は、酸素、Ｆｅ（ＩＩＩ）含有化合物、例えば、シアン化第二鉄、又 は電子受容体としての様々な芳香族化合物を使用してセロビオース及びセロデキ ストリンをその対応ラクトンに酸化することができるヘモフラボプロティン（ｈ ｅｍｏｆ　１ａｖｏｐｒｏＬｅｉｎ）酵素をさすことを意図される。用語”比活 性（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）”は、最大活性に対して上記電子受 容体の存在中でセロビオースを酸化する能力において理解されることを意図され る。

上記タイプのセロビオース・オキシダーゼは、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ） の株から得られたセロビオース・オキシダーゼに対して生じた抗体と免疫学的応 答性であるものである。用語”免疫学的応答性”は、フミコーラ（）Ｉｕｍｉｃ ｏｌａ）の株から得られたセロビオース・オキシダーゼと共通な少なくともｌの エピトープをもつ酵素をもっことを示すと意図される。

本発明に係る好ましい酵素は、５−１ＯのｐＨにおいて安定性であるものである 。特に、この酵素は、電子受容体としてＤＣＰＩＦ又はベンゾキノンを使用して 約５−９のｐＨ１例えば、約ｐＨ７における、電子受容体としてチトクロームＣ を使用して約ｐＨ７−９における、そして電子受容体としてシアン化第二鉄を使 用して約ｐＨ９における、最適ｐＨをもつものである。比較により、先に記載さ れたＭ、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅからのセロビオース・オキシダーゼの最適ｐＨ は、電子受容体としてシアン化第二鉄を使用して３−４である。本発明の特に好 ましい酵素は、ｐＨ９，５において５５℃の最適温度をもつものである。

当業者に公知のやり方における標識タンパク質を使用した５ＤＳ−ポリアクリル アミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び等電点電気泳動を、それぞれ、 分子量及び等電点（ｐｌ）を測定するために使用した。この方法においては、本 発明のセロビオース・オキシダーゼの分子量は、約９２ｋＤであると測定された 。この酵素のｐＨは約４−５であると測定された。

フミコーラ・インソレンス（ｌｌｕｍｉｃｏｌａ　１ｎｓｏｌｅｎｓ）　、例え ば、特許手続きの目的（ブダペスト条約）をもって微生物の寄託の国際的承認に 関するブダペスト条約の条項に従って１９＆１年１０月１日にＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｍｌｕｎｇ　ｗｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓａ＋ｅｎ、Ｍａｓｃｈ ｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ　ＩＢ、Ｄ−３３００Ｂｒａｕｎｓｃｈｅｉｇ、　ＦＲＧ に寄託されたＤＳＭ　１８００株から精製されることができる。

他のセロビオース・オキシダーゼであってアルカリ性条件下で活性であるものは 、スポロルミエラ（Ｓｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌａ）の株、例えば、スポロルミエラ ・インターメディア（Ｓｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）　、 例えば、特許手続きの目的（ブダペスト条約）をもって微生物の寄託の国際的承 認に関するブダペスト条約の条項に従って１９９３年７月１日（こＣｅｎｔｒａ ａｌｂｕｒｅａｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、　Ｐ、Ｏ ，Ｂｏｘ　２７３．３７４０ＡＧ　Ｂａａｒｎ、　ＮＬに寄託されたＣｌｌ５３ ６９．９３株から得られることができる。

しかしながら、本発明に係るセロビオース・オキシダーゼの工業的生産のために は、所望の酵素活性の過剰生産を確保することに関連した発酵の調節又は微生物 の突然変異を含む組換えＤＮＡ技術又は他の技術を使用することが好ましい。こ のような方法及び技術は、本分野において公知であり、そして当業者により容易 に行われることができる。

従って、セロビオース・オキシダーゼは、そのセロビオース・オキシダーゼ又は そのための前駆体をエンコードするＤＮＡ配列、並びにそのセロビオース・オキ シダーゼ又はそのための前駆体をエンコードするＤＮＡ配列の発現を許容する機 構をエンコードするＤＮＡ配列を担持する組換えＤＮＡベクターにより形質転換 された宿主細胞を、培養中、そのセロビオース・オキシダーゼ又はそのための前 駆体の発現を許容する条件下で培養し、そしてその培養物からセロビオース・オ キシダーゼを回収することを含んで成る方法により、生産可能であるものである ことができる。

セロビオース・オキシダーゼ又はそのための前駆体をエンコードするＤＮＡ断片 は、例えば、セロビオース・オキシダーゼ産生微生物、例えば、フミコーラ・イ ンソレンス、ＤＳＭ　１８００のｃＤＮＡ又はゲノム・ライブラリーを樹立し、 そして慣用の手順により、例えば、そのセロビオース・オキシダーゼの全体的又 は部分的アミノ酸配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチド・プローブへの ハイブリダイゼーションにより陽性クローンをスクリーニングすることにより、 又は適当な酵素活性を発現するクローンについて選択することにより、又は生来 のセロビオース・オキシダーゼ成分に対する抗体と応答性であるタンパク質を生 産するクローンについて選択することにより、単離されることができる。

一旦選択されると、ＤＮＡ配列は、セロビオース・オキシダーゼが特定の宿主生 物内で発現されることを許容する適当なプロモーター、オペレーター及びターミ ネータ−１並びにそのベクターが問題の宿主生物内で複製されることを可能する 複製起点を含んで成る好適な複製可能な発現ベクター内に挿入されることができ る。

次に、得られた発現ベクターは、好適な宿主細胞、例えば、菌細胞、例えば、ア スペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　Ｉ　Ｉｕｓ）の種、最も好ましくはる。菌細胞 は、それ自体公知のやり方で、プロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転 換その後の細胞壁の再生を含む方法により、形質転換されることができる。宿主 微生物としてのアスペルギルスの使用は、（Ｎｏｖｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／ Ｓの）ＥＰ　２３８，０２３号中に記載されており、この内容を、引用により本 明細書中に取り込む。また、宿主細胞は、酵母細胞、例えば、サツカロミセス・ セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株である ことができる。

あるいは、宿主生物は、バクテリア、特にストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ ｙｃｅｓ）及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株、又は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ ）であることができる。バクテリア細胞の形質転換は、常法により、例えば、Ｓ ａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ 　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　ＣｏＩｄ　Ｓｐｒｊｎｇｔ（ａｒｂｏ ｒ、　１９８９中に記載されたように、行われることができる。

適当なりＮＡ配列のスクリーニング及びベクターの構築は、標準的な手順により 行われることもできる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、引用書中、を参照の こと。

形質転換された宿主細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を 培養するのに好適ないずれかの慣用培地であることができる。発現されたセロビ オース・オキシダーゼは、便利にはその培養基中に分泌され、そして遠心分離又 は濾過によりその培地から細胞を分離し、塩、例えば、硫酸アンモニウムにより その培地のタンパク質成分を沈降させ、その後クロマトグラフィー手順、例えば 、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティー・クロマトグラフィー等を含 むよく知られた手順により、それから回収されることができる。

先に示したような組換えＤＮＡ技術、タンパク質精製の技術、発酵の技術又は本 分野においてよく知られた他の技術を使用することにより、高純度のセロビオー ス・オキシダーゼを提供することができる。

他の態様においては、本発明は、非発塵粒状物（ｎｏｎ−ｄｕｓｔｉｎｇｇｒａ ｒ＋ｕｌａ＋ｅｓ）、安定性液体又は保護された酵素の形態において本発明のセ ロビオース・オキシダーゼを含んで成る酵素剤に関する。非発塵粒状物は、例え ば、ＩＪＳ　４．１０６．９９１号及び４．６６１．４５２号（両者ＮｏｖａＩ ｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓへのもの）に従って製造されることができ、そして場合 により、本分野において公知の方法によりコートされることができる。液体酵素 調製物は、例えば、確立された方法に従ってポリオール、例えば、プロピレン・ グリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又は硼酸を添加することにより安定化さ れることができる。他の酵素安定剤も、本分野においてよく知られている。保護 された酵素は、ＢＰ　２３８．２１６号中に開示された方法に従って製造される ことができる。

バルブ漂白工程における使用のために、セロビオース・オキシダーゼと他の酵素 であってそのセロビオース・オキシダーゼの活性を補う活性をもつ酵素、例えば 、エンドグリカナーゼ（ｅｎｄｏｇｌｙｃａｎａｓｅ）及び／又は（セロビオー ス・オキシダーゼ以外の）オキシドレダクターゼ（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓ ｅ）とを組み合わせることが特に有利である。

エンドグリカナーゼは、例えば、ヘミセルラーゼ、例えば、キシラナーゼ、マン ナーゼ又はアラビナーゼ、又はセルラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼ、特に キシラナーゼであってリグニン分解についてその重要性が既に確立されているも の、であることができる。

このキシラナーゼは、好ましくは、フミコーラ・インソレンス、フ又はストレプ トミセス・オリボクロモゲン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｏｆ　ｉｖｏｃｈｒｏ ｍｏｇｅｎｅｓ）から得られたものである。セルロース又は他の多糖類基質の分 解工程においては、エンドグルカナーゼがオリゴ糖類、例えば、セロビオース及 びセロデキストリンを作り出し、これをセロビオース・オキシダーゼが基質とし て使用することができる。

本発明の酵素剤に添加されるオキシドレダクターゼは、好ましくダーゼ、又はマ ンガン・ペルオキシダーゼ（ｍａｎｇａｎｅｓｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ラ ッカーゼ（ｌａｃｃａｓｅ）（フェノールオキシダーゼ（ｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄ ａｓｅ）、例えば、ボリボロス・ペンシタス（Ｐｏｌｙｐｏｒｏｓ　ｐｅｎｓｉ ｔｕｓ）により生産可能なもの、又はリグニナーゼ（Ｉｉｇｎｉｎａｓｅ）　、 例えば、ファネロカーゼは、オキシドレダクターゼのための基質として働く基質 、例えば、過酸化水素を生成することができる。

本発明に係る酵素剤は、さらに、漂白加速剤、例えば、金属イオン、例えば、フ ェリンアン化カリウム、ハライド・イオン又は有機化合物、例えば、フェノール 化合物、例えば、７−ヒドロキシクマリン、バニリン、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、 ２．４−ジクロロフェノール、ジクロロフェノール−インドフェノール、３．５ −ｔｅｒｔ−、ブチル−１，２−ベンゾキノン、ｐ−クマリン酸、アントラキノ ン又はｐ−ヒドロキシベンゼン・スルホネートを含んで成ることができる。これ らの化合物は、酸化過程のための電子受容体として働く。

さらなる態様においては、本発明は、１以上の酵素的脱リグニン化段階を含んで 成る紙バルブの漂白方法であってバルブをセロビオース・オキシダーゼにより処 理することを含んで成る方法に関する。

この酵素的処理は、典型的には、バルブの塩素漂白の前に起こるであろう、そし てさらに少量の塩素が、酵素の使用に関係しない慣用の方法において要求される よりもそのバルブの満足できる輝度を得るために、必要とされる。

セロビオース・オキシダーゼは、好ましくは、本発明に係るものである。なぜな ら、このセロビオース・オキシダーゼは、アルカリ性ｐＨ値において活性である からである。この場合においては、酵素の添加前に紙バルブを酸性にすることが 必要とされないであろう。

本発明の方法においては、セロビオース・オキシダーゼは、好ましくは、エンド グリカナーゼ、例えば、先に示唆したエンドグリヵナーゼの中の１つ、及び／又 はオキシドレダクターゼ、例えば、先に示したオキシドレダクターゼの中の１つ との組み合わせにおいて使用される。このような組み合わせは、改良されたリグ ニン分解をもたらすことが予想される、なぜなら、先に示したように、エンドグ リカナーゼがセロビオース・オキシダーゼのための基質を提供することができ、 そしてそれらが、今度は、オキシドレダクターゼのための基質を提供し、そして 結果として改良された漂白効果をもたらすからである。

従って、本発明に係る方法の好ましい態様においては、酵素的処理は、約７を超 えるｐＨにおいて行われる。

さらに好ましくは、酵素処理は、４０〜１００　’Ｃの間の、好ましくは４０〜 ８０℃の間の、より好ましくは５０〜７ｏの間の温度において行われる。

酵素処理は、典型的には、１５分間〜２４時間、好ましくは３０分間〜５時間の 間の、より好ましくは３０分間〜３時間の間の時間にわたり行われる。

本発明に係る方法においては、バルブのコンシスチンシーは、典型的には、５− ３５％、好ましくは８−２５％、より好ましくは８−１５％である。

本性は、さらに、それぞれの脱リグニン化段階において酵素処理後のアルカリに ょろりグツセルロース（ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ）材料の抽出を含んで 成ることができる。抽出後、このリグノセルロース材料は、水でよく洗浄される 。少なくとも１の慣用の漂白段階が酵素的脱リグニン化に加えて含まれることも できる。

本発明を、さらに以下の実施例において説明するが、これは請求されるものとし て本発明の範囲がいずれの方法によっても限定されることを意図されない。

実施例 実施例１ ２１．４ｇのタンパク質を含むｃｅｌｌｕｚｙｍｅ　ＴＭ（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄ ｉｓｋ　Ａ／Ｓ）（ＴＭは商標）の溶液を。５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩバツ フアー、ｐｌ（７，０により平衡とした３００ｍ１アルギニン５ｃｐｈａｒｏｓ ｅカラム上に適用し、そしてＴｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，０−９，０と０−０ ．２Ｍ　ＮａＣ１の同時グラジェントにより溶出した。セロビオース酸化活性を 含む溶出液を１１ＣＩによりｐＨ５，０に調整し、そして２０ｍＭクエン酸Ｎａ 　ｐＨ５中、Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅカラム上に適用した。このカラムは、セル ラーゼのほとんどを結合し、一方、セロビオース・オキシダーゼは、溶出液によ り溶出された。溶出液のｐＨを７．０に調整し、そして溶出物を前もって５０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＭＣＩ　ｐＨ７，０により平衡とされたアニオン交換カラム（Ｈ ＰＱ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ）上に適用した。このカラムをＯ−Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ グラジェントにより溶出した。これは大量のもの（９２ｋＤａ及び４．０のｐｌ ）から少量のセロビオース・デヒドロゲナーゼ（９４ｋＤａ及び４．４のｐｌ） を分離ひた。５ｕｐｅｒｄｅｘ　２００　Ｈｉｌｏａｄカラム上のゲル濾過を９ ２ｋＤａの見かけの分子量をもつセロビオース・デヒドロゲナーゼを溶出させ、 このように、低分子量の汚染セルラーゼからそれを分離した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び等電点電気泳動 後なる画分の分析用ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動をＴｒｉｓ−グルシン・ バッファー系により製造者により推奨された手順に従ってＢｉｏ−Ｒａｄ装置上 のＩＯＸゲル・スラブ上で行った。等電点電気泳動をＬＫＢマルチフォア（ｍｕ 　ｔ　ｉ　ｐｈｏｒｅ）装置及びアンフォリン・プレキャスト・ゲル（ａｍｐｈ ｏｌｉｎｅ　ｐｒｅｃａｓｔ　ｇｅｌｓ）（ＬＫＢ）を使用して行った。等電点 電気泳動後のセロビオース・オキシダーゼ活性をセロビオース及びＤＣＰＩＦを 含むＩ％アガロース重層を使用して測定した。このＣＢＯｓがはっきりとした明 るい領域として現れた。

生化学的特徴付は アミノ酸組成をＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのアミノ酸装置を使用し て測定した。アミノ酸組成を表１中に示す。値は、加水分解の２４時間後に測定 したアミノ酸組成から計算された。トリプトファンは、ＨｏＥｄｅｌｈｏｃｈ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　６．１９６７、　ｐｐ、　１９４８−１９５４の 方法に従って測定した。

サンプル（２５０ｐｍｏｌ）をＩＭ　ＨＣＩにより１００℃において４時間加水 分解した。酸を真空蒸発により除去し、そして存在する糖の同定をＰＡＤ検出器 （Ｄｉｏｎｅｘ　Ｃｏｒｐ、、　５ｕｎｎｙｖａｌｅ、　ＵＳＡ）及びＣａｒｂ ｏｐａｋ　ＰＡＩｖイクロカラムを備えたＨＰＬＣにより確立した。

タンパク質は、２％（Ｗ／Ｗ）の全糖含量をもつ糖タンパク質である。

以下の糖が検出された：酵素１ｍｏｌ当たり、４ｍｏｌのグルコサミン、４ｍｏ 　ｌのマンノース及び３ｍｏ　ｌのガラクトース。

″　Ｃａｎｅｖａｓｃｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、（１９９１）、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、１９Ｂ。

１９９１．ｐｐ、４３−５２゜ ’　Ｈ，Ｅｄｅｌｈｏｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｔｓ旦１６．１９６７、　ｐｌ） 、　１９４８−１９５４の方法に従って測定した。

補欠分子団の同定 全吸収スペクトル及び速度測定を１ｃ＋ｎの光路をもつ０．７５ｍ１の黒色キュ ベツト内で）ｌｅｗｌｅｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　８４５２Ａ　Ｄｉｏｄｅ　Ａｒｒ ａｙＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ上で記録した。蛍光スペクトルをＰＲ ＲＫＩＮ　ｆ！ＬＭ［！ＲＬＳ　５０上で記録した。

５００μｍ４．８μＭセロビオース・オキシダーゼのスペクトルを記録し、そし て１０μｌの５ｎ＋ｍＭセロビオース又は数粒のナトリウム・ジチオニット（Ｍ ｅｒｃｋ）を添加し、還元ＣＢＯを得た。そのフラビン基の検出のために、１． ７μＭセロビオース・オキシダーゼの蛍光スペクトルを記録した。３９７及び４ ４３Ｍｍにおける励起のための発光スペクトル及び４８０における発光のための 励起スペクトルを記録した。

消光係数 ＣＢＯε２ｓｏ　”　３３０，０００　Ｍ　’　・Ｃｍ−’、消光係数は、その アミノ酸組成及び８５ｋＤａの分子量を使用して推定した。

２つの消光係数をＤＣＰＩＦについて測定した＋　ｐＨ２〜５．５のレンジ１こ おいて、ε５．。＝　７，５００　Ｍ　−’　・ａｍ−’及びｐｌ＋５．５から ＩＯまで、ε６゜。

＝１４．０００　ｈｌ　’　・ｃｍ　’ｏフェリシアン化カリウム（Ｍｅｒｃｋ ）　：　ｅ　ｌ　２゜＝９７０　Ｍ　−’　・ｃｍ−’、３，５−ジーｔｅｒｔ −ブチルー１．２−ベンゾキノン（Ｍｅｒｃｋ）　：εｔ１ｏ　：１，４００　 Ｍ　−’−ｃｍ　’、メチレン・ブルー（Ｍｅｒｃｋ）：　Ｅ　ａｇｏ　＝４２ ．０００　Ｍ　−’　−Ｃｍ−’、チトクロームＣ（Ｓｉｇｍａ、ウマ心臓由来 ）：εａｓ。

＝　８，０００　Ｍ−’・Ｃｍ−’。

セロビオース・オキシダーゼの可視スペクトルは、ヘモプロティンの特徴をもつ 。酸化状態は４２０Ｍｍにおいて最大吸収をもち（γ）くノド２０３，０００Ｍ 　−’　・ｃｍ−’）　、一方、還元状態のスペクトルは、５６４ｒ＋ｍ（αバ ンド６１，０００Ｍ　−’　・ｃｍ−’）　、５３４Ｍｍ　（β）くノド４６， ０００Ｍ　−’　−ｃｍ−’）及び４３２ｒ＋ｕ＋　（７バンド２Ｂ７．０００ Ｍ　’・ｃｎ＋−’）にお（Ａで吸収ピ一りを示し、これはチトクロームｂに典 型的なものである（Ｇ。

ビン基は弱く蛍光性であり、４８０Ｍｍにおける最大発光及び３９７及び４４３ Ｍｍにおける最大励起をもっていた。

活性の測定 測定を０．１Ｍ燐酸ナトリウムバッファー中、ｐＨ７，５４０℃におし）て行っ た。４５０μＩの、１００μＭの２，６−シクロロフエノールーインドフエノー ル（ＤＣＰＩＦ、　Ｍｅｒｃｋ）、２５０ＭＭのセロビオース（Ｓｉｇ、ａ）の 混合物を、５０７１１の酵素と混合した。活性のユニ・ノドは、１分間当たりに 酸化されたセロビオース（還元されたＤＣＰｌｔ’）のμｍｏｉｌこ等し０゜触 媒特性 酸化生成物の同定 ４０ｍｇのセロビオースを１０ｍ１の水中で３０ｍｇのＤＣＰＩＦと混合し、そ して１００μｍ０１．６μＭセロビオース・オキシダーゼを添加した。この混合 物を室温において一夜攪拌した。この混合物を水により希釈し、そして酢酸エチ ルにより数回抽出し、還元及び非還元ＤＣＰＩＦを除去した。ＤＩＯ中のセロビ オース及びその酸化生成物の’　ＨＮＭＲ及び”ＣＮＭＲスペクトルを次にＢｒ ｕｋｅｒ　ＡＣＰ　３００スペクトロメーター上で採取した。セロビオース、　 ’　ＨＮＭＲ（Ｄ　２０）：　δ（ｐｐｍ）　４．６５（β。

１（−１，Ｊｌ、　！　＝８．Ｏｆ＋ｚ）、　５．２１（（Ｚ、　Ｈ−１，Ｊ　 １．２　”　３．７　ＨｚＭＣｌａｅｙｓｓｅｎｓｅｔ　ａｌ、、１９９０）； 　”　ＣＮＩＪＲ（Ｄ　２０）：　δ（ｐｐｍ）　９２．９（ａ、　Ｃ−１）、 ９６．８（β、　Ｃ−１Ｃ−１）（Ｄｏｒ　ａｎｃｌ　Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９７ １）。セロピノラクトン、＋８ＮＭＲ（Ｄ　２０）：　４．２８ｐｐｍ　〜４． ７５ｐｐｍ間にピークなしくＨ−１°＋　Ｊ　ｌ’、２”８、Ｏｔ（ｚ）；　” 　ＣＮＭＲ（Ｄ　ｒ　Ｏ）、δ（ｐｐｍ）　８４．２ｐｐｍ（Ｃ−４）〜１０５ ．５ｐｐｍ（Ｃ−１°）間にピークなし。

すべての測定を、０．１Ｍ燐酸ナトリウム・バッファー、　ｐＨ７，５中、４０ ℃において行った。４５０μｌの、１５μＭ　〜５ｍＭ（Ｋ　、に依存する）の 電子供与対する及び受容体並びに５０μｇの、ｋ　Ｃａｔに依存して７０ｎＭ〜 ２００ｎＭの酵素を混合し、５００μｍの全容量にした。反応を適当な波長（上 記参照）における吸収の変化として４００秒間モニターした。ベンゾキノンをＩ ＯｎＩＭの濃度までエタノール中に溶解し、そして適当な濃度まで燐酸バッファ ー中で希釈した。触媒定数（ｋ　ｅ、、）は酸化セロビオース１ｆｆｌｏｌ／秒 ／酵素１＋ｎｏｌとして表された。ＤＣＰＩＦ　、メチレン・ブルー又はベンゾ キノンの１当量はセロビオースの１当量を酸化し、一方、チトクロームＣ又はフ ェリシアニドの２当量はセロビオースの１当量を酸化する。速度定数はＬｉｎｅ ｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋｅプロットを使用して決定され、そして２回の測定の結 果であった。

酵素は、表２中に列記したように、様々な２糖類及びセロデキストリンを酸化す るとができることが分かった。それはグルコースを酸化することができなかった 。セロビオースの酸化の生成物をり、０中のＩＨ及び”ＣＮＭＲを使用して同定 した。両スペクトルにおいて、その還元末端のα−及びβ−アノマーに対応する ピークが消失し、セロビン酸をもたらすＣ−１における酸化を含意した。

セロビオース及びセロデキストリンは、表２中に見られるように、重合の程度と 独立して殆ど同じｋ　ｅａｒ及びに、をもつセロビオース・オキシダーゼにより 容易に酸化される。ラクトースは、セロデキストリンの速度に匹敵する速度にお いて酸化される。マルトース及びキシロビオース（ｘｙｌｏｂｉｏｓｅ）も基質 である。しかしながら、これらの基質は、セロデキストリンの結合よりもかなり 弱い結合を示す。

グルコース、Ｎ、Ｎ−ジアセチルチトビオース及びＮ−アセチルラクトサミンは 酸化されない。

表３ アルカリ性ｐＨにおける温度活性の測定温度活性のために、測定を、Ｏ，１Ｍグ リシン・バッファー中、ｐＨ９，５において、様々な温度において、５００μｍ の全容量中で混合された５５０μＭチトクロームＣ（Ｓｉｇｍａ　ウマ心臓由来 ）　、２２５　ｕＭセロビオース（Ｓｉｇｍａ）及び酵素を使用して、行った。

活性を８．ＯＯＯＭ−’　・ＣＩ＋−’のモル消光係数を使用してチトクローム Ｃの還元として測定した。

最適活性は、５分間のインキュベーションの間５５℃において見つかった。結果 を図１に示す。

ｐＨ活性プロフィールをｐＨ３，５から６．５まで酢酸ナトリウム・バッファー を、ｐＨ６，５から８．５まで燐酸ナトリウムを、そしてｐＨ９がら１０までグ リシン・バッファーを使用して４０℃活性において測定した。

すべてのバッファーは、Ｏ，ＬＭ濃度、上記のような酵素及びセロビオース及び チトクロームＣの濃度であった。最適活性をｐＨ７，５において得て、そして７ ５％の残活性をｐｌ＋９．５において得た。定常状態の速度は、ＩＯ分分間−た 。結果を図２に示す。

セルラーゼについての結合検定 電子受容体によりセロデキストリンを酸化するセロビオース・オキシダーゼの能 力を、セルラーゼのための検定において利用した。

還元末端をもたない基質、例えば、還元セロデキストリンを使用することにより 、セルラーゼによる加水分解により形成された還元末端がＣＢＯにより酸化され るであろう。同時に、着色電子受容体、ジクロロフェノールインドフェノール（ ＤＣＰＩＦ）がセロビオース・オキシダーゼにより無色の化合物に還元され、６ ００ｎｍにおいて分光光度的な反応が継続することを可能にする。その高い消光 係数のために、ＤＣＰＩＦが電子受容体として選ばれた。

この検定により、５つの異なるセルラーゼの還元セロデキストリンのための速度 定数を測定した（表２）。結果は、この結合系の利用性を示している。この酵素 は、非常に異なる基質特異性を示し、その幾つかは非常に長い基質を必要とし、 定常状態の速度のために利用されることができるウンベリフェリル・セロビオシ ド及びラクトシト（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｉｄｅｓ　 ａｎｄ　１ａｃｔｏｓｉｄｅｓ）を使用を不可能にする。結論として、広いレン ジのセルラーゼについて定常状態速度を測定することが本検定により可能となり 、これは、セルラーゼの機構のさらなる理解における良好な道具である。

阻害剤、メチル４−チオセロトリオシト、メチル４−チオセロテトラオシド及び メチル４−チオセロペンタオシドを１、ＧｒｅｎＯｂｌｅ’にある実験室で合成 した。阻害定数を２つのセルラーゼについて開発した検定を使用して測定した。

結果を表３中に表す。

実施例２ オキシドレダクターゼの作用により形成されたキノンの還元によるリグニン分解 をペルオキシダーゼとの組み合わされたセロビオース・オキシダーゼを使用して 調査した。最初に、リグニンのモデル化合物、クロロゲン酸（ｃｈｌｏｒｏｇｅ ｎｉｃ　ａｃｉｄ）を適用した。

反応混合物は２ｎ＋１の０．１Ｍ燐酸塩バッファー、ｐＨ７中、１μモルのクロ ロゲン酸 １ユニツトのコプリナス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ　ｃｉｎｅｒｅｕｓ） ペルオキシダーゼ（Ｉ　ＰＯＤＵ） ０．４μモル過酸化水素 １５０ユニツトのセロビオース・オキシダーゼから成った。

ＩＰＯＤＵはＮｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓ、　Ｎｏｖｏ　Ａ１１ｅｅ、　 ２８８０　Ｂａｇｓｖａｅｒｄ、　Ｄｅｍａｒｋから要求により入手可能な、Ｎ ｏｖｏ　Ｎｏｒｄｌｓｋ　ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄＡＦ　３１０／ ｌ中に記載されている。

温度は室温であった。

反応を、その波長においてキノンの形成が検出されることができる４４０ｎｍに おけるＬＩＶ−吸収により行った。ペルオキシダーゼの作用により、吸収がキノ ンの形成に対応して増加した。８０秒後、１５μモルのセロビオースを添加した 。吸収は、セロビオース・オキシダーゼにより触媒されたキノンの還元の結果と して、直ちに減少しはじめた。

類似の実験において、クロロゲン酸をリグノスルホネート（４ｍｇ）により置き 換えた。結果は同じであった：最初にＡｌｌ。がキノンの形成のために増加した が、セロビオースが添加されるとすぐに、吸収が減少した。

両ケースにおいて、吸収は、４分後に、開始レベルと同様のレベルに落ちついた 。すなわち、キノンの定量的還元が得られた。

実施例３ バルブの脱リグニン化 パルプの脱リグニン化を、５ｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ　ｐｉｎｅ　Ｋｒａｆｔバ ルブを使用して検査した。以下のサンプルを調製した：ａ）　２−５乾燥パルプ １０ユニツト １５μモルの過酸化水素 １５０μモルのセロビオース ６０００ユニツトのセロビオース・オキシダーゼ７０ｍＩ　Ｏ，１Ｍ燐酸塩バッ ファー、ｐ）＋８ｂ）　ａ）と同じ、但し、セロビオース・オキシダーゼを添加 せず。

上記サンプルを４０℃において２４時間振とう水浴内でインキュベートした、濾 過後、パルプ・サンプルを水により洗浄し、そして乾燥させた。脱リグニン化の 程度の指標として、カッパ数を、ＴＡＰＰＩ標準に従って測定した。

このように、有意な脱リグニン化がセロビオース・オキシダーゼ及びペルオキシ ダーゼによるバルブの処理の間に得られることができた。

実施例４ ０ビオース・オキシダーゼの生産 ２つのバッフルを備えた５００ｍ１のＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振とうフラスコ内の １００ｍ１の２倍濃縮ＹＭ培地（１％グルコース、０．５％ペプトン、０．３％ 麦芽エキス及び０．３％酵母エキス、ｐＨ６，５を含む）に、ＰＤＡ寒天中のス ポロルミエラ・インターメディア（Ｓｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅ ｄｉａ）　、株ＣＢ５３６９、９３のカルチャーを接種した。培養上澄のアリコ ツト（２５μｍ）を間隔をあけて採り、そして５０μｌの２５０ｍＭ燐酸カリウ ム・バッファー、ｐＨ６，５，５０μｌの１００ｍＭセロビオース、及び２５μ ｍの０．４ｍＭ２．６−ンクロロフエノールインドフエノールを含むマイクロタ イター・プレート内でセロビオース・オキシダーゼ活性について検定した。

セロビオース活性を２．６−シクロロフエノールインドフエノールの脱色として 測定した。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年１２月２７日

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．セロビオース・オキシダーゼ活性を示す酵素であって、約９のｐＨ及び約５ ０℃の温度において少なくとも７０％の比活性をもつ酵素。
2. ２．フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）の株から得られたセロビオース・オキシダ ーゼに対して生じた抗体と免疫学的に応答性である、請求項１に記載の酵素。
3. ３．フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ）株ＤＳ Ｍ　１８００の株から得られたセロビオース・オキシダーゼに対して生じた抗体 と免疫学的に応答性である、請求項２に記載の酵素。
4. ４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されるとき約９２ｋＤの分子量をもつ、請求項 ２又は３に記載の酵素。
5. ５．５−１０のｐＨにおいて安定性である、請求項１〜４のいずれかに記載の酵 素。
6. ６．ｐＨ５−９において最適ｐＨをもつ、請求項５に記載の酵素。
7. ７．ｐＨ９．５において５５℃の最適温度をもつ、請求項５に記載の酵素。
8. ８．約４−５のｐｌをもつ、請求項２又は３に記載の酵素。
9. ９．非発塵粒状物、安定化された液体、又は保護された酵素の形態における、請 求項１〜８のいずれかに記載のセロビオース・オキシダーゼを含んで成る酵素剤 。
10. １０．セロビオース・オキシダーゼ並びにエンドグルカナーゼ及び／又はオキシ ドレダクターゼを含んで成る酵素剤。
11. １１．セロビオース・オキシダーゼが請求項１〜８のいずれかに記載のものであ る、請求項１０に記載の酵素剤。
12. １２．セロビオース・オキシダーゼがスポロルミエラ（Ｓｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌ ａ）、例えば、スポロルミエラ・インターメディア（Ｓｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ＣＢＳ　３６９．９３の株により生産可能なものであ る、請求項１１に記載の酵素剤。
13. １３．エンドグルカナーゼがヘミセルラーゼ、例えば、キシラナーゼ、マンナー ゼ若しくはアラビナーゼ、又はセルラーゼ、例えば、エンドグルカナーゼである 、請求項１０に記載の酵素剤。
14. １４．キシラナーゼが、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａｉｎｓｏ ｉｅｎｓ）、フミコーラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｌａｎｕｇｉｎｏ ｓａ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｉｉｕｓ　ｐｕｍｉｌｕｓ）、マルブラ ンケア・シナモネア（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ　ｃｉｎｎａｍｏｎｅａ）、バチ ルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ ｐｈｉｌｕｓ）、サーモノスポラ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｎｏｓｐｏｒａ　ｆｕ ｓｃａ）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｉｉｖ ｉｄａｎｓ）又はストレプトミセス・オリポクロモゲン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ ｅｓ　ｏｉｉｖｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）から得られたものである、請求項１ ２に記載の酵素剤。
15. １５．オキシドレダクターゼが、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ又はリグニナー ゼである、請求項１０に記載の酵素剤。
16. １６．ペルオキシダーゼが、コプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）の株、例えば、コ プリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ　ｃｉｎｅｒｅｕｓ）又はコプリヌス ・マクロリザス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ　ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓ）により生産可能 なものである、請求項１４に記載の酵素剤。
17. １７．リグニナーゼが、ファネロカエート（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）又は トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）の株により生産可能なものである、請求項１４ に記載の酵素剤。
18. １８．非発塵粒状物、安定化された液体、又は保護された酵素の形態にある、請 求項１０〜１６のいずれかに記載の酵素剤。
19. １９．漂白加速剤、例えば、金属イオン、例えば、ハライド・イオン又は有機化 合物、例えば、フェノール化合物、例えば、７−ヒドロキシクマリン、バニリン 、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、２、４−ジクロロフェノール、ｐ−クマリン酸、アン トラキノン又はｐ−ヒドロキシベンゼン・スルホネートをさらに含んで成る、請 求項９〜１７のいずれかに記載の酵素剤。
20. ２０．１以上の酵素的脱リグニン化段階を含んで成る紙パルプの漂白方法であっ て、セロビオース・オキシダーゼによるパルプの処理を含んで成る方法。
21. ２１．セロビオース・オキシダーゼが請求項１〜８のいずれかに記載のものであ る、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．セロビオース・オキシダーゼがスポロルミエラ（Ｓｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌ ａ）、例えば、スポロルミエラ・インターメディア（Ｓｐｏｒｏｒｍｉｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ＣＢＳ　３６９．９３の株により生産可能なものであ る、請求項２１に記載の方法。
23. ２３．パルプが請求項１０〜１９のいずれかに記載の酵素剤により処理される、 請求項２０に記載の方法。
24. ２４．酵素処理が約７を超えるｐＨにおいて行われる、請求項２０又は２３に記 載の方法。
25. ２５．酵素処理が４０〜１００℃の間の、好ましくは４０〜８０℃の間の、より 好ましくは５０〜７０℃の間の温度において行われる、請求項２０又は２３に記 載の方法。
26. ２６．酵素処理が１５分間〜２４時間、好ましくは３０分間〜５時間、より好ま しくは３０分間〜３時間の時間にわたり行われる、請求項２０又は２３に記載の 方法。
27. ２７．パルプのコンシステンシーが５−３５％、好ましくは８−２５％、より好 ましくは８−１５％である、請求項２０又は２３に記載の方法。
28. ２８．それぞれの酵素的脱リグニン化段階が、セロビオース・オキシダーゼによ る処理後に、アルカリによるりグノセルロース材料のさらなる抽出段階を、その 後の水によるそのリグノセルロース材料の十分な洗浄を、含んで成る、請求項２ ０又は２３に記載の方法。
29. ２９．前記酵素的脱リグニン化段階（単数又は複数）に加えて、少なくとも１の 慣用の漂白段階を含んで成る、請求項２０又は２３に記載の方法。