JPH07505606A - 細菌エンドトキシンの解毒ならびに敗血病性ショックの防止および処置のための合成ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌エンドトキシンの解毒ならびに数曲病性ショックの防ＩＬおよび処置のため の合成ペプチド 発明の背景 エンドトキシンによって誘発されるショックは敗血症性ショック（Ｓ　Ｓ）とし て知られている。この状部は生命を脅かす状況であって、これは外１１手術の合 併症、長引いた入院、事故およびその他の外傷性事象の場合にグラム陰性閑によ る感染の結果として生ずるものである。今日、この疾病の原因となる作因は細菌 エンドトキシン、すなわちグラム陰性閑の表面のみに存在する一種の糖脂質抗原 であることはよく認識されている。この糖脂質はまた、炭水化物鎖であって、リ ビ゛ドΔ（Ｌ　ｉ　ｐＡ）と呼ばれる脂肪酸に富む部分に共有結合するものの炭 水化物鎖のサイズによってリボ多糖（ＬＰＳ）またはりボオリゴ糖（ＬＯ３）と して知られる。リビドＡのみがエンドトキシン（ＬＰＳ）によって示される主要 毒性作用について病仔がある。一度エンドトキンンが細菌によって血流中に放出 されると、マクロファージおよび単核細胞のような免疫系の特殊化細胞がエンド １−キシンによって活性化され、そして数を類の免疫仲介体（ｓｅｄｌａｔｏｒ ｓ）が解放される（シトキン、たとえばインターロイキン−１およびインターロ イキン−６、α−腫瘍壊死因子、γ−インターフェロン）。更に、エンドトキシ ンはまた、補体カスケードを活性化し、これが細胞溶解をもたらし、その結果と して血小板から血管作動性エフェクター（たとえば、プラノキニンおよびヒスタ ミン）の解放を促進する蛋白質う）解酵素の放出を招来するものである。最終的 な結果は症例４０−６０％の重者の４８−７２時間以内の死亡である。今までの ところは、副腎皮質ステロイド、たとえばメチルプレドニソロンのポーラス注入 （ｂｏｌｕｓ　Ｉｎｊｅｃｔｌｏｎｓ）が行われているが、有効な特定の医療剤 または治療法は全く存在しない。

ポリミキシン”Ｂ″は細菌エンドトキシンと結合し、かつ毒性を除く分子として 知られており、動物モデルに治療的に投与した場合、敗血症性ショックを阻止し 得るものである。しかしながら、ポリミキシン５Ｂ”は生体外および生体内の毒 性生成物であり、そしてこの事実が敗血症性ショックの処置に関する治療剤とし ての可能性を制限するものである。

敗面病性ショックは、ＬＰＳの放出をもたらすあらゆる細菌による感染によって 惹き起こされる可能性がある。これらの細菌にはシュードモナス・アエロギノー サ（Ｐｓｅｕｄｏ＠ｏｎａｓ　ａａｒｏｇｌｎｏｓａ）　、１ンエリヒア−コリ （Ｅｓｃｈｅｒｌｃｈｌａ　ｃｏｌｔ）、サルモネラ・チフィ　（Ｓａｌ＋＋ｏ ｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｌ）　、ナイセリア・メニンギチディス（Ｎｅｌｓｓｅｒ ｌａ　＋＋ｅｎｌｎｇｌｔｌｄｌｓ）　、ナイセリア・ゴノルヘアｙ−（Ｎｅｌ ｓｓｅｒｌａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａｅ）、ボルデテラ・ペルッシス（Ｂｏｒｄｅ ｔｅｌｌａ　ｐｃｒｔｕｓｌｓ）　、クレブシェラ”：−二％ニアエ（に１ｅｂ ｓｌｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｌａａ）等がある。

ポリミキシンＢの報告された毒性に立ち至る理由は完全には理解出来ないが、そ れらは多分、そのアミノ酸組成の特異性、特にＬα−γ−、ノアミノ酪酸（ＤＡ Ｂ）であって、ａａミリシン文献には、蛋白質合成においてリシンを置換出来る ことが報告されている）の類似体であるものの含有量（その構造の４９．１％Ｗ 　／　Ｗ　）ならびに天然産出のし一フェニルアラニンの異性体であるＤ−フェ ニルアラニンの存在に特別に関係しているものと思われる。更に８８組成に関連 するその他の考えられる理由は、蛋白質分解酵素に対するポリミキシン”Ｂ”の 高い安定性ならびにＬＰＳのリビドＡ部分に関し構造的に類似点のある細胞レセ プターに対する有り得る結合に関係している可能性がある（神経組織のガングリ オジッドはリピドＡ構造中に存在するＮ、　Ｏ−アンル鎖と密接に関連するＮ、 　Ｏ−アシル（ＣＩＡ−Ｃ１８）鎖に関する糖脂質である）。

本出願人は新規な高次構造的ペプチドを発見した。これらは構造的にポリミキシ ンとは（それらのアミノ酸組成において）異なっているが、エンドトキシン（Ｌ Ｏ５およびＬＰＳ）のリビドＡ内の同一結合部位であって、ポリミキシン１Ｂ” もまた結合するであろう場所に対し結合可能なものである。この新規ペプチドの 相対的結合効率（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｂｌｎｌｄｌｎｇ　ｅｆｒｌｃｌｅｎｃｙ ）はポリミキシン”Ｂ＠の親和力定数値（ａｌＴＩｎｌｔｙ　ｃｏｎｓｔａｎｔ 　ｖａｌｕｅ）に匹敵している。

リビドＡまたはＬＰＳが本発明のペプチドと反応して形成された複合体は非毒性 てあり、リピドＡおよびＬＰＳの天然の抗原性は維持される。

エンドトキシンのリピドＡ部分に対するこの強力な親ｆ口性結合の結果、合成ぺ プチド類似体の大部分は、生体外ならびに生体内分析によって証明されるように エンドトキ／ンを無毒化する能力を示した。生体外試験では、解毒の手段として 、エンドトキンンによるＬｙｖｕｌｕｓ　１ｙｓａｔｅ　（Ｌ　Ａ　Ｌ試験）の 凝固を導く酵素的カスケードの抑制を用いた。ＬＡＬ試験は最も鋭敏であり、ま たＬＰＳの毒性および発熱原性作用に関する予知試験であると認められている。

それは生体内の発熱原性が内在性免疫モノュレータ、インターロイキン−１（Ｉ Ｌ−１）およびアルファー顆瘍壊死因子（α−ＴＮＦ）　、数曲病性ショックに 関連する致死の原因となる仲介体に関係しているからである。ＬＰＳの解毒作用 を確認する生体内試験として、次に米国薬局方ＸＸＩに従って行われる家兎発熱 物質試験を利用した。

このようにして、この発見は数曲病性ンジノクの処置において使用し得る新しい クラスの化合物を提供するものである。新規なペプチドはヒトにおいては、それ らの完全な天然アミノ酸組成に基づいて、またヒト血清中の蛋白質分解に対する それらの限定された耐性のために、ポリミキシン＋Ｂ＋の毒性効果を示さないで あろうことが予防される。

従って、本発明の主要な目的は敗面病性ショックの処置において使用し得る新規 な予防および治療剤を提供することである。

更に本発明の目的は数曲病性ショックの処置において使用し得る新規なペプチド 化合物を（Ｉ　ＩＢすることである。

本発明の別の目的は数曲病性ノヨノクの処置において使用し１）る新規な票学的 組成物を提ｆｌｔすることである。

本発明の別の目的はリビドＡまたはＬＰＳとペプチドとのＵ＋現な複合体であっ て、抗原性であり、かつＪＰ毒性のものを提ｆｌｋすることである。

本発明の別の目的は新規な４１市性リピｌ”ＡまたはＬＰＳ抗原を製造する方法 をＩ７１供することである。

エンドトキンンが生成される場合の敗１１１１病性ショック以外の条件らまた、 数曲病性ショックを処置するために用いるペプチドの同−投！ｊ量を使用するこ とによって本発明のペプチドにより処置してもよい。これらの条（’ｌは百日咳 細菌性髄膜炎（ｐｃｒｔｕＳｓｌｓ　ｂａｃｔｅｒｌａｌ　ｓｃｎｌｎｇＩＬｌ ｓ）およびウイルスヤＩＨＩＶ−関連感染を包含する。

本発明のこれらおよび他の目的は本明細書の検討によって明らかとなるであろう 。

図面の簡単な説明 第１図はエンドトキシノに対する本発明のペプチドの効果を示すグラフである発 明の詳細な説明 本発明は式： ％式％（１） （式中Ｒ１およびＲは独立にＨあるいはアミノ酸残基または脂肪酸残基であり、 ＡはＬｙｓ％ＡｒｇおよびＨｌＳから成るＦ！■から選択されるアミノ酸残基で あり、ＢはＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐから成る群から選択されるアミノ酸であ り、ＣはＬｅｕ、ＩｌｅおよびＶａｌから成る１１から選択されるアミノ酸であ り、ｎは１−１００の整数、そして好ましくは１−１０の整数である。）で表さ れる両親媒性−ポリカチオン特性を示す化学式をＩＴする、新規なモノマー、線 状ポリマー、環式モノマーまたは環式ポリマーペプチドを１ｌＨＩｊする。

これらのペプチドは数曲病性ショックの処置に際して有用である。

式１に従う好ましい式は式１１・ Ｒ１−（Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）ｎ−Ｒ（Ｔ　Ｉ）（式中ｎは１−１００、好 ましくは１−１０の整数であり、そしてＲおよびＲ１はＨあるいは天然生成のア ミノ酸または脂肪酸であって、アルキル鎖長１乃至２０（あるいは以上）のメチ レン基を包含するもののいずれかであればよい、、）である。記載されたペプチ ドの逆配向された（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｌｅｎｔｅｄ）　ａ　ａ配列を有するペプ チド、記載されたペプチドの鏡像異性１＄ａａ配列またはジアステレオマーａａ 配列を有するペプチドおよびそれらの元の位置に対する適所にａａ移動したペプ チドは数曲病性ショックの処置において有用であるペプチドを提１共する。

式■およびＩＩで表されるペプチドの例には次のものが含まれる。

グループｉ　グループＩ＋　グループｌ１１（Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）　ｎ　 （＾ｒｇ−１”ｈｅ−Ｌｅｕ）　ｎ　（ＩＩＩｓ−Ｉ’ｈｃ−Ｌｃｕ）　ｎ（Ｌ ｙｓ−Ｐｈｃ−Ｖａｌ）　ｎ　（＾ｒｇ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）　ｎ　（ＩＩＩｓ− Ｐｈｅ−Ｖａｌ）　ｎ（Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｉｌｃ）　ｎ　（＾ｒｇ−ｒ’ｈｅ− １１ｅ）　ｎ　（ＩＩＩｓ−Ｉ’ｈｅ＝ＩＩＱ）　ｎ（Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−１，ｃ ｕ）　ｎ　（＾ｒＨ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）　ｎ　（Ｉｌｌｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ）　 ｎ（Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ）　ｎ　（＾ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ）　ｎ　（ＩＩ Ｉｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｔ）　ｎ（Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−ｌｌｅ）　ｎ　（＾ｒｇ−Ｔｙ ｒ−１１ｅ）　ｎ　（ＩＩＩｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ）　ｎ（ｌｙｓ−Ｔｒｐ−１， 、ｃｕ）　ｎ　（＾「ｇ−丁ｒｐ−１，ｅｕ）　ｎ　（ＩＩＩｓ−Ｔｒｐ−Ｌｃ ｕ）　ｎ（Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｖａｔ）　ｎ　（＾ｒｇ−丁ｒｐ−Ｖａｌ）　ｎ　 （ＩＩＩｓ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ）　ｎ（Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−１１ｅ）　ｎ　（＾ｒｇ −Ｔｒｐ−１１ｅ）　ｎ　（ＩＩＩｓ−Ｔｒｐ−１１ｅ）　ｎこれらペプチドの 具体例には次のものが含まれる。

Ｃｙｓ−１，ｙｓ−Ｐｈｅ−１，ｃｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＣｙｓＳ−−−−−− −−−−−Ｓ しｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−１，ｙｓ−１”ｈｅ−１，ｅｕ−１，ｙｓ− Ｌｙｓ−ＣｙｓＳ−一一一−−−−−−−Ｓ １、ｙｓ−１”ｈｅ−１，ｅｕ−１，ｙｓ−１，ｙｓ−てｈ「ｌ　Ｉｅ−Ｌｙｓ −Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｏｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−丁ｈ「Ｃｙｓ− １，ｙｓ−Ｌｙｓ−１ｃｕ−１”ｈｅ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙ ｓＳ−−−一−−−−−−−Ｓ Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−１，ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ Ｓ−−−−一−−−−−−Ｓ ｌ　ｌ　ｅ−１，ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−１，ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ− Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＣｙｓＳ−−一、−−−一−−−Ｓ １　Ｉ　ｅ−Ｌｙｓ−Ｐｈｃ−１ｅｕ−１ｙ　ｓ−Ｐｈｅ−Ｌｃｕ−Ｌｙｓ　− Ｐｈ　ｅ−Ｌｅｕ−ＬｙｓＬｙｓ−ｒ’ｈｅ−Ｌｃｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ −Ｌｙｓ＾ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−＾ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｖａｔ−＾ｒｇ−Ｔｙｒ− Ｖａｔ新規なペプチドはヒトを含む哺乳動物における数曲病性ショックの予防お よび処置に関して約０．１μｇ−２，０ｍｇ／体重ｋｇの投与量において有用で あり、また約１０μｇ乃至約０．１ｍｇ／体重ｋｇのレベルにおいて用いてもよ く、そしてこの量を１日基準とする分割投与量において投与してもよい。ペプチ ドは敗面病性ショックを起させる可能性のある生物体に対し曝される可能性ある 、あるいは曝された重責に対し予防的に投与してもよいし、あるいは生体内に上 述した同一投与量を用いることによって細菌エンドトキンンを無毒化するもので ある。エンドトキンン汚染の生体外解毒またはＴ・防は所望結果を達成するのに 有効であるレベルにおいて行えばよい。その量は第１ＩＩ表に示すように約１モ ルのエンドトキンンは１モルのペプチドによって結合されるといつ前掃に基づく ルーチンの実験を基礎とすればよい。特定ペプチドの特定投与量は特定の用途ま たは疾病の激しさおよびホストの状態によって本明細書で特定される＠皿内また は外で変化させればよい。当業者は標章の手順を利用して適切な投与量を確定す ることが出来る。

この化合物は周知の薬学的担体または不活性希釈剤を用いて静脈管内に、また非 経口的に投与すればよい。経口投与は好ましくない。それはペプチドが消化管の 酵素によって分解されがちだからである。水または等張塩水が希釈剤として好ま しく、そして濃度０．１ｍｇ／ｍ＋を用いればよい。好ましいのはこの化合物が 乾燥形管で貯蔵されることてあり、そして投与の直前に希釈剤中に溶解されるこ とである。

これらの新規なペプチドは手動または自動技法を利用するペプチド化学の古典的 方法ならびにＤＮＡｌｌ１換えテクノロジーによって合成すればよい。この合成 手順はＦｍｏｃ化学による固相合成、開Ｒ（ＴＦＡ９５％＋Ｅｔ−（ＳＨ）２５ ９６）、引続く真空蒸発を含んて成る。その後、この生成物を１０％酢酸中に溶 解し、エーテルで抽出し、ＴｌＨ６，Ｏ−７，５においてＯ，１ｍｇ／ｍｌに濃 縮する。ンステイン含有ペプチドの場合は濾過空気下の撹拌が１乃至６時間続き 、そして最後に逆用クロマトグラフィーによって脱塩が行われる。

通常、リピドーＡおよびＬＰＳと本発明ペプチドとの複合体は化学量論量のリピ ドーＡまたはＬＰＳとこのペプチドを用いることによって作ることが出来る。

ホスト中に抗体を誘導もし得る複合体の…は臨界的なものではなく、ペプチドと の複合体中のリピドーＡ約１ｍｃｇがホスト中に抗体を安全に誘導するに際して 有効であることが示されている。

ペプチドの活性はＢ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓリピドＡおよびＢ、ｐｅｒｔｕｓ８Ｉ ｓＬＰＳによるａ接微投沈殿検定法によって確認されている。更に、ポリミキシ ン２８２との比較におけるＬＰＳについての結合活性はｗ　／　ｗ基準でペプチ ド／ＬＰＳおよびペプチド／リビドＡの割合に基づいて立証されている。カブト ガニ（ＬＡＬ）ＩＩｔ験からのデータは、適切な濃度で試験したとき、新規な化 合物がポリミキシン２Ｂ”に対して均等なＬＡＬ抑制を存することを示している 。

本発明はまた、エンドトキシンを解毒する目的で液体中に分散させたエンドトキ シンを含む接触系に対するペプチドの利用をも包含する。この方法はバイオ調合 薬、たとえばワクチン、薬剤の溶液、注入可能栄養素溶液等を解毒するために使 用することが出来る。この発明は更に、エンドトキシンを生成することになる細 菌の成長を持続させる液体に関する添加物としてのペプチドの利用を含んでいる 。非毒性ペプチドの存在は次に生ずる如何なるエンドトキシンをも解毒すること になる。

この発明のペプチドは１ｍｇ／ｍ目？の高い濃度において臨床的に関連する細菌 、たとえばビブリオ・コレラエ（ＶＩｌ＋ｒｌｏ　ｃｈｏｌｃｒａｅ）　、サル モネラ・チフィ　（Ｓａｌ＠ｏｎｅｌ　ｌａ　Ｔｙｐｈｌ）およびハエモフィラ ス・インフルエンザエ（ｌｌａｅｗｏｐｈ　Ｉ　ｌ　ｕｓ　ｌ　ｎ　ｒＩｕｃｎ ｚａｃ）に抗するポリミキシンＢについて固有の抗生物質活性をインビトロで呈 することは示されていプｊい。ここで開示される１１１１なペプチドは１ｍｇ／ ｍｌ稈の高い′ａ度においてヒト赤１（１１球に対する溶血活性がエクスビボ（ 肱ｖ　Ｉ　ｖｏ）では示されていない。

これらのペプチドはスイス・ウェブスター・マウス（Ｓｗｉｓｓ　Ｖｃｂｓｔｅ ｒ　ｍ１ｃｅ）に５０ｍｇ／ｋｇをもって注入したとき４８時間および超過の観 察の後、生体内で急激な毒性を示すことは無かった。同一種のマウスに関してポ リミキシンＢについてのＬＤ５０は２．５−５ｍｇ／ｋｇである。

米国ＣＦ　ＲＴＩＬｌｅ　２１　ＧｌＯ，ｌｌ（ｂ）によるｔ、Ｉ）、注射の後 マウスまたはモルモットにおいて異常な毒性は全く示されなかった。試験動物は ７日間またはそれを超えて観察されたが、異常の徴候は全く示さなかった。

更に、この新規な化合物は蛋白質分解酵素、たとえばトリプシンの存在下で比較 的不安定であることを示すのに対し、ポリミキシン”Ｂ”はトリプシンの存在下 で安定であることが確認されている。これらの結果は新規な化合物が数曲病性シ ョックの処置に関して有用であることを示している。

好ましい実施態様の説明 以下は本発明化合物の合成に関する好ましい手順を例証するものである。

次の手順を用いて、ポリアミド／多孔質珪藻土樹脂（２、Ｏｇ）の固相支持体に 対し自動合成装置１１ＦＭＩＬＬＩＧＥＮモデル９０５０　ＣＭＩＬＬ　ＩＰＯ ＲＥ、［ｌｕｒｌｌｎｇｔｏｎ、　Ｍ＾）を使用することによってペプチドは合 成される。このペプチド類似体の合成において用いられるアミノ酸は、逐次的に ペプチドを形成するために各アミノ酸０．８ｍｍｏｌを用いる考慮された配列に 包含される各アミノ酸（ａａ）のＦｍｏｃ−ａａ−Ｏｐｆｐ誘導体（９−フルオ レニルメチロキシカルボニル−ａａ−０−ペンタフルオロフェニルエステル）で あった。

合成の各サイクルは室温（２０℃）で行われ、そして下記の反応工程を包含して いた。

工程１−脱保護 Ｆｍｏｃα−保護基を除去するために、アミノ基における第−ａ　ａ　Ｆｍｏ　 ｃ−保護をピペリジンの２０％溶液で７分間処理した。

ジメチルホルムアミドによる洗浄を１２分間続けてピペリジンのあらゆる痕跡を 除去した。脱保護および洗浄は樹脂を容れたカラムを介してポンプによって流量 ５ｍ１／分で連続的に行った。

工程２−Ｆｍｏｃ−ａａ−Ｏｐｆｐ誘導体の活性化所望配列に従う、アミノおよ びカルボキン−保護アミノ酸デユー（ｄ　ｕ　ｅ）は、ジメチルホルムアミド５ ｍｌ中へのその溶解の後、触媒量のヒドロキシベン゛ノドリアゾール（ジメチル ホルムアミド中の５９６ｗ／ｖｉｆ？ｉ［１，５ｍ　ｌ）ｌこよって１占性化さ れた。

工程３−アシル化 次いで、活ｒ目ヒおよび保護Ｆｍｏｃ−ａａ−Ｏｐ　ｆ　ｐ誘導１本を、所望配 夕Ｉｌｌこお１する新しいものに先行してアミノ酸のく工ｆ’ｉ！、　１　＋こ お（１て報告しｔこよう；こ先（こ脱保護された）α−アミノ基に、導入された ａａの結合を得るｊこめ（こ、５ｍ１ｚ”ｙ）のポンプによってカラムを杆山し て３０分間再循環させた。

工程４−洗浄 カラム内のマトリックスの洗浄に続き、新しいサイクルカ（始る１Ｔｉｉｌこジ メチルホルムアミドで２分間、５ｍ１／分で洗浄した。

合成の完了に際して、もしンステイン残基がａａ配列中（こ存ｎニするとき（よ 、樹脂支持体」−のペプチドを、スカベンジャーとして９５％トリフルオロ＾ｒ 酸（ＴＦＡ）および５？６エタンジチオールにより室温で２時間開裂させｔこ。

濾過１こよる樹脂からの開裂ペプチドの分離の後、この溶液を真空蒸発（こより 濃縮して乾固する。次いで、この収集した固体残留物を濃度１０−２０ｍｇ／ｍ ｌｌこお（洩で１０％酢酸中に溶解し、そしてスズ１ベンジャ−であるエタンジ チオールを除去するために引続いてジエチルエーテルによる数回の抽出（ペプチ ド溶１ｆｆｌの２ト容激をもって６乃至８回抽出）を行った。次に、このペプチ ド溶液を０．ＩＮの水酸（ヒアンモニウムにより中和し、そして大凡濃度０．１ ｍｇ／ｍｌｌニ調節した。次（１で、配列内のＣｙｓ残基に属する２個のスルフ ィドリル基（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ　ｇｒｏｕｐｓ）の選択的酸化を行うために 、この溶液を空気の下で１乃至６時間撹拌した。この方法において、高分子物質 の痕跡を全り（１°わずに低分子量酸（ヒペプチドのみを１■ｔこ。

次に、酸化ペプチドの溶液を、ＳＥＴ’−ＰＡＫ　Ｃ−１８カートＩＪ・ノジ（ ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）で逆相クロマトグラフィーにかけること（こよって脱塩し 、そして最後に凍結乾燥した。生成物は高性能ｚＩｋ体クロマトグラフィー（Ｈ ＰＬＣ）り）を斤ならびに合成構造体についての化γ分析により分析された。

高速原子衝撃ｉｔｓ分析法（Ｆａｓｔ＾ｔｏｗ　ｒｌｏｓｂａｒｄｓｅｎｔ　Ｍ ａｓｓ　５ｐｃｃＬｒｏ＊ｅＬｒｙ）を１１１用してペプチドのｉ　ｔ　ｒｊ　 ”ｎ　！ｉｔ　′５−ｔｉｔ　認した。

下記のペプチドは上に述べた方法を用０て調製された。

Ｉ　Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−ＰｈＣ−１，ｅｕ−１，ｙｓ−１，ｙｓ−Ｃｙｓ３＝＝− −−−−−−ｓ １１　Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−１，ｃｕ−Ｌｙｓ− Ｌｙｓ−Ｃｙｓ、−＝−−−−−−Ｓ １目　Ｌｙｓ−１”ｈｅ−１，ｃｕ−１，ｙＳ−Ｌｙｓ−ＴｈｒＩ　Ｖ　Ｃｙｓ −Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−１−、ｃｕ−Ｉ’ｈｃ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ− ＣｙｓＶ　Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−１，ｙｓ−１，ｅｕ−Ｐｈｅ−１，ｙｓ−Ｃｙｓ− Ｌｙｓ−ＴｈｒＳ−−−−−一−−＋−−３ Ｖ　Ｉ　ｌ１ｅ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−１，ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ −Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−ＣｙｓＳ＝−ｍ−−−−−−−ｓ Ｖ　Ｉ　Ｉ　１ｌｅ−１，ｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌ ｙｓ−Ｌｙｓ−ＴｈｒＶ　Ｉ　Ｉ　Ｉ　ｌ　１ｅ−Ｌｙｓ−１’ｌ＋ｅ−しｃｕ −１，ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓｌ　Ｘ　Ｌｙｓ −Ｐｈｃ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｃｕ−ＬｙｓＸ　Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｖａ ｔ−＾「＠−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−＾ｒｇ−Ｔｙｒ−Ｖａ１６Ｎの塩化水素酸により １−１２時ｆｌｔｌ＋こ亘り１５０℃で酸水解した後、各ペプチドのアミノ酸組 成物をＰ　Ｉ　Ｃｏ−ＴＡＧＩこより決定し、そして以下のように判明した。

表１ ア　ミ　ノ　酸　組　成　物１ （ａ　ａ　５ｏｌｅｓ／ペプチド−０１）ペプチド　アミノ酸　予想　？４明 ｌ　Ｃｙｓ　２．００　２．１３ Ｌｅｕ　１．００　１．　０６ Ｌｙｓ３．００　２゜９０ Ｐｈｅ　１．００　１．０１ １Ｉ　Ｃｙｓ　２．００　２．１６ Ｌｅｕ　ｉ、００　０．　９９ Ｌｙｓ　５．　００　４．　９５ Ｐｈｅ　１．　００　０．　９６ Ｔｈｒ　１．　００　１．　０３ ＩＩＩ　Ｌｅｕ　１．　００　０．　９８Ｌｙｓ　３．　００　２．　９９ Ｐｈｅ　１．　００　１．　０１ Ｔｈｒ　１．、　００　１．　０５ ＩＶ　Ｃｙｓ　２．００　２．１５ １、ｅｕ　１．　００　０．　９４ １、ｙｓ　５．Ｏｏ　４．９７ １’ｈｅ　１．、　００　０．　９３ Ｔｈｒ　１．　００　１．　１０ ＶＩ　Ｃｙｓ　２．００　２．１４ １１ｅ　１．　００　０．　９８ １、ｃｕ　１．　００　０．　９９ Ｌｙｓ　５．　００　４．　９８ Ｐｈｅ　１．　００　０．　９４ Ｔｈｒ　４．　００　１．　００ Ｖｌｌ　ｌｉｅ　１．、　００　０．　９８Ｌｃｕ　１．　００　１．　００ Ｌｙｓ　５．００　４．９９ Ｐｈｅ　１．、　００　０．　９８ Ｔｈｒ　２．　００　２．　００ Ｖｌｌｌ　ｌｉｅ　１．　００　０．　９８Ｌｅｕ　３．００　２．９８ Ｌｙｓ　４．　００　３．　９２ Ｐｈｅ　３．　００　３．　０２ ＩＸ　Ｌｅｕ　２．００　１．９０ Ｌｙｓ　３．　００　３．　１０ Ｐｈｅ　２．　００　１．　９０ Ｘ斡　＾ｒｇ　３．００　３．００ Ｔｙｒ　３．００　２．９５ Ｖａｌ　３．　００　２．　９０ ＊Ｖは合成類似体■Ｖからのヒト血清中のトリプシン氷解により生成される。

上で報告された式を有する全てのペプチドは、それらの沈殿（結合）活性を検出 するために、リピドＡおよびＢ、　ｐｅｒｔｕｓ＋ｓ　（各５μｇ）のＬＰＳに 関する直接Ｗｔ量沈殿検定法においてポリミキシン”Ｂ”と比較された。

表Ｉ＋ μｇ　ｎｍｏ　ｌ　複合体 ｐｔ ポリミキシン＋　Ｂ”　７．　３　６．　１　＋＋＋＋＋チド　＋　５．３　６ ．１　＋＋−ペプチド　＋＋　７．５　６．１　＋＋＋＊＊ペプチドＸは樹脂か ら、スカベンジャーとして５％フェノールを含有する９５％トリクロロ酢酸によ って一晩中、室温において開裂されｔこ。

Ｂ、　ｐｅｒＬｕｓｌｓのＬＰＳとノ（に腹合体中に存在する沈殿ペプチド量の 定ｉｌｌよ、３．０００ｒｐｍ　ｘ　１５分間の遠心分離により回収された複合 体の（６ＭのＨＣｌによる）酸水解の後、アミノ酸分１斤によって行われｔこ。

表１１１１こお−Ｎで、成る種の１！合体の化学量論が、各ペプチドの量と実験 （こ使用しｔこＬＰＳの＋Ｍ造＋１１に存在するリビドＡの限との間の比率（モ ル基準で）１：よりＸＬ）？されたものとして？１１告されている。

表　ＩＩ＋ ｔ、　Ｐ　Ｓ　ｂｐ＊とポリミキシン０８″の合成ペプチド類似体間で形成され た腹合体の化学量論 ｍ＝体中のペプチド零＊の量　ペプチド／Ｌ　ｉ　ｐＡ比（ｎｍｏ　Ｉ　ｅｓ） 　（ｍｏ　Ｉ／ｍｏ　Ｉ）ポリミキシン°　Ｂ”　２．６９　１．０２ペプチド 　Ｖｌｌｌ　３．８６　１゜４６＊Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｉｓ　ＬＰＳｌｏｕｇ　（ リピドＡの４５０μｇまｔこ＋１２．６４ｎｍｏ＋に等しい）とペプチド１０μ ｇ（親和力の分析中でポリミキシン”Ｂ”について判明した飽和点に相当する量 の２倍）との間で形成された複合体零＊値は回収された腹合体の酸水解後のアミ ノ酸分析についての２回の別の実験の平均値を示す エンドトキシンのリピドＡに関する合成ペプチドの結合活性を更に特徴づけるべ く、エンドトキシンの毒性部分についてポリミキシン“Ｂ”の親和力定数値を評 価し、また最終的に合成ペプチド類似体の選択性をｚＩ算する（リビドＡに関す る与えられたペプチドの親和力定数値およびポリミキシン”Ｂ“の新和力実数値 間のモル基準の割合）ために、ポリミキシン″Ｂ０に対する直接競合の実験を設 定した。表ＩＶは親和力の相対値および調査されたペプチドに関する選択性の相 対値を示す。

表　ＩＶ ＬＰＳｂｐおよびポリミキシン”Ｂ“の合成ペプチド類似体間に形成された腹合 体の特性 親！１１力（Ｋａ）　選択性　ｐｐｔ＊の量ペプチド　（１，／Ｍｏ１ｅｓ）　 （ＫａＡＮＡ／ＫａＰＣｒ’）ポリミキシン＋　Ｂ”　１．１５１１０７　１． ０　＋＋＋＋＋チド　Ｉ　＜　１．１５　ｘ　１０５　＜　０．０１　＋＋　− ペプチド　Ｉ　Ｉ　Ｏ，５８Ｘ　１０７　０．４９　＋＋＋＋＋チド　Ｖ　Ｉ　 Ｏ，２９ｘ　１０７　０．２５　＋＋＋＋＋チド　Ｉ　Ｖ　０．４９　Ｋ　１０ ７　０．４３　＋＋＋＋＋チド　Ｖ　Ｉ　Ｉ　Ｏ，＋９　ｘ　１０７　０．１７ 　＋＋＋＋＋チド　Ｖｌｌｌ　１．２９Ｘ１０７　１．１２　＋＋＋＋＋チド　 ＩＸ　Ｏ，Ｉ　Ｘｌ０７　０．１０　＋＋＋＋＋チド　Ｘ　Ｏ，２７ｘ　１０７ 　０．２４　＋＋＋＊毛細管内の？＠量沈殿およびアガロース中の免疫拡散法に よって得、られた沈殿の慣として検出。

表Ｖ中に示すカブトガニ（ＬＡＬ）試験により得られた結果はＬＰＳのリピドＡ 部分に関する本発明ペプチドの親和力を測定することによって得たデータを、そ れらがカブトガニに対するＬＰＳ活性の抑制に際してポリミキシン“Ｂ１と略等 しいという点で、サポートしている。ＬＡＬ抑制において低い活性を示した唯一 のペプチドはペプチドｉてあって、これは本発明中で報告されたペプチドの中で も最低の親和力定数値を示した。実際にペプチド■は、合成ペプチド類似体１■ 、ＩＶ、ＶｌおよびＶｌｌが先の表ＩＶ中に明瞭に示したように、ポリミキシン ゛Ｂ″の模倣物に関して必要とされる不完全な構造を示すものであった。ＬＡＬ 試験が公衆衛生分野（世界保健ｔｌ１Ｍ、米国食品・医薬品局等）における最も 重要な協会によって、注入可能物質中に発熱原性が認められないことの予示試験 として受入れられていること、そしてそれが家兎の発熱原性についての生体内試 験とｌ！喚し得ることに注目するのことが重要である。

表Ｖ ポリミキシン”Ｂ”の構造を模倣する合成ペプチドによるＬＡＬ試験本における ＬＰＳ−誘発ゲル化の抑制ＬＰＳ／Ｐｅｐｔ試験＊＊ （Ｗ／Ｗ） ＬＰＳ（０，１μｇ　ＬＰＳ＞　陽性 ポリミキシン１Ｂ”（０１ｇｇ　＋　ＬＰＳ　（０，１μｇ）　１　陰性ペプチ ドＩ　（０１ｇｇ）÷ＬＩ’Ｓ　（０，１μｇ＞　１　陽性ペプチド＋　（１， ０μｇ）÷Ｌｒ’Ｓ　（０，１μｇ）　１０　陰性ペプチド＋　（１０，０２５ ｇ）　＋　ＬＰＳ　（０，１μｇ）　１００　陰性ペプチドＩ　＋　（０，１μ ｇ）　＋　ＬＰＳ　（０，１ｕｇ）　１　陰性ペプチドＩＩ＋（１００μｇ）　 ＋　ＬＰＳ　（０，１１１ｇ）　１０００　陽性ペプチドＩ　Ｖ　（０，１μｇ ）　＋　１．ｒ’ｓ　（０，１μｇ＞　１　陰性ペブ４−　ＦＶ　＋　（０，１ μｇ＞　＋１．Ｉ’ｓ　（０，１ｕｇ）　２　陰性ペプチドＶ　Ｉ　１　（０， １ｚｌｇ）　＋　１．ｒ’ｓ　（０，１μｇ）２　陰性ペプチドＩＸ　１００　 陰性 ペプチドＸ　２０　陰性 これらの結果は、有効に結合し、かつＬＰＳを解毒するためにポリミキシン”Ｂ “の構造を模倣するためには、合成ペプチドが類似の（しかし、同一ではない） 化学的特徴と共にポリミキシン”Ｂ”の殆ど完全なａａ配列（ポリミキシン１Ｂ ”の１０個のａａ残基に対しペプチドＩ＋、ＩＶＳＶｌおよびＶｌｌは１ｏおよ び１１個のａａ残基を含んでいる）を存する必要性を示している。対照的に、僅 かに６個のａａ残基（ポリミキシン”Ｂ”中のペプチド−サイクルの線状配列） を含むペプチドＩ１１は有効に結合し、かつＬＰＳを解毒することは出来ない。

ＬＰＳを解毒し得る最小の構造はペプチドＩ　（ポリミキシン１Ｂ″のペプチド −サイクルに対応）のように思われるが、これはより長いａａ配列を示すその他 のペプチド類似体と比較し１する親和力値を示さない。ポリミキシン″Ｂ”およ び本発明ペプチドに対するヒト血ｌ＾中に存在するトリプシンの効果はヒト血清 １０μを１０μｌ容量中の与えられたペプチド２０μｇと混合し、かつその混合 物を異なった時間間隔に亘り３７℃の温度に保持することによって決定された。

様々な時間において、調査されるペプチドの残１を検出するためにこの混合物の 一部をＨＰＬＣ分析によって処理した。表Ｖｌ中には調査される各ペプチドの半 減期がポリミキシン″Ｂ２の半減期と比較して示されている。

本試験はＬＰＳの０．４μｇ／ｍｌに対し我々のケース（Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉ ｓのＬＰＳ）における０、１２５工ンドトキンン単位／ｍ＋等価の感応性を有し ていた。食塩水をもって１／１００に希釈した後、分析に関して処理する前に、 これらの複合体は３７℃で３０分間生成させた。

＊＊値は３回の異なった分析の最小値を表している。

表Ｖｌ ヒト血清中のトリプシンによる蛋白質分解に対するポリミキシン’Ｂ”の合成ペ プチド類似体についての安定性 半減期　回収潰（％） ヘフチ）’　（ｔ／２）　（分）　１．８Ｏ１Ａｉ＆（％） ペプチドｒ　＞１８０　７０ ペプチド■Ｉ　５ｏ　１゜ ペプチドＶＩ＊　１，０８０　（１８時間）７６ベブｆＦＩＶｌｔ　１８　０ ペプチドＶ　２４０　５５ ベブチ）’Ｖｌ＋　５０　２８ ペブチＦＶＩ１１　７　０ ペプチドＩＸ　１０　０ ペプチドＸ　３５　０ ＊ペプチドＶｌのトリプシン水解はペプチドＩ＋を生成する＊＊ペプチド１ｖの トリプシン氷解はペプチドＶを生成する発明の背景において既に述べたように、 生体内ＬＰＳの発熱原性活性は、サイトカイン、インターロイキン−１（ＩＬ− １）およびα−腫瘍壊死因子（α−ＴＮＦ）で、その先導分子が数曲病性ショッ クの致命的結果にｆ’ｔｆ１があるものについてのマクロファージおよび中球か らの遊離に起因する。

ペプチドの解毒活性を生体内で実証するために、我々は各３匹の家兎がら成る５ つのグループに、２種類の代表的合成ペプチド類似体とＬＰＳによって形成され た複合体を注射した。発熱１ｍｌ’Ｊ試験は米国薬局方（Ｖｏ　１．　ＸＸ　Ｔ ）　／Ｔｈｅ　Ｎａｔｌｏｎａｌ　ｆｏｒｌｕｌａｒｙ　（Ｖｏ　１．　ＸＶ　 Ｉ）　、合同編集、１９８５年１月１日に従って行われた。試験における負のχ １町として、ポリミキシン”Ｂ”とＬＰＳがら形成された複合体を注射した。■ の火、ｌｌＱとして、遊！ＬＰＳを注射した。それらの結果は第１図中に報告さ れる。理解し１ｕるように、ＬＰＳは注ｑ１がら第一の時間に始るその固ｆＴの 発熱原性活性を示し、そしてその温度は試験によって要求される観察の第三の時 間まで増加を続けた。ＬＰＳによって誘発される発熱性パターンの固ａの挙動は 温度増加について二つの波（二相挙動）を含んでいる。すなわち、第一の温度増 加（第−波）はＬＰＳの注射から２時間以内に現れ、そしてそれ二およびそれ以 降の−１した４度増加（第二波）はＬＰＳの注射から第三の時間内に現れ、そし てそれはＬＰＳにより刺激された免疫応答能のある細胞から解放された内在性発 熱物１ｉ１　Ｌ−１およびα−ＴＮＦによって仲介される。ＬＰＳと共にペプチ ド１およびペプチドＩ＋ならびにポリミキシン′Ｂ″によって形成された２種類 の複合体は温度槽ＩｊＩについての２つの波のいずれをも示すことなく、ＬＰＳ の（１１合された）発軌原性投与隋の注射によっては２種類の免疫仲介体１Ｌ− １およびａ−ＴＮＦが生体内に解放されることは無いことを明示している。

それらの結果は第１図中に示される。

以下の実験ではポリミキシン”Ｂ”の抗生作用活性を本発明の各種ペプチドとト 上で行われた。各ペプチドを水に希釈し、そしてプレートの表面上の滅菌１ｉａ ｔｈ−ａ讃３Ｍディスクに配置した。これらのプレートを乾燥し、そして３７℃ でインキュベートした。抑制のゾーンを１８時間後に測定した。

濃度　抑制のゾーン（ｍｍ） 化合物　ｓｇ／ｍｌ　Ｓ、　ｔｙｐｈｌ　Ｉｌ、　Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　Ｖ、 　ｃｈｏｌｅｒａｅポリミキシン＋　Ｂ”　１．０　４　６　５０．００８　０ 　０　１ ペプチド＋　１．０　０　０　０ ０．２　０　０　０ ０．０４　０　０　０ ｏ、ｏｏｇ　ｏ　ｏ　。

Ｏ，０４０００ ０．００８　０　０　０ ペプチドｖ１ １．０　０　０　０ ０．２　０　０　０ ０．０４　０　０　０ ｏ、ｏｏｇ　ｏ　ｏ　。

Ｌ　Ｐ　Ｓ−誘発ポリクローナルロー細胞活性化に関する本発明のペプチドの効 果は未免疫の健康なＳ　Ｊ　Ｌ／ＪマウスからのｌＩ？臓細胞をＬＰ３５０μｇ ／ｍｌおよび表示したＰＲ変におけるポリミキシン１Ｂ”または本発明のペプチ ドと共に培養することによって明示した。細胞は、１．０９６の正常なマウス血 清を含有するＲＰＭＩ培地中で３７℃において３日間培養した。培養は３Ｈ−チ ミジンの１．０μｉ／ｗｅｌｌで１６時間に亘すパルスさせ（ｐｕｌｓｅｄ）　 、モしてＬＳベータプレート・カウンターにより＝１数するために収集した。そ れらの結果は以下の通りであった。

単位　３Ｈ−チミジンのインコーポレーション（ｃｐｍ）（／ｊｇ／ｍｌ）　Ｐ ｍＢ　ペプチド！　ペプチド結合無　２２．７３７　２２．７３７　２２．７３ ７］、００　４．１２８　３．２８７　２．２６６５０　２．８３１　２．７７ ５　２．３５５２５　３．５５９　２．５８２　２，４４５１２．５　２．３６ ６　２．３８５　２．３５０無刺激培養により肺１定したｃｐｍ＝２．４４９゜ 臨床的に重要なグラム陰性菌によって同化されるエンドトキシンに対するペプチ ドＩ＋の結合効率をＬＡＬ試験によって明示した。それらの結果は表Ｖｌｌ中に 示される。

エントドキノン源　反応中の１．Ｕ／ｍｌ　ペプチド／ＬＰＳ　（ｗ／ｗ）試験 本　結合の効率Ｈ（９ｇ） Ｂ、　ｌ’ｃｒＬｕｓｓｌｓ　４　１ 陰性　〉９８ Ｅ、　Ｃａ１ｌ　０５５：Ｂ５　４　１陰性　〉９８ Ｐ、　Ａｅｒｕｇｌｎｏｓａ　４　１ 陰性　〉９８ Ｓ、　Ｔｙｐｈｏｓａ　４　１ 陰性　〉９８ に、　Ｐｎｅｕ＊ｏｎｌａｅ　４　１ 陰性　〉９８ Ｓ、　Ｍｌｎｎｅｓｏｉａ　４　１ 陰性　〉９８ Ｓ、　Ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ　４　１ 陰性　〉９８ Ｓ、　Ｆｌｅｘｎｅｒｌ　４　１ 陰性　〉９８ Ｅ、　Ｃｏ１ｔ　０１１１＋８４　４　１陰性　〉９８ ＊３回の復製分析の平均値 ＊＊結合の効率　〉９８％は遊離エンドトキシンの＜０．０８Ｅｕ／ｍ目こ相当 する（陰性ＬＡＬ試験） ９７％の結合効力のみが遊離エンドトキシンの０．１２ＥＵ／ｍｌに相当する本 発明のペプチドＶｌをビオチンでＬａしたが、これは感度マーカー（ｓｅｎｓｌ ｔＩｖｅ　ｍａｒｋｅｒ）として作用し、ペプチドＶｌ　（Ｋａ−０，３ｘ１０ ７）を介して細閑エンドトキシンのリピドＡと、また標識分子ビオチン（Ｋ　ａ 　−１０１，５）を介して高親和性の天然蛋白質アビジンと選択的に反応し得る 双特異性（ｂｌ−ｓｐｅｃｌｒｌｃ）分子を提ＩＩける。２神類の選択的かつ高 親和性反応の組合わせはエンドトキシンのリピドＡ検出をノｌ常に低レベル（ピ コモルのレベルまたは１０−１２モル／リットル）で許容する。ビオチン−アビ ノンの反応は、リビドＡ／ＬＰＳおよび本発明ペプチドの１種類間の反応を検出 するための一例として使用される。

ペプチドＶｌは０．ＩＭ酢酸ナトリウムｆａ　Ｍ中、ｐＨ−６，０においてＮ− ヒドロキシサクシニミジル・ビオチンにＪ（役させた（１・１ｍｏｌ／ｍｏｌ） 。この反応を３７℃で１時間保持した。これらの条ｆｉにおいて、アミノ末端ａ ａの一アミノ基のみが反応するので、得られたペプチドは一置換され、モしてリ ピドＡに関して親和性を失うことはない。標識ペプチドは逆相液体クロマトグラ フィー　（ＨＰＬＣ）により精製され、モしてａａ組成物および遊離アミノ基に ついて化学的に分析された。分析は比率］　：　１ｍｏ　ｌ／ｍｏ　＋において 生成したペプチドのビオチニル化（ｂｌｏｔｌｎｌｌａｔｌｏｎ）を確認した。

標識されたペプチドＶ１のヒト血清またはヒト全曲におけるリピドＡ／ＬＰＳに ついての親和力および半減期は（ここに記載した方法に従って試験したとき）、 同し出願中に報告された値（それぞれＫａ−０，３ｘ１０７モル／リットルおよ びｔ／２−２０時間）と顕著に異なるものではないことが判明した。

アビジンに対するペプチド結合−ビオチンの親１１１力は、遊離ビオチンについ て検出されたそれと顕著に異なるものではないことが判明した。等しい濃度（Ｉ ｎｍｏｌ／ｍｌ）において、遊離およびペプチド−結合ビオチンは、ニトロセル ロース上の固相ＤＯＴ−ＢＬＯＴ検定法におけるパーオキシダーゼー標識ビオチ ンおよびアビノン間の反応の抑制によって評価したとき、アビジンに対して同様 に競争した。

複合体ペプチド／リビトＡ（１・１ｍｏｌ／ｍｏｌ）の判明した化学量論および 腹合体ビオチン／アビジン（４・１ｍｏｌ／ｍｏｌ）について一般に知られたと ころから、エンドトキシンに結合している標識されたペプチドであって、その標 り剤（すなわち、ビオチン）およびそれの特定試薬（すなわち、酵素−標識アビ ジン）間の反応によって明らかにされるものの量の滴定により、与えられた試？ ４中のエンドトキシンの未知量の評価が可能となる。

これらの結果は、液体（すなわち、血清、血液および水溶液）中のエンドトキシ ンの痕跡ですら明らかにし得る新規な高感度かつ選択的試薬の調製を立証したＢ 、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに由来するリピドＡおよびＬＰＳは化学量論量のペプチド １１によって解毒され、そしてそれぞれ投与量１および２μｇにおいて、アジュ バント水酸化アルミニウム１ｍｇ／用量をｔｔい、またｔｔわずにマウスに注射 された。この免疫化スケジュールは３週間ずれた、皮下的に与えられた３種類の 用量を包含した。免疫化期間の最後にマウス１０匹／群の血γ＾をプールし、そ してエンドトキシンのリピドＡ部分について特有の抗体（ＩｇＧおよび１ｇＭイ ソタイプ）を免疫化期間（０，３，６および８週）の各段階において分析した。

タイターを固相検定法にトロセルロース上ＤＯＴ−ＢＬＯＴ）によって抗体の特 異性および定量的最について分析した。ニトロセルロース・シートをｐＨ−７２ のＰＢＳ中１０または２０℃ｇ／ｍ＋においてリピドＡまたはＬＰＳをもって室 温にて７時間１京布した。このニトロセルロースを３％Ｂ　Ｓ　Ａ　ｗ　／　ｖ を含有するＰＢＳで洗浄した後、マウスの血清プールを様々な希釈度においてリ ピドーＡ塗布ニトロセルロースと共に一晩室温でインキュベートした。次いで、 パーオキシダーゼ標識した抗−ＩｇＧまたは抗−１ｇＭ抗体を２時間に亘り室温 で添加し、引続いて反復的洗浄を行い、更に０．３％ｗ／ｖにおいて基質４−ク ロロナフトールにより洗浄した。酵素反応は暗所で室温にて０．５−１時間亘り 現れたマウスの血清プール中の抗−ＩｇＧおよび抗−１ｇＭタイターの結果は表 Ｖｌ！■およびＩＸ中に報告されている。それらは、リピドＡならびにＬＰＳが 複合体の形態て哺乳類ホスト中に注入されたとき、本発明ペプチドによって解毒 された後、それらの天然の抗原レパートリ−は依然として損われず、そして特定 の血清学的応答がホストの免疫系によって生成されることを、示している。注入 された複合体中に存在するペプチドについて特有である、如何なる抗体も誘発さ れなかった。動物は、その腹合体のそれぞれの投与の後、注射の部位において出 血性の病巣または皮膚壊死の如何なる徴候をも示さなかった。

このようにして、本発明のペプチドは毒性抗原様リピドＡまたはＬＰＳの新規な 変性方法を提（」（するもであり、これらの物質は天然および特定の抗原性レパ ートリ−を発現して哺乳動物ホストに対して免疫を誘発させる安全で、無毒性慢 合体の形管て哺乳動物ホストにおいて使用し得るものである。

液体における診断用ならびにホストの数曲病性ショックの処置のために単離した リビドＡ／ＬＰＳ−特異抗体を使用するために、従来の方法、たとえば硫酸アン モニウムまたはアルコール沈殿およびアフィニティー・クロマトグラフィーを利 用して抗体を抗血ｔＦｇから回収すればよい。

表Ｖｌｌ＋ 抗−リビドＡ　ＩｇＧ応答 （ペプチド１１により解毒されたリピドＡまたはＬＰＳで処置したマウスの血ｒ ｎブール） 希釈−■　希釈−１ Ｊ　（Ａ　Ｉ　（ＯＨ）３有り）　（ＡＩ（ＯＨ）３無し）８　２００　１、　 Ｏ０ 表　ＩＸ 抗−リビドＡ　１ｇＭ応答 （ペプチド１１により解毒されたリビドＡまたはＬＰＳで処置したマウスのｌ′ Ｉｎ清プー小プ ール−１希釈−１ 週　（Ａ　Ｉ　（ＯＨ）３８す）　（Ａ　Ｉ　（ＯＨ）３無し）マウスにおける エントドキノン誘発死の抑制は本発明ペプチドの静脈内注射によって達成された 。この実験に関し、細胞エンドトキシンの致死機能に対し非常に鋭敏なマウスの 味を用いた。アクチノマイシンＤ（ＣＤ１株）で増感したマウスはエンドトキシ ンの極端に低い投与量に対し高い感受性を示す。エンＦトキシン１μｇ／マウス （約４０μｇ／体重ｋｇ）程の低い用量でマウスの個体群を２４−４８時間以内 に完全に殺すこと力呵能である。

２０匹のＣＤＩマウスのグループを、マウス当り滅菌食塩水中に溶解させた。

、１ｍｇのペプチドの単一投与量をもって、本発明ペプチドを静脈内に用いて処 置した。３０分後、マウスはＥ、Ｃｏ１１株０５５−８５がら精製されたエンド トキシン１μｇを腹腔内に注射することによってチャレンツさせられた。観察の ７日間の期間、２４時間ごとに生残りマウスを記録した。正の対照として、ポリ ミキシンＢ　（ＰｍＢ）およびクロルプロマジン（ＣＰ　Ｚ、エンドトキシンの チャレンジによるこの株のマウスにおける致死性を阻Ｉトするのに非常に有効で あることが最近示された抗ヒスタミン剤）の比較し得る用量を利用して平行実験 を行った。負の対照は食塩水の静脈内注射を受けた。

表Ｘは得られた結果を示しているが、本発明のペプチドにより処置されたマウス の生存率に続いて示されているのは、リピドＡについてのペプチドの親和力定数 値から予示可能な挙動である。

表Ｘ アクチノマイシンＤで増感されたｃＤ１マウスにおける生存率４　１６８時間　 ＋１意 （２５％）　（１５％）　（５％）　（５％）（５％）　（５％）　（５％）（ ４０％）　（２０％）（１５％）（１５％）（１５％）（１５″％＞　（１５Ｘ ）　ｐ　＜　０．０２（６５％）　（４０％）（４０％）　（４０％＞　（４０ ％）（４０％）　”（４Ｂ）　ｐ　＜　０．００１ ペプチド　Ｖｌ　５　５　５　５　５ （２５％）　（２５％）　（２５％）　（２Ｂ）　（２５％）（２５％）　（２ ５％）　ｐ　＜　０．０１ＰｍＢ　１０　８　６　６　６ （５０％）（４０％）（３０％）（３０％）（３０％）　（３０’Ｘ）　（３０ ％）　＋１　（０，００１ＣＰ　ｚ　］、　０　１０　１０　１０　１０グルー プ当り２０匹のマウスが存在した。７回に亘る２４時間観観察間のそれぞれにお けるマウスの生存がリストアツブされている。生存％は括弧内に示される。Ｐは 統異１的有意のレベルを表すもので、これは各グループにおける合旧生存率を考 慮しながら食塩水による処置と比較された各分子に関する「【−テスト」により 計算されたものである。

ペプチドＩＩはＰｍＢにχ１する比較においてより高い効力を示す（ｐ＜領　０ ５）。

ペプチドＴＩはＣＰＺと同一の効力を示す（ｐ＜０．２）。

エンドトキシンの高い用量に１し天然の抵抗性を有するマウス（Ｂａｌｂ／ｃ株 ）において行われた他の実験は、ポリミキシンＢによって行われた比較可能な処 置に関して本発明ペプチドの安全性および有効性の更なる証拠をもたらした。

２０匹のＢａ１ｂ／ｃマウスのグループを、１ｍｇ／マウスの用量において本発 明のペプチドによって、あるいはポリミキ／ンＢのＯ，１ｍｇ／マウス（単独で 注射したとき、この薬剤の最高用阻をマウスは許容した）によって静脈内に処置 した。３０分後、Ｅ、Ｃ，株０５５−Ｂ５よりのエンドトキンン１ｍｇ腹腔内注 射によってマウスはチャレンジに臨んだ。生存マウスは７０間の観察期間中２４ 時間ごとに記録された。負の対照は食塩水の静脈内注射を受けた。

表Ｘ！は得られた結果を示す。すなわち、本発明のペプチドによる動物の処置は 安全性と有効性をもたらした。対照的に、ポリミキ／ンＢによる処置はエンドト キシンのチャレンジに続く３日以内のみ所期の効果をもたらした。それはその直 後からのポリミキシンＢ　（ＰｍＢ）の毒性がエンドトキシンと相乗的役割を演 じたからであり、そして全てのマウスは死に至った。

表ＸＩ Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスにおける生存率４　１６８時間　有意 Ｎ　ａ　Ｃ１１２１，０８８８ （６０％）（５０％）（４０％）（４０％）（４０％）（４０％）（４０％）ペ プチド　＋　１８　１．２　１０　１０　１０（９０％）（６０％）（５０％＞ 　（５０％）　（５０％）　（５ｏ％）　（５ｏ％）９（０，０１ペプチド　１ １　２０　１２　１２　１２　１２（１００％）（８０％）（６０％）（６０％ ）（６０％）（６０％）（６ｏ％）ｐ＜０゜ＰｍＢ　１８　１４　１２　０　０ グループ当り２０匹のマウスが存在した。７回に亘る２４時間観察期間のそれぞ れにおけるマウスの生存がリストアツブされている。生存％は括弧内に示される 。Ｐは統＝１的ｆｄ！のレベルを表すもので、これは各グループにおける合計生 存率を考慮しながら食塩水による処置と比較された各分子に関する「ｔ−テスト 」により計ｙされたものである。

ペプチドＩおよびＩＩはＰｍＢに対する比較において安全性および有効性を示し ている（ｐ＜０．００１）。

比較例 請求項１のペプチドに関して記載した特徴およびリビドＡに対する結合活性につ いて必要とされる更なるサポートにおいて、式。

Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｔ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｖａｔを 有するペプチド、すなわちペプチドＸの類似体であるが、ポリ−カチオン性より むしろポリ−アニオン性を示す（＾「ｇ残基をグルタミン酸残基により置換した ）ものを合成し、そしてこれはリピドＡ／Ｌ　Ｐ　Ｓに関する結合活性も、ＬＡ Ｌ検定法におけるＬＰＳの毒性機能の抑制をも示さなかった。

ポリミキシンＢの毒性を減少させるために、本発明のペプチドをポリミキシンＢ と協働させ、表ＩＶ中に示す選択性を基準として計算されたポリミキシン−Ｂの 化学量論的過剰におけるレベルで使用してもよい。

配列一覧表 （１）一般的情報： （＋）出願人：　Ｐｏｒｒｏ、Ｍａｓｓｉｍ。

（１、発明の名称：　細菌エンドトキシンの解毒ならびに数曲病性ショックの防 ＋１および処置のための合成ペプチド（Ｌｉｔ）配列の数・　１０ （ｉｖ）通信アドレス・ （Ａ）受信人：　１ｌｃｄｓａｎ、　Ｇｌｂｓｏｎ、　Ｃｏｓｔｌｇａｎ　＆　 １ｌｏａｒｅ（Ｂ）ＳＴＲＩＥＥＴ：　１１８５＾ｖｅｎｕｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　 Ａｍｅｒｉｃａｓ（Ｃ）市：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ （Ｄ）州：　Ｎｅｗ　Ｗｏｒｋ （Ｅ）国・ＵＳ＾ （Ｆ）　Ｚ　Ｔ　Ｐ　４　１００３６ （Ｖ）コンピュータの読取り可能形式 （Ａ）媒体タイプ・　ディスケット、３．５０インチ、１．４４Ｍｂ記憶容量（ Ｂ）コンピュータ　ＩＢＭ　ＰＳ／２（Ｃ）オペレーティング・システム：　Ｄ Ｏ３（Ｄ）ソフトウェア：　１ｉｏｒｄ　Ｐｅｒｆｅｃｔ　５．１（Ｖ量）現在 の出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願口： （Ｃ）分類： （ｖｉａ）先行出願データ： （Ａ）出願番号・ （Ｂ）出願口・ （ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）弁理士／代理人情報：（Ａ）氏名：　ＣｏｓＬＩｇａｎ、　 Ｊａｍｅｓ　Ｖ。

（Ｂ）登録番号：　２５．６６９ （Ｃ）　ＲＥＦＥＲＥＮＣＥ／ＤＯＣＫＥＴ番号：　５７６−００２（ｌｘ）電 話通信情報 （Ａ）電話：　（２１２）３０２−８９８９（Ｂ）　置ＥＦＡＸ：　（２１２） 　３０２−８９９８（２）配列ＩＤ　Ｎｏ・１に関する情報：（＋）配列特性・ （Ａ）長さ：　７　アミノ酸 （Ｂ）タイプ：　アミノ酸 （Ｃ）トポロジー、　円形 （ｉ　ｉ）配列の記述：　配列ＩＤ　Ｎｏ＝１Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ 　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ（３）配列ＩＤ　Ｎｏ・２に関する情報：（ｉ）配列 特性 （Ａ）長さ・　１０　アミノ酸 （Ｂ）タイプ・　アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：　円形 （ｉ　ｉ）配列の記述：　配列■Ｄ　Ｎ０＝２：Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙ ｓ　Ｌｙｓ　ｒ’ｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ（１）配列特性。

（Ａ）長さ＝　９　アミノ酸 （Ｂ）タイプ　アミノ酸 （Ｃ）トポロジｍ：　線杉 （１１）配列の記述・　配列ＩＤ　Ｎ０＝９：＾ｒｇ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ＾ｒｇ　 Ｔｙｒ　Ｖａｌ＾「ｇ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ２　いｎは、試験した１２匹の家兎に関 するに１照１ｇ度（Ｔ−’４９　５４±００５℃）の平均１４に相当する。

３、　ｉＦＯ＆４ｎＱ＋３０ｎｇエンＦト＋／ン／１４重Ｋｇ４　負のり１照　 ６０ｎＨのポリミキ７ノ°Ｂ”をもって）夏合させた３　Ｑ　ｎ　ｇエンドトキ ンノ／Ｃ本重Ｋｇ ５、６０ｎｇのペプチド１１をらって１ＪｉＡさせた３０ｎｇエンドトキンン／ 体重Ｋｇ ６、３００ｎＨのペプチド１をもって１ｆｆｉＡさせた３ｎｎｇ工／ドＩ・キン ２７体Ｋｇ ７．１Ｍ丁Ｒ米国ｌ１ｆｆｌ方（ｖｏ　１．　ＸＸ　Ｉ）　、国民医薬品集（ｖ ｏｌ、ＸＶｌ）、合同編集、１９８５ＣＦ、１月によって許容された酬体最大温 度１昇（ｌｎｄｌνＩｄｕａｌｊｌａｘ１ｍａｌＴｃｓｐｃｒａＬｕｒｅＲ１ｓ ｅ＞国際調査報告 １＋＋＋＋＋＋＋＋　ＰＣＴ／ＥＰ　９２１０１０６０ＰＣＴ／ＥＰ　９２１０ １０６０ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号ＣＯ７Ｋ　５１０８　 ８３１８−４Ｈ ７１０８８３１８−４Ｈ １４１００８３１８−４Ｈ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ 、　ＭＧ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、Ｒ○、ＲＵ、ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＡ、　Ｕ Ｓ Ｉ

Claims (62)

【特許請求の範囲】
1. １．式： Ｒ１−（Ａ−Ｂ−Ｃ）ｎ−Ｒ（Ｉ） （式中Ｒ１およびＲは独立にＨあるいはアミノ酸残基または脂肪酸残基であり、 ＡはＬｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓから成る群から選択されるアミノ酸残基であり 、ＢはＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐから成る群から選択されるアミノ酸であり、 ＣはＬｅｕ、ＩｌｅおよびＶａｌから成る群から選択されるアミノ酸であり、ｎ は１−１００の整数である。）で表されるモノマー、線状ポリマー、環式モノマ ーまたは環式ポリマーペプチド。
2. ２．式： Ｒ１−（Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ）ｎ−Ｒ（ＩＩ）（式中ｎは１−１０の整数で あり、そしてＲおよびＲ１はＨあるいはアミノ酸残基または脂肪酸残基である。 ）で表されるモノマー、線状ポリマー、環式モノマーまたは環式ポリマーペプチ ド。
3. ３．式： 【配列があります】 で表される請求項１によるペプチド。
4. ４．式： 【配列があります】 で表される請求項１によるペプチド。
5. ５．式： 【配列があります】 で表される請求項１によるペプチド。
6. ６．式： 【配列があります】 で表される請求項１によるペプチド。
7. ７．式： 【配列があります】 で表される請求項１によるペプチド。
8. ８．式： 【配列があります】 で表される請求項１によるペプチド。
9. ９．式： 【配列があります】 で表される請求項１によるペプチド。
10. １０．式： 【配列があります】 で表される請求項１によるペプチド。
11. １１．式： 【配列があります】 で表される請求項１によるペプチド。
12. １２．式： 【配列があります】 で表される請求項１によるペプチド。
13. １３．請求項１のペプチドおよび薬学的キャリヤーを含んで成る薬学的組成物。
14. １４．請求項２のペプチドおよび薬学的キャリヤーを含んで成る薬学的組成物。
15. １５．請求項３のペプチドおよび薬学的キャリヤーを含んで成る薬学的組成物。
16. １６．請求項４のペプチドおよび薬学的キャリヤーを含んで成る薬学的組成物。
17. １７．請求項５のペプチドおよび薬学的キャリヤーを含んで成る薬学的組成物。
18. １８．請求項６のペプチドおよび薬学的キャリヤーを含んで成る薬学的組成物。
19. １９．請求項７のペプチドおよび薬学的キャリヤーを含んで成る薬学的組成物。
20. ２０．請求項８のペプチドおよび薬学的キャリヤーを含んで成る薬学的組成物。
21. ２１．請求項９のペプチドおよび薬学的キャリヤーを含んで成る薬学的組成物。
22. ２２．請求項１０のペプチドおよび薬学的キャリヤーを含んで成る薬学的組成物 。
23. ２３．請求項１１のペプチドおよび薬学的キャリヤーを含んで成る薬学的組成物 。
24. ２４．請求項１２のペプチドおよび薬学的キャリヤーを含んで成る薬学的組成物 。
25. ２５．ホストに対し、有効量の請求項１のペプチドを投与する工程を含んで成る 敗血病性ショックを処置する方法。
26. ２６．ホストに対し、有効量の請求項２のペプチドを投与する工程を含んで成る 敗血病性ショックを処置する方法。
27. ２７．ホストに対し、有効量の請求項３のペプチドを投与する工程を含んで成る 敗血病性ショックを処置する方法。
28. ２８．ホストに対し、有効量の請求項４のペプチドを投与する工程を含んで成る 敗血病性ショックを処置する方法。
29. ２９．ホストに対し、有効量の請求項５のペプチドを投与する工程を含んで成る 敗血病性ショックを処置する方法。
30. ３０．ホストに対し、有効量の請求項６のペプチドを投与する工程を含んで成る 敗血病性ショックを処置する方法。
31. ３１．ホストに対し、有効量の請求項７のペプチドを投与する工程を含んで成る 敗血病性ショックを処置する方法。
32. ３２．ホストに対し、有効量の請求項８のペプチドを投与する工程を含んで成る 敗血病性ショックを処置する方法。
33. ３３．ホストに対し、有効量の請求項９のペプチドを投与する工程を含んで成る 敗血病性ショックを処置する方法。
34. ３４．ホストに対し、有効量の請求項１０のペプチドを投与する工程を含んで成 る敗血病性ショックを処置する方法。
35. ３５．ホストに対し、有効量の請求項１１のペプチドを投与する工程を含んで成 る敗血病性ショックを処置する方法。
36. ３６．ホストに対し、有効量の請求項１２のペプチドを投与する工程を含んで成 る敗血病性ショックを処置する方法。
37. ３７．感染しやすいホストに対し、有効量の請求項１のペプチドを投与する工程 を含んで成る敗血病性ショックを防止する方法。
38. ３８．感染しやすいホストに対し、有効量の請求項２のペプチドを投与する工程 を含んで成る敗血病性ショックを防止する方法。
39. ３９．感染しやすいホストに対し、有効量の請求項３のペプチドを投与する工程 を含んで成る敗血病性ショックを防止する方法。
40. ４０．感染しやすいホストに対し、有効量の請求項４のペプチドを投与する工程 を含んで成る敗血病性ショックを防止する方法。
41. ４１．感染しやすいホストに対し、有効量の請求項５のペプチドを投与する工程 を含んで成る敗血病性ショックを防止する方法。
42. ４２．感染しやすいホストに対し、有効量の請求項６のペプチドを投与する工程 を含んで成る敗血病性ショックを防止する方法。
43. ４３．感染しやすいホストに対し、有効量の請求項７のペプチドを投与する工程 を含んで成る敗血病性ショックを防止する方法。
44. ４４．感染しやすいホストに対し、有効量の請求項８のペプチドを投与する工程 を含んで成る敗血病性ショックを防止する方法。
45. ４５．感染しやすいホストに対し、有効量の請求項９のペプチドを投与する工程 を含んで成る敗血病性ショックを防止する方法。
46. ４６．感染しやすいホストに対し、有効量の請求項１０のペプチドを投与する工 程を含んで成る敗血病性ショックを防止する方法。
47. ４７．感染しやすいホストに対し、有効量の請求項１１のペプチドを投与する工 程を含んで成る敗血病性ショックを防止する方法。
48. ４８．感染しやすいホストに対し、有効量の請求項１２のペプチドを投与する工 程を含んで成る敗血病性ショックを防止する方法。
49. ４９．ポリミキシンＢとの組合わせにおいて有効量の請求項１のペプチドを投与 する工程を含んで成るポリミキシンＢの毒性を減少させる方法。
50. ５０．ヒトならびに動物の血液または血清を請求項１のペプチドと接触させる工 程を含んで成る前記血液または血清からエンドトキシンを除去する方法。
51. ５１．有効量の請求項１のペプチドをホストに対し投与する工程を含んで成るエ ンドトキシンにより誘発されるサイトカインの解放制御のための方法。
52. ５２．請求項１の逆配向されたａａ配列であるペプチド配列。
53. ５３．請求項１のペプチドの鏡像異性体ａａ配列（配列中の全−Ｄ　ａａ）であ るペプチド配列。
54. ５４．請求項１のペプチドのジアステレオマーａａ配列（同一配列における−Ｄ および　−Ｌａａ）であるペプチド配列。
55. ５５．請求項１のペプチドの配列におけるそれらの元の位置に関してアミノ酸が 逆転しているペプチドの配列。
56. ５６．罹患したホストを、有効量の請求項１のペプチドで処置する工程を含んで 成る細菌エンドトキシンの解毒方法。
57. ５７．エンドトキシンの特定の検出に関して有用である感応性マーカーをもって ペプチドを標識する工程と、哺乳動物ならびに溶液中の血清または血液をこの標 識したペプチドと接触させる工程と、エンドトキシンの存在を決定する工程とを 含んで成る前記血清または血液中のエンドトキシンを検出、かつ定量するための 診断用プローブとして請求項１のペプチドを使用する方法。
58. ５８．リピドーＡまたはＬＰＳを請求項１のペプチドと接触させる工程と、その 後抗原性複合体を回収する工程とを含んで成るリピドＡまたはＬＰＳの無毒抗原 性複合体を調製するための方法。
59. ５９．（ａ）リピドーＡまたはＬＰＳを請求項１のペプチドど接触させて複合体 を生成する工程と、（ｂ）ホストに対し有効量の前記複合体を投与する工程と、 （ｃ）前記ホストの血清から抗体を回収する工程とを含んで成るリピドＡまたは ＬＰＳに対する抗体を調製するための方法。
60. ６０．（ａ）リピドＡまたはＬＰＳを請求項１のペプチドと接触させて複合体を 生成させる工程と、（ｂ）ホストに対し有効量の前記複合体を投与する工程とを 含んで成るホスト中のリピドーＡまたはＬＰＳに対し抗体を誘発させる方法。
61. ６１．細胞エンドトキシンまたはエンドトキシンを含有する液体を、有効量の請 求項１のペプチドと接触させる工程を含んで成る細胞エンドトキシンの解毒方法 。
62. ６２．細菌の成長により引続き生成される如何なるエンドトキシンをも中和させ るに足る量の請求項１のペプチドを、生成物に対し添加する工程を含んで成る、 エンドトキシンによる生成物の汚染を防止する方法。