HUT69707A

HUT69707A - Synthetic peptid for detoxification of bacterial endotoxins and treatment o septic shock

Info

Publication number: HUT69707A
Application number: HU9401970A
Authority: HU
Inventors: Massimo Porro
Original assignee: Porro
Priority date: 1992-01-16
Filing date: 1992-05-14
Publication date: 1995-09-28
Also published as: FI943396A0; AU1691492A; AU665945B2; CA2123576A1; HU9401970D0; JPH07505606A; EP0623144A1; US5371186A; WO1993014115A1; ES2172506T3; NZ241446A; IE920437A1; FI943396A; TW215441B; DE69232378D1; DK0623144T3; IL100811A0; US5589459A; DE69232378T2; IL100811A

Description

Az endotoxinok által indukált sokk szeptikus sokk (SS) néven ismeretes, amely életveszélyes állapot, és műtét, hosszan tartó kórházi kezelés, balesetek vagy más sérüléses események komplikációjaként bekövetkező, Gram-negativ baktériumok által okozott fertőzéseket követően alakul ki. Manapság jól ismert, hogy ezért a betegségért felelős közvetítő a^- bakteriális endotoxin, egy glikolipid antigén, amely csak Gram-negativ baktériumok felületén van jelen. Ez a glikolipid — a lipid-A-nak (LipA) nevezett, zsírsavban gazdag részhez kovalensen kapcsolódó szénhidrát méretétől függően — gliko-poliszacharid (LPS) vagy lipoo1igoszacharid (LOS) néven is ismert. Az endotoxin (LPS) által mutatott fő toxikus hatásokért csak a lipid-A felelős. Amint a baktériumok a véráramban felszabadítják az endotoxint. az az immunrendszer specializált sejtjeit, mint például a makrofágokat és monocitákat aktiválja, és különféle immun-mediátorok (citokinek, mint az Interleukin-1 és Interleukin-6; alfa-tumor-nekrózis faktor, gammainterferon'? szabadulnak fel. Az endotoxin a komplement kaszkádot is aktiválja, ami sejtlízist, s annak következményeként proteolitikus enzimek felszabadulását eredményezi, amelyek elősegítik a vazoaktív effektorok (pl.

bradykinin és hisztamin) vérlemezkékből történő esetek 40-60 %-ában a végeredmény a beteg 4S-72 órán belül bekövetkező halála. Ezidáig specifikus gyógymódok vagy kezelések nem álltak rendelkezésre, bár alkalmaznak adreno-kortikoszteroid (mint pl. metil-prednizolon) injekciókat.

- 3 A Polymixin B olyan molekulaként ismert, amely köti és • detoxifikálJa a bakteriális endotoxinokat, és kísérleti állatoknak gyógykezelésszerűen adva megakadályozza a

V szeptikus sokkot. A Polymixin ’B azonban in vitro és in vivő toxikus termék, s ez a tény korlátozza a szeptikus sokk kezeléséhez gyógyszerként való alkalmazásának lehetőségét.

Szeptikus sokkot bármely olyan baktérium fertőzése okozhat, amely LPS felszabadulását eredményezi. Ilyen baktérium a Pseudomonas aeroginc-sa, Escherichia coli, Salmonella typhi, Neisseria meningitidís, Neisseria gonorrheae, Bcrdetella pertussis, Klebsiella pneumoníae és hasonlók.

A Polymixin B leírt toxicitását eredményező okok nem világosak, de minden valószínűség szerint sajátos ar.in.osavösszetételével kapcsolatosak. különösen az L-alfa-gammadiamino-vajsavat (DAB) (a molekula 49,1 m/m %-a). amely a lizin analógja (a tudományos irodalom szerint a fehérjeszintézis során képes a lizin helyettesítésére), és a természetesen előforduló L-fenilalanin izomere, a Dfenilalanin jelenlétét illetően. Más lehetséges okok, még mindig az aminosav-összetétellel összefüggésben, a Fzlymixin B proteo1itikus enzimeknek ellenálló stabilitásával, továbbá az LPS molekula lipid-A részletéhez szerkezetileg hasonló sejtreceptorokhoz való lehetséges kötődésével állhatnak kapcsolatban (az idegszövet gangliozidjai glikolipidek, melyek Ν,Ο-acil (C14-C18) láncai közeli rokonságban állnak a

- 4 lipid-A molekulában lévő Ν,Ο-acil lánccal.

Új konformációjú peptideket fedeztünk fel, melyek aminosavösszetételük következtében szerkezetileg eltérnek a Polymixintől, de az endotoxinok (LOS és LPS) lipid-A részén belül ugyanahhoz a kötési helyhez képesek kötődni, mint a Polymixin B. Az új peptidek kötési hatékonysága hasonló a Polymixin B affinitási konstans értékéhez. A lipid-A vagy az LPS találmány szerinti peptidekkel való reakciójakor kialakuló komplex nem toxikus, és fennmarad a lipid-A és az LPS antigén hatása.

Az endotoxinok lipid-A részletéhez mutatott nagy affinitású kötődés eredményeként a szintetikus peptid analógok többsége (amint azt in vitro és in vivő analízisekkel bebizonyítottuk). képes az endotoxinok detoxifikálására. A detoxifikálás méréséhez in vitro tesztként az endotoxin (Lymmulus lizátum koagulálódását eredményező) enzim-kaszkád gátlását alkalmaztuk (LAL teszt). A LAL teszt az LPS toxikus és lázkeltő aktivitásának elismerten legérzékenyebb és előzetes meghatározásra alkalmas tesztje, mivel a lázkeltés in vivő az Interleukin-1 (IL-1) és alfa-tumor nekrózis faktor (alfa-TNF) endogén immunmodulátorok felszabadulásával kapcsolatos, mely mediátorok a szeptikus sokk halálos kimeneteléért felelősek. Az LPS detoxifikálását bizonyító in vivő tesztként az Egyesült Államok-beli Pharmacopeia (gyógyszerkönyv) XXI. kötetében leírtak szerint végzett Rabbit pyrogen tesztet alkalmaztuk.

Felfedezésünk egy olyan új vegyületcsoportot eredményez, amely felhasználható a szeptikus sokk kezeléséhez.

Előrebocsátjuk, hogy az új peptidek, köszönhetően teljesen természetes aminosav-összetételüknek, illetve az emberi vérszérumban a proteolitikus lebomlással szembeni korlátozott rezisztenciájuknak, emberi szervezetben nem mutatják a Polymixin B toxikus hatásait.

A fentiek értelmében, a találmány első tárgya szeptikus sokk kezelésében alkalmazható új megelőző és gyógykezelési szerek.

A találmány következő tárgya szeptikus sokk kezeléséhez alkalmazható új peptidek.

A találmány további tárgya szeptikus sokk kezeléséhez alkalmazható új gyógyszerkészítmények.

A találmány további tárgya lipid-A-ból vagy LPS-ből és pepiidből álló, antigén hatású, nem toxikus, új komplexek.

A találmány további tárgya eljárás nem toxikus, új lipid-A vagy LPS antigének előállítására.

A találmány szerinti peptidek, a szeptikus sokk kezeléséhez alkalmazottal megegyező dózisok alkalmazásával, szeptikus sokkon kívül más betegségek kezelésére is alkalmasak. Ezek közé tartozik a szamárköhögés (pertussis), a bakteriális agyhártyagyulladás, és a vírusos, HIV-rokon fertőzések.

A találmány fenti és egyéb tárgyai a részletes leírásból nyilvánvalók lesznek.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábrán a találmány szerinti peptidek endotoxinra gyakorolt hatását bemutató grafikon látható.

A találmány tárgya az amfipatikus-polikationos jellemzőkkel rendelkező, (I) képlet szerinti

Rí-(A-B-C)n-R (I) új monomer, lineáris polimer, ciklikus monomer vagy ciklikus polimer peptidek, melyekben Rí és R jelentése, egymástól függetlenül, hidrogénatom, aminosavgyök vagy zsirsavgyök; A jelentése Lys, Arg vagy His; B jelentése Phe, Tyr vagy Trp; C jelentése Leu, Ile vagy Val; n jelentése 1 és 100 közötti, előnyösen 1 és 10 közötti egész szám. Ezek a peptidek alkalmasak szeptikus sokk kezeléséhez.

Az (I) képlet szerinti előnyben részesített vegyület a (II) képlet szerinti vegyület

R¹-(Lys-Phe-Leu)n-R (II) melyben n jelentése 1 és 100 közötti, előnyösen 1 és 10 közötti egész szám, és R és R¹ jelentése hidrogénatom vagy a természetben előforduló bármely, 1-20 (vagy több) metiléncsoportot magában foglaló aminosav vagy zsírsav:

azok a peptidek. amelyek a leírt peptidek fordított orientációjú aminosav-szekvenciáival rendelkeznek; azok a peptidek, amelyek a leírt peptidek enantiomer vagy diasztereomer aminosav szekvenciáival rendelkeznek; és azok a peptidek, amelyek az aminosav eredeti helyzetéhez képes eltolt aminosawal rendelkeznek, ami szeptikus sokk kezeléséhez alkalmas peptidet eredményez.

Az (I) és (III· képlet szerinti peptidek példái közé tartoznak az alábbiak:

I, csoport (Lys-Phe-Leu)n (Lys-Phe-Val)_n (Lys-Phe-Ile)n (Arg-Phe-Leu (Arg-Phe-Val)n

IArg-Phe-Ile)_n

I LI. . C£PPQ£Í (His-Phe-Leu)n (His-Phe-Val)n (His-Phe-Ile)_n (Lys-Tyr-Leu)n (Lys-Tyr-Val)_n < Lys-Tyr-Ile m (Lys-Trp-Leu)_n (Lys-Trp-Val)n (Lys-Trp-I le (Arg-Tyr-Leu)n (Arg-Tyr-Val)« (Arg-Tyr-Ile)n (Arg-Trp-Leu)n (Arg-Trp-Val)_n (Arg-Trp-Ile)n (His-Tyr-Leu)n (His-Tyr-Val)_n (His-Tyr-Ile )n (His-Trp-Leu)n (His-Trp-Val)_n (His-Trp-Ile

Ezen peptidek specifikus példái közé tartoznak az alábbiak:

Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys

S ----------- S

Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys

S-----------S

Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Thr

Ile-Lys-Thr-Lys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Thr Cys-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Cys-Lys-Thr-Lys

SS

Cys-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Cys-Lys-Thr

SS

Ile-Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys

S --------s

ILe-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-Leu-Lys

Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-Leu-Lys

Arg-Tyr-Val-Arg-Tyr-Val-Arg-Tyr-Val

Az új peptidek emlősökben (beleértve az embert) alkalmasak szeptikus sokk megelőzésére vagy kezelésére. A peptidek dózisa körülbelül 0,1 jjg-2,0 mg/testömeg-kilogramm, de alkalmazhatók kb. 10 ug-0,1 mg/testömeg-kilogramm mennyiségben is, és az alkalmazott mennyiség naponta osztott dózisokban is beadható. A peptidek a szeptikus sokk előidézésére képes organizmusok fertőzésének kitett, vagy már megfertőzött betegeknek profilaktikusan adhatók, illetve a fentebb leirt dózisok alkalmazásával in vivő a bakteriális endotoxinok detoxifikálására használhatók. Az endotoxinos fertőzöttség in vitro detoxifikálása vagy megelőzése a kívánt eredmény eléréséhez szükséges szinten végezhető. A szükséges mennyiséget hagyományos kísérletezéssel lehet ··· megállapítani, előrebocsátva, hogy egy mól peptid kb. 1 mól endotoxint köt meg. Egy adott peptid adott dózisa az adott alkalmazástól, a betegség súlyosságától és a gazdaszervezet állapotától függően a fentebb meghatározott tartományon belül (vagy azon kívül is) változhat. A szakemberek standard eljárások alkalmazásával megállapíthatják a megfelelő dózisokat.

A vegyületek jól ismert gyógyszerészeti hordozók vagy inért diluensek alkalmazásával intravénásán és parenterálisan adhatók be. A orális beadás nem előnyös, mivel az emésztőrendszer enzimjei lebontják a peptideket. A víz és az izotóniás sóoldat az előnyben részesített diluens, s ezekben 0,1 mg, /ml koncentráció alkalmazható. A vegyületeket lehetőleg száraz alakban kell tárolni, és közvetlenül a beadás előtt a diluensben feloldani.

Az új peptidek klasszikus kézi, illetve automatizált peptidkémiai eljárásokkal, valamint DNS rekombinációs technológiával szintetizálhatok. Az szintetikus eljárás Fmoc-védőcsoportos szilárd fázisú szintézisből, lehasításból (95% TFA ·+ 5% Et-(SH)2) és vákuumos bepárlásból áll. Ezután a terméket 10 % ecetsavban oldjuk, éterrel extraháljuk, és 6,0 és 7.5 közötti pH-n 0,1 mg/ml-re koncentráljuk. A ciszteint tartalmazó peptidek esetében szűrt levegő alatt 1-6 óráig keverést végzünk, végül reverz fázisú kromatográfiával sótalanítjuk a terméket.

A lipid-A és LPS találmány szerinti peptidekkel képzett komplexei általában a pepiiddel sztöchiometrikus mennyiségű lipid-A-val vagy LPS-sel állíthatók elő. A komplex azon mennyisége, amely képes antitesteket indukálni a gazdában, nem kritikus jelentőségű; a peptiddel alkotott komplexben kb. 1 mg lipid-A hatásosnak mutatkozott az antitestek gazdában történő biztonságos indukálására.

A peptidek aktivitását B. pertussis lipid-A és B. pertussis LPS alkalmazásával közvetlen mikroprecipitálási vizsgálattal igazoltuk. Ezenkívül, az LPS Polymixin B-hez viszonyított kötési aktivitását a peptidzLPS és peptid:lipid-A tömegarány alapján bizonyítottuk. A Limulus (LAL) teszt adatai azt mutatják, hogy az új vegyületek — megfelelő koncentrációban alkalmazva — a Polimyxin B'-vel egyenértékű LAL-gátlást mutatnak.

A találmány további tárgya az endotoxint tartalmazó rendszerekhez kapcsolódó peptidek alkalmazása a folyadékban diszpergált endotoxin detoxifikálása céljából. Ez az eljárás biológiai gyógyszerkészítmények. mint a vakcinák, gyógyszeroldatok, injektálható tápanyagoldatok és hasonlók méregtelenítésére alkalmazható. A találmány további tárgya a peptidek adalékként való alkalmazása endotoxint termelő baktériumok fejlődését elősegítő folyadékokban. A nem toxikus peptidek bármely endotoxint detoxifikálnak, melyek később lebomlanak.

• ·« • · I

- 11 A találmány szerinti peptidek 1 mg/ml koncentrációban in vit.ro nem mutatják a Polymixin B klinikailag idetartozó baktériumokkal (mint a Vibrio cholerae, Salmonella typhi és Haemophilus influenzáé) szembeni antibiotikum aktivitását. A találmányban leírt új peptidek 1 mg/ml koncentrációban a humán vörösvérsejtekre e.x vivő nem mutatnak hemolitikus aktivitást.

A peptidek Swiss

Webster egerekbe mg/kg mennyiségben injektálva a 48 órás és azon túli megfigyelés alatt nem mutatnak iii vivő akut toxicitást. A

Polymixin B esetében.

ugyanezen egérfajban, az

LDso értéke 2,5-5 mg/kg.

Az US CFR

Title 21

610.11(b) szerinti intraperitoneális inj ektálást követően egerekben és tengerimalacokban rendellenes toxicitás nem volt tapasztalható. A teszt állatokat hét napig vagy tovább figyeltük, és rendellenesség semmilyen jelét nem mutatták.

Az új vegyületekről kimutattuk, hogy proteolitikus enzimek,

mint a	tripszin jelenlétében viszonylag bomlékonyak,
miközben	megbizonyosodtunk arról, hogy a Polymixin B

tripszin jelenlétében stabil. Ezen eredmények azt mutatják, hogy az új vegyületek alkalmasak a szeptikus sokk kezelésére.

A következőkben a találmány szerinti vegyületek szintézisének előnyben részesített eljárását írjuk le.

• ··

Az alábbi eljárás alkalmazásával a peptideket MILLIGEN Mód. 9050 (MILLIPORE. Burlington, MA) automata szintetizátoron, poliamid/Kieselguhr gyanta (2,0 g) szilárd hordozón szintetizáltuk. A peptid analógok szintézisében a megállapított szekvenciába tartozó aminosavak Fmoc-aminosavOpfp (9-fluoreni1-metiloxi-karbon!1-aminosav-O-pentafluorfenil) származékait használtuk, melynek során a peptid lépésenként! kialakításához minden egyes aminosav 0,8 mmól-ját alkalmaztuk.

A szintézis valamennyi ciklusát 20 ’C-on végeztük. Az eljárás az alábbi reakciólépésekből áll.

1^_lépés;.—yédocsopcrt..eltávolítás

Az aminocsoporton Fmoc-védett első aminosavat az Fmococ védöcsoport eltávolítása érdekében 20 %-os piperidin oldattal 7 percig kezeltük. A piperidin maradékának eltávolításához dimetil-formamiddal 12 percig mosást végeztünk. A védőcsoport eltávolítását és a mosást a gyantát tartalmazó oszlopon keresztül, szivattyú alkalmazásával, 5 ml/perc átfolyási sebességgel folyamatosan végeztük.

2. lépés:_Az Fmoc-aminosav-Or>f p származék aktiválása

A kívánt szekvenciához megfelelő, amino- és karboxicsoporton védett aminosavat 5 ml dimetil-formamidban történő feloldás ♦ ··

után katalitikus mennyiségű hidroxi-benzo-triazollal (0,5 ml m/V %-os, dimetil-formamidos oldat) aktiváltuk.

3. lépés: Acilezés

Az aktivált és védett Fmoc-aminosav-Opfp származékot ezután, a bevitt új aminosavnak a megelőző aminosav alfaaminocsoportjához (melyről az 1. lépésben eltávolítottuk a védőcsoportot) való kapcsolása érdekében, 30 percig, szivattyúval, 5 ml/perc átfolyási sebességgel engedtük át az oszlopon.

Az új ciklus megkezdése előtt az oszlopot dimetilformamiddal. 2 percig 5ml/perc átfolyási sebességgel mostuk.

A szintézis befejeztével a gyanta hordozón lévő peptidet szobahőmérsékleten 95 %-os trif luor-ecetsawal (a szekvenciában ciszteingyökök jelenléte esetén tisztítószerként 5 %-os etán-ditiol jelenlétében) két óráig kezelve hasítottuk le a gyantáról. A lehasitott peptid gyantától történő elválasztása (szűréssel) után az oldatot vákuum alatt szárazra pároltuk. Az összegyűjtött szilárd maradékot 10-20 mg/ml koncentrációban 10 %-os eecetsawal szolubilizáltuk, és az etán-ditiol eltávolítása érdekében dietil-éterrel több extrakciót végeztünk (a peptid-oldat térfogatának fele mennyiséggel 6-8 extrakció).

A peptid oldatot ezután 0.1 N ammónium-hidroxid oldattal semlegesítettük, és a koncentrációt durván 0,1 mg/ml-re állítottuk be. Ezután, a szekvencia cisztein gyökeihez tartozó két szulfhidrilcsoport szelektív oxidálása érdekében, az oldatot 1-6 órán keresztül levegő alatt kevertük. Ezzel a módszerrel polimerizálódott anyag nélkül kizárólag oxidált, monomer peptideket nyertünk. Az oxidált peptid oldatát ezután SEP-PAK C-18 töltetű oszlopon (MILLIPORE) reverz fázisú kromatográfiával sótalanítottuk, s végül fagyasztva szárítottuk. A termékeket nagy teljesítményű folyadék-kromatográfiával (HPLC), és a szintetikus szerkezet kémiai analízisével vizsgáltuk.

A peptidek számított tömegének igazolásához gyors atom bombázásos tömegspektrometriát (FABS) alkalmaztunk.

A fentebb leírt eljárással az alábbi peptideket állítottuk elő

I. Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys

II. Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys

S - - - ---- - - - - S

III. Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Thr

IV. C ys-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Cys-Lys-Thr-Lys

V. Cys-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Cys-Lys-Thr

VI. Ile-Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys

S - ----------S

VII. Ile-Lys-Thr-Lys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Thr

VIII. ILe-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-Leu-Lys

IX. Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-Leu-Lys

XI. Arg-Tyr-Val-Arg-Tyr-Val-Arg-Tyr-Val

Az egyes peptidek aminosav-összetételét 6N sósavval 150 ’C-

on 1-12	óráig végzett	savas	hidrolízis után PICO-TAG
alkalmazásával határoztuk	meg.	s az alábbi eredményeket
kaptuk.
	I .	. TÁBLÁS	:at
		Aminosav-Összetétel
		(mól	aminosav/mól peptid)
Peptid	Aminosav	Várt	Tapasztalt
I .	Cys	2.00	2,13
	Leu	1.00	1,06
	Lys	3.00	2,90
	Phe	1.00	1,01
II .	Cys	2.00	2,16
	Leu	1,00	0,99
	Lys	5,00	4,95
	Phe	1,00	0,96
	Thr	1.00	1,03

I. TÁBLÁZAT (folytatás)

Aminosav-összetétel (mól aminosav/mól peptid)

Peptid	Aminosav	Várt	Tapasztalt
III.	Leu	1.00	0,98
	Lys	3,00	2,99
	Phe	1,00	1,01
	Thr	1,00	1,05
IV.	Cys	2.00	2.15
	Leu	1,00	0,94
	Lys	5.00	4.97
	Phe	1,00	0,93
	Thr	1,00	1,10
V. *	Cys	-	1,85
	Leu	-	0.94
	Lys	-	4,04
	Phe	-	0,98
	Thr	-	1,06
VI.	Cys	2.00	2,14
	Ile	1,00	0,98
	Leu	1,00	0.99
	Lys	5,00	4,98
	Phe	1,00	0.94
	Thr	1,00	1,00
VII.	Ile	1,00	0.98
	Leu	1,00	1,00

I. TÁBLÁZAT (folytatás)

Peptid	Aminosav	Aminosav-összetétel
(mól Várt	amincsav/mól peptid) Tapasztalt
VII.	Lys	5,00	4,99
	Phe	1,00	0,98
	Thr	2,00	2.00
VIII.	Ile	1,00	0,98
	Leu	3,00	2,98
	Lys	4,00	3,92
	Phe	3,00	3,02
IX.	Leu	2,00	1,90
	Lys	3.00	3.10
	Phe	2.00	1,90
X.**	Arg	3,00	3,00
	Tyr	3,00	2,9S
	Val	3.00	2,90
* Az V.	pepiidet humán sz	árumból.	tripszines hidrolízissel a
IV. szintetikus analógból	készítettük.
** A X.	peptidet tisztít	óként 5 °	έ fenclt tartalmazó 95 %-os
trifluor	-ecetsavval, s	zobahőmérséklecen egy éjszakán

keresztül hasítottuk a gyantáról.

Precipitáló (kötési) aktivitásuk kimutatása érdekében a fentebb leírt képletek szerinti valamennyi pepiidet • λ ·

	··* ··* .· - 18 -
B. pertussis	lipid-A és LPS endotonxinjára (mindegyikből

/jg) vonatkozó — közvetlen mikroprecipitin vizsgálattal összehasonlítottuk a Polymixin B-vel.

Peptid	II. TÁBLÁZAT pg nmol Komplex
Polymixin B	7,3 6,1 + + +
I. peptid	5,3 6,1 + + -
II. peptid	7,5 6.1 + + +
III. peptid	4, 6,1 + - -
IV. peptid	7.5 6,1 + + +
V. peptid	7,3 6,1 + + +
VI. peptid	8.2 6,1 + + +
VII. peptid	7,5 6,1 + + +
VIII. peptid	8,~ 6.1 + + +

A B. pertussis LFS-ével képzett komplexben jelenlevő

precipitált	peptidek mennyiségét a 3000 percenkénti
fordulattal	15 percig végzett centrifugálással kinyert
komplexek 6	M HC1 oldattal végzett savas hidrolízisét

követően aminosav analízissel határoztuk meg. A III. táblázatban néhány komplex sztöchiometrikus összetételét

mutatjuk be,	melyet az egyes peptidek és a kísérletekben
alkalmazott	LPS-ben lévő lipid-A anyagmennyiségének

(mólszám) arányából számítottunk.

• « ··· ·· «· • · >

• ··

III. TÁBLÁZAT

Az LPStop* és a Polymixin B szintetikus analógjai által képzett komplexek sztöchiometrikus összetétele

Peptid	A peptid mennyisége a komplexben (nmól)**	Peptid/lipid-A arány (mól/mól)
Polymixin B	2,69	1,02
11. peptid	3,39	1,28
IV. peptid	3,55	1,34
VI. peptid	3,12	1,18
VII. peptid	3,00	1,13
VIII. peptid	3.86	1.46

* A komplexek 10 pg B. pertussis LPS-böl (mely 4,50 pg vagy 2,64 nmól lipid-A-nek felel meg) és 10 pg pepiidből (az affinitás analízise során a Polymixin B esetében tapasztalt telítettségi pontnak megfelelő mennyiség kétszerese) képződtek.

** Az értékek két külön kísérletből származó, a kinyert peptidek savas hidrolízisét követően végzett aminosav analízis eredményeinek átlagát jelentik.

A vizsgált peptidek szelektivitását a IV. táblázatban mutatjuk be.

♦ • 4 ··«

IV. TÁBLÁZAT

Az LPSbp és a Polymixin B szintetikus analógjai által képzett komplexek jellemzői

Peptid	Affinitás (1/mól	; (Ka) )	Szelektivitás (KaANA/Kapcp)	Peptid mennyisége*
Polymixin B	1,15 x	10⁷	1,0	+ + +
I. peptid	< 1.15 x	10B	< 0,01	+ + -
II. peptid	0,56 x	107	0,49	+ + +
VI. peptid	0,29 x	10⁷	0.25	+ + +
IV. peptid	0,49 x	10⁷	0.43	+ + +
VII. peptid	0.19 x	107	0.17	+ + +
VIII. peptid	1,29 x	107	1,12	+ + +
IX. peptid	0.1 x	107	0.10	+ + +
X. peptid	0,27 x	107	0.24	+ + +

* Kapilláris csövekben végzett mikroprecipitálással és agarózon végzett immundiffúzióval kapott precipitátum mennyiségeként fejeztük ki.

A Limulus (LAL) teszttel kapott eredmények (ld. V. táblázat) alátámasztják a találmány szerinti peptidek LPS lipid-A részéhez való affinitásuk mérésének eredményeit, amennyiben azok a Limulus tesztben az LPS-aktivitás gátlásában a Polymixin B-vel lényegében egyenértékűek voltak. Az egyetlen peptid, amely a LAL - gátlásban alacsonyabb aktivitást mutatott, az I. peptid volt, amely a • · 4

- 21 találmány szerinti peptidek közül a legalacsonyabb affinitási konstans értéket adta. Valójában az I. peptid volt az egyetlen, amely nem rendelkezett a Polymixin B utánzásához szükséges teljes szerkezettel (amit a fenti IV. táblázatban a II., IV., VI. és VII. szintetikus peptid analógok világosan mutatnak). Meg kell jegyezni, hogy a LAL teszt a közegészségügy területébe tartozó legfontosabb intézmények (World Health Organization, Unoted States Food and Drug Administration) által elfogadott teszt, amely alkalmas az injektálható anyagok pirogenitásának (lázkeltés) előzetes meghatározásra, s amely felhasználható a nyulakban végzett pirogenitás in vivő teszt helyettesítésére.

V. TÁBLÁZAT

Az LPS-indukálta gélesedés Polymixin B szerkezetét utánzó szintetikus peptidekkel történő gátlása a LAL-tesztben*

LPS/peptid (m/m) teszt**

LPS	(0.1 pg LPS)			pozitív
Pol	ymixin B (0,1	pg) + LPS (0,1 pg)	1	negatív
I .	peptid (0,1 pg)	+ LPS (0,1 ug)	1	pozitív
I .	peptid (1,0 ug)	+ LPS (0,1 pg)	10	negatív
I .	peptid (10,0 pg)	+ LPS (0.1 pg)	100	negatív
II .	peptid (0,1 pg)	+ LPS (0,1 pg)	1	negatív
III	- peptid ( 100 pg	) + LPS (0,1 pg)	1000	pozitív
IV.	peptid (0,1 pg)	+ LPS (0,1 pg)	1	negatív
VI.	peptid (0,1 ng)	+ LPS (0.1 pg)	2	negatív

V. TÁBLÁZAT (folytatás)

LPS/peptid (m/m)	teszt**
VII. peptid (0,1 pg) + LPS (0,1 ;;g)	2	negatív
IX. peptid	100	negatív
X. peptid	20	negatív

Az eredmények azt jelzik, hogy a szintetikus pepiidnek — az LPS-hez történő hatásos kötődéshez, és a hatásos detoxifikálásához — a Polymixin ”B szerkezetének utánzása érdekében a Polymixin B aminosav-szekvenciájának majdnem az egészét tartalmaznia kell (a II., IV., VI. és VII. peptid a Polymixin B tíz aminosavával szemben tíz és tizenegy aminosav gyököt tartalmaz), s analóg (de nem azonos) kémiai sajátosságokkal kell rendelkezni. Ezzel szemben, a III. peptid, amely csak hat aminosav gyökcol áll (a Polymixin B peptid szakaszának lineáris szekvenciája), nem képes az LPShez való hatékony kötődésre. illetve az LPS detoxifikálására. Ügy tűnik, az LPS detoxifikálásához szükséges minimális struktúra az I. peptid (amely megfelel a Polymixin B peptid szakaszának). amely azonban kisebb affinitási értéket mutat, mint a hosszabb aminosavszekvenciájú egyéb peptid analógok.

A humán szérumban jelenlevő tripszin Polymixin B-re és a találmány szerinti peptidekre gyakorolt hatását úgy határoztuk meg, hogy 10 μΐ humán szérumot az adott peptid 20

/.jg-jával 10 μΐ térfogatban elegyítettük, s az elegyet különböző ideig 37 °C-on tartottuk. A vizsgált peptid maradék mennyiségének kimutatása céljából az elegy egy alikvotját különböző időpontokban HPLC analízisnek vetettük alá. A VI. táblázatban a vizsgált peptidek felezési idejét a Polymixin B felezési idejéhez hasonlítva mutatjuk be.

VI. TÁBLÁZAT

A Polymixin B szintetikus peptid analógjainak tripszines proteolízissel szembeni stabilitása humán szérumban

Peptid	Felezési idő (t/2) (perc)	Kinyert 180 per	mennyiség (%) c elteltével
Polymixin E	>> 180		100
I. peptid	> 180		70
II. peptid	50		10
VI. peptid*	1080 (18 óra)		76
IV. peptid**	18		0
V. peptid	240		55
VII. peptid	50		28
VIII. peptid	7		0
IX. peptid	10		0
X. peptid	35		0

A VI. peptid tripszines hidrolízise a II. pepiidet eredményezi.

** A IV. peptid tripszines hidrolízise az V. pepiidet ·· ··· ··

999 eredményezi.

Amint a találmány hátterének leírásában említettük, az LPS in vivő lázkeltö aktivitása az Interleukin-1 (IL-1) és alfaTumor Nekrózis Faktor (alfa-TNF) (melyek a szeptikus sokk halálos kimenetelű hatásaiért felelős fő molekulák) makrofágokból és monocitákból történő felszabadulásának köszönhető.

A peptidek detoxifikáló aktivitásának in vivő igazolása érdekében öt, három nyűiből álló csoportot két jellemző szintetikus analóg LPS-sel képzett komplexével oltottunk. A pirogenitás tesztet a United States Pharmacopoeia XXI. kötet)/The Naticnal formulary (XVI. kötet) (kettős kiadvány, 1985. jan. 1.) szerint végeztük. A teszt során negatív kontrollként a Polymixin B és LPS komplexét injektáltuk. Az eredményeket az első ábrán mutatjuk be. Amint láthazi, az LPS az injektálás utáni első órától sajátos pirogén aktivitását mutatja, s a höméréséklet a megfigyelés harmadik órájáig (amely a teszthez szükséges időtartam) tovább emelkedik. Az LPS által indukált láz sajátos lefolyása két hőmérséklet emelkedési hullámból áll kétfázisú lefolyás'⁵. Az első hőmérséklet emelkedés (első hullám) az LPS injektálásától számított két órán belül mutatkozik, s az antigén gazda immunrendszerére gyakorolt azonnali hatásának eredménye. A második (és egyenletesebb) hőmérséklet emelkedés (második hullám) az LPS injektálásától számított három órán belül jelentkezik, és ezt az LPS által stimulált ·· *

··· immunkompetens sejtekből felszabadult IL-1 és alfa-TNF endogén pirogének közvetítik. Az LPS I. és II. peptiddel, illetve a Polymixin B-vel kialakult komplexei akét hőmérséklet emelkedés közül egyiket sem mutatták, bizonyítva ezzel, hogy az LPS (komplexált) pirogén dózisai injektálásának hatására az IL-1 és az alfa-TNF immunmediátor ín vivő nem szabadult fel. Az eredményeket az 1. ábrán mutatjuk be.

következő kísérletekben a

Polymixin B antibiotikum aktivitását különböző, találmány szerinti peptidekkel hasonlítottuk össze.

teszteket

BHI lemezeken, a tesztorganizmusok folyadéktenyészeteivel, pázsitszerű telepek kialakításával eztük. A peptideket vízben hígítottuk, és steril Whatman

3M korongokon a lemez felületére helyeztük. A lemezeket szárítottuk, és 37 ’C-on inkubáltuk. A gátlási zónát 18 óra elteltével mértük.

Koncentráció

Gátlási zóna (mm)

Vegyület (mg/ml) S. typhi H. influenzáé V. cholerae

Polymixin B	1,0	4	6	5
	0,2		3	2,5
	0,04	1	0	2

0.008

Vegyület

Koncentráció

Gátlási zóna (mm) (mg/ml)

S. typhi H. influenzáé V. cholerae

I. peptid	1,0	0	0	0
	0,2	0	0	0
	0,04	0	0	0
	0,008	0	0	0
II. peptid	1,0	0	0	0
	0,2	0	0	0
	0,04	0	0	0
	0,008	0	0	0
VI. peptid	1,0	0	0	0
	0,2	0	0	0
	0,04	0	0	0
	0,008	0	0	0
A találmány	szerinti	peptidek LPS-	induká	lta poliklonális
B-sejt aktiválásra gyakorolt hatásé	,t az	immunizálatlan,

egészséges SJL/J egerekből származó lépsejtek 50 Mg/ml LPS-sel és a PolymixinB vagy a találmány szerinti peptidek feltüntetett koncentrációjával végzett tenyésztésével bizonyítottuk. A sejteket 37 °C—on, három napig 1,0 % normál egérszérumot tartalmazó RPMI tápközegben tenyésztettük. A tenyészeteket 16 órán keresztül, üregenként 1,0 mCí ³Htimidinnel radioaktívan jelöltük, összegyűjtöttük, és a beütésszámot LS betaplate számlálón számoltuk. Az alábbi eredményeket kaptuk:

Egység ³H-timidin beépülés ( cpm ) ( /jg/ml)

Polymixin B

I. pepiid

II. peptid

100	22	737	22	737	22	737
50	4	128	3	287	2	266
25	2	831	2	775	2	355
12,5	2	366	o 4-,	385	2	350

A stimulálatlan tenyészetek esetében mért cpm érték = 2 449.

A II. peptid (klinikailag fontos Gram-negatív baktériumok által termelt) endotoy.inhoz való kötődésének hatékonyságát a LAL-teszttel bizonyítottuk. Az eredményeket a VII. táblázatban mutatjuk be.

VII. TÁBLÁZAT

Endotoxin	EU/ml	Peptid/	LPS	Kötési haté-
forrás	reakcióban	{m/m)	Teszt*	konyság** (%)
B.	pertussis	4	1	negatív	> 98
	coli 055.B5	4	1	negatív	> 98
P.	aeruginosa	4	1	negatív	> 96
c *-' .	typhosa	4	1	negatív	> 98
K.	pneumoníae	4	1	negatív	> 98
s.	minnesota	4	1	negatív	> 98
s.	marcescens	4	1	negatív	> 98
s.	flexneri	4	1	negatív	> 98
E.	coli 0111:B4	4	1	negatív	> 98
V.	cholerae	4	1	negatív	> 98

* Három, ismételt analízis átlaga.

** A 98 %-nál nagyobb kötési hatékonyság 0,08 EU/ml-nél kevesebb szabad endotoxinnak felel meg (negatív LAL-teszt).

A mindössze 97 %-os kötési hatékonyság 0,12 EU/ml szabad endotoxinnak felel meg (pozitív LAL-teszt).

A találmány szerinti VI. peptidet szenzitív markerként működő biotinnal jelöltük, miáltal bi-specifikus molekulát kaptunk, amely a VI. peptid révén a bakteriális endotoxinok lipid-A részletével (Ka = 0,3 x 10⁷ ) , a Biotin jelölő molekula révén pedig a nagy affinitású, természetes avidin proteinnel (Ka - 10¹⁵) reagál szelektíven. A két szelektív és nagy affinitású reakció kombinálása lehetővé teszi az endotoxinok lipid-A részletének nagyon alacsony szinten (pikomólos vagy 10^-12 mól/1 szint) történő kimutatását. A biotin-avidin reakciót a lipid-A/LPS és a találmány szerinti peptidek valamelyike közötti reakció kimutatásának példájaként alkalmazzuk.

A VI. peptidet 0,1 M nátrium-acetát oldatban (pH = 6,0) N-hidroxi-szukcinimidil-biotinhoz (1:1 mól/mól) kapcsoltuk.

A reakciót 37 ’C-on egy órán keresztül végeztük. Ilyen körülmények között csak az N-terminális aminosav (Ile) aminocsoportja reagál úgy, hogy a kialakuló peptid monoszubsztituált marad, s nem veszíti el a lipid-Ahoz való affinitását. A jelölt peptidet reverz fázisú folyadék-kromatográfiával (HPLC) tisztítottuk, és aminosavösszetételre és szabad aminocsoportokra vizsgáltuk. A vizsgálat megerősítette, hogy a peptid biotinilálódása 1:1 mól/mól arányban következett be.

Azt találtuk, hogy humán szérumban vagy teljes vérben a jelölt VI. peptid lipid-A/LPS-hez való affinitása (ha a tesztelést a találmányban leírt eljárások szerint végeztük) nem különbözött jelentősen az ugyanebben a találmányban leírt értékektől (Ka = 0,3 x 10⁷ mól/1; illetve t/2 - 20 óra) .

A peptid-köiött biotin avidinhez való affinitása nem különbözik jelentősen a szabad biotin esetében kimutatottól.

A szabad és peptid-kötött biotin egyenlő koncentrációkban (1 nmól/ml> az avidinhez hasonló affinitást mutat, amit nitrocellulózcn. végzett. szilárd fázisú dot-blot analízissel. a peroxidázzal jelölt biotin és az avidin közötti reakció gátlásával határoztunk meg.

A peptid/lipid-A komplex tapasztalati sztöchiometrikus összetétele (1 mól/mól) és a biotin/avidin komplex ismert összetétele <4 mól/mól) segítségével lehetőség nyílik arra, hogy adott mintában, az endotoxinhoz kötött, jelölt peptid

(amelyet	a jelölő ágens [azaz a biotin] és specifikus
reagense	[azaz enzim-jelölt avidin] közötti reakcióval
mutatunk	ki) mennyiségének titrálásával meghatározzuk az
endotoxin	ismeretlen mennyiségét.

Az eredmények azt bizonyítják, hogy új, igen érzékeny és • « · · ·

szelektív reagens készítménnyel folyadékokban (szérumban, vérben vagy vizes oldatokban) az endotoxin nyomnyi mennyiségei is kimutathatók.

A B. pertussis-ból származó lipid-A-t és LPS-t a II. peptid sztöchiometrikus mennyiségével detoxifikáltuk, és dózisonként 1 mg alumínium-hidroxid adjuvánssal vagy anélkül 1 yg, illetve 2 yg dózismennyiségben egerekbe injektáltuk. Az immunizálás során három hetenként, szubkután összesen három dózist adtunk. Az immunizálási periódus végén a csoportonkénti tíz egér szérumát összegyűjtöttük, és az immunizálási periódus mindegyik stádiumában (0., 3., 6. és 8. hét) az endotoxin lipid-A részletére specifikus antitestek (IgG és IgM izotípusok) jelenlétére vizsgáltuk.

A titereket nitrocellulózon szilárd fázisú dot-blot analízissel az antitestek specifitására és mennyiségére vizsgáltuk. A nitrocellulóz lapokat szobahőmérsékleten 7 órán keresztül PBS-ben (pH - 7,2) lipid-A-val vagy LPS-sel (10 yg/ml vagy 20 yg/ml koncentrációval) vontuk be. Miután a nitrocellulózt 3 m/V %-os BSA-t tartalmazó PBS-sel mostuk, az egerek összegyűjtött egy éjszakán keresztül.

szérumait különböző hígításokban, szobahőmérsékleten a lipid-A-val bevont nitroce1lulózzal inkubáltuk.

Ezután két órára szobahőmérsékleten peroxidázzal jelölt anti-IgG vagy anti-IgM antitestet adtunk hozzá, majd ismételten mostuk, s 0,3 m/V %-os 4-klór-naftolt adtunk hozzá. Az enzimreakciót szobahőmérsékleten, sötétben 0,5-1 óráig végeztük.

Az egerek összegyűjtött szérumában az anti-IgG és anti-IgM titerek eredményeit a VIII. és IX. táblázatban mutatjuk be. Az eredmények azt mutatják, hogy amennyiben a lipid-A-t, illetve az LPS-t a találmány szerinti peptidekkel végzett detoxifikálás után, komplex formában injektáljuk az emlős gazdába, természetes antigén repertoáruk változatlan marad, s a gazda immunrendszere idéz elő. A beinjektált specifikus antitestek nem specifikus szerológiai reakciót komplexben jelenlevő peptidre indukálódtak. Az állatok egyik komplex dózis injektálásának helyén sem mutatták vérzéses sérülések vagy bőrelhalás jelét.

Ilyenformán, a találmány szeried peptidek új eljárást biztosítanak toxikus antigének (mint a lipid-A és az LPS) modifikálására, amelyek emlős gazdában a bakteriális endotoxin természetes és specifikus antigén repertoárét expresszáló komplexek formájában felhasználhatók az emlős gazda immunizálásara.

Az izoltált lipid-A/LPS-specifikus antitestek folyadékokban való diagnosztikai alkalmazása, illetve a gazdában szeptikus sokk kezelése érdekében az antitestek hagyományos eljárások alkalmazásával nyerhetők ki az antiszérumból, például ammónium-szulfátos vagy alkoholos kicsapással és affinitáskromatográf iával.

VIII. TÁBLÁZAT

Anti-lipid-A IgG reakció (a II. peptiddel detoxifikált lipid-A-val vagy LPS-sel kezelt egerek összegyűjtött széruma)

Hét	Hígítás^-1 (AI(OH)3-dal)	Hígítás^-1 (Al(0H)3 nélkül)
0.	0	0
3.	50	50
6.	100	50
8.	200	100

IX. TÁBLÁZAT Anti-lipid-A IgM reakció
(a II. peptiddel detoxifikált lipid-A-val vagy	LPS-sel
kezelt	egerek összegyűjtött széruma)
Hét Hígítás^-1	(AI(OH)3-dal) Hígítás^-1 (Al(OH)	3 nélkül)
0. 0	0
3. 50	QP.
6. 200	50
8. 100	50

Az egerek endotoxin-indukálta elhullását a találmány szerinti peptidek intravénás injektálásával akadályoztuk

meg. Ehhez a kísérlethez a bakteriális endotoxin letális hatására nagyon érzékeny egértörzset alkalmaztunk. Az Aktinomycin D-vel érzékenyített egerek (CDI törzs) igen alacsony endotoxin dózisokra is nagyon érzékenyek. Mindössze egerenként 1 pg endotoxin (kb. 40 /jg/testtömeg-kilogramm) 24-48 órán belül képes teljesen elpusztítani egy egér populációt.

CDI egérből álló csoportokat a találmány szerinti peptidekkel (egerenként steril sóoldatban szolubilizált, 0,1 mg egyszeri peptid dózissal) intravénásán kezeltünk. Harminc perccel később az egerekben 055-B5 E. coli törzsből tisztított 1 pg endotoxin intraperitoneális injektálásával immunreakciót váltottunk ki. A hétnapos megfigyelési

időtartam

során minden 24 órában feljegyeztük a túlélő

egerek számát. Pozitív kontrollként hasonló dózisú Pclymixin

B (PmB)	és klór-promazin (CPZ: anti-hisztamin hatású
gyógyszer,	amely újabban igen hatásosnak bizonya. ezen
egértörzs	endotoxinos fertőzés hatására kialakuló

letalitásának megelőzésére) alkalmazásával párhuzamos kísérleteket végeztünk. A negatív kontrollokat intravénásán injektált sóoldattal kezeltük.

A kapott	eredményeket a X. táblázatban mutatjuk be. A
találmány	szerinti peptidekkel kezelt egerek túlélési
aránya a	peptidek lipid-A-ra vonatkozó affinitás konstans
értékéből	(ld. IV. táblázat) előre meghatározható

viselkedést követett.

♦

J • · · »·· ·· ·

X. TÁBLÁZAT

Actinomycin D-vel érzékenyített CDI egerek túlélési aránya

Megfigyelés ideje (óra)

	24	48	72	96	120	144	168 Szignií	: ikanc
NaCl	5	3	1	1	1	1	1
	(25%)	(15%)	(5%)	(5%)	(5%)	(5%)	(5%)
I.	8	4	3	3	3	3	3
peptid	(40%)	(20%)	(15%)	( 15%)	(15%)	(15%)	(15%)	P	<	0,02
II.	13	8	8	8	8	8	8
peptid	(63%)	(40%)	(40% )	( 40%)	(40%)	(40%)	( 40%)	P	<	0,001
VI.	5	5	5	5	5	5	5
peptid	(25%)	(25%)	(25% )	(25%)	(25%)	(25%)	(25%)	P	<	0,01
PmE	10	8	6	6	6	6	6
	(50%)	(40%)	( 30% )	( 30%)	( 3 G 'c)	(30%)	(30%)	P	<	0,01
CPZ	10	10	10	10	10	10	10
	(50%)	(50% )	(50% )	(50%)	(50%)	(50%)	(50%)	P	<	0,001

Valamennyi csoport 20 egérből állt. Minden 24 óránkénti megfigyelésnél tapasztalt túlélő egerek számát felsoroltuk. A %-os túlélést zárójelben tüntettük fel. A p a statisztikai szignifikancia szintjét fejezi ki, amit a sóoldatos kezeléshez hasonlítva mindegyik molekulára a tteszttel számítottunk, figyelembe véve az egyes csoportok teljes túlélési arányát.

A II. peptid a PmB-vel összehasonlítva nagyobb hatékonyságot mutat (p < 0,05).

A II. peptid a CPZ-vel megegyező hatékonyságot mutat (p < 0,2).

A magas dózisú endotoxinra (max. 0,5 mg/egér) természetesen rezisztens Balb/c törzsbe tartozó egerekkel végzett másik kísérlettel (Polymixin B-vel végzett hasonló kezeléssel összehasonlítva) további bizonyítékát szolgáltattuk a találmány szerinti peptidek biztonságának és hatékonyságának.

Balb/c egérből álló csoportokat intravénásán, egerenként 1 mg dózissal a találmány szerinti peptidekkel, vagy egerenként 0,1 mg dózissal Polymixin B-vel (e gyógyszer önmagában injektált legnagyobb, egérben tolerálható dózisa) kezeltünk. Harminc perccel később az egerekben 055-B5 E. coli törzsből tisztított 1 /jg endotoxin intraperitoneális injektálásával immunreakciót váltottunk ki. A hétnapos megfigyelési időtartam során minden 24 órában feljegyeztük a túlélő egerek számát. A negatív kontrollokat. intravénásán injektált sóoldattal kezeltük.

A kapott eredményeket a XI. táblázatban mutatjuk be. Az állatok találmány szerinti peptidekkel végzett kezelése biztonságos és hatékony. Összehasonlításul. a Polymixin B-vel végzett kezelés az endotoxin beadása után csak három napig volt hatásos, mivel közvetlenül azután a Polymixin B (PmB) toxicitása az endotoxinnal együttműködő (szinergikus) «

* • ·« · ·« , ··· · · hatása miatt valamennyi egér elpusztult.

XI. TÁBLÁZAT

Balb/c egerek túlélési aránya

	Negfigyelés ideje (óra)	168 Szignifikancia
24	48	72	96	120 144
NaCl	12	10	8	8	8	8	8
	( 60%)	(50%)	(40%)	(40%)	(40%)	(40%)	(40%)
I .	18	12	10	10	10	10	10
peptid	(90%)	(60%)	(50%)	(50%)	(50%)	(50%)	(50%)	p < 0,01
II.	20	12	12	12	12	12	12
peptid	(100%)	(60%)(60%)	(60%)	(60%)	(60%)	(60%)	p < 0,001
PmB	18	14	12	0	0	0	0
	( 90%)	(70%)	(60% )	(0%)	(0%)	(0%)	(0%)	—

Valamennyi csoport 20 egérbe 1 állt. Felsoroltuk a 24 óránkénti megfigyelésnél tapasztalt túlélő egerek számát. A %-os túlélést zárójelben tüntettük fel. A p a statisztikai szignifikancia szintjét fejezi ki, amit a sóoldatos kezeléshez hasonlítva mindegyik molekulára a t-teszttel számítottunk, figyelembe véve az egyes csoportok teljes túlélési arányát.

A PmB-hez képest az I. és II. peptid biztonságos és hatékony volt. (p < 0,001).

♦ · ♦

- 37 összehasonlító példa

Az 1. igénypont szerinti peptid leirt sajátosságainak további bizonyítása érdekében (melyek a lipid-A-hoz való kötődési aktivitáshoz szükségesek), a

Glu-Tyr-Val-Glu-Tyr-Val-Glu-Tyr-Val képlet szerinti pepiidet szintetizáltunk, amely a X. peptid sokkal inkább poli-anionosságot, mint poli-kationosságot mutató analógja. Ez a peptid nem mutatott lipid-A/LPS-re vonatkozó kötési aktivitást, s a LAL-tesztben nem gátolta az LPS toxikus aktivitását.

A találmány szerinti peptidek a Polymixin B toxicitásának csökkentése érdekében a Polymixin B-vel együtt alkalmazhatók. olyan arányban. hogy a Polymixin B a IV. táblázatban közölt szelektivitási adatok alapján számított sztöchiometrikus feleslegben legyen.

• ·4 · • ·4 •44··4 « · · • 4· ·

SZEKVENCIALISTA

SZEKVENCIÁK SZÁMA: 10

TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) ALAK: cirkuláris (ii) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Cys Lys Phe Leu Lys Lys Cys

5

TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) ALAK: cirkuláris (ii) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Lys Thr Lys Cys Lys Phe Leu Lys Lys Cys

10

TUDNIVALÓK A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 6 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) ALAK: cirkuláris (ii) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

• · • · · • ·· ··· • · · ·· ··

- 39 Lys Phe Leu Lys Lys Thr

5

TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) ALAK: cirkuláris (ii) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Cys Lys Lys Leu Phe Lys Cys Lys Thr Lys

10

TUDNIVALÓK AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 9 aminosav (B) TIBUS: aminosav (C) ALAK: cirkuláris (ii) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Cys Lys Lys Leu Phe Lys Cys Lys Thr

5

TUDNIVALÓK A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 11 aminosav (B) TIBUS: aminosav (C) ALAK: cirkuláris (ii) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

• a · · • * · •····· a ·a a ·«a

Ile Lys Thr Lys Cys Lys Phe Leu Lys Lys Cys

1510

TUDNIVALÓK A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 10 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) ALAK: lineáris (ii) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Ile Lys Thr Lys Lys Phe Leu Lys Lys Thr

5 10

TUDNIVALÓK A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 11 aminosav (E TÍPUS: aminosav (C) ALAK: cirkuláris (ii) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Ile Lys Phe Leu Lys Phe Leu Lys Phe Leu Lys

5 10

TUDNIVALÓK A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) ALAK: lineáris (ii) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA:

Lys Phe Leu Lys Phe Leu Lys

5

TUDNIVALÓK A 10. SZÁMO SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIA JELLEMZŐK (A) HOSSZÚSÁG: 7 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) ALAK: lineáris (ii) SZEKVENCIA LEÍRÁS: 10. SZÁMO SZEKVENCIA:

Arg Tyr Val Arg Tyr Val Arg Tyr Val

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Az Rí-(A-B-C)n-R (I) képlet szerinti monomer, lineáris polimer, ciklikus monomer vagy ciklikus polimer peptid, amelyben Rí és R jelentése, egymástól függetlenül, hidrogénatom, aminosavgyök vagy zsírsavgyök; A jelentése Lys, Arg vagy His; B jelentése Phe, Tyr vagy Trp; C jelentése Leu, Ile vagy Val; és n jelentése 1 és 100 közötti egész szám.
2. Az Rí-(Lys-Phe-Leu)_n-R (II) képlet szerinti monomer, lineáris polimer, ciklikus monomer vagy ciklikus polimer peptid, melyben n jelentése 1 és 10 közötti egész szám, R és Rí jelentése pedig hidrogénatom, aminosavgyök vagy zsírsavgyök.

3. Az 1. igénypont szerinti peptid, amely a Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys S — — — — — — — — — — — S képlettel írható le. 4. Az 1. igénypont szerinti peptid, amely a Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys ε - — ________ _s képlettel írható le. 5. Az 1. igénypont szerinti peptid, amely a Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Thr

• ·

6. Az 1. igénypont szerinti peptid, amely a képlettel írható le.

Cys-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Cys-Lys-Thr-Lys képlettel írható le.

7. Az 1. igénypont szerinti peptid, amely a

Cys-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Cys-Lys-Thr képlettel írható le.

8. Az 1. igénypont szerinti peptid, amely az

Ile-Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys

S - - - --------S képlettel írható le.

9. Az 1. igénypont szerinti peptid, amely az

Ile-Lys-Thr-Lys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Thr képlettel írható le.

10. Az 1. igénypont szerinti peptid, amely az

Ile-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-Leu-Lys képlettel írható le.

11. Az 1. igénypont szerinti peptid, amely a

Lys-Phe-Leu-Lys-Phe-Leu-Lys képlettel írható le.

•·· ··· · · • · · · · ·· ·· ·«« ·«·

12. Az 1. igénypont szerinti peptid. amely az

Arg-Tyr-Val-Arg-Tyr-Val-Arg-Tyr-Val képlettel írható le.

13. Gyógyszerkészítmény, amely az 1. igénypont szerinti pepiidből és gyógyszerészeti hordozóból áll.

14. Gyógyszerkészítmény, amely a 2. igénypont szerinti pepiidből és gyógyszerészeti hordozóból áll.

15. Gyógyszerkészítmény, amely a
3. igénypont szerinti pepiidből és gyógyszerészeti hordozóból áll.

16. Gyógyszerkészítmény, amely a
4. igénypont szerinti peptidböl és gyógyszerészeti hordozóból áll.

17. Gyógyszerkészítmény, amely az 5. igénypont szerinti peptidböl és gyógyszerészeti hordozóból áll.

18. Gyógyszerkészítmény, amely a 6. igénypont szerinti peptidböl és gyógyszerészeti hordozóból áll.

19. Gyógyszerkészítmény, amely a 7. igénypont szerinti pepiidből és gyógyszerészeti hordozóból áll.

20. Gyógyszerkészítmény, amely a 8. igénypont szerinti pepiidből és gyógyszerészeti hordozóból áll.

21. Gyógyszerkészítmény, amely a 9. igénypont szerinti pepiidből és gyógyszerészeti hordozóból áll.

22. Gyógyszerkészítmény, amely a 10. igénypont szerinti peptidböl és gyógyszerészeti hordozóból áll.

23. Gyógyszerkészítmény, amely a 11. igénypont szerinti peptidböl és gyógyszerészeti hordozóból áll.

24. Gyógyszerkészítmény, amely a 12. igénypont szerinti peptidböl és gyógyszerészeti hordozóból áll.

25. Eljárás szeptikus sokk kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy gazdának az 1. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

26. Eljárás szeptikus sokk kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy gazdának a 2. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

27. Eljárás szeptikus sokk kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy gazdának a 3. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

28. Eljárás szeptikus sokk kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy gazdának a 4. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

• · · · <* * * * · * · «· ··· ·· · 9 * • · · ♦ * ·· ♦· ·«* ··*

29. Eljárás szeptikus sokk kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy gazdának az 5. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

30. Eljárás szeptikus sokk kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy gazdának a 6. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

31. Eljárás szeptikus sokk kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy gazdának a 7. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

32. Eljárás szeptikus sokk kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy gazdának a 8. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

33. Eljárás szeptikus sokk kezelésére, azzal jellemezve.

hogy egy gazdának a 9. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

34. Eljárás szeptikus sokk kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy gazdának a 10. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

35. Eljárás szeptikus sokk kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy gazdának a 11. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

• · · ·· ·· • ·* ··· * * • · · · · *· 4· ·«· ·«,

36. Eljárás szeptikus sokk kezelésére, azzal jellemezve, hogy egy gazdának a 12. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

37. Eljárás szeptikus sokk megelőzésére, azzal jellemezve, hogy fogékony gazdának az 1. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

38. Eljárás szeptikus sokk megelőzésére, azzal jellemezve, hogy fogékony gazdának a 2. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

39. Eljárás szeptikus sokk megelőzésére, azzal jellemezve, hogy fogékony gazdának a 3. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

40. Eljárás szeptikus sokk megelőzésére, azzal jellemezve, hogy fogékony gazdának a 4. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

41. Eljárás szeptikus sokk megelőzésére, azzal jellemezve, hogy fogékony gazdának az 5. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

42. Eljárás szeptikus sokk megelőzésére, azzal jellemezve, hogy fogékony gazdának a 6. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

• · · · ·· ·· ·«* «*»

43. Eljárás szeptikus sokk megelőzésére. azzal jellemezve, hogy fogékony gazdának a 7. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

44. Eljárás szeptikus sokk megelőzésére, azzal jellemezve, hogy fogékony gazdának a 8. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

45. Eljárás szeptikus sokk megelőzésére, azzal jellemezve, hogy fogékony gazdának a 9. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

46. Eljárás szeptikus sokk megelőzésére, azzal jellemezve, hogy fogékony gazdának a 10. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

47. Eljárás szeptikus sokk megelőzésére, azzal jellemezve, hogy fogékony gazdának a 11. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

48. Eljárás szeptikus sokk megelőzésére, azzal jellemezve, hogy fogékony gazdának a 12. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

49. Eljárás Polymixin B toxicitásának csökkentésére, azzal Jellemezve, hogy a Polymixin B-vel együtt az 1. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét alkalmazzuk.

«V ·· • · · · ··· ··· • · · ·· ·· «

50. Eljárás az endotoxin humán vagy állati vérből vagy szérumból történő eltávolítására, azzal jellemezve, hogy az említett vért vagy szérumot az 1. igénypont szerinti pepiiddel hozzuk érintkezésbe.

51. Eljárás a citokinek endotoxin által indukált felszabadulásának szabályozására, azzal jellemezve, hogy a gazdának az 1. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségét adjuk be.

52. Peptid szekvenciák, melyek az 1. igénypont szerinti aminosav-szekvenciához képest fordított orientációjúak.

53. Peptid szekvenciák, amelyek az 1. igénypont szerinti peptidek enantiomer aminosav-szekvenciái (a szekvenciában csak D-aminosavak találhatók).

54. Peptid szekvenciák, amelyek az 1. igénypont szerinti peptidek diasztereomer aminosav-szekvenciái (ugyanazon szekvenciában D- és L-aminosavak találhatók).

55. Peptid szekvenciák, melyekben az aminosavak az 1.

igénypont szerinti peptidek szekvenciáiban való eredeti elhelyezkedésükhöz képest fordítottan helyezkednek el.

56. Eljárás bakteriális endotoxinok detoxifikálására, azzal jellemezve, hogy a megtámadott gazdát az 1. igénypont szerinti peptid hatásos mennyiségével kezeljük.

• · ·· • · · » ··· ·*· • · · ·· ·· · • ·

57. Eljárás az 1. igénypont szerinti peptidek diagnosztikai próbaként való alkalmazására endotoxin emlősök szérumában vagy vérében, valamint oldatokban történő kimutatásában és mennyiségi meghatározásában, azzal jellemezve, hogy a peptidet az endotoxin specifikus kimutatására alkalmas, szenzitiv markerrel jelöljük, az említett szérumot vagy vért érintkezésbe hozzuk a jelölt pepiiddel, és meghatározzuk az endotoxin jelenlétét.
5Θ. Eljárás nem toxikus, antigén hatású lipid-A vagy lipo-poliszacharid komplex előállítására, azzal jellemezve, hogy a lipid-A-t vagy a lipo-poliszacharidot az 1. igénypont szerinti pepiiddel hozzuk érintkezésbe, majd kinyerjük az antigén hatású komplexet.

59. Eljárás lipid-A vagy lipo-poliszacharid elleni antitestek kialakítására, azzal jellemezve, hogy 'a.’ a lipid-A-t vagy a lipo-poliszacharidot komplex létrehozása érdekében az 1. igénypont szerinti pepiiddel hozzuk érintkezésbe;

(b) a gazdának az említett komplex hatásos mennyiségét adjuk be; és <c) az említett gazda szérumából kinyerjük az antitesteket.

60. Eljárás lipid-A vagy lipo-poliszacharid elleni antitestek indukálására a gazdában, azzal jellemezve, hogy (a) a lipid-A-t vagy a lipo-poliszacharidot komplex létrehozása érdekében az 1. igénypont szerinti pepiiddel hozzuk érintkezésbe; és (b) az emmlített gazdának az említett komplex hatásos mennyiségét adjuk be.

61. Eljárás bakteriális endotoxin detoxifikálására, azzal jellemezve, hogy a bakteriális endotoxint, vagy az endotoxint tartalmazó folyadékot az 1. igénypont szerinti peptiddel hozzuk érinttkezésbe.

62. Eljárás egy termék endotoxinos szennyeződésének megakadályozására. azzal jellemezve, hogy a termékhez az 1. igénypont szerinti peptid olyan mennyiségét adjuk, amely elégéges bármilyen endotoxin semlegesítéséhez, melyeket később a baktériumok feldolgoznak.