JPH0710773A

JPH0710773A - 制癌作用増強剤

Info

Publication number: JPH0710773A
Application number: JP5253854A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Maeda; 浩前田; Yasuhiro Matsumura; 保広松村; Seiji Takamatsu; 清治高松; Tadahisa Shimoda; 忠久下田
Original assignee: Fuji Oil Co Ltd
Current assignee: Fuji Oil Co Ltd
Priority date: 1993-10-12
Filing date: 1993-10-12
Publication date: 1995-01-13
Anticipated expiration: 2011-01-10
Also published as: JPH08783B2

Abstract

(57)【要約】【目的】自体制癌作用を有する剤と併用することによ
り、該剤の有する抗癌作用を増強する。【構成】大豆クニッツ (Kunitz）型トリプシンインヒビ
ターまたはその誘導体を活性成分とする制癌作用増強
剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、制癌作用増強剤に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】従来から植物由来のプロテアーゼインヒ
ビターが種々報告されている。これらインヒビターには
特異性があり、例えば、トウモロコシトリプシンインヒ
ビターやカボチャトリプシンインヒビターは、トリプシ
ンと活性型ハーゲマン因子に抑制活性を示し (Thromb.
Res. 20, 149,1980等) 、ダイズトリプシンインヒビタ
ーのうちクニッツ(Kunitz)型トリプシンインヒビター
は、トリプシン、血漿カリクレイン、活性型第Ｘ因子等
に抑制効果を有することが知られている。また炎症性浮
腫亢進の際には、ブラジキニンの活性が発現し、疼痛や
血管透過性が増大するが、ブラジキニンの活性発現には
ハーゲマン因子やカリクレインが関与するスキームが提
案されている。

【０００３】しかし、プロテアーゼインヒビターと炎症
の関係は、in vitroでの研究の段階にとどまっているの
が現状で、in vivo での効果を実証した報告例は極めて
少ない。

【０００４】一方、胃癌、腎癌、卵巣癌、肝癌等の患者
には腹水が、肺癌の患者の場合には胸水が、屡々貯留
し、またこれら固形腫瘍の術後播種によって高い確率で
腹腔或いは胸腔内に腫瘍が転移し、その結果同様の貯留
が認められる。腹水の貯留が生じると、血漿タンパクの
低下を来し、患者の体力低下その他の増悪を来すので、
治療効果の低下、多量輸血漿の必要性が生じ又、胸水の
貯留が生じると呼吸不全をもたらし、ひいては患者の悪
疫質の導入を速める等、癌の治療上重大な結末をもたら
す。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、炎症抑制
とプロテアーゼインヒビターの関連について種々検討し
た結果、大豆クニッツ (Kunitz）型トリプシンインヒビ
ター、とりわけその誘導体が、in vivo において炎症性
浮腫の抑制に著しい効果があることを見出した。また、
炎症における血管透過性増大と固形腫瘍における血管透
過性増大の機構が類似していること( 固形腫瘍及び炎症
部位における血管透過性亢進と血漿成分の漏出が類似)
に着目して種々検討する中で、該インヒビター及びその
誘導体が癌性胸・腹水貯留抑制にも効果を有すること、
即ち、該インヒビターが癌組織における血管透過性を強
く阻害し、腹水癌(Meth A, Sarcoma 180 )の系に於いて
上記阻害物質の連続投与によって、腹水の貯留を顕著に
抑えて、担癌マウスに延命効果をもたらすこと等を見出
し、癌治療上にも有益な薬剤になるとの知見を得、この
発明を完成したものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】即ち、この発明は、一
つは、大豆クニッツ（Kunitz) 型トリプシンインヒビタ
ーまたはその誘導体を活性成分とする癌性胸・腹水貯留
抑制剤及び炎症性浮腫亢進抑制剤であり、他の一つは、
大豆クニッツ (Kunitz）型トリプシンインヒビターまた
はその誘導体を活性成分とする制癌作用増強剤である。

【０００７】大豆トリプシンインヒビターは、分子量約
２万のクニッツ (Kunitz）型トリプシンインヒビターと
分子量約６千〜８千のボウマン─バーク（Bowman- Bir
k) 型トリプシンインヒビターに二大別される。それら
の基本的性質はMethods in Enzymology 19, 853 (197
0)、及び、「タン白質研究の新しい視点( 化学的研究を
中心として) 」第1738頁(1982)( 共立出版) 等によって
明らかにされており、その内代表的なクニッツ (Kunit
z）トリプシンインヒビターやボウマン─バーク（Bowma
n- Birk) インヒビターの構造はすでに決定されており
(Eur.J.Biochem.,32,417 (1973)、J. Biochem.74, 697
(1973) ) 、従って、それらの化学的、生物学的方法(
細胞培養、遺伝子組替等) による合成も今日可能であ
る。

【０００８】この発明の剤は、大豆クニッツ (Kunitz）
型トリプシンインヒビター( 以下KTI という) を活性成
分とするが、KTI は大豆由来のもの、及びこれを限定分
解して尚KTI 固有の活性を保持するもの、並びにこれら
を上記化学的、生物学的方法により合成して得たものを
包含する。

【０００９】大豆由来のKTI の調製方法は、すでにいく
つかの具体的方法が提案されていて、いずれの方法を採
用してもよいが、一般的には大豆, 脱脂大豆, 大豆ホエ
ーなどを原料にし、これらから、水性媒体または極性有
機溶剤( 例えばエタノール、アセトンなど) による抽
出、膜分離, 等電点沈澱、塩析等による濃縮、分画によ
って粗精製物を得、これをさらに、ゲル濾過、イオン交
換、物理的若しくは化学的吸着手段などによりさらに精
製された標品を得ることができ、その活性や純度も、公
知の方法例えばクニッツ(Kunitz)のカゼイン消化法[ 本
明細書での表記は、この方法で測定し、Sigma 社製トリ
プシン「タイプ-XI 」(7500 〜9000 BAEEUnit/mg の活
性蛋白) 1mg を阻害する量を1 Unitとした] やSDS 含有
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等により測定するこ
とができる。

【００１０】活性成分としての量は、精製度、投与方
法、残存活性により多少相違するが、1.5 〜2.5 Unit／
mgの活性を有するKTI 蛋白質重量に換算して、概ね腹腔
内投与の場合１〜3000mg／60kg体重の範囲、静脈注射の
場合１〜300mg ／60kg体重の範囲を目安として定めた含
量が適当である。

【００１１】誘導体は、蛋白質であるKTI の抗原性を低
下させ、また分解物質(SH-プロテアーゼなど) に対する
安定性を増し( 生体内半減期の改善) 、或いは疎水性を
賦与することにより両親媒性を増すといった一または二
以上の目的のために使用することができる。このような
誘導体は、KTI と、種々の修飾体、例えばスチレンマレ
イン酸無水物共重合体(SMA) 及びその部分エステル化
物、ポリエチレングライコール、ビニールエーテル共重
合体、ピラン、西独公開特許第315541号に例示のもの
等、との結合物、その他低分子の修飾体との結合物等が
挙げられ、これらとの結合方法は既知に属するが、上記
一または二以上の目的が達成されるものであればどの様
な方法によってもよい。例えば修飾体がSMA またはその
部分エステル化物の場合は、KTI のN-末端アミノ基乃至
リジン残基のε─アミノ基に対して中性乃至アルカリ性
溶液中で直接反応させ、ペプチド結合を形成する方法が
本発明者である前田らにより報告されている(Journal o
f Medicinal Chemistry, 28, 455-461,(1985))。

【００１２】本物質及びその誘導体は、局所的、経静脈
的、経動脈的、経粘膜的、経皮的、経口的な投与及び腹
腔内投与することが可能である。

【００１３】即ち、例えば静脈注射用の水溶性薬剤とし
て、KTI そのまま、又は生理食塩水、5%グルコース溶
液、若しくはその他の水溶性注射剤に溶解しての使用を
することができ、動脈注射用の油剤としてリピオドール
化した製剤としても使用することができ、その他、KTI
を溶解した水溶液を乳化剤を用いオリーブ油、中鎖脂肪
酸エステル、リノール酸エステル、大豆油、桐油等の油
脂と乳化しての使用、リポゾームの形態での使用も可能
である。

【００１４】KTI またはその誘導体は、自体制癌作用を
有する剤と併用することが出来る。自体制癌作用を有す
る剤としては、ネオカルチノスタン(NCS) 、スマンクス
[SMANCS:スチレンマレイン酸(SMA) 共重合体とネオカル
チノスタン(NCS) のアミノ基を介して結合させたもの]
、マイトマイシン( 商品名) 等の抗癌性抗生物質、5-F
u( 商品名) 等の代謝拮抗剤、ピシバニール( 商品名)
等の免疫賦活剤、又はその他の抗癌性薬剤を使用するこ
とができ、KTI との併用の態様としては、一製剤に加工
して、若しくは単味体を各々個別に投与する方法があげ
られる。

【００１５】

【作用】KTI は炎症性浮腫亢進抑制効果、及び癌性腹
水, 胸水貯留抑制効果を有し、結果として延命効果を示
す。KTI は、さらに、自体制癌作用を有する剤と併用す
ることにより、該剤の有する抗癌作用を増強する。これ
らの効果の生じる理由は完全には明らかではないが、炎
症性浮腫の場合に関与すると考えられるカリクレイン−
ブラジキニン系をin vivo においてKTI が効果的に阻止
し、ブラジキニンの発現による疼痛発生と血管透過性の
亢進を抑制すること、及び、癌組織の血管透過性増大に
同様の系が存在して血管透過性を抑制、即ち、該組織へ
の血漿蛋白質などの漏出が抑制され、胸水, 腹水の貯留
を抑制すること、並びに、該組織への血漿成分─栄養補
給が遮断され、抗癌剤の直接の作用力を高めるのではな
いかと推定される。又プロテアーゼによる癌細胞増殖促
進作用を一部には抑制している可能性がある。さらに、
KTI の分子量は約２万（誘導体はこれ以上）であるた
め、血管透過性の亢進していない正常組織への漏出は殆
どなく、ある程度血管透過性の亢進した組織への選択的
な透過・作用に寄与し、浮腫や癌組織の成長を抑制する
ことも推定される。また、炎症局所の浸出液（漏出液）
はリンパから回収されるが、腫瘍組織においてはリンパ
系がないので浸出した高分子は回収されずに長期間そこ
に留まると考えられ、この性質も患部への選択的作用に
有用であると考えられる。

【００１６】尚、癌組織への栄養供給の遮断は、物理的
塞栓療法による栄養供給抑制の考え方と類似するが、物
理的塞栓は屡々正常な組織までも壊す弊害があるのに比
べ、本発明剤ではこのような副作用は生じない。

【００１７】

【実施例】以下この発明の実施例を説明するが、例示は
説明用のものであって発明精神の限定を意図したもので
はない。実施例１（KTI の調製例) 低変性脱脂大豆から分離大豆蛋白を製造する過程で得ら
れる大豆ホエーを濃縮し、この濃縮物( 粗蛋白質含量5.
5%）１容に対し0.5 容のアセトンを加えて約１時間攪拌
し、遠心分離により得られた上清に対し、さらに1.5 容
のアセトンを加えて約１時間攪拌し、遠心分離して得ら
れた沈澱画分を、水に対して透析した。この透析液に１
／50量の0.5M- 燐酸ナトリウム緩衝液(pH7.0) を加え、
pHを7.0に調節し、DEAE- セルロースイオン交換カラム
に通して、該樹脂に吸着させ、次いで０〜0.4Mの直線食
塩濃度勾配を有する溶出液を、フラクションコレクター
により分画し、BBI 型トリプシンインヒビター又はKTI
に富む画分をさらに各々塩析濃縮し、( BBI 型トリプシ
ンインヒビターについてはCMセルロースイオン交換樹脂
でさらに精製し) 、各濃縮精製物を等電点沈澱後、凍結
乾燥してKTI 評品及びBBI 型トリプシンインヒビターを
得た。各評品の純度は、SDS 含有ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で、蛋白質中95% 以上であった。又、比活性
は前者が1.97Unit ／mg蛋白、後者が3.37 Unit ／mg蛋
白であった。実施例２（腹水貯留抑制及び延命効果）生後８週目の雌のddY-マウス（１群７匹）の腹腔内にSa
rcoma 180 懸濁液を50万セル／匹になるように移植し、
その日から生理食塩水１ccに対して上記調製例で得たKT
I 若しくはBBI 型トリプシンインヒビターを３mg溶解し
た水溶性薬剤又は溶解しない生理食塩水を１日、１匹あ
たり１ccづつ４日又は14日連続して腹腔内に投与し、そ
の間自由摂食・自由摂水させた。Sarcoma 180 を全く移
植しない無処置例も並行して実施した。

【００１８】この間の体重測定を行った結果を第１図
（14日間投与) 及び第２図（４日間投与) に示した。両
図に示された結果及び肉眼的観察により、KTI による体
重増加の抑制効果( 腹水貯留の抑制効果) が明らかに認
められ、無処置群との差異が殆ど無かったのに対して、
BBI 型トリプシンインヒビターによる該抑制効果は殆ど
認められなかった。

【００１９】さらに上記投与例での平均生存日数等は次
表の通りで、延命効果が認められた。

【００２０】

【表１】実施例３（部分ブチル化SMA と結合した誘導体の調製
例) 実施例１の方法で調製したKTI 300mgを、30ccの 0.5M
炭酸水素ナトリウム液に溶解し、部分ブチル化SMA(平均
分子量約2000) を150mg 加えて25℃で90分間攪拌した
後、グリシン溶液を加えて反応を停止した。このものの
残存活性は36.3%であり、TNBS法( 蛋白質, 核酸, 酵素,
18 (13), 1153-1159, (1973))にて測定した修飾された
アミノ基の個数は1.94個／分子であった。さらに炭酸水
素アンモニウム溶液に透析し、凍結乾燥してKTI のSMA
で修飾された誘導体 (KTI-SMA)を得た。実施例４（炎症性浮腫亢進抑制剤）実施例３で得た修飾したKTI-SMA を生理食塩水に溶解し
たものを被験薬とし、該被験薬又は生理食塩水と混合し
て調製した１％カラゲニン溶液 (KTI-SMA の含量は各々
5mg／cc, 又は15mg／cc) をSD系雄ラット( 平均体重 1
50g ± 5g 、１群５匹）に対して、0.1cc ／部位投与し
て炎症を惹起し、経時的に足容積を測定することによ
り、カラゲニン誘発足浮腫に対する抑制効果を調べた結
果は第３図の通りであった。

【００２１】同図に示されるように、炎症惹起後３時間
の時点において、KTI-SMA 15mg／cc投与群に顕著な炎症
性足浮腫抑制効果が認められた。

【００２２】尚、KTI-SMA に代えて実施例１で得た無修
飾のKTI 20mg／ccを使用したものの抑制効果はKTI-SMA
5mg／cc投与群と同程度の効果にとどまった。実施例５（制癌剤増強作用の効果）生後８週目の雌のｄｄＹ−マウス（１群10匹) の腹腔内
にSarcoma 180 懸濁液を 50 万 cell ／匹になるよう移
植し、その日から生理食塩水に対して前記調製例で得た
KTI 、ネオカルチノスタチン(NCS) 又は両者の混合物を
１日、１回７日間連続投与し、生理食塩水のみを投与し
た群をコントロールとした。実験期間中は自由摂食・自
由摂水させた。

【００２３】投与量及び、生存率（％）の推移を次表に
示した。

【００２４】

【表２】上表の結果が示すように、KTI は自ら延命効果を有する
のみならず、制癌剤 (NCS)の効果を高める相乗作用を有
することが認められた。

【００２５】

【発明の効果】以上説明したように、KTI 及びその誘導
体を有効成分とする剤は、炎症性浮腫の抑制及び癌性胸
水腹水の貯留抑制効果並びに制癌作用増強効果を有す
る。炎症性浮腫の抑制は浮腫による疼痛の発生または亢
進を未然に抑制し、胸水腹水の貯留抑制により、該貯留
による弊害例えば、患者の体力低下、治療効果の低下、
多量の輸血漿、呼吸不全、悪疫質の導入等を未然に防止
乃至抑制し、治療効果を高める等、延命させる効果があ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２における投与薬剤と体重増加（≒復水
貯留量）の関係を示すグラフである。

【図２】実施例２における投与薬剤と体重増加（≒復水
貯留量）の関係を示すグラフである。

【図３】実施例４における足浮腫の容積変化を示すグラ
フである。

【符号の説明】

図１中(1)(△).... 生理食塩水投与群（Sarcoma 180 担
癌対照) 、(2)(◇).... BBI トリプシンインヒビター投
与群、(3)(□).... KTI 投与群、(4)(○)....無処置群
( 非癌対照) 、 (白抜き矢印）.... 癌細胞移植日、(
↓).... 薬剤投与日。図２中(1)(○).... 生理食塩水投
与群（Sarcoma 180 担癌対照) 、(2)(△).... BBI トリ
プシンインヒビター投与群、(3)(□).... KTI 投与群、
（折破線).... 無処置群( 非癌対照) 、 (白抜き矢
印).... 癌細胞移植日、( ↓).... 薬剤投与日。図３
中、(1)(○).... 生理食塩水投与群、(2)(△).... KTI-
SMA 5mg ／cc投与群、(3)(□).... KTI-SMA 15mg／cc投
与群。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者高松清治大阪市大正区鶴橋１─13─10 (72)発明者下田忠久大阪府泉南市新家1315─30

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】大豆クニッツ (Kunitz）型トリプシンイン
ヒビターまたはその誘導体を活性成分とすることを特徴
とする制癌作用増強剤。