JPH07501830A - ピルビン酸イオンの投与方法及びピルビン酸イオン前駆物質の合成方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ピルビン酸イオンの投与方法及びピルビン酸イオン本発明は全般に、哺乳類にピ ルビン酸イオン（ｐｙｒｕｖａｔｅ）を投与する方法、及びピルビン酸イオンの 非塩前駆物質を合成する方法に係わる。

発明の背景 肥満症はアメリカ合衆国の成人のうちの２５％を越える人々が罹患する多因子疾 患である。ＵＳＡでは３．４００万〜５．０００万人の成人が肥満しており、こ れらの成人のうちの少な（とも５００万人が肥満症のための医学的処置を受けて いると推定される。肥満症の病因は、単純な過食から重度のホルモン平衡異常ま で様々であり得る。しかし、大部分の肥満症は恐らく、エネルギーの摂取及び利 用を調節する多くの因子同士の複雑な関係に起因する。

目的論的には、肥満した人間は食料供給が制限される時に生き残るだめの備えに おいてより優れているとも言え、なぜなら彼らはエネルギーをより効率的に利用 し得るからである。しかし、ＵＳＡでは食料はほとんど無制限に供給されるので 、エネルギー利用のそのような効率性が肥満症の原因になると考えられる。肥満 症は、心血管疾患、■型糖尿病、冠動脈疾患その他の慢性疾患に罹患する危険の 増大を伴う。例えば、ＵＳＡでは肥満者の■型糖尿病の診断例は６００万を上回 り、推定４００万例が未診断のままであると考えられる。

肥満者人口が太き（、また関連する諸問題が存在するので、肥満症研究、及び肥 満症の管理のための製品開発の分野で探究が為されているが、問題は依然として 存在する。

米国特許第４．３５１．８３５号には、哺乳類における体脂肪の蓄積をピルビン 酸イオンとジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）との混合物の経口投与によって防止 する方法が教示されている。

後から為されたラットでの付加的研究において、通常の食餌条件下でのピルビン 酸イオン及びＤＨＡの作用が調べられた。この研究ではラットに対照食餌か、ま たは炭水化物の一部をピルビン酸イオンとＨＡとの１：１混合物によって置き換 えた実験食餌を与え、その際前記混合物は総カロリー摂取量のうちの１５％を提 供した。実験食餌を与えられたラットは対照食餌を与えられたラットよりも体重 増加が少なく、その熱発生及びエネルギー消費の速度は大きかった。

実験食餌は、タンパク質含量にも水分含量にも大した影響を及ぼさずに体脂肪含 量を３２％低下させた。

同様に、別の研究ではヒトの■型糖尿病患者に５６ｇのピルビン酸イオン及びＤ ＨＡをｌ＝１混合物の形態で７日間投与し、その間糖耐性及び回転率を測定した 。空腹時血中グルコース濃度及びグルコース負荷試験後の最高グルコース濃度の 低下が観察された。

更に別の研究ではピルビン酸イオンとＤＨＡとの相対的有効性が評価された。こ の研究では肥満したＺｕｃｋｅｒラットを、食餌の種類に従って４グループに分 けた。１グループの食餌を対照とし、その他の食餌はそれぞれ次の特徴：　（ａ ）６％ピルビン酸イオン、（ｂ）６％ＤＩ＾、及び（Ｃ）６％ピルビン酸イオン ／ＤＭＡ　（１：　１）のうちのただ一つを有する半精製ラット食餌とした。幾 つかの生理学的変量を測定した。この研究の結論は、食餌にＤＨＡまたはピルビ ン酸イオン／ＤＩｌ＾を添加したことに起因する変化は通常、ピルビン酸イオン のみの添加に起因する変化はど太き（ないというものであった。実際、ＤＨＡま たはピルビン酸イオン／ＤＨ＾の添加に起因する変化はしばしば摂食制限（ｆｅ ｅｄ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）にか、または組み合わせられたピルビン酸イオ ンに帰せられ得る。

最後に、米国特許第４．５４８．９３７号には、食餌にピルビン酸イオンを添加 することによって体重増加を最小限に留める方法が開示されている。

上述の諸研究に基づき、実験データはピルビン酸イオンがラットにおける代謝変 量の変更に有効な化合物であることを示した。ピルビン酸（ｐｙｒｕｖｉｃ　ａ ｃｉｄ）としても知られるピルビン酸イオンは身体の通常の代謝物である。

有効量のピルビン酸イオンのヒトへの投与では、従来ピルビン酸イオンは液化ピ ルビン酸の形態でか、またはピルビン酸イオンの無機塩の形態で、例えばナトリ ウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩として供給するしかなかった点に問題が 存在する。上記塩に対する耐性は低いが、該塩の器官感覚受容性も低い。そのう え、ヒトでは、最大の効果を得るための適正なピルビン酸イオン量の実現に必要 な量の上記塩は被投与者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）の電解質レベルを、典型的食餌 に補助物質として添加される場合の安全かつ十分な推奨レベルの２〜６倍に高め る。液体ピルビン酸に関しては、この液体は強い酸性であり、身体を文字通り焼 く。酸性問題を稀釈によって解決しようとすると、ヒトの身体が許容可能レベル のピルビン酸イオンを経口摂取（ｉｎｇｅｓｔ）することは不可能となる。

このように、ヒトにピルビン酸イオンを投与する優れた方法の必要性が存在する ことは明らかである。また、ピルビン酸イオンの加水分解可能な前駆物質でピル ビン酸塩の形態でないものを合成する優れた方法の必要性が存在することも明ら かである。

発明の開示 本明細書に、哺乳類にピルビン酸イオンを投与する方法であって、ピルボアミド またはピルビル−アミノ酸の形態のピルビン酸イオン前駆物質を治療有効量で投 与することを含む方法を開示する。好ましくは、ピルビン酸イオン前駆物質は哺 乳類の食餌の２〜２０重量％を構成する。

本明細書には、空腹時血中グルコース負荷試験で測定される哺乳類のインシュリ ン抵抗性を改善する方法も開示してあり、この方法は空腹時血中グルコース負荷 試験実施前にピルビル−アミノ酸の形態のピルビン酸イオン前駆物質を治療有効 量で投与し、それによって空腹時血中グルコース負荷試験での血中グルコースレ ベルの維持に前記ピルビン酸イオン前駆物質を予め投与しなかった場合に示され るレベルより低いレベルのインシュリンしか必要とならないようにすることを含 む。好ましくは、ピルビン酸イオン前駆物質は哺乳類の食餌の２〜２０重量％を 構成する。

本明細書には、哺乳類における脂肪の蓄積を低減する方法も開示してあり、この 方法はピルビル−アミノ酸の形態のピルビン酸イオン前駆物質を治療有効量で投 与することを含む。

本明細書には、ピルビン酸イオン前駆物質のピルボアミド、ピルビル−グリシン 、ピルビル−アラニン、ピルビル−バリン、ピルビル−ロイシン及びピルビル− イソロイシンを合成する方法も開示しである。

本発明の一構成は、哺乳類にピルビン酸イオンを投与する有効な方法を提供する 。

本発明の別の構成は、塩形態以外のピルビン酸イオン前駆物質を合成する比較的 容易でかつコスト的に有効な方法に認められる。

本発明の他の構成及び利点は、以下の説明、実施例、及び添付した請求の範囲各 項から明らかであろう。

図面の簡単な説明 第１図は、ピルビン酸塩の経口摂取、並びに本発明の方法を用いたピルビン酸イ オン類似体の経口摂取が毎日の食物摂取に及ぼす影響を示すグラフである。

第２図は、ピルビン酸塩の経口摂取、並びに本発明の方法を用いたピルビン酸イ オン類似体の経口摂取が毎日の体重に及ぼす影響を示すグラフである。

第３図は、ピルビン酸塩及びピルビン酸イオン類似体が体重増加、体水含量及び 体脂肪含量に及ぼす影響を示すグラフである。

第４図は、様々なピルビン酸イオン前駆物質のガバーシュ後の所定期間にわたる 体内ピルビン酸イオン濃度を示すグラフである。

第５図及び第６図は、ピルビン酸塩及びピルビン酸イオン類似体の経口摂取がグ ルコース負荷試験後の脂肪質ＺＬＩｃｋｅｒラットのグルコースレベル及びイン シュリンレベルに及ぼす影響を示すグラフである。

発明の詳細な説明 本発明は、肥満した、または体重超過の哺乳類、及び■型糖尿病に罹患した哺乳 類によって用いられ得る食餌補助物質に係わる。本発明はまたピルビン酸イオン の、塩の形態でない前駆物質の合成にも係わる。

現時点ではピルビン酸イオンが肥満症、及び■型糖尿病に関連する諸問題の処理 に最も有効な化合物であると理論上考えられるが、■型糖尿病や肥満症の臨床管 理においてヒトにピルビン酸イオンを用いることは、これまで身体にピルビン酸 イオンを供給する唯一の実際的手段であったピルビン酸塩に関連する無機質負荷 の増大によって制限されてきた。ピルビン酸イオンは液体酸としても供給可能で あるが、液体酸は強い酸性であるので稀釈しなければならない。液体酸を許容可 能となるように十分稀釈した場合、十分なピルビン酸イオンを経口摂取するため にはあまりにも大量の液体を消費しなければならない。

表Ｉに、有効量（２８ｇ）のピルビン酸イオンをピルビン酸塩の形態で供給する ことに関連する電解質レベルの上昇を示す。塩は１種類のみ用いたり、複数種類 を組み合わせて用いたりした。

点−１ ＥＳＡＣＤＩ本本範囲　１．１００〜３．３００　１．８７５〜５．６２５　１ ．２００表Ｉに見えるように、ピルビン酸塩がどのように経口摂取されても電解 質レベルはヒトにお０て推奨されるレベルの２〜６倍に上昇する。

哺乳類にピルビン酸イオンを与え、もしく（よ哺乳類１こおいてピルビン酸イオ ンを発生させるべく、ピルビン酸イオンの加水分解可能な前駆物質であるピルボ アミドを製造する新規な合成を実現した新規な方法を提案する。以前のピルボア ミド合成は、ピルボニトリルの加水分解力＼、ランタシジンＡ（ｌａｎｔａｃｉ ｄｉｎ　Ａ）の酸加水分解か、また：′；！ラクトアミドの過マンガン酸塩酸化 によってｌ、Ｎ？こ。

提案する新規な、本発明に関連するピルボアミドの合成では、ピルビン酸ナトリ ウムと０化六オニ、”Ｉ５または塩化オキサリルとからの塩化ビルビルの用時生 成を用いた。生成した塩化ピルビルを温度０〜４０℃において１．１．１．３． ３．３−へキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）と反応させ、その後ジクロロメタ ン（ＤＣＭ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはジメチルホルムアミド（Ｄ ＭＦ）といった適当な溶媒の存在下にメタノールで処理してピルボアミドを生成 させた。ピルボアミドの収率は５０〜８０％であった。その後、塩化チオニルの 替わりに塩化オキサリルを用いれば収率が上昇し、かつ有色度のより低い副産物 が生成することを発見した。この発見によって、塩化ビルビル中間体を得る方法 が改善された。

ピルビン酸イオン類似体のピルボアミドとその新規な合成とは有用なピルビン酸 イオン源に関する問題を解決したと考えられたが、なぜならこの特定の合成によ って、最終的にピルビン酸無機塩を経口摂取しなくともよくなったからである。

むしろ驚いたことに、後から行なったラットでの研究において、用いた投与量で はラットは明らかにピルボアミドに対する耐性を示さないことが判明した。この 特定の試験グループのラットは僅少量の食物しか消費せず、またかなりの体重を 失ったが、これは僅少量の食物しか消費しなかったためで、何等かの望ましい理 由からではないと考えられた。ラットがピルビン酸イオンを含有する食餌を驚く ほど嫌悪する理由は完全には解明されず、更に研究及び試験を行なわなければな らなかった。

ピルボアミドは好ましいピルビン酸イオン類似体でないことが最初に確認された ので、他のピルビン酸イオン前駆物質を調べた。すると、加水分解可能でかつ塩 でない別のピルビン酸イオン前駆物質を合成し得ることが判明した。

例えば、ベンジルエステル保護法を介してビルビルーグリシンを合成する優れた 方法を発見した。通常のピルビル−グリシン合成方法は、オキシ塩化リンまたは ｐ−トルエンスルホニルクロリドをピルビン酸と反応させて塩化ピルビルを得る ことを含む。通常の合成法を用いて生成させたこの塩化ピルビルを、グリシンベ ンジルエステルヒドロクロリドと反応させてビルビル−グリシンベンジルエステ ルを生成させるか、またはピリジン中のグリシンと反応させてピルビル−グリシ ンを得る。ピルビル−グリシンベンジルエステルの収率は約３５％、ピルビル− グリシンの収率は約１２％であった。

上記の優れた合成方法は、ピルビン酸ナトリウムを塩化チオニルと、または好ま しくは塩化オキサリルと反応させて塩化ピルビルを得ることを含む。得られた塩 化ピルビルをグリシンベンジルエステルヒドロクロリドと反応させ、それによっ てピルビル−グリシンベンジルエステルを約８５％の収率で得る。このピルビル −グリシンベンジルエステルを水素化分解して、ピルビル−グリシンを約９０％ の収率で得る。この優れた方法を用いた場合の最終的なピルビル−グリシン収率 が通常の合成方法に関連付けられる収率より実質的に高いことは容易に理解でき る。この優れた方法を以下に説明する。

この合成方法では好ましくは、ピルビン酸ナトリウムの懸濁液に塩化チオニルま たは塩化オキサリルを添加して塩化ピルビルを得、これにグリシンベンジルエス テルヒドロクロリドの懸濁液を添加する。得られたスラリーをＮ−メチルモルホ リン溶液の添加の間冷部してピルビル−グリシンベンジルエステルを得る。ピル ビル−グリシンベンジルエステルは、加温、水の添加、分離、洗浄、脱水、蒸発 、沈澱、濾過及び再脱水の後に得られる。このピルビル−グリシンベンジルエス テルを溶媒及びパラジウム−炭触媒と共に水素圧約５Ｑｐｓｉの水素圧力容器に 、水素が消費されるように装填し、その後濾過、濃縮、沈澱、濾過及び脱水する とビルビル−グリシンが得られる。

更に好ましくは、ピルビン酸ナトリウムをジクロロメタン中に懸濁させた懸濁液 を機械的に攪拌し、これに塩化チオニルまたは塩化オキサリルを添加し、それに よってガスを発生させて塩化ビルビルを得る。塩化ピルビルをグリシンベンジル エステル溶液の滴下の間冷部し、室温に加温し、水を添加し、分離し、稀塩酸及 びブラインで洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、ジクロロメタンを蒸発させ、 沈澱を生起させ、濾過し、かつ再び脱水してビルビル−グリシンベンジルエステ ルを得る。得られたビルビル−グリシンベンジルエステルを酢酸エチル及び４〜 ２０％パラジウム−炭と共に水素圧約４０〜１５０ｐｓｉの水素圧力容器に、水 素が消費され、それによって加温、濾過、濃縮、沈澱、濾過及び脱水後にビルビ ル−グリシンが得られるように装填する。

上記ビルビル−グリシンベンジルエステルを合成するには、例えばグリシンベン ジルエステルヒドロクロリド（１８２ｇ：　０．９ＩＩｌｏｌ）をジクロロメタ ン（５００ｍｆ）中に懸濁させた懸濁液を撹拌し、これを室温においてＮ−メチ ルモルホリン（２２０ｍｌ；　２ｍｏｌ）に滴下し加える。約２時間後に溶液を 冷却し、沈澱した塩を溶液使用前に濾別して廃棄する。更に、ピルビン酸ナトリ ウム（１１０ｇ；　１■０１）をジクロロメタン（１１）中に懸濁させた懸濁液 を機械的に攪拌し、これに塩化オキサリル（１１０ｍｌＨ１ｍｏｌ）を−気に添 加する。約５時間後にガスの発生が終息する。淡黄色のスラリーを、上述のよう に製造したグリシンベンジルエステルヒドロクロリド溶液の滴下の間窒素雰囲気 下に保持して−２０〜−３０℃に冷却する。

その後、スラリーを室温に加温する。水（１１）を添加する。

下方の有機層を分離し、稀塩酸（３Ｘ　５０（１＋０、ブライン（２×２５０１ １）で洗浄し、最後に硫酸マグネシウムで脱水する。次にジクロロメタンを蒸発 させ、最後に沈澱が始まったらヘプタンをゆっくり添加して生成率を高める。砂 状の固体を濾別し、乾燥して恒量とする。

水素圧力容器に、ビルビル−グリシンベンジルエステル（１２０ｇ；　０．５１ ｍｏ１）と、酢酸エチル（４８０ｉｏと、４％パラジウム−炭（１２ｇ；　１０ 重量％）とを装填する。水素圧を約６０ｐｓｉに、温度を約４０℃に調節し、反 応物質を化学量論量の水素が消費されるまで攪拌する。その後、溶液を１．５μ ■ガラス繊維フイルターで濾過し、濃縮する。生成物が沈澱し始めたら、再びヘ プタンを添加して生成率を高める。沈澱物を濾別及び乾燥して、ビルビル−グリ シンである恒量の白色固体を得る。

本発明によるビルビル−アラニンまたはビルビル−グリシン合成方法は、ピルビ ン酸ナトリウムを塩化オキサリルと反応させて塩化ピルビルを得、次に塩化ピル ビルをアラニントリメチルシリルエステルヒドロクロリドの懸濁液と反応させて ビルビル−アラニントリメチルシリルエステルを得、その後ビルビル−アラニン トリメチルシリルエステルを加水分解してビルビル−アラニンを得る諸ステップ を含む。上記方法で合成したビルビル−アラニンはピルビン酸イオン前駆物質の ビルビル−アミノ酸として有用である。

本発明によるビルビル−バリン合成方法は、ピルビン酸ナトリウムを塩化オキサ リルと反応させて塩化ピルビルを得、次に塩化ピルビルをバリントリメチルシリ ルエステルヒドロクロリドの懸濁液と反応させてビルビル−バリントリメチルシ リルエステルを得、その後ピルビルーバリントリメチルンリルエステルを加水分 解してビルビル−バリンを得る諸ステップを含む。上述の手順を経て合成したビ ルビルーバ１〕ンはピルビン酸イオン前駆物質のビルビル−アミノ酸として有用 である。

本発明によるビルビル−ロイシン合成方法は、ピルビン酸ナトリウムを塩化オキ サリルと反応させて塩化ピルビルを得、次に塩化ピルビルをロイシントリメチル シリルエステルヒドロクロリドの懸濁液と反応させてビルビル−ロイシントリメ チルシリルエステルを得、その後ビルビル−ロイシントリメチルシリルエステル を加水分解してビルビル−ロイシンを得る諸ステップを含む。上述の手順を経て 合成したビルビル−ロイシンはピルビン酸イオン前駆物質のビルビル−アミノ酸 として有用である。

本発明によるビルビル−インロイシン合成方法は、ピルビン酸ナトリウムを塩化 オキサリルと反応させて塩化ピルビルを得、次に塩化ピルビルをイソロイシント リメチルシリルエステルヒドロクロリドの懸濁液と反応させてピルビルーイソロ イシントリメチルシリルエステルを得、その後ビルビル−イソロイシントリメチ ルシリルエステルを加水分解してビルビル−インロイシンを得る諸ステップを含 む。

上記方法で合成したビルビル−イソロイシンはピルビン酸イオン前駆物質のビル ビル−アミノ酸として有用である。

本発明によるビルビル−フェニルアラニン合成方法は、ピルビン酸ナトリウムを 塩化オキサリルと反応させて塩化ピルビルを得、次に塩化ピルビルをフェニルア ラニントリメチルシリルエステルヒドロクロリドの懸濁液と反応させてピルビル −フェニルアラニントリメチルシリルエステルを得、その後ピルビル−フェニル アラニントリメチルシリルエステルを加水分解してピルビル−フェニルアラニン を得る諸ステップを含む。上記方法で合成したピルビル−フェニルアラニンはピ ルビン酸イオン前駆物質のピルビル−アミノ酸として有用である。

ピルビン酸イオン前駆物質のピルボアミドの本発明による合成方法は、ピルビン 酸ナトリウムを塩化チオニルまたは塩化オキサリルと反応させて塩化ピルビルを 得ることにより塩化ピルビルを用意し、この塩化ピルビルを温度θ〜４０℃にお いて１．１．１．３．３．３−へキサメチルジンラザンと反応させ、その後溶媒 の存在下にメタノールで処理してピルボアミドを生成させる諸ステップを含む。

好ましくは溶媒は、非限定的にジクロロメタン、アセトニトリル、テトラヒドロ フラン及びジメチルホルムアミドから成る溶媒群の中から選択する。

例えばオキシ塩化リンや塩化チオニルを塩化オキサリルによって置き換えた優れ た合成方法で、他のピルビン酸イオン類似体を合成した。他の類似体の合成のそ の他のステ・ツブは、ピルビル−グリシンの合成のステップに対応する。

アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニンを含有する前 駆物質のピルビル−アミノ酸は当該アミノ酸のベンジルエステル塩酸塩を用いて 合成し得るが、前記塩酸塩に替えて各アミノ酸のトリメチルシリルエステルを用 いた方が好ましく合成できることを発見した。

次に、最も好ましいピルビル−グリシン合成方法を説明する。この方法は安価な 出発物質を用い、合成を１ステ・ツブで行ない、かつ本明細書に開示した他の方 法に比べて同等以上の生産レベルを示す。

上記した最も好ましいピルビル−グリシン合成方法の第一の例では、例えば２１ 容フラスコ（攪拌機、凝縮器、窒素）にグリシン（１５ｇ＋　０．２ｍｏｌ）、 無水テトラヒドロフラン（４００ｍｌ）及び塩化トリメチルシリル（２２ｇ；口 、　２１１０１）を装填した。

反応物質を還流下に４時間攪拌した。次に、溶液を冷却浴中で０℃に冷却した。

別に、０℃の塩化メチレン（４００ｍｌ）中のピルビン酸ナトリウム（２２ｇ； 　０．２ａ＋ｏｌ）に、塩化オキサ１ノル（２６ｇ；　０．２ｍｏｌ）を塩化メ チレン（４００ｍｌ）に溶解させた溶液を滴下し加えた。得られたスラリーを窒 素雰囲気下１こ２５℃で２時間攪拌した。沈澱した塩化ナトリウムを濾過によっ て除去し、濾液を０℃において上記グリシントリメチルシリルエステル溶液に添 加した。凝縮器を添加漏斗に取り替え、酸化プロピレン（２３ｇ；　０．４ｍｏ ｌ）を塩化メチレン（５０■ｔ）に溶解させた溶液を０℃において滴下し加えた 。得られた反応混合物を、透明となるまで２５℃で２時間にわたり攪拌した。メ タノール（８０■ｔ）を直ちに添加し、溶媒を蒸発させた。固体残留物（３６ｇ ）を酢酸エチル／ヘプタンから再晶出させて、融点８６〜８７℃の黄褐色固体（ １７ｇ；　５９％）を得た。

最も好ましいピルビル−グリシン合成方法の第二の例では、例えば２１容フラス コ（攪拌機、凝縮器、窒素）にグリシン（１５ｇ；　０．２ｍ＋０１）、無水ジ オキサン（４００冨ｌ）及び塩化トリメチルシリル（２２ｇ；　０．２ｍｏｌ） を装填した。反応物質を還流下に４時間攪拌した。次に、溶液を水浴中で０℃に 冷却した。

別のフラスコ内で、０℃において酢酸エチル（４００■ｌ）中のピルビン酸ナト リウム（２２ｇ：　０．２ｍｏｌ）に塩化オキサリル（２６ｇ；０、２ｍｏｌ） を添加した。得られたスラリーを窒素雰囲気下に２５℃で２時間攪拌した。沈澱 した塩化ナトリウムを濾過によって除去し、濾液を０℃において上記グリシント リメチルシリルエステル溶液に添加した。凝縮器を添加漏斗に取り替え、酸化プ ロピレン（２３ｇ；　０．４ｍｏｌ）を酢酸エチル（５０■ｔ）に溶解させた溶 液を０℃において滴下し加えた。得られた反応混合物を４０℃で２時間、及び２ ０℃で一晩攪拌した。メタノール（８０■ｔ）を直ちに添加し、溶媒を蒸発させ た。固体残留物（３４ｇ）を酢酸エチル／ヘプタンから再晶出させて、融点８７ ℃の黄褐色固体（２２ｇ；　７６％）を得た。

ピルビル−グリシンを１ステ・ツブで合成する最も好ましい方法は、２１容フラ スコ（空気攪拌機、凝縮器、窒素送入口）にグリシン（１５ｇ；　０６２１００ １）、無水アセトニトリル（八ＣＮ）（５００ｍｌ）及び塩化トリメチルシリル （３０，５寵−１０，２４■ｏｌ）を装填することを含む。反応物質を還流下に ３時間攪拌する。

次に、透明だが濁りも見える（ｃｌｅａｒ　ｔｕｒｂｉｄ）溶液を水浴中で５℃ に冷却し、直ちに酸化プロピレン（１００ｍυを添加する。

別のフラスコ内で、激しくガス抜きしなから０℃薯こおし１てＡＣＮ（５００ｍ ｌ）中のピルビン酸ナトリウム（２４，２ｇ；　０．２２■ｏｌ）ｌこ塩化オキ サリル（２１■ｔ；　０．２４■ｏｌ）を添加する。溶液を窒素雰囲気下に２５ ℃で３時間攪拌する。スラリーを５℃に冷却し、これを５℃の上記トリメチルシ リルエステル溶液に一気に添加する。塩化ナトリウムの濾過による除去（まこの 段階では行なわない。スラリーを５℃で約２時間攪拌し、その後２５０Ｃに加温 して一晩保持する。メタノール（８０ＩＯを直ちに添加し、塩を濾過によって除 去し、かつ３５℃より低い温度において溶媒を蒸発させる。残留物（約７４ｇ） を、酢酸エチル／ベンクン（１：　１）を用いてシリカ層（２００ｇ）でフラッ シュ濾過する。生成物を含有する両分を濃縮して固体塊（２６ｇ、　９Ｑ％）と する。クロロホルム／ヘプタン（１：　３；　１５０ｍＤから再晶出させて、融 点８７℃の黄褐色固体（２１，９ｇ；　７５％）を得る。ピルビル−グリシンの 再晶出は、凍結乾燥、噴霧乾燥またはマイクロ波真空乾燥など任意の適当操作を 用いて実現する。

この１ステップ合成には幾つかの利点が有り、（ａ）アミノ酸誘導体のピルビル 化の際に放出された酸の捕獲で僅かな熱しか発生されず、従って反応をより良好 に制御でき、また反応の間僅かな冷却しか必要でなく、（ｂ）副産物（即ちクロ ロプロパツール）を蒸発によって容易に除去し得、即ち他の方法で行なわれる生 成塩の水による排除（ａｑｕｅｏｕｓ　ｅｌｉ−ＩＩｌｉｎａｔｉｏｎ）を回避 でき、かつ（Ｃ）酸化プロピレンのコストは通常の有機塩基に比較して些少であ る。

本発明は以下の実施例を参照することによってより良く理解されようが、これら の実施例は説明のためにのみ提示してあり、本発明の請求の範囲を限定すると解 釈されるべきでない。

ラットに食餌補助物質として投与した成るピルビン酸イオン類似体即ちピルビル −グリシンの効力を測定するべく、次の試験を計画した。

８匹のラットを１グループとして複数の実験グループを形成した。試験期間が始 まる前の１週間、ラットを個別ケージに収容し、粉末状の対照食餌を与えてその 環境に順応させた。ラットが粉末状の食餌に馴染んだことは、体重の増加及び飼 料の摂取が４日以上変わらずに続くことによって確認した。第一のグループは、 最少量の食物を消費した実験グループに従い対飼養（ｐａｉｒ−ｆｅｄ）　Ｌ／ た、タンパク質２６％、脂質１２．１％及び炭水化物６２％（総ｋｃａｌ）の食 餌を与えるラットによって形成した。対照グループに与えた以外の各食餌は６％ のピルビン酸イオン（カロリーに基づく）を含有することを特徴とした。実験グ ループ１のラットには、スクロースの替わりに９％（重量に基づく）のピルビン 酸カルシウムを含有する対照食餌を与えた。実験グループ２のラットには、スク ロースの替わりに７．２％（重量に基づく）のピルボアミドを含有する対照食餌 を与えた。実験グループ３のラットには、スクロースの替わりに１２，２％（重 量に基づく）のピルビル−グリシンを含有する対照食餌を与えた。

４グループのいずれの食物鉢も、原則として毎日１回食餌で満たし直した。前日 の食物消費とラットの体重とを記録し、最少量を消費するグループに対しては動 物を対飼養した。ラットには当該ラット自身の食餌を８日間与え続けた。

次の表Ｈに、四つの試験グループそれぞれに関連する実際の成分を示す。

表■ 対照　ピルビン酸　ピルボアミド　ピルビル−カゼイン　２００　２００　２０ ０　２００メチオニン　３　３　３　３ 澱粉　２５０　２５０　２５０　２５０スクロース　３５８　３１０　２８６　 ２３６セルロース　５０　５０　５０　５０ トウモロコシ油　５０　５０　５０　５０ビタミン　１０　１０　１０　１０ コリン　２　２　２　２ 塩混合物　５　５　５　５ Ｃａ／ＰＯ４７２３０７２７２ ピルビン酸 カルシウム　０　９０　０　０ ピルボアミド　０　０　７２　０ ピルビル− グリシン　０　０　０　１２２ 合計　１０００　１０００　１０００　１０００第１図から知見され得るように 、対照グループ、ピルビン酸塩グループ及びピルビル−グリシングループの食物 摂取は総て多少とも類似し、特に４〜７日目の期間は似ていた。

しかし、先に検討したように、また第１図から知見され得るように、ピルボアミ ドを用いる食餌処理を施した場合の毎日の食物摂取はきわめて些少であった。

第２図から知見され得るように、対照グループの体重は約２０５グラムから約２ ３０グラムに増加した。一方、ピルビン酸塩を投与したグループは統計的にはる かに小さい体重増加を示した。しかし、先に指摘したようにピルビン酸の無機塩 をヒトに用いることは、電解質レベルが高くなるので排除される。この図からは 、ピルビル−グリシンを投与した試験グループも対照グループに比較して小さい 体重増加を示したことが知見され得る。最後に、ピルボアミドを投与した試験グ ループは急激な体重減少を示した。しかし、これはピルボアミドグループのラッ トが不十分な量の食物しか消費しなかったためであり、体重減少の原因は当初、 用いたレベルのピルボアミドに対する耐性が低かったためと考えられた。

上述のような短期試験結果に基づき、ピルビルーグリシンはピルビン酸塩の代替 物として優れた可能性を有すると判明し、なぜならピルビル−グリシンは生物学 的活性を示し、顕著な毒性を示さず、かつピルビン酸塩に関連付けられる過剰な 無機質負荷を化学的安定性は保ちつつ排除したからである。以前の研究において 、ピルビル−グリシンはカゼイン食餌中でピルビン酸の無機塩と同様に安定（３ ７℃で５日間での損失３％未満）であることが判明しており、一方ピルボアミド はより不安定であると考えられた（同じ条件下に損失７３％）。加えて、ピルビ ル−グリシンは模擬滅菌条件下にも安定であり（１２５℃で８分間での損失５％ 未満）、一方ピルボアミドの損失はより高い（同じ条件下に５０％を越える損失 ）。

実施例２−比較試験 比較試験においてピルビン酸塩及びピルビル−グリシンがラットの飼料摂取及び 体重増加に比較的長期にわたって及ぼす影響を、対照グループ、並びに食餌補助 物質としてピルビン酸塩を投与したグループ及びピルビル−グリシンを投与した グループについての試験を延長することによって調べた。

試験の８日目が過ぎてから、３グループそれぞれを１日当たり１５ｇのより低い レベルで飼養した。この試験の結果を表■に示す。

」Ｊ 対照　ピルビン酸塩　ピルビル−グリシン８〜２３日月　２２５　２２５　２２ ５０〜２３日目　３７７．１　３５７．２　３３６．６平均毎日摂取量（ｇ）　 １６．４　１５．５　１４．６８〜２３日目　５２．３　５０．２　４５．５０ 〜２３日目　８０　６４　５７．８ 平均毎日増加量Ｃｇ）３．４８　２．７８　２．５１開始体重（ｇ）　２０５． ４　２０５．６　２０２．３最終体重（ｇ）　２８５．５　２６９．６　２６０ ．１８日目から２３日目まででは体重増加が、ピルビル−グリシングループが最 少ではあるものの各グループ間ではるかに類似していた。ピルビル−グリシンを 用いる食餌処理を施したことによって、死体（ｃａｒｃａｓｓ）重量が１２％低 下し、腹膜後脂肪パッド重量が５０％減少し、かつ最も顕著な結果として、第３ 図に示したように総体脂肪率が低下した。実際のところ僅か３週間後に、ピルビ ル−グリシンを含有する処理食餌を与えたグループは他の実験グループに比較し て３０％の体脂肪含量低下を示した。

以前に行なわれた実験から、ラットの食餌へのピルビン酸イオン、またはＤＨ＾ を伴ったピルビン酸イオンの添加によって予測される体重増加が低減されること が判明している。本実験において、食餌へのピルビン酸塩の添加は体重増加に抑 制的な影響を及ぼしたが、死体組成（ＣａｒＣａＳＳｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ） には影響しなかった。ピルビン酸塩は死体組成に測定可能な影響を及ぼさなかっ たが、ピルビル−グリシンは体脂肪含量の低下に劇的に影響した。この相違は、 比較的短期間の飼養試験を実施した時顕著となる。脂肪含量の劇的変化にもかか わらず、脂肪無し体重（タンパク質）及び灰分のレベルに悪影響は無かった。実 際のところ、ピルビル−グリシンを投与したラットグループでは、タンパク質及 び灰分の体重に基づ（パーセンテージは上昇した。

ピルビル−グリシンの大きい影響についてどのような理由を考え得るか、明らか ではない。影響が大きいのはおそらく、（１）グリシンの付加がピルビン酸イオ ンの作用を相乗的に高めること、（２）ピルビル−グリシンがグリシンからもピ ルビン酸イオンからも独立した代謝作用を有すること、及び／または（３）ピル ビン酸イオンがグリシンとの結合により安定し、従って標的組織に対してより高 いレベルで放出されることの結果であろうという理論が成り立つ。

塩でないピルビン酸イオン類似体の経口摂取が血中のピルビン酸イオンレベルに 及ぼす実際の影響を評価する付加的試験を行なった。第４図に、ピルビン酸イオ ン、ピルビン酸イオン／グリシン混合物、ピルビル−グリシン、ピルビル−アラ ニン、ピルビル−ロイシン及びピルボアミドを投与したラットに関して、所定期 間にわたるピルビン酸イオンの濃度レベルを血液１リツトル当たりのミリモル数 で示す。この試験によって、ピルビル−グリシンのピルビン酸イオン前駆物質と しての有効性が確認できると考えられた。

第４図から知見され得るように、ピルビン酸イオンの投与は血液中のピルビン酸 イオンの濃度を上昇させた。同様に、未だ完全には解明されていない理由から、 ピルビン酸イオンをグリシンと共に経口摂取させても血液中のピルビン酸イオン の濃度は最終的に高くなった。従って、ピルビル−グリシンが経口摂取され、か つ分解されてピルビン酸イオン及びグリシンを生じ、それによってピルビン酸イ オン及びグリシンが測定できるようになった時、ピルビン酸イオンレベルの変化 を見て多少とも驚いた。即ち、ピルビル−グリシンはピルビン酸イオンをさほど 増加させず、かつグリシンをかなり増加させ、従ってピルビル−グリシンは、お そらく有効なピルビン酸イオン類似体のうちで最良ではないが許容可能な類似体 ではあることが明らかとなった。ピルビル−アラニン及びピルビル−ロイシンを 用いたその後の試験では、これら２種のピルビル−アミノ酸が実際上、より短期 間でより大量のピルビン酸イオンを身体に供給し得ることが判明した。

次に、ピルボアミド投与後の血中ピルビン酸イオン濃度のレベルについて試験し た。驚（べきことに、ピルビン酸イオン濃度は最も劇的に上昇した。第４図から 知見され得るように、１時間後のピルビン酸イオン濃度は他の類似体を経口摂取 させた場合と比較するとほぼ４倍の高さであった。この事態に基づき、以前の試 験でのピルボアミドに対する明らかな不耐性（ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ）はピル ボアミドの経口摂取が一切嫌悪されることに起因するのではなく、ピルボアミド がはるかに急速にピルビン酸イオンに変換され、従って所望の結果を得るのに類 似体の総経口摂取量がより僅かしか必要でないためであるという理論が成り立っ た。即ち、今や、実際に経口摂取され得るピルボアミドの量の減少が問題の最良 の解決をもたらすと考えられる。

実施例３−比較試験 肥満症及び■型糖尿病に関する問題を有するラット（脂肪質Ｚｕｃｋｅｒラット ）に投与した成るピルビン酸イオン類似体即ちピルビル−グリシンの有効性を確 認するべく、次の試験を計画した。上記ラットには、実施例１に述べたのと同じ 食餌を２１日間与えた。上記ラットは血中グルコースレベルの制御に困難を見出 しており、従って血中グルコースを正常に保つべく大量のインシュリンを生成さ せなければならない。

各食餌を２１日間与えた後、ピルビン酸塩を投与したラット及びピルビル−グリ シンを投与したラットでは空腹時インシュリンレベルが低下したが、空腹時血中 グルコースへの悪影響は認められなかった。この結果を第５図及び第６図に示す 。次に、これらのラットに、体重１ｋｇ当たり１ｇのグルコースのガバーシュに よってグルコース負荷試験を実施した。血中グルコースはいずれの処理グループ でも同様であったが、ピルビン酸塩を投与したグループ、及び特にピルビル−グ リシンを投与したグループのインシュリンレベルは対照食餌を与えたグループの ものより低かった。このことは、ピルビン酸塩及びピルビル−グリシンを投与し た脂肪質Ｚｕｃｋｅｒラットにおいてそのインシュリン耐性が低下したことを示 唆している。

本発明の食餌補助物質は、Ｒｏｓｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｃｏ１ｕｓ −ｂｕｓ、　０ｈｉｏによって販売されている栄養製品であるＥＭＳＵＲＥ（登 録商標）のような完全栄養中にその時々の都合に応じて、飲料に添加可能な食餌 補助物質として用いたり、錠剤の形態で消費され得る食餌補助物質として用いた りすることができる。その他の投与方法として、経小腸放出系、非経口放出系、 または他の経口放出系などが有る。同様に、好ましい用量レベルは所望の結果に 応じて食餌の０．５重量％から２０重量％まで様々となろう。

凹 ロ　ロ　０　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ■のトロ１寸の〜− フロントベージの続き （７２）発明者　パーレット、ニラキー・リンアメリカ合衆国、オハイオ・４３ ２０６、コロンバス、サウス・パール・ストリート・（７２）発明者　シポロ、 ケント・り一アメリカ合衆国、オハイオ・４３０８１、ウェスタービル、マーレ ーン・ドライブ・１５３（７２）発明者　ダーオン、マダツブ・クリシナアメリ カ合衆国、イリノイ・６００６０、マンダレイン、ノース・ハンチイントン・ド ライブ・１３３７ （７２）発明者　フービオン、ジョン・アンドレアメリカ合衆国、イリノイ・６ ００６１、バーノン・ヒルズ、ホブル・ブツシュ・レーン・３６９ （７２）発明者　ランゾール、ニドウィン・オービルアメリカ合衆国、イリノイ ・６００４８、リバテイビル、バトック・コート・７０７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳類にビルビン酸イオンを投与する方法であって、ピルポアミド及びピル ビル−アミノ酸化合物の中から選択した少なくとも１種のピルピン酸イオン前駆 物質を治療有効量で投与することを含む方法。 ２．ピルビル−アミノ酸化合物をピルビル−グリシン、ピルビルーアラニン、ピ ルビル−ロイシン、ピルビル−バリン、ピルビル−イソロイシン及びピルビル− フェニルアラニンの中から選択することを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．ピルピン酸イオン前駆物質が食餌の０．５〜２０重量％を構成することを特 徴とする請求項１に記載の方法。 ４．グルコース負荷試験で測定される哺乳類のインシュリン抵抗性を低下させる 方法であって、グルコース負荷試験実施前にピルポアミド及びピルビル−アミノ 酸化合物の中から選択した少なくとも１種のピルビン酸イオン前駆物質を治療有 効量で投与し、それによってグルコース負荷試験において前記ピルビン酸イオン 前駆物質を投与しなかった場合に現われるインシュリン抵抗性より低いインシュ リン抵抗性が現われるようにすることを含む方法。 ５．ピルビル−アミノ酸化合物をピルビル−グリシン、ピルビルーアラニン、ピ ルビル−ロイシン、ピルビル−バリン、ピルビル−イソロイシン及びピルビル− フェニルアラニンの中から選択することを特徴とする請求項４に記載の方法。 ６．ベンジルエステル保護法によってピルビル−グリシンを合成することを特徴 とする請求項５に記載の方法。 ７．ピルピン酸イオン前駆物質が食餌の０．５〜２０重量％を構成することを特 徴とする請求項４に記載の方法。 ８．哺乳類における体脂肪の蓄積を低渡する方法であって、ピルポアミドまたは ピルビル−アミノ酸化合物の形態のピルビン酸イオン前駆物質を治療有効量で投 与して体重の減少を誘起することを含む方法。 ９．ピルビル−アミノ酸化合物をピルビル−グリシン、ピルビルーアラニン、ピ ルビル−ロイシン、ピルビル−バリン、ピルビル−イソロイシン及びピルビル− フェニルアラニンの中から選択することを特徴とする請求項８に記載の方法。 ｍ．ベンジルエステル保護法によってピルビル−グリシンを合成することを特徴 とする請求項９に記載の方法。 １１．ピルピン酸イオン前駆物質が食餌の０．５〜２０重量％を構成することを 特徴とする請求項８に記載の方法。 １２．ピルビル−グリシンを合成する方法であって、（ａ）ピルピン酸ナトリウ ムを塩化チオニルまたは塩化オキサリルと反応させて塩化ピルビルを得るステッ プと、（ｂ）塩化ピルビルをグリシンベンジルエステルヒドロクロリドの懸濁液 と反応させてピルビル−グリシンベンジルエステルを得るステップと、 （ｃ）ピルビル−グリシンベンジルエステルを水素化分解してピルビル−グリシ ンを得るステップとを含む方法。 １３．（ｉ）前記塩化チオニルまたは塩化オキサリルを機械的に閣かくこう撹坂 拌したピルビン酸ナトリウムのジクロロメタン溶液に添加し、それによってガス を発生させて塩化ピルビルを得ること、（ｉｉ）グリシンベンジルエステルヒド ロクロリドの前記溶液を、グリシンベンジルエステルヒドロクロリド溶液のＮ− メチルモルホリンヘの添加によって得られるグリシンベンジルエステル溶液を沈 澱物が生じるように冷却し、生じた沈澱物を濾別して廃棄することによって製造 すること、（ｉｉｉ）前記塩化ピルビルを前記グリシンベンジルエステル溶液の 滴下の間冷却し、室温に加温し、水を添加し、分離し、稀塩酸及びブラインで洗 浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、ジクロロメタンを燕発させ、沈澱させ、濾過 し、かつ再び脱水してピルビル−グリシンベンジルエステルを得ること、及び（ ｉｖ）得られたピルビル−グリシンベンジルエステルを酢酸エチル及び２０％パ ラジウムー炭と共に水素圧約６０ｐｓｉの水素圧力容器に、水素が消費され、そ れによって加温、濾過、濃縮、沈澱、濾過及び脱水後にピルビル−グリシンが得 られるように装填することを特徴とする請求項２０に記載の方法。 １４．ピルポアミドを合成する方法であって、（ａ）ピルピン酸ナトリウムを塩 化チオニルまたは塩化オキサリルと反応させて塩化ピルビルを得るステップ、及 び（ｂ）塩化ピルビルを温度０〜４０℃において１，１，１，３，３，３−ヘキ サメチルジシラザンと反応させ、その後溶媒の存在下にメタノールで処理してピ ルポアミドを生成させるステップを含む方法。 １５．前記溶媒を、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジ オキサン及びジメチルホルムアミドを含む溶媒群の中から選択することを特徴と する請求項１４に記載の方法。 １６．ピルビル−アラニンを合成する方法であって、（ａ）ピルビン酸ナトリウ ムを塩化オキサリルと反応させて塩化ピルビルを得るステップ、 （ｂ）塩化ピルビルをアラニントリメチルシリルエステルの懸濁液と反応させて ピルビル−アラニントリメチルシリルエステルを得るステップ、及び （ｃ）ピルビル−アラニントリメチルシリルエステルを加水分解してピルビル− アラニンを得るステップを含む方法。 １７．ピルビル−バリンを合成する方法であって、（ａ）ピルビン酸ナトリウム を塩化オキサリルと反応させて塩化ピルビルを得るステップ、 （ｂ）塩化ピルビルをバリントリメチルシリルエステルの懸濁液と反応させてピ ルビル−バリントリメチルシリルエステルを得るステップ、及び （ｃ）ピルビル−バリントリメチルシリルエステルを加水分解してピルビル−バ リンを得るステップを含む方法。 １８．ピルビル−ロイシンを合成する方法であって、（ａ）ビルビン酸ナトリウ ムを塩化オキサリルと反応させて塩化ピルビルを得るステップ、 （ｂ）塩化ピルビルをロイシントリメチルシリルエステルの懸濁液と反応させて ピルビル−ロイシントリメチルシリルエステルを得るステップ、及び （ｃ）ピルビル−ロイシントリメチルシリルエステルを加水分解してピルビル− ロイシンを得るステップを含む方法。 １９．ピルビル−イソロイシンを合成する方法であって、（ａ）ピルビン酸ナト リウムを塩化オキサリルと反応させて塩化ピルビルを得るステップ、 （ｂ）塩化ピルビルをイソロイシントリメチルシリルエステルの懸濁液と反応さ せてピルビル−イソロイシントリメチルシリルエステルを得るステップ、及び（ ｃ）ピルビル−イソロイシントリメチルシリルエステルを加水分解してピルビル −イソロイシンを得るステップを含む方法。 ２０．ピルビル−フェニルアラニンを合成する方法であって、（ａ）ピルビン酸 ナトリウムを塩化オキサリルと反応させて塩化ピルビルを得るステップ、 （ｂ）塩化ピルビルをフェニルアラニントリメチルシリルエステルの懸濁液と反 応させてピルビル−フェニルアラニントリメチルシリルエステルを得るステップ 、及び（ｃ）ピルビル−フェニルアラニントリメチルシリルエステルを水素化分 解してピルビル−フェニルアラニンを得るステップ を含む方法。 ２１．ピルビル−グリシンを合成する方法であって、（ａ）グリシンと、無水テ トラヒドロフランと、塩化トリメチルシリルとを混合して第一の溶液を製造し、 この第一の溶液を撹拌し、その後０℃以下の温度に冷却するステップ、 （ｂ）ピルピン酸ナトリウムと、塩化オキサリルと、塩化メチレンとを混合して 第二の溶液を製造し、この第二の溶液を０℃以下の温度において窒素雰囲気下に 撹拌し、沈澱した塩化ナトリウムを濾過により除去するステップ、（ｃ）第二の 溶液の濃液を第一の溶液と混合して反応混合物を製造し、この反応混合物を透明 になるまで撹拌するステップ、及び （ｄ）反応混合物にメタノールを添加するステップを含む方法。 ２２．ピルビル−グリシンを合成する方法であって、（ａ）グリシンと、無水ア セトニトリルと、塩化トリメチルシリルとを混合して第一の溶液を製造し、この 第一の溶液を撹拌し、その後約５℃の温度に調節するステップ、（ｂ）アセトニ トリル中で塩化オキサリルとピルピン酸ナトリウムとを混合して第二の溶液を製 造し、この第二の溶液を撹拌し、その後約５℃の温度に調節するステップ、（ｃ ）第一の溶液と第二の溶液とを混合してスラリーを製造し、このスラリーを撹拌 し、スラリーの温度を約２５℃に調節するステップ、及び （ｄ）スラリーにメタノールを添加し、かつスラリーから塩を濾別するステップ を含む方法。 ２３．前記塩を、酢酸エチル／ヘプタンを用いてシリカ層で濾過し、その後ピル ビル−グリシンを再結晶させるステップ（ｅ）も含むことを特徴とする請求項２ ２に記載の方法。