JPH07501059A - 多量体ヘモグロビンの生成法及び使用法 - Google Patents

多量体ヘモグロビンの生成法及び使用法

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JPH07501059A JP5508788A JP50878893A JPH07501059A JP H07501059 A JPH07501059 A JP H07501059A JP 5508788 A JP5508788 A JP 5508788A JP 50878893 A JP50878893 A JP 50878893A JP H07501059 A JPH07501059 A JP H07501059A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多量体ヘモグロビンの生成法及び使用法本出願は、（ａ）　１９８９年６月３０ 日出願の１．＋）ｑｋｅｒとＨｏｆｆＩＩＩａｎの米国特許出願第０７／３４９ ６２３「ジアルファ及びジベータグロビン様ポリペプチドならびにその使用法」 、（ｂ）　１９８９年７月１３日出願の５ｔｅｔｌｅｒとＷａｇｅｎｂａｃｈの 米国特許出願第０７／３７４１１６号「形質転換された酵母細胞によるヒトヘモ グロビンの生成法」、（ｃ）　１９８９年５月１０日出願のｆｌｌｏｆｆｎａｎ 、　Ｌｏｏｋｅｒ、　Ｒｏｓｅｎｄａｈｌおよび５ｔｅｔｌｅｒの米国特許出願 第０７／３４９６２３号「α−グロビンおよびβ−グロビンのポリジストロニッ ク共発現法および生物学的に活性な四量体ヘモグロビンのインビボ合成法」の一 部継続出願である１９９０年５月１０日出願のＰＣＴ／ＵＳ９０１０２６５４の 国内段階出願である１９９１年４月１日出願の一部継続出願第０７／６７１７０ ７号の一部継続出願の１９９１年１１月８日出願の一部継続出願第０７／７８０ １７９号の一部継続出願であって、上記全ての出願はソマトジエンインコーホレ ーテッドか所有している。
関連する出願 １９８８年５月１０日出願のＨｏｆｆＩ［ＩａｎとＮａｇａｉの米国特許出願第 ０７／１９４３３８号であ、って現在ソマトジエンインコーホレーテッドか所有 する米国特許第５０２８５８８号は、代用血液としての低酸素親和性ヘモグロビ ンその他の突然変異ヘモグロビンの使用法に関し、また非赤芽細胞中のαグロビ ンおよびβグロビンの発現にも関する。１９８９年１２月１日出願のＦｌｏｆｆ ＩＩＩａｎとＮａｇａｉの米国特許出願第０７／４４３９５０号は、ある種の追 加的ジシステインヘモグロビン突然変異体につき開示しており、第０７／１９４ ３３８号の一部継続出願となっている。Ａｎｄｅｒｓｏｎらの１９９１年１１月 ８日出願に係る米国特許出願第［）７／７８９１７７号「薬物運搬剤としてのヘ モグロビン」は、患者に薬物を運搬する手段としてヘモグロビンと薬物との接合 を利　。
用する方法につき開示する。
発明の背景 本発明は遺伝子融合または化学的架橋により２個または３個以上のリンクされた 偽四量体からなる多量体［ｍｕＬｔｉｍｅｒｉｃｌのヘモグロビン様タンパク質 に関する。
背景技術 Ａ、ヘモグロビンの構造および機能 ヘモグロビン（ｌｌｇｂ）は血液の酸素運搬成分である。ヘモグロビンは赤血球 （ＲＢＣ）と呼ばれる小さい脱核細胞内にあって血流中を循環している。ヘモグ ロビンは連結した４個のポリペプチド鎖からなるタンパク質で、ヘムと呼ばれる 補欠分子族をもっている。赤血球はヘモグロビンをしてその還元された官能的形 態に維持することに役立っている。ヘムの鉄原子は酸化反応に敏感だが赤血球中 の２つの酵素系、つまりシトクロムｂ５およびグルタチオン還元系、のうちの１ つによって再度還元され得る。
ヘモグロビンの構造はよくしられている。ここにはＢｕｎｎとＦ。
面（Ｗ、Ｂ、　５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏ、ペンシルバニア州フィラデルフィア１ ９８６年）およびＦｅｒｍｉとＰｅｒｕｔｚの「ヘモグロビンとミオグロビン」 、またＰｈ１ｌｌｉｐｓとＲｉｃｈａｒｄｓの生物学的分子構造地図（Ｃ１ａｒ ｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ：　１９８１年）を引用して本書の内容に取り込むもの とする。
平均的おとなの溶血物の約９２％はＨｇｂＡ（２本のα鎖と２本のβ鎖でなるか らα２β２と記される。）が占める。その他のヘモグロビンとしてはＨｇｂ　Ａ ２（α２δ２）、Ｈｇｂ　Ａｈａ、　Ｈｇｂ　Ａ＋ｈ、　Ｈｇｂ　Ａ＋１．希少 種のＨｇｂ　ＦＣａ　２７２）、Ｈｇｂ　Ｇｏｗｅｒ−１（ゼータ２、ε２）、 ｔｌｇｂＧｏｗｅｒ−２（（１２、ε２）、Ｈｇｂ　Ｐｏｒｔｌａｎｄ（ゼータ ２．７　ｚ）、Ｈｇｂ　Ｈ（β、）およびＨｇｂ　Ｂａｒｔ（γ４）が知られて いる。これらはｆｌｇｂ　Ａとは異なるポリペプチド鎖を選択する所から区別さ れる。
ポリペプチドの一次構造は、そのアミノ酸配列、ならびに個々のアミノ酸の側鎖 の何らかの修飾上の違いによって確定される。「ノーマルな」ヒトヘモグロビン のαグロビンポリペプチド鎖とβグロビンポリペプチド鎖両者のアミノ酸配列を 表１に示した。たくさんの突然変異体もまた知られているが、いくつかの突然変 異体につき表４００に同定しである。野生型α鎖は１４１個のアミノ酸からなる 。ヘム（フェロプロトポルフィリン■）グループの鉄原子は町８７（近位：プロ クシマルヒスチジン）のイミダシルに共有結合する。アポヘモグロビンはヘムの ないヘモグロビン類似体であって、αβグロビンニ量体として大量に存在する。
ポリペプチド鎖のセグメント［ｓｅｇｍｅｎｔ］は２つの共通のコンフォメーシ ョン、αヘリックスとβプリーツシート、の１つの中に畳み込まれて安定化され る。その生の状態ではヘモグロビン分子の約７５％がαヘリカルである。αヘリ カルセグメントは鎖を比較的ゆるやかにするセグメントによって分割されている 。各鎖のαヘリカルセグメントを文字［１ｅｔｔｅｒｓ］によって識別すること は従来から行われている。例えばα鎖のプロクシマルヒスチジンはＦ８である（ ヘリックスＦの残基８）。非ヘリカルセグメントは、どちらのヘリカルセグメン トにつながっているかを示す文字対によって識別される。こうして非ヘリカルセ グメントＢＣはへリックスＢとへリックスＣとの間に存在することになる。ある 特定のヘモグロビン鎖の２つの変異種［ｖａｒｉａｎｔｓ］を比較した場合、構 造的相同性［５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｈｏｍｏｌｏｇｉｅｓ］を見つけようとし て探すと、そのヘリカルセグメントを整列させることができるであろう。アミノ 酸配列および平均的ヒトヘモグロビンＡ。のα鎖およびβ鎖のヘリカル残基の表 記法につい、てはＢｕｎｎとＦｏｒｇｅｔの上記文献および本明細書の表１を参 照されたい。
ヘモグロビン分子の三次構造は直線的配列とは遠く離れたアミノ酸残基の立体的 関係に関するが、四次構造はサブユニット（鎖）がまとめてパックされているそ のされ方に関する。ヘモグロビン分子の三次と四次の構造はヘモグロビン結晶の Ｘ線回折分析によって判別できるが、これは当該分子の原子の三次元的位置関係 を計算することをすら可能にする。
その酸素化されていない［ｕｎｏｘｙｇｅｎａｔｅｄ］　（ｒデオキシ」または 「緊張した［ｔｅｏｓｅ］　ＪのＥＴ」）状態では、ヘモグロビンＡ（（Ｚｌ、 Ｇ２、β１およびβ２）のサブユニットは二重対称軸のある四面体［ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎｌを形成する。この対称軸は水が満ちた「中央部の凹み」に降りて いる。サブユニットはファンデルワールス力、水素結合およびイオンの相互作用 （あるいは塩橋）により互いに反応しあう。α１β１およびα２β２のインター フェイスは酸素化生比較的固定的に維持される。反面、α１β２（およびα２β １）のインターフェイスにはかなりのフラックス（流動性）がある。その酸素化 した（「オキシ」または［ゆるんだ［ｒｅｌａｘｅｄ］　Ｊの「Ｒ」）状態では 相互のサブユニットの距離は広がる。
生のオキシヘモグロビンと生のデオキシヘモグロビンの三次および四次構造は、 殆どの非水素原子が０．５Ａあるいはそれ以上の精度で位置決めてきるほどよ（ 知られている。ヒトデオキシヘモグロビンについてはＦｅｒｍｉらのＪ、　Ｍｏ １．　Ｂｉｏｌ、　１７５：１５９（１９８４）及び、ヒトオキシヘモグロビン については５ｈａａｎａｎのＪ。
１１ｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１７１：３１　（１９８３）を参照のこと。
ノーマルなヘモグロビンはβ９３（β９）、β１１２（Ｇ１４）およびα１０４ （Ｇｌｌ）にシスティンを有している。後２者の位置は共にオキシおよびデオキ シ状態中に深く埋め込まれている。それらはα１βｌインターフェイス近くにあ る。しかしオキシ形のβ９３はＳＨ試薬に反応する。
生ヒトヘモグロビンは分離したヘムフリーのαβグロビンとヘミンから完全に再 構成されている。好ましくはヘムがαグロビンのサブユニットにまず添加される のがよい。ヘムの結合したαグロビンは次にヘムフリーのβサブユニットに複合 する。
そして最後に、半分満したグロビンニ量体にヘムを添加し、四量体ヘモグロビン が得られる。Ｙｉｐら、ＰＮＡＳ　（米国）、７４：　６４−６８（１９７７） 。
ヒトαグロビン遺伝子およびβグロビン遺伝子は各々、染色体１６及び１１に存 在する。１７２で後述するＢｕｎｎとＦｏｒｇｅｔを参照されたい。両遺伝子と もクローニングされ配列決定されている。
ＬｉｅｂｈａｂｅｒらのＰＮＡＳ７７：　７０５４−５８　（１９８０）　（（ ＺグロビンゲノムＤＮＡ）ＨＭａｔｏｔｔａら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、 　２５２：　５０４０−５３　（１９７７）　（βグロビンｃＤＮＡ）；　Ｌａ ｗｎらＣｅ１１．２１：６４７　（１９８０）　（βグロビンゲノムＤＮＡ） ヘモグロビンはヘモグロビン分子の４つのサブユニット（ＨｇｂＡの場合は２つ のαグロビンと２つのβグロビン）によって協同的に酸素と結合するが、この協 同性は効果的な酸素運搬を大いに促進するものとなっている。いわゆるヘム間相 互作用によってもたらされる協同性は、ヘモグロビンをしてその酸素親和性を変 化させることを可能にする。ヘモグロビンはＩｌｇｂ　１モル当たり酸素４モル まで可逆的に結合する。
酸素運搬化合物は、酸素解離曲線として知られる手段によってよく比較される。
この曲線は所定の酸素運搬体［ａ　ｇｉｖｅｎ　ｏｘｙｇｅｎ　ｃａｒｒｉｅｒ ］について、酸素飽和ないし酸素量［ｃｏｎｔｅｎｔｌが酸素分圧に対してなす グラフを描いたとき得られる曲線である。
Ｅｌｇｂにとっては、Ｓ字形（シグモイド）相関に従った、分圧とともに増加す る飽和率である。Ｐｒｏは酸素運搬液が酸素と半分飽和したときに示す分圧であ る。したがってこれは酸素結合親和性の測定値となり、高ければ高いほどそれだ けゆるやかに酸素が保持されていることを示すことになる。
酸素運搬液の酸素解離曲線が、全血のβ５（＋より低いＰ、。であるときは「左 寄り」と呼ばれる。
ヘモグロビンの酸素親和性は２．３−ジフオスホグリセリン酸（２゜３−ＤＰＧ ）、塩素イオンおよび水素イオンが存在するときは低下する。呼吸組織［ｒｅｓ ｐｉｒｉｎｇ　ｔｉｓｓｕｅ］は二酸化炭素を血液中に放出し血液のｐＨを下げ る（つまり水素イオン濃度を高める）、そしてこれによって酸素をヘモグロビン から解離させ、個々の細胞中に酸素が分散することを可能にする。
ヘモグロビンの酸素親和性を変化させる能力は、酸素の身体への運搬効率を高め るものであるが、代謝生成物２．３−ＤＰＧの有無に左右される。赤血球中には ２．３−ＤＰＧがヘモグロビン濃度とほぼ同じ濃度で存在している。２．　ａ− ｔｉｐＧがないときは、［従来の［ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ］　Ｊヘモグロビ ンは酸素と非常に強固に結合するので、呼吸組織にほとんど酸素を放出しない。
老化した赤血球は血漿中に少量のフリーなヘモグロビンを放出するが、そこでフ リーなヘモグロビンはスキャベンジングタンパク質であるハプトグロブリンに急 速に結合されていく。ヘモグロビン−ハプトグロブリン複合体は血液から除去さ れ肝臓と肝臓によって分解される。
単離されたαグロブリン鎖は単量体で、高い酸素親和性を示すかもちろんサブユ ニットの協同性を欠如している。単離されたβグロブリン鎖は集合［ａｇｇｒｅ ｇａｔｅ］　Ｌ、てβ４四量体（ＨｂＨ）を形成する。β、四量体は高いか非協 同性の酸素親和性を有する。
Ｂ９代用血液、一般論 献血血液で患者に輸血することは常に実行できるものでもない。こうした状況下 では赤血球代用物を使用することが好ましい。しかし産物は、赤血球がしている のと同じくらい効果的に酸素を輸送するものでなければならない（デキストラン やアルブミンのような「血漿拡張剤」は酸素を輸送しない）。これまでよく研究 されている代用物の２タイプはヘモグロビン溶液とフルオロカーボンエマルジョ ン［ｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｎ　ｅｍｕｌｓｉｏｎｓｌである。
上述したことから判断して、血流中に直接注射されたフリーな生ヘモグロビンＡ は体内中を循環する酸素の効果的な輸送を支持するものではないことか明らかで ある。必須のアロステリックレギュレータ２．３−ＤＰＧは、ヘモグロビンをし て静脈の酸素圧［Ｏｘｙｇｅｎ　ｔｅｎｓｉｏｎ］において大量の酸素を放出て きるに十分な濃度で血漿中に存在していない。
しかしそれにも拘わらず従来のヘモグロビン溶液はＲＢＣ代用物として使用され てきた。ヘモグロビン溶液を調製する古典的方法では日付の古くなった血液を使 用して行われる。赤血球を溶解し細胞片［ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄｅｂｒｉｓ］を 除去し、できるだけ［ストローマ（血球基質）のないヘモグロビンＪ　（ＳＦＨ ）を残すようにする。
しかしこの方法にはいくつかの根本的問題がある。というのは第一に、溶液は、 大規模生産を困難にするような厄介で長時間かかる過程を経ることなく赤血球膜 の毒性成分のないものにしなければならないことである。ＤｅＶｅｎｕｔｏ　［ 代用血液としてのヘモグロビン溶液の評価Ｊ　Ｓｕｒ　ｅｒｙ、　Ｇ　ｎｅｃｏ ｌｏ　ａｎｄ　０ｂｓｔｅｔ亘到１４９・４１７−４３６（１９７９）参照。
第二に、予想された通り、かかる溶液は全血より「左寄り」（低いＰｓｏ）であ る。Ｇｏｕｌｄら「赤血球代用物としての重合されたピリドキシレートされたヘ モグロビン溶液ＪＡｎｎ、Ｅｍｅｒｇ、　Ｍｅｄ。
１５：　１４１６−１４１９　（１９８６年１２月３日）。その結果酸素親和性 は組織内に十分な酸素をおろすには高すぎるものとなる。ＢｅｎｅｓｃｂとＢｅ ｎｅｓｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　ｔｉｅｓ、　ＣｏＩ［Ｉ ｍ、、２６：１６２−１６７　（１９６７）第三に、５ＦＩＩは循環系では限ら れた半減期しかもっていない。
これはオキシＩ（ｇｂが、糸球体濾液により血液から急速に消滅し循環するハプ トグロブリンに結合していく二量体（αβ）中に部分的に解離するからである。
大量の可溶性ヘモグロビンかその循環系中に導入された場合には、二量体の糸球 体濾過によってタンパク質になり、鉄か腎臓障害を起こし得るように腎臓に付着 することとなる。Ｂｕｎｎ、　Ｈ，Ｆ、ら（１９６９）　ｒヘモグロビンＩに対 する腎臓の作用Ｊ　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１２９：９０９−９２３；　Ｂ ｏｎｎ、　Ｈ，Ｆ。
及びＪ、Ｈ，Ｊａｎｄｌ；　（１９６９）　ｒヘモグロビン■に対する腎臓の作 用Ｊ　Ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１２９：９２５− ９３４；　Ｌｅｅ、　Ｒ，Ｌ、ら（１９８９）「超純ストローマフリーの重合の 子ウシヘモグロビン溶液：腎臓障害の評価（代用血液）Ｊ　Ｊ、　Ｓｕｒｇｉｃ ａｌ　Ｒｅｓ、　４７：４０７−４１１；　Ｆｅｏｌａ、　Ｍ、ら（１９９０） 　ｒヘモグロビン溶液の腎孟障害［ｎｅｐｂｒｏｔｏｘｉｃｉｔ幻Ｊ　ＢｉｏＩ ｌ］ａｔ、Ａｒｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ａｒｔ、Ｏｒｇ、、１８（２）：２３３−２４ ９；　Ｔａｎ。
３、　Ｉ：、とＪ、　Ｔ、Ｆ、　Ｗｏｎｇ　（１９８８）　ｒラットにおけるス トローマフリーヘモグロビンによる腎臓機能の回復Ｊ　Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ ｎ、　Ｍｅｄ、　１１１　：１８９−１９３゜ 最後に、ＳＦＨは高いコロイド浸透圧（ＣＯＰ）を有する。したがってパックさ れた赤血球ユニットと同じ酸素運搬能を有するドーズ［ｄｏｓｅｌ　（投与量） でのＳＦＨの投与は、高い浸透圧（６０■■ｇ）が細胞から血流へと水分の大量 流入を引き起こし、もって患者の組織を脱水するおそれがあるから好ましくない 。こうしたおそれはＳＦＨのドーズを約６〜８ｇ＋ｎ　Ｈｇｂ／ｄｉの最終濃度 にするような限界がある。
所望のＰＳＯを得ようとして研究者たちは２．３−ＤＰＧをヘモグロビン溶液中 に添加してみた。しかし残念なことに２．３−ＤＰＧは急速に循環から消えてい った。そこで研究者たちはほかの有機リン酸塩、特にピリドキシルリン酸を試し てみた。２．３−ＤＰＧ同様、これらの合成物は二つのβ鎖のＮ末端間に塩橋を 形成することによってＩｌｇｂの「Ｔ状態」を安定させた。　ピリドキシル化さ れたヘモグロビン［ｐｙｒｉｄｏｘｙｌａｔｅｄ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ］はＳ ＦＨの１０ｔｏｒｒおよび全血の２８ｔｏｒｒに対し、２０〜２２ｔｏｒｒのＰ ５（＋を有していた。これはＳＦＨに対する改良一点であり、また、ピリドキシ ル化されたＨｇｂは全血に対して「高い親和性」を保持する。
Ｃ３自然発生システィン置換を有するヘモグロビン突然変異体（非重合） ノーマルなヘモグロビンＡ０のアミノ酸残基かシスティン残基に置換されたヒト ヘモグロビンの自然に発生する突然変異体については僅かな数か知られている。
ヘモグロビンナイシェリアでは、突然変異体はα８ｉＳｅｒ−Ｃｙｓ内のジスル フィドが野生型Ｆ９（９３）βシスティンとＩ（Ｃ２（１４５）βてＴｙｒを置 き換えることによって導入されるシスティンとの間に形成される。Ｇｒｅｅｒら 、Ｎａｔｕｒｅ　［Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏ　ｙ　、　２３０：２６１．−２６４　 （１９７１）ヘモグロビンＮｕｎｏｂｉｋｉ　（β１４１　Ｄｒｇ−Ｃｙｓ）も 非重合システィン置換を特徴とする。Ｗｂ　Ｒａ１ｎｉｅｒおよびＨｂ　Ｎｕｎ ｏｂｉｋｉの両者とも、新規のシスティン残基は四量体の表面にある。
Ｄ、自然発生的重合すなわち重合ヘモグロビン分子間（第１四量体の第２四量体 への）ジスルフィド結合の形成の結果とし７て重合する３つのその他のヒト突然 変異体か知られている。ヘモグロビンＰｏｒｔｏ　Ａｌｅｇｒｅ中には、Ａ６　 （９）βのＳｅｔがシスティンに変えられるが、このシスティン残基は外を向い ているため、自発的重合か起こりジスルフィド結合によりリンクされた３つのＰ ｏｒｔｏ　Ａｌｅｇｒｅ四量体で１２量体［ｄｏｄｅｃａｍｅｒ］の形成が行わ れる。へ量体［ｏｃｔａｍｅｒ］もＰｏｒｔｏ　Ａｌｅｇｒｅヘモグロビンとノ ーマルなヘモグロビンとの１・１混合体から調製された。
Ｔｏｎｄｏ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　３４２：１ ５−２０　（１９７４）；　Ｔｏｎｄｏ。
Ａｎ、Ａｃａｄ、Ｂｒａｓ、Ｃｒ、、５９：２４３−２５１　（１９８７）。
ヘモグロビンミシシッピーはＳｅｒ　ＣＤ３（４４）βがシスティンに置換され ている点に特徴がある。患者のへモライセート［ｈｅｏｏｌｙ３ａｔｅｓ］　（ 溶血物）をゲル濾過カラムクロマトグラフィにがけ、空隙（ホイド）容量の４８ ．８％で溶出された。分子量排除［ｍ０１ｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｅｘｃ ｌｕｓｉｏｎ］は約６００ｋＤだったから、ヘモグロビンミシシッピーポリマー は１０あるいはそれ以上のヘモグロビン四量体からできているらしいことが示唆 された。Ａｄａｍｓら、Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｏ、１１（５）：４３５−４５２　 （１９８７）β８３（ＥＦ７）Ｇｌｙ→Ｃｙｓ突然変異がヘモグロビンＴａ　Ｌ ｉの特徴テする。この突然変異体は澱粉ゲル電気泳動で緩慢に移動しており、ポ リマーであることを示唆している。
マウス高分子ヘモグロビンについての報告かある。ＢＡＬＢ／ｃＪマウスにおい て、β鎖のＮＨ２末端（マウスのβ−１３）近くに活性なシスティン残基がある 。このマウス突然変異体は、同様にβ鎖のＡ−ヘリックスにシスティン残基を有 するヘモグロビンＰＯｒｔＯＡｌｅｇｒｅと対比されている。へ量体形成は最も よく見られるものである。しかし各四量体は各々のβ鎖に１つづつ、２つの余分 なシスティン残基を有しており、これらが異なる四量体に反応するのかもしれな い、［これが何故へ景体より大きい集塊が生ずるのかを物語っているＪ　Ｂｅｎ ａｖｅｎｔｕｒａ　ａｎｄ　Ｒｉｇｇｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ１１４９：８００− ８０２　（１９６７）；　Ｒｉｇｇｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　１４７：６２１− ６２３　（１９６５）Ｍａｃａｕｅｓはまた重合ヘモグロビン変異種［ｖａｒｉ ａｎｔ］につき開示している。Ｔａｋｅｎａｋａら、Ｂｉｏｐｃｈｅｃ、　Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　４９２：４３３−４４４　（１９７７）；　ｌ５ｈ ｉＩｏｏｔｏら、Ｊ、Ａｎｔｈｒｏｐ、Ｓｏｃ、Ｎ１ｐｐｏｎ、　８３（３）： ２３両生類および爬虫類はともに重合ヘモグロビン［ｐｏｌｙｗ＋ｅｒｉｚｉｎ ｇ　ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ］を有している。例えばウシガエル［ｂｕｌｌｆｒ ｏｇｌには、ヘモグロビン「成分Ｃ」は四量体間のジスルフィド結合形成により 重合する。これはα鎖のシスティン残基に主に依存して行われるものと言われて いる。Ｔａｍら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩＩ＋、、２６１：８ミミズ［ｅａ ｒｔｈｗｏｒｍｌ（Ｌｕｍｂｒｉｃｕｓ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）の細胞外ヘモ グロビンは複雑な構造をしている。１２個のサブユニツトがあり、各々は構造［ ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ］　（ａ　ｂ　ｃ　ｄ　）　２の二量体となっている。
ここでａＳｂ、ｃ、およびｄとはヘムを含有する主たる鎖である。α鎖、ｂ鎖、 α鎖はジスルフィド結合による三量体を形成する。全分子は１９２のヘム含有鎖 と１２の非ヘム鎖とからなり、分子量３８００ｋＤ、ｉである。その他の無を椎 動物のヘモグロビンも大きな多サブユニットのタンパク質である。
塩水エビ［ｂｒｉｎｅ　ｓｈｒｉｗ＋ｐ］Ａｒｔｅｍｉａは９つの遺伝子的に融 合されたグロビンサブユニットのある３つの高分子ヘモグロビンを産生する。Ｍ ａｎｎｉｎｇ、ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４８：６５３　（１９９０）　これらは ２つの異なるサブユニット型ａ及びｂβを不特定に結合することで形成される。
８つのサブユニット間リンカ−のうち６つは長さが１２残基で、１つは１１残基 、もう１つは１４残基である。
Ｅ１人工的に架橋されたヘモグロビン（非重合）鎖を特異的に化学架橋すること によって改変される。Ｗａｌｄｅｒ。
Ｕ、Ｓ、４，６００．５３１　ａｎｄ　４，５９８，０６４；　５ｎｙｄｅｒら 、ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）　８４：　７２８０−８４　（１９８７）；　Ｃｈａｔ ｅｒｊｅｅら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、２６１　：９９２７−３７（ １９８６）　β鎖も化学的に架橋された。Ｋａｖａｎａｕｇｈら、Ｂｉｏｃｈｅ ｉｉｓｔｒｙ、　２７：　１８０４−８　（１９８８）　Ｋａｖａｎａｕｇｈは βＮ末端同士がＴ状態では１６ＡＲ状態では２０λ離れていることを発見した。
当然のことながら、Ｔ状態ヘモグロビンのＮ末端間にＤＩＤＳ橋［ａ　ＤＩＤＳ 　ｂｒｉｄｇｅｌを導入することはＲ状態への移行の障害となり、ゆえに当該分 子の０２親和性を低下させる。Ｋａｖａｎａｕｇｈ類似体は好ましい酸素結合特 性および腎臓浄化特性を有するが、これもまた低い回収率でしか得ることができ ない。
ＨｏｆｆＩＩａｎとＮａｇａｉ　ＵＳＰ　５．０２８．５８８はヘモグロビンの Ｔ状態がシスティン残基以外の残基に代わるシスティン残基からもたらされるサ ブユニット間（四量体内ではなく）のジスルフィド架橋によって安定化され得る ことを示唆している。特＆ｑ好ましい架橋はβＧｌｙ　Ｃｙｓをａ　Ｇ１？（Ａ ｌａ−Ｃｙｓ）またはＧ１８（Ａｌａ−Ｃｙｓ）のいずれかと結合させたもので ある。
Ｆ１人工的に架橋されたヘモグロビン（重合）Ｂｏｎｓｅｎ、　ＵＳＰ　４，０ ０１，４０１、　口ＳＰ　４，００１，２００、　及び　ＵＳＰ　４．０５３， ５９０はすべて赤血球由来のヘモグロビンの化学的架橋による重合に関する。そ こでは架橋は二官能性あるいは多官能性の架橋剤、特にグロビン鎖の露出したア ミノ基と反応するものに補助されて達成されている。架橋反応の結果は共有結合 により架橋された集塊の多分散組成物である。
Ｂｏｎｈａｒｄ、口ＳＰ　４．３３６．２４８はヘモグロビン分子相互の、ある いはアルブミンのような血清タンパク質との化学的架橋について開示している。
ＢｏｎｈａｒｄＳＵＳＰ　４．７７７、２４４は、アゾメチン結合［ａｚｏｍｅ ｔｂｉｎ　ｂｏｎｄ］を安定化するため還元剤を添加することによって貯蔵中に さらに重合される傾向にある先行技術のジアルデヒド架橋のヘモグロビンを安定 化する方法を試みている。
Ｂｕｃｃｉ、ＵＳＰ　４．５８４．１３０はｃｏｌ、２で次のように言っている 。「ポリヘモグロビン反応産物は大きさ及び形状の異なるさまざまな分子種［ａ ＋ｏｌｅｃｕｌａｒ　５ｐｅｃｉｅｓ］の不均一な混合体である。それらの分子 量は６４．５００から６００．０００ダルトンである。不均一な混合体から個々 の分子種を分離することは事実上不可能である。また、ポリヘモグロビンを使え ばインビボ保持時間をより長く得ることができるが、酸素親和性はストローマの ないヘモグロビンのものより高い」と。
Ｔｙｅ、　ＵＳＰ　４，５２９．．１７９によれば次の通りである。［大半の研 究者はヘモグロビンのランダムな分子間架橋ポリマーを形成することを選んだ、 というのは６５．０００ダルトンの四量体が糸球体４．。
によって濾過されると彼らは信じたからである。通常、ヘモグロビン分子の表面 にあるリシンのアミノ基はゲルタールアルデヒド［ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄ ｅｌあるいはサブエリミダート［ｓｕｂｅｒｉｍｉｄａｔｅ］のような二官能性 の反応物と結び付く。種々のへモグロビンポリマーを作る無数の異なる分子間又 は分子内架橋を得ることができるように反応できるのはヘモグロビン四量体１個 につき４２個のリジンである。ランダムな重合［ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏ口 ］は制御が困難で１ポリマーにつき２ないし１０の四量体を生ずるにすぎない。
しかしまだ誰も構造および機能の多様性を確立する分析的方途を標準化していな い。重合されたピリドキシル化［ｐｙｒｉｄｏｘｙｌａｔｅｄ］ヘモグロビンは 非常に化学的に不均一で、薬剤として研究することが無理である。
Ｇ、融合遺伝子とタンパク質、一般論 遺伝子は第１の遺伝子の終止コドンを除去し、それを第２の遺伝子に位相が合う ように付加することによって融合することかできる。遺伝子の一部もまた融合す ることができ、位相を維持するスペーサーＤＮＡをそれら融合された配列間に介 在させてもよい。融合遺伝子の産物は、ポリジストロニックオペロンによって発 現されるような複数のポリペプチドではなく、１つのポリペプチドである。いろ いろな遺伝子がさまざまな目的のため重合されている。このようにＧ１１ｂｅｒ ｔ、　Ｕ、Ｓ、　４，３３８，３９７はラットプレプロインシュリン遺伝子をＥ 、　Ｃｏ１１ペニシリン遺伝子のフラグメントの後に挿入した。彼の目的は融合 遺伝子の発現産物を分泌するようにＥ、　ｃｏｌｉ形質転換体を仕向けることで ある。
免疫原キャリアタンパク質に既に接合されて非抗原ポリペプチドか発現されるよ うに、融合された遺伝子も調製された。　２つの別々のＤＮＡ配列をつなげるた めリンカ−ＤＮＡ配列を利用することは公知である。これらのリンカ−はＤＮＡ 開裂（または切断）のための制限部位を提供するため、あるいはコードされた融 合タンパク質またはそのフラグメントを精製するのを促進するという特殊な性質 を有するペプチドをコードするために使用される。例えばＲｕｔｔｅｒｓ口、Ｓ 、　４，７６９，３２６を参照せよ。
Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６４：５２６０−６ ８　（１９８９）１９はＣｕＺｎスーパーオキシドジスムターゼの類似体を調製 した。各ジスムターゼ分子は２つの同一なサブユニットの二量体で、銅イオンと 錫イオンはサブユニットにリガンドされている。この二量体のＣｕＺｎスーパー オキシドジスムターゼ中の相互反応は非常に強烈なのでサブユニットは酵素を不 活性化させることなしには分離されていない。これらの酵素は免疫グロブリンと かなりな程度までコンフォメーション上の類似性か認められている。Ｈａｌｌｅ ｗｅｌｌらは２つのヒトスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子を直接に、または １９残基のヒト免疫グロブリンＩｇＡ１ヒンジ領域［ｈｉｎｇｅ　ｒｅｇｉｏｎ ］をコートするＤＮＡと共に結合し、形質転換した宿主中でこれらの融合遺伝子 を発現させた。直接結合した遺伝子を発現させようとして、あるプラスミド分子 中にあるタンデム遺伝子の１つを除去する組換えが行われた。■ａｉｌｅｗｅｌ ｌらは直接の結合は二量体をひすませ、疎水性領域をさらすことになり、その結 果毒性効果を有するもの吉なるという仮説を立てた。
これは遺伝子欠失への選択圧をもたらすものとなろう。ＩｇＡ１リンカ−構造に は何らの組換えも見られなかった。
Ｈｏｆｆｍａｎら、ＷＯ３８１０９１７９は、細菌および酵母におけるヘモグロ ビンならびにその類似体の生産について記述している。１成分のポリペプチド鎖 がペプチド結合によって共有結合された２つのαグロビンアミノ酸配列または２ つのβグロビンアミノ酸配列からなるヘモグロビンタンパク質を含む、そこに開 示された類似体は、好ましくは１つまたは２つ以上のアミノ酸の中間的リンカ− を介して、枝分かれすることなく存在している。ノーマルなヘモグロビンでは、 αグロビンサブユニットとβグロビンサブユニットは共有結合していない。
発明の概要 本発明は２つまたは３つ以上の四量体もしくは偽四量体が共有結合しているマル チメリックなヘモグロビン様タンパク質に関する。共有結合した四量体の対の間 では、共有結合は、異なるポリペプチド鎖の２つのシスティン残基間での架橋の 形式、または１つの四量体のグロビン様ドメインの「多カルボキシ」［ｃａｒｂ ｏｘｙ　ｍｏｓｔ］残基ともう１つの四量体の同様のドメインの［多アミノ且ａ ｍｉｎｏ　Ｉ［１ｏｓｔ］残基とを結合するペプチドリンカ−の形式をとり得る 。
好ましくはマルチメリックなヘモグロビン様タンパク質含有組成物は少なくとも ５０％の単分散体［ｌ０ｏｏｏｄｉｓｐｅｒｓｅ］であること、より好ましくは ９５％の単分散体であることがよい。
天然源から精製されたフリーなヘモグロビンは、分子量を増加させることによっ て半減期を延ばすため、また膨張圧を減少させるため、化学的架橋によって重合 され得るか、かかる調整は全て不均一でしかない。単分散性は精製を精励するこ とによって初めて達成され得るものでしかない。
本発明はヘモグロビン四量体の重合の程度を厳格に制御する手段を提供するもの である。多量体形成を厳格に制御できる能力は最終製品の純度および特性を格段 に高め微量成分の有害な反応の発生を抑制するであろう。またより一層単分散な 組成物は臨床効果においてより高い安定性を示すであろうことが予想される。
ヘモグロビンはまた、同じ又は異なる宿主細胞中でαグロビン遺伝子およびβグ ロビン遺伝子を発現させ、発現したα、βグロビンをヘムと組合せることにより 生成され得る。適切なｃｙＳコドン突然変異を上記グロビン遺伝子中に導入すれ ば架橋したマルチメリックなヘモグロビンを生成することができるが、発現物質 は一般に単分散体でないのが通常である。ヘモグロビンは２つのαグロビンサブ ユニットと２つのβグロビンサブユニットとからできている。両αグロビンサブ ユニットは１つのαグロビン遺伝子から天然に発現され、また両βグロビンサブ ユニットは１つのβグロビン遺伝子から天然に発現される。このようにもし１つ のＣｙｓコドン置換を含有する１つのαグロビン遺伝子が発現されるなら、組合 わされた四量体は各々架橋可能なＣｙｓを１つづつ有する２つのαグロビンサブ ユニットを含有することになろう。１つのＣｙｓは第２の四量体に架橋すること かでき、他のＣｙｓは第３のものに架橋することができるから、より高次のオリ ゴマーを形成することになる。
本発明の１実施例でマルチメリックなタンパク質とは、本質的に共有結合した２ つの四量体からなるへ量体となっている。
無用な重合反応を回避するため、各四量体は関与するシスティン残基を１つしか もっておらず、そのチオール基は（酸化条件下でジスルフィド結合して）相互に 反応するか、チオール反応する架橋剤と反応して、架橋をなす。
２つのグロビン様ドメインを有する１つのポリペプチドをコードする融合遺伝子 は、もたらされる偽二量体ポリペプチドの他の部分はほぼ同一の２つのドメイン のうちの１つのみにおいて外部に架橋可能なＣｙｓをもたらすように突然変異さ れる。次にこの偽二量体は相捕的［ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ］サブユニット と組合［ａｓｓｅｍｂｌｅｄ］わされて１つのシスティンのみしかもたない四量 体を形成する。そして最後にかかる四量体２つを架橋させて、好ましくは本質的 に単分散形の、へ量体を得る。
例えば１２量体のような高次の多量体［ｍｕｌｔｉｍｅｒ］を形成することが必 要なら、各々が外部と架橋可能である１つのシスティンを有する成分たる偽四量 体が、血流中で適切な半減期を有する多機能架橋剤の反応部位に各々共有結合に より付着する。
２つまたは３つ以上の偽四量体を架橋して多量体ヘモグロビンを得ることをせず に多量体へそグロビンを得る別の方法は、多量体ヘモグロビンの成分たる偽四量 体全部が分有する１つの偽オリゴマー中にそれら偽四量体のサブユニットを結合 することである。例えば８つのαグロビン様ドメインからなるペブチ合した偽へ 量体ポリペプチドが、８つの個々のβグロビン様サブユニットと組合わさって４ つの四量体［ｔｅｔｒａ−ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ］ヒトヘモグロビン様タンパク 質を形成する。高次の多量体は適切な偽オリゴマーを発現させてそれを相補的単 量体サブユニットと組合わせるだけで調製することができる。
遺伝子融合された偽オリゴマーバックボーンのある多量体ヘモグロビンの調製は 化学的架橋に伴う欠点を回避するものである。後者は非効率的で、ヘモグロビン 溶液の脱酸素を必要とし、競合反応［ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ　ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ］を避けるため（例えばイノシトール６リン酸又は２．３−ＤＰＧのような）別 の分子の存在を必要上記した実施例では、外部に架橋可能なシスティンの数を１ つの四量体につき１つに制限することによって本質的に単分散の多量体ヘモグロ ビンを得ることができる。しかし１つが外来の［ｆｏｒｅｉｇｎ］四量体に架橋 した後、他の外来の四量体がもとの四量体の残りのシスティンに架橋することを 立体的に妨げられるように配置されているのであれば、１つの回置体当たり１つ 以上の外部的に架橋可能なシスティンをもつことは可能である。
本発明の多量体タンパク質は、特に重合が高いレベルで行われているときは、浸 出［ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ］および解離したサブユニットのインビボの糸 球体濾過を減少させることによって、天然のヒトヘモグロビンに比へ組換えヘモ グロビンの半減期を延命することができる。巨大分子サイズの［ＩＩａｃｒｏｃ ｏｌｅｃｕｌａｒ　５ｉｚｅ］機能としての半減期の研究は、他の巨大分子は勿 論、増大されたサイズと化学的に架橋されたＨｂの増大された循環半減期との間 に相関関係があることを示している。好ましくはヒトにおいて、半減期が少なく とも１　ｇｍ／ｋｇｍ体重で１ドーズ当たり９時間を超えるものがよい。これは 匹敵するドーズを投与されたラットには約３時間の半減期に相当すると考えられ る。
四量体のハプトグロビン結合部位が全体的または部分的にふさがれるようにする ために、血管的保持もまた四量体の架橋部位を加工することによって促進される 。ハプトグロビン結合を立体的に妨げるため、あるいは静電気的に反発するがク ロスリンクを減少させる薬剤のアプローチを立体的に妨げるため、独自の突然変 異をさせてもよい。
本発明の多量体タンパク質はまた膨張圧を上げることができる。というのはオー ダーｎのポリ装置体当たりの酸素結合ヘム群の数は回置体当たりｎ倍の数である がらである。サイズとは無関係にポリ四量体Ｈｂ溶液中のヘム群の所与の濃度に 対する膨張圧は四量体Ｈｂ中に含有のヘムの等モル溶液のそれの１／ｎ倍である と考えられる。こうした膨張圧効果があるため、血流［ｂｌｏａｄ　ｓｔｒｅａ ｍ］へ導入されるフリーな四量体Ｈｂの最大濃度は体積ベースで本来の（インタ クトな）　［１ｎｔａｃｔ］赤血球中に通常運搬されているｕｂ濃度より低い。
したがって膨張圧を減少させることは、代用血液の体積当たりの酸素運搬能を増 大させるのに有益なのである。
好ましい実施例では、全血の酸素結合特性に近づくように、１または２以上のグ ロビン様ドメインは溶液中のヘモグロビン類似体の酸素結合親和性を減少させる 突然変異を含有している。
図面の簡単な説明 図１　プラスミドｐｓＧＥ１．　ＩＦ５　このプラスミドにはｐＴＡＣプロモー ターと１つのジアルファグロビンと１つのβグロビンをコードする遺伝子を有す るポリジストロニックオペロンがある。
またこのプラスミドはテトラサイクリンとアンピシリン耐性遺伝子および１ａｃ Ｉ遺伝子ももっている。
図２は（ｄｅｓ−Ｖａｌ）−α−（Ｇｌｙ）−ａ及びｄｅｓ−Ｖａｌβグロビン を発現させるのに好ましい合成遺伝子の配列（配列番号１）である。
この遺伝子はｐｓＧＥｌ、　１Ｅ４に保持されている。ＡはＳｈｌｎｅ−Ｄｅ１ ｇａｒｎＯリポソーム結合部位（配列番号１．２）を含む領域で、オクタペプチ ド（Ｍｅｔ、　、　、　Ｇｌｕ）を発現する配列を示す。（配列番号２５）は共 同翻訳カップラー［ａ　ｃｏｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｃｏｕｐｌｅｒｌとして 機能するもので、２つの殆ど同一なαグロビン様ポリペプチドと介在するＧｌｙ −ｃｉｙリンカ−をコードする配列である。最初のαグロビン配列は［ｅｅｔ− ＬｅｕＪで始まるが、これは人工的なメチオニンを有していること、成熟αグロ ビンの通常の最初の残基であるバリンが除かれており、第二の残基、ロイシンが ら続けられていることを意味する。残基は１から１４１まで番号を付けられてい る（配列番号２６）。第２のαグロビン配列はアンダーラインされたｒＧＩｙ− Ｇ１ｙＪリンカ−のすぐ後がらｒｅａｌ−ＬｅｕＪで始まる。残基は１′から１ ４１゛と番号付けされる（配列番号２７）。
開始コドンと終止コドンにはアンダーラインがされている。旦はｄｅｓ−Ｖａｌ βグロビンのコート配列を有する類似体領域（ＰｓｔｌからＨｉｎｄＩＩＩまで ）を示す。β残基は１がら１４６（配列番号２８）に番号付けされている。Δ及 び旦はＰｓｔ　Ｉ部位で結合され１つのポリシストローニックオペロンを形成す る。
３文字のアミノ酸コードが単独にアンダーラインされているときはその残基が架 橋可能な部位を提供するＸａａ−＋Ｃｙｓ突然変異のための潜在的部位であるこ とを示す。この突然変異は非対称的になされなければならない、つまりジアルフ ァがジベータ遺伝子かの１領域でのみなされ、四量体１つ当たり１つだけの架橋 か付くようにされなければならない。一方図２で、そうした部位はα遺伝子の第 １のコピーにのみマークされているが、そうされずに第２のコピーにのみマーク したものでも変わりはない。便宜上、適当なβグロビン突然変異部位にもマーク されている。しかしこれらの突然変異はジベータグロビン遺伝子の１βグロビン にのみ行われなわれなければならない。
二重にアンダーラインされたアミノ酸は２つのジスルフィド結合（またはサブユ ニットごとに）の形成が立体的に妨げられ得る部位をコートするもので、ジアル ファまたはジベータ構造の利用が不必要となる。
ハプトグロビン結合を阻止する突然変異の候補部位となる残基はボックスで囲ま れている。
図３は偽へ量体Ｈｇｂの１形式を表す模式図で、へ量体ヘモグロビンは非対称的 シアルファＨｇｂの２分子をリンクまたは架橋することで形成されている。
図４Ａは４つ、図４Ｂは６つのＨｇｂ四量体を結合するのに適切な捩られたコイ ル架橋を示す。図４０は４らせん束の平面図で結合部位にマークが付けられてい るものを示す。
図５はどのようなシスティン突然変異がサブユニットの遺伝子的融合なしにへ量 体形成するのに都合がよいかを示す概略図好適な実施例の詳細な説明 定事 ヘモグロビンはヘム（フェロプロトポルフィリン■）を含何するタンパク質て呼 吸面（皮膚、エラ、気管、肺など）で酸素と結合し、その酸素を内部組織へ運ぶ もので、そこで酸素は放出され代謝に使われる。性質上低い分子量のヘモグロビ ン（１６〜１２０キロダルトン）は循環赤血球に囲まれる傾向が強く、大きな高 分子ヘモグロビンは血液リンパの血液中を自由に循環する。
特許請求の範囲の記載に資するためヘモグロビン様タンパク質は次の性質を有す るタンパク質とする。
（ａ）代用血液として臨床的に有用となるに十分なほど血液中に溶解すること。
（ｂ）生理学的条件下で可逆的に酸素に結合すること。
（ｃ）各ポリペプチド鎖は少なくとも１つのグロビン様ドメイン（後で定義する ）を有していること。
（ｄ）各グロビン様ドメインはヘム補欠群［ａ　ｈｅｍｅ　ｐｒｏｓｔｂｅｔｉ ｃｇｒｏｕｐ］を有する（または取り込むことができる）こと。
（ｅ）２つまたは３以上のポリペプチド鎖からなること。
（ｆ）２つまたは３以上の四量体がらなり、各四量体は４つのグロビン様ドメイ ンを有すること。
（ｇ）各成分四量体は少なくとも１つの他の成分四量体に共有結合していること 。　以上 好ましくは、本発明のヘモグロビン様タンパク質は、血液中３７℃で２〜４５ｔ ｏｒｒのＰ５Ｇ％より好ましくは２４〜３２ｔｏｒｒのＰ、。
を有する。また、好ましくはある程度の協同性を示すものである。代用血液とし て投与されたとき少なくとも普通のヒトヘモグロビンのものに匹敵する血管的保 持［１ｏｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ］があるものがよい。
ンを、へ量体ヘモグロビン様タンパク質は８つのグロビン様ドメインを、などと いうように各々有している。［多量体Ｊ　［ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ］とは（４ｘ ｎ）個のグロビン様ドメイン、ただしｎ＞１、を有するヘモグロビン様タンパク 質のすべてを言う。
偽量体［ｐｓｅｕｄｏｍｅｒｉｃ］ヘモグロビン様タンパク質はグロビン様ドメ イン数が成分ポリペプチド鎖の数より大きい、即ち少なくとも１本の鎖が少なく とも２つのグロビン様ドメインを有するものをいう。例えば偽へテロ四量体ヘモ グロビン様タンパク質は、（ａ）１つのシアルファグロビン様ポリペプチドと２ つのβグロビン様ポリペプチド、（ｂ）２つのαグロビン様ポリペプチドと１つ のジベータグロビン様ポリペプチド、（Ｃ）１つのシアルファグロビン様ポリペ プチドと１つのジベータグロビン様ポリペプチド、（ｄ）１つの融合α／βグロ ビン様ポリペプチドと個別のαグロビン様ポリペプチドおよびβグロビン様ポリ ペプチド、あるいは（ｅ）２つの融合α／βグロビン様ポリペプチドからなる。
［四量体Ｊ　［ｔｅｔｒａｍｅｒ］とは［偽回置体且ｐｓｅｕｄｏｔｅｔｒａｍ ｅｒｓ］を含む語である。
「遺伝子的に融合されたヘモグロビン」とは少なくとも１つの「遺伝子的に融合 されたグロビン様ポリペプチド」、（グロビン偽オリゴマー）、−一後者は２つ または３つ以上の同一または異なるグロビン様ドメインを有し直接に接続されて いるか、またはアミノ酸もしくはペプチドリンカ−を介して接続されているｍ− を有するヘモグロビン様タンパク質である。ジアルファグロビン様ポリペプチド は第１αグロビン様ポリペプチド（ドメイン）の通常のＣ末端と第２αグロビン 様ポリペプチド（ドメイン）の通常のＮ末端との間のペプチド結合で結合された 本質的に２つのαグロビン様ポリペプチド配列（ドメイン）からなる。これらの ２つの配列は直接接続されていても、１つまたは２つ以上のアミノ酸のペプチド リンカ−を介して接続されていてもよい。ペプチド結合以外（例えばＤＩＤＳ） のＮ末端およびＣ末端で架橋されたαグロビン鎖はジアルファグロビンではない 。ジアルファグロビン様ポリペプチドはβグロビンと共にたたまれ得［ｆｏｌｄ ｉｎｇ　ｔｏｇｅｔｂｅｒ］、またヘムを取り込んで官能的ヘモグロビン様タン パク質を形成するものでなければならない。
成分ドメインの１カ所だけに突然変異があるジアルファグロビン様ポリペプチド またはジベータグロビン様ポリペプチドは「非対称的」と呼ばれる。
αグロビン様配列がペプチド結合でβグロビン様配列に接続されている「α／β グロビン様偽二量体」を提供することもできる。この「α／βグロビン様ポリペ プチド」と、ジアルファグロビン様ポリペプチドおよびジベータグロビン様ポリ ペプチドは集合的に「偽二量体グロビン様ポリペプチドＪ［ｐｓｅｕｄｏｄｉｍ ｅｒｉｃ　ｇｌ。
ｂｉｎ−１ｉｋｅ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ］、または［ジグロビンＪ　［ｄ ｉｇｌｏｂｉｎｓ］と呼ぶことがある。−広くは、ジアルファ、ジベータまたは α／βグロビン様ポリペプチドからなるヘモグロビン様タンパク質は「偽四量体 」である。
外部に架橋可能なシスティンを１つだけしかもたない偽四量体は略して「モノシ スＪ　［ｍｏ口叶ｃｙｓ］分子と呼ぶことがある。しかしこの用語を使ったから といってその四量体が他のシスティンを有していないことを示唆するが如くに解 されてはならない。
「モノシス」偽四量体は別の偽四量体のシスティン残基と有意な程度まで架橋反 応することができるシスティンを１つだけ有しているものである。
ヘモグロビン様タンパク質は、そのグロビン様ドメインの少なくとも２つが異な るものであるときはへテロメリツクであると呼ばれる。普通のヒトヘモグロビン は２つのαグロビンと２つのβグロビンから構成されているので、それはへテロ 四量体は各偽四量体が２つのヒトαグロビン様ドメインと２つのヒトグロビン様 ドメインは、必ずしもそうであるものではないが、ポリペプチド鎖当たり１つで 、正常ヒトヘモグロビンのαグロビンおよびβグロビンの配列に正確に対応する ものである必要はない。ヘモグロビンの酸素親和性（またはその協同性、または そのｐｔｌ、塩、温度、その他の環境的パラメータへの依存性）や安定性（熱、 酸、アルカリ、その他の変性剤に対する）を変えるため、遺伝子的融合ないしは 架橋を促進するため、あるいは個々の鎖の発現や組合せ［ａｓｓｅａ＋ｂｌｙｌ を容易にするのを増進するため、突然変異がむしろ導入されるほうがよい。ある 種の突然変異を起こすためのガイダンスは、例えばＨｏｆｆ１＋ａｎとＮａｇａ ｉの米国特許第５０２８５８８号および出願第０７／４４３９５０号にある。本 発明は実質的に生物学的活性に影響しない不要な突然変異によってここに示され たものから離れている分子も含む。
「グロビン様ドメインＪとは、天然のヘモグロビンのグロビンサブユニットとほ ぼ相同的なポリペプチドドメインである。「を椎動物且ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ］ 、「哺乳類」または「ヒト」のグロビン様ドメインとは、天然のを椎動物の、哺 乳類の、またはヒトのヘモヒトαグロビン様ドメインまたはポリペプチドは、生 のヒトαグロビンまたは１つまたは２つ以上の置換、欠失、または挿入によって 生の配列がら異なるものにされているが、ヒトαグロビンとなお実質的に相同で あって、ヘムを取り込んだりβグロビンと関係することができるような、その突 然変異体をいう。
「ヒトαグロビン様ドメイン」とは、正常ヒトαグロビンを含み、天然ヒトαグ ロビンを含むがそれらに限定されない意である。
βグロビン様ドメインまたはポリペプチドは類似体的に定義される。ヒトαまた はβグロビンと十分に相同な動物ヘモグロビンのサブユニットまたはその突然変 異体は「ヒトαまたはβグロビン様ドメインまたはポリペプチド」の語に包含さ れる。例えば子ウシヘモグロビンのサブユニットはこの語の内容内にある。
ポリペプチドがα（またはβ）グロビンに実質的に相同であるか否かを決定する に当たっては、配列的類似性が重要な基準である。尤も基準はそれだけではない 。配列的類似性は、最も合致するものを得るためには僅かな数のギャップの導入 を一般に許容するという従来のアルゴリズムによって決定される。ヒトαグロビ ン様ドメインは野生型ヒトαグロビンと典型的には少なくとも約７５％の配列上 の相同性があり、ヒトβグロビンとよりもヒトαグロビンとの方がより大きな相 同性かあるのが普通である。しかしより少ない相同性しかないポリペプチドでも 、もしそれか偶々ありうる相同性より大きな配列相同性かあり、またαグロビン の特徴的な高次構造（例えば「ミオグロビンたたみこみＪ［ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ 　ｆｏｌｄ］）　、ヘムを取り込む能力、および酸素結合活性をももっているな ら、なお「実質的に相同」と考えてよい。（別の箇所で説明するように、酸素親 和性Ｐｒｏ、血管的保持率、あるいは協同性における変更は望ましく、もし可逆 的な酸素結合能になお貢献することかできるものなら、そのような変異は非相同 となるものであはないという点に留意されたい）。比較してみると、Ａｒｔｅ＝ ａのヘム結合ドメインは、ミオグロビンとの一次配列の相同性は２７％以上でな いのだが、その保存された残基の周りのヘム結合ドメインの配列およびその他の ヘモグロビン（すなわちヘム接触に含まれるか、相互にらせんセグメント関係を 決定することに関係する）に保存された残基周りのヘム結合ドメインの配列が、 Ａｒｔｅｒｎｉａドメインの対応するターンにクラシカルなグロビンヘリックス ＡからＨを、種々の保存されたグロビンファミリー残基とともに、有しているの て−ミオグロビンと相同と考えられる。また、セリンブロテアーセインヒビター の中には僅か３０％しか配列相同性のない相同と認められる対のタンパク質のフ ァミリーがある。
α鎖およびβ鎖のいずれにも変化をもたらしているヒトヘモグロビンの突然変異 体は百以上も知られており、またこれら突然変異のヘモグロビンの多くの酸素結 合特性その他の特性か知られている。ヒトα／βグロビン自身も８４箇所で異な っている。さらにグロビン配列中の種相互間の変化も熱心に研究されている。Ｄ ｉｃｋｅｒｓｏｎ、　Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃ ｔｉｏｎ、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、ｃｈ、　３　（ １９８３）は１９８２年に、６０個の公知のを椎動物αグロビンが１４１箇所の うち２３箇所で同一残基をもつが、６６個のを椎動物βグロビンについては、１ ４７個のアミノ酸のうち２０か同一であることを報告している。これもグロビン ファミリーに属する６０個のを椎動物ミオグロビンは、１５３箇所のうち２７個 は不変のアミノ酸である。哺乳類のみにつき考察すれば、不変のアミノ酸はαグ ロビンにっき５０／１４１、βグロビンにっき５１／１４６、そしてミオグロビ ンにつき７１／１５３となる。不変の箇所は分子の活動の中央部、すなわちヘム 凹部［ｈｅｍｅ　ｃｒｅｖｉｃｅｌとサブユニット同士の接触部に集まっている 。不変アミノ酸のうちあるものは考察対象の種の小さなフラクションだけがコン センサス配列部分から分岐するものとなっている。
ヒトαグロビンと選択したその他のを椎動物のαグロビンとの間の全体的相違数 は、次の通りである。アカゲザル（４）、ウシ（１７）、カモノハシ（３９）、 ニワトリ（３５）、ヒトゼータ（胎児）（６１）、コイ（７１）、サメ（８８） 。無を椎動物グロビンについては分岐ファミリーについてみると、その他のを椎 動物βグロビンがらヒトβグロビンが違う点は、アカケザル（８）、ヒトαグロ ビン（１０）、ウシβグロビン（２５）、ウシβグロビン（３３）、ヒトγグロ ビン（３９）、ヒトεグロビン（３６）、カモノハシ（３４）、ニワトリ（４５ ）、サメ（９６）、海水ヤツメウナギ（１２３）、軟体動物（１２７）、グリセ ラ（１２５）、及び、キロノマス（１２８）。
これらの相違の多くは誤解を招くおそれがある。というのは可変アミノ酸は機能 的に同等な１アミノ酸を別のアミノ酸の「保守的置換置ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖ ｅ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓｌとして示されるにすぎないからである。「保 守的置換」とはヘムを取り込みαグロビンサブユニッ）・とβグロビンサブユニ ットと関係して、その定義された内容を維持しつつ可逆的に酸素と結合する四量 体（または偽四量体）ヘモグロビン様タンパク質を形成する、グロビン様ポリペ プチド（またはドメイン）の能力を改廃しない置換をいう。次に挙げるようなソ ースがこうした保守的置換（および欠失と挿入）を同定するのに使われる。
（ａ）機能を有するヘモグロビン突然変異体に関するデータ（１００以上の突然 変異体が存在） （ｂ）を推動物、特に哺乳類、αグロビンおよびβグロビンの配列上の変種に関 するデータ （ｃ）を推動物、特に哺乳類、ミオグロビンの配列上の変種に関するデータ （ｄ）を推動物と無を推動物のグロビン間の配列上の変種、または無を推動物グ ロビン間の配列上の変種、に関するデータ（ｅ）ヒトヘモグロビンならびにその 他の酸素結合タンパク質の三次構造に関するデータ、および同構造に及ぼす配列 変化の効果を予測する分子モデルソフトウェア（ｆ）相同タンパク質のファミリ ーの構成員間に見られるアミノ酸変化の頻度に関するデータ（グロビンファミリ ーに限定せずに）。例えば５ｃｈｕｌｚ　ａｎｄ　Ｓｃｈｉｒｍｅｒ、　Ｐｒ１ ｎｃｉｐｌｅａ　ｏｆ　ＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ　（Ｓｐｒｉｎｇｅ ｒ−Ｖｅｒｌａｇ：　１９７９）　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　（ Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｌ！Ｉａｎ：　１９８３）の表１−２参照。
（ａ）〜（ｄ）のデータは同族の［ｃｏｇｎａｔｅ］タンパク質中の変更部位に おける耐性［ｔｏｌｅｒａｂｌｅ］突然変異を決定するのにきわめて有益であり 、また同分子のその他の類似部位における耐性突然変異を同定するのに有効であ る。カテゴリー（ｆ）のデータによれば、次の交換群か認められるが、その中で のアミノ酸の置換はしばしば保守的である。
■　小さな脂肪族の、無極性または微弱極性の残基−Ａｌａ。
Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ　（Ｐｒｏ、　Ｇｌｙ）■　負荷電された残基およびそれらの アミド−Ａｓｎ、　Ａｓｐ。
Ｇｌｕ、Ｇｉｎ ■　正荷電の残基−Ｈｌｓ、　Ａｒｇ、　Ｌｙｓ■　大きな脂肪族の無極性残基 −Ｍｅｔ、　Ｌｅｕ、　Ｉｌｅ、　Ｖａｌ（Ｃｙｓ）■　大きな芳香族残基−Ｐ ｈｅ、　Ｔｙｒ、　Ｔｒｐ３つの残基か括弧で括られているが、これはタンパク 質構造においてそれらには特殊な役割があるからである。ｃｔｙは側鎖のない唯 一の残基だからその鎖に対する柔軟性を有する。Ｐｒ。
は鎖をしっかりと制約する普通にみられない幾何学的形を有している。Ｃｙｓは タンパク質をして特定のおりたたみを保持するジスルフィド結合に参加すること ができる。５ｃｈｕｌｚとＳｃｈｉｍｅｒが上記１１■を合併したことに注意さ れたい。またＴｙｒは、水素結合の可能性を有しているから、Ｓｅｒ、　Ｔｈｒ などと一種の親類関係になっていることにも注意されたい。
一般に官能性（活性）は表面の残基における突然変異によってあまり影響を受け ない、少なくともヘム凹部またはサブユニット接触のいずれにも関係しなかった ものは影響されていない。
また、フリーのアミノ末端またはカルボキシ末端は勿論、αヘリックスを接続す る「ループＪは、欠失や挿入により大きな耐性を有している。
ｒＭｅｔＦＸαグロビン」とは、Ｎ末端メチオニンと、因子Ｘａ（例えばｌ１ｅ −Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）　（配列番号２）の認識部位として機能するオリゴ ペプチドと、そしてαグロビン様配列（例えばＶａｌ−Ｂｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ −Ｐｒｏ、、、）とからなるαグロビン様ポリペプチドであり、（配列番号３） 後者の配列は野生型αグロビンまたはここに記載のその突然変異体に対応する。
Ｆｅｅｔ　ＦＸαグロビン」は、ｒＦＸαグロビンＪと略されることもある。ｒ ＦＸβグロビン」とは類似的に定義されたβグロビン様ポリペプチドである。
ｒＭｅｔ−αグロビン」とはＮ末端メチオニンが余分についたαグロビン様ポリ ペプチドである。成熟野生型αグロビンの第一のアミノ酸である、第２アミノ酸 はバリンである。Ｍｅｔ−βグロビンは類似体的に定義されている。「Ｄｅｓ− ＦＸαグロビン」遺伝子（またはｒｄＦＸαグロビン」）とは、Ｎｅｔ−ＦＸα グロビン遺伝子がら得たＦＸフトンを切り出すことによって得たｎｅｔ−αグロ ビン遺伝子である。メチオニルαグロビンおよびメチオニルβグロビンから形成 されるメチオニルｆ１ｇｂにつきｒＭｅｔ−ＨｇｂＪが使われることに注意され たい。
ｒ　Ｄｅｓ−Ｖａｌ−αグロビン」（またはｒｄＶａｌ　αグロビン」）は成熟 野生型αグロ、ビン配列を開始するバリンに一メチオニンが置換されたαグロビ ン様ポリペプチドである。Ｄｅｓ−Ｖａｌ−βグロビンは類似体的に定義されて いる。Ｄｅｓ−Ｖａｌ−α／αグロビン（ｄｉ−Ｄｅｓ−Ｖａｌ−αグロビン） はｒＤｅｓ−Ｖａｌ−α」配列か適当なペプチジルリンカ−を介してＶａｌで始 まるαグロビン様配列にリンクされた「ｄｉ−αグロビン」である。
低親和性の突然変異体 「低親和性ヘモグロビン様タンパク質」とは、同一条件下で無細胞正常ヘモグロ ビンＡ。のＰ５゜より少なくとも１０％大きなｐｓｏを有するヘモグロビン様タ ンパク質をいう。そのタンパク　。
質が代用血液として使われるときは、好ましくは低親和性タンパク質とされるも のであること、より好ましくはそのＰ２Ｏが、無細胞ヘモグロビンのＰ２Ｏより も全血赤血球［ｗｈｏｌｅ　ｂｌｏｏｄ　ｅｅｌＩｓ］のＰｒｏの方に近い値で あるのがよい。
低親和性突然変異体ヘモグロビン、すなわち無細胞正常ヘモグロビンに比し「右 寄り」の酸素平衡結合曲線を有するヘモグロビンは、多くの面に利用可能性を有 する。まず考えられるのは全赤血球と同様の酸素親和性を有する突然変異ヘモグ ロビンは、感染の危険のない、また供給不足の問題もない、献血された赤血球の 代わりに酸素を運搬する輸血代用物として使用することができる。無細胞生ヒト ヘモグロビンは輸血代用物として機能することはできないが、その多くの理由中 主なものは酸素があまりにしっかりと結合してしまうという欠点があるからであ る。
また無細胞ヘモグロビン溶液はクロスマツチされる必要もなく全血より長い貯蔵 寿命をもつので、低親和性ヘモグロビン溶液が全血の輸血が実際的でないような 場合、例えば救急車の中とか戦場などで広く使われている。赤血球より一層低い 酸素親和性を有する突然変異ヘモグロビンは実は多くの場合より効果的に酸素を 運搬することができる。全血よりいくぶん高い酸素親和性（しかし無細胞生ヒト ヘモグロビンよりは低い親和性）を有する突然変異ヘモグロビンは適切な輸血代 用物として機能することができ、実際、場合によっては赤血球より効果的に酸素 を運搬している。これは、赤血球膜を通して分散をせずに酸素がヘモグロビンを ベースとする溶液から血漿に直接放出されるからで、また、無細胞ヘモグロビン が赤血球に入りにくい領域中に貫通するからでもある。例として低親和性突然変 異ヘモグロビンが冠状動脈バルーン血管形成手術の間、効果的に酸素を運搬する ことが期待される一方、赤血球の循環は手術中妨げられる。低親和性突然変異ヘ モグロビンは移植に先立って行われる器官保存における潅流成分として、あるい は哺乳類細胞培養の添加剤としても有効である。
可能な低親和性突然変異体につき、Ｈｏｆｆｍａｎらの米国第５０２８５８８号 の表１（天然の低親和性ヘモグロビン突然変異体）吉表２（候補の非天然発生低 親和性ヘモグロビン突然変異体）に例を挙げて説明する。特に興味のある低親和 性突然変異体はＰｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｏ　（βＬｙｓ１０８）βＰｈｅ６３、 βＩｌｅ”及びＫａｎｓａｓ　（βｔｈｒ　”り突然変異体である。
ヘモグロビンの酸素結合特性上の予想外の驚くべき変化がメチオニンでＮ末端バ リンを置換したとき観察された。血液から精製されたヘモグロビンＡｎは、２５ ℃で測定したときＮ＝２゜８、Ｐ５０値４．０３であった。Ｅ、　ｃｏｌｉ中で 産生されたＤｅｓＦＸ−ｂｇｂは、α鎖およびβ鎖のＮ末端にメチオニンが付加 していることを除けばＡ。と同一のヘモグロビンであって、本質的に同一のＰ、 。値およびＮ値である。したがってメチオニンの付加は近隣のバリン残基を変化 させることなく酸素結合にほとんど何も影響しない。逆に高いＰＳＯ値の６．６ かＥ、　ｃｏｌｉ中で産生されたｄｅｓＶａｌ−ｂｇｂｌすなわち６鎖の正常Ｎ 末端バリンがメチオニンに取って代わったヘモグロビンにつき観察された。Ｎで 測定された協同性は３分子すべてにつき実質的に同一であった。
同様の比較をＰｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ突然変異を含有する、１つはト」山中で もう１つは酵母中で産生じた、２つのヘモグロビン、について行った。Ｅ、　ｃ ｏｌｉヘモグロビンはＤｅｓ−Ｖａｌα鎖で構成されていた。すなわちＮ末端は メチオニンで置換された正常バリンを有していた。酸素結合は２５°ＣでＰｓｏ ＝１９．８．　Ｎ＝２．５、そして３７°ＣでＰｓｏ＝３４．５、Ｎ＝２．５で 特徴付けられる。対応する酵母コート領域は正常バリンコドンの前で付加された メチオニンコドンから始まる。この最初のメチオニンは後でインビボ翻訳のとき 除去されるので、精製されたヘモグロビンが正常Ｎ末端バリンを有することにな る。この分子は、３７°Ｃ測定てＰ５゜＝２３〜２５で、Ｎ　＝　２．５であっ た。こうして上記の例ではＮ末端メチオニンてＮ末端バリンを置換することはｐ ｓｏ値を増大させた。生理学的条件では、Ｅ、　ｃｏｌｉ中で産生された遺伝子 的融合Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎヘモグロビンは、Ｎ末端を置換された酵母中で 産生の同様のヘモグロビンより２０〜３０％も多量の酸素を運搬する。
高親和性突然変異体 「高親和性ヘモグロビン様タンパク質」とは同一条件下で無細胞ヘモグロビンＡ 。のｐｓｏより少なくとも１０％は少ないＰＳＯをもったヘモグロビン様タンパ ク質をいう。
高親和性突然変異体ヘモグロビンは一定の場合には利用価値かある。例えばパー フルオロカーボンベースの代用血液調製は、放射線治療ならびに固形腫瘍のある 種の化学療法処置の向上のため臨床実験中である。（Ｄｏｗｌｉｎｇ、　Ｓ、、 　Ｆｉｓｃｈｅｒ、　ＪＪ、、　ａｎｄ　Ｒｏｃｋｗｅｌｌ、　Ｓ、　（１９９ １）　Ｂｉｏｍａｔ、　Ａｒｔ、　Ｃｅ１ｌｓ　ｌｍｌｌ１ｏｂｉ１．　Ｂｉｏ ｔｅｃｈ。
１９、２７７；　Ｈｅｒｍａｎ、　Ｔ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｔｅ１ｃｈｅｒ、　Ｂ、 Ａ、　（１９９１）　Ｂｉｏｍａｔ、　Ａこうした研究の基礎となっているのは 、酸素か放射線およびある種の化学療法試薬の細胞毒性作用の必要な成分である という事実である。固形腫瘍は腫瘍内においてしばしばきわめて低い酸素分圧を 示すもので、これが治療を妨げている。パーフルオロカーボンベースの酸素運搬 溶液はある種の腫瘍治療を劇的に向上させるものと思われ、またヘモグロビンベ ースの代用血液は同様の効用を有するものと期待されている。無細胞ヘモグロビ ンは全血細胞と異なり、酸素運搬のために腫瘍の内部領域を貫通できる可能性が ある。無細胞ヘモグロビン調製物によって放出された酸素の実際の割合は、Ｐｒ ｏの直接的関数ではなく、むしろ肺（そこで酸素かヘモグロビンに結び付く）の 酸素分圧および酸素が吐き出される組織での分圧という２つの分圧間の酸素平衡 結合曲線の形に左右されている。したがって高親和性突然変異ヘモグロビンが腫 瘍治療のアジュバントとして好ましいことはありうることである。高親和性ヘモ グロビンはその結合酸素を正常循環系を通して維持するから、酸素分圧は相対的 に高く維持されるが、きわめて酸素浪費する腫瘍内部中に酸素を放出する。正常 のまたは低親和性ヘモグロビンは、それが腫瘍内部に到達するときまでに放出す ることができるヘモグロビンは少なくしかもたないことになる。
自然発生的高親和性ヘモグロビン突然変異体も知られており、ＢｕｎｎとＦｏｒ ｇｅｔ、表１４−１参照、非自然発生的高親和性ヘモグロビン突然変異体の候補 がその公知の突然変異体とヘモグロビンの構造から提案されて得る。特に好まし い高親和性突然変異体は表４００に挙げである。
遺伝子的融合と架橋とは酸素結合親和性に影響し得ることについては注意されな ければならない。
システィン突然変異とジスルフィド橋形成システィン突然変異は四量体の安定性 を増加させる価値力（ある（米国特許第５０２８５８８号、米国特許出願第０７ ／４４３９５０号参照）。
それらはまたポリ（四量体）（ｎ≧２）ヘモグロビンを構築するのを促進する。
これは隣接する四量体（偽四量体を含む）上のシスティンが酸化されてそれら四 量体を共有結合してジスルフィド橋を形成することかできるからである。また、 システィンのチオール基が種々の架橋剤と反応することもある。
システィンをヘモグロビン様タンノくり質中に導入するのｆこＣｔ種々の部位を 使うことができる。
部位を選択するに当たって必要な基準は（１）突然変異方く機能に影響するもの でないこと、（２）側鎖かオキシまたζまデオキシ構造で水を受け入れやすいこ と、（３）その部位力くたたまれたタンパク質の表面に存在すること、（４）側 鎖のスルフヒドリルカく分子の内部に向かってよりも表面から離れるよう（こ外 方龜こ（申びていること、（５）その部位がＲ−Ｔ遷移［Ｒ−Ｔ　ｔｒａｎｓｉ ｔｉｏｎ］［こ直接関与しない分子の部分中にあること、（６）その変化“強固 に固定される箇所をもたない分子部分にあること（かかる領域（よ一般に判然と しないＸ線回折〕くターンを示す）、（７）その突然変異が局部的二次構造を破 壊するものでないこと、つまりｉノフォールディングの問題を引き起こすおそれ かあるｐｒｏ−＋ｃｙｓの突然変異を回避するものであること、（８）も１７可 能なら５ｅｒ−’ｃｙｓまたはａｌａ−ｅｃｙｓのような保守的変化であること 、以上である。突然変異は必ずしも上述のこと全てを満足するものでなくてもよ い。例えばＲ−Ｔ遷移（上記５参照）に関与する部位を予想しても、Ｆ５゜（上 記１参照）の有利な変化を重視することもある。
最も重要な点はその突然変異が、架橋形成の前後を問わず酸素結合性を改廃する ものでないこと、また、システィンが所望の架橋反応に参加できるだけの近づき やすさを有することである。
α表面の候補部位は次のものを含む。
ａｌａ７２．　ａｓｈ　７Ｂ、　ａｓｎ６Ｂ、　ａｌａ７１．　ｔｈｒ６７、１ ｙｓ７．１ｙｓｌｌ、　ｔｈｒ８゜ａｌａＬ２．　ｔｈｒ１１８．１ｙｓＬ６． 　ａｌａ４５．　ｇｌｕＬｌＧ、　ｅｌｙ１５．　ｈｉｓｌ１２．　ｔｈｒ２４ ゜ｇｌｕ２コ、　１ｙｓ６０．　１ｙｓ５６．　ａｌａ５０．　ｇｌｙ５１．　 ｇｌｕ５３．　５ａｒ４９．　ａｓｐ４フ。
ｇＬｎ、５４．　ａｌａ４５．１ｙｓ９０．　ａｌａ８２．１ｙｓ６１．　ａｌ ａ１９．　ａｌａ２０．　ａｓｐ８５゜５ａｒ８１．　ａｓｐ７５．　ａｓｐ７ ４．　ｌｙｓエコ９．　ａｓｐ６４．　ａｎｄ　ｇｌｙ１ｇ計４０個のアミノ酸 β表面の候補部位は次のものを含む。
ａｓｐ７９．　ａｌａ２．　１ｅｕ３．　ｔｈｒ４．　ｇｌｕ６．　５ａｒ９． 　ｔｈｒ１２．　ａｌａｓコｒ　ｑ’Ｙ１６ｔｌｙｓ１７．、ｖａｌｌＢ、　ａ ｓｎ１９．　ｖａ１２０．　ａｓｐ２１．’　ｇｌｕ２２．１ｙｓ６５．５ｅｒ ７２゜ａｌａ７６、ａｌａ７７、ａｓｐ７９．　ａｓｎ８０．　ｇｌｙ８コ、ａ ｌａｓ６．　ｔｈｒ８フ、９１ｕ９０゜１ｙｓ９５．　１ｙｓ５９．　ｇｌｕ４ ３．　５ａｒ４４．’　ａｓｐ４７．　５ａｒ４９．　ｔｈｒ５０．　ａｌａ５ コ。
ａｓｐ５２．　１ｙｓ６１．　ｇｌｕ１２１．　１ｙｓ１２０．　ｔｈｒ１２３ ．　ｌｙｓｇ６．　ａｓｐフ３．　ａｌａ６２゜ｈｉｓｌ１６．　ｈｉｓｌ１７ 　計４５個のアミノ酸これらの部位で既に突然変異を示した自然発生的突然変異 体は多数存在する。次の通りである。
残基　領域　突然変異 ５４　Ｆ３　ＧＬＮ−＞ＡＲＧ ７１Ｅ２０　ＡＬＡ−＞ＧＬυ ７５　ＥＦ４　ＡＳＰ−＞ＧＬＹ ８１　Ｆ２　５ＥＲ−＞ｃＹ、ｓ もし偽へ量体（ｎ＝２）が２つの偽四量体をジスルフィド結合で直接にリンクす ることによって形成されたなら、血清中の半減期は内生的［ｅｎｄｏｇｅｎｏｕ ｓｌ血清の小分子チオール（グルタチオンのような）がジスルフィド結合を緩め るその割合［ｒａｔｅ］で影響され得る。こうした反応のメカニズムは実際の還 元種としてのチオレート陰イオンを含む。（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｔ、Ｅ、　 （１９７８）　肛ｍＬＢｉｏｐｈｙｓ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、、　３３： ２５９−２６０；　Ｃｒｅｉｇｂｔｏｎ、　Ｔ、Ｅ、（１９７５）　Ｊ、　Ｍｏ １．　Ｂｉｏｌ、、　９６：７６７；　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｔ、Ｅ、　（１ ９７７）　Ｊ、　Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ、、　１１３：３１３）　このように還元速度はジスルフィド結合周辺 の分子静電気環境の関数なのであろう。もしシスールフイドが静電気的にマイナ ス環境にあれば、チオレート陰イオンの反発かあるから遅い還元速度となるであ ろう。グルタチオンの場合には不活発な遷移陽子化された種［ｕｎｒｅａｃｔｉ ｖｅ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ　５ｐｅｃｉｅｓ］でさえ実 負電荷［ａ　ｎｅｔ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｈａｒｇｅ］を有していて反発する からジスルフィド還元の速度をさらに減速する。
したがって負に荷電した表面残基に近い所にあるジアルファまたはジベータヘモ グロビンの表面のまたは表面に近いアミノ酸残基はジアルファまたはジベータポ リペプチド中の１つのシスティン突然変異の場所としてよい選択である。そのよ うな２つのシスティン間の最初のジスルフィド結合の形成も、システため、遅い のであるが、その反応はインビトロ形成反応中の高い塩または高いｐＨの使用で 促進することができる。デオキシ条件下でレドックス緩衝液中で行なわれれば、 その反応は温度上昇につれて促進されるであろう。
負荷電残基に最も近いｃｓ突然変異に好ましい部位α５ｅｒ４９　ａｓｐ４７近 辺；自然発生の５ｅｒ４９がらａｒｇは正常酸素親和性を有する。
ａ　ａｌａ２０　ｇｌｕ２３近辺、自然発生のａｌａ２０がらｔｙｒ、　ｇｉｎ 、　ａｒｇは何も知られている有害特性をもっていない。
ａ　１ｙｓ１６　ｇｌｕｌ１６近辺：自然発生のｌｙｓからｇｌｕは正常酸素親 和性をもっている。
ａ　ａｌａ５０　ｇｌｕ３０近辺、自然発生のａｌａ５０からａｓｐは何°も知 られている有害特性をもっていない。
βｔｈｒ５０　ａｓｐ５２近辺：自然発生のｔｈｒ５０がらｌｙｓは何も知られ ている有害特性をもっていない。
β１ｙｓ６５　ａｓｐ２１近辺 βａｓｎ１９　ａｓｐ２１近辺 表面または、近表面でのシスティン突然変異は一般に、ヘモグロビン偽四量体の 機能性に重要な影響を与えるようなものではないと考えられている。システィン 突然変異はαヘソックスを有意に不安定化するものとは考えられておらず、また 表面残基はヘモグロビンの酸素結合特性に直接関与しないと考えられている。は とんどの表面残基はかなりな運動［ｍｏｔｉｏｎ］にさらされるのでしっかりと 束縛されない。またタンパク質の呼吸運動があるため、システィンの側鎖は必ず しもジスルフィド結合形成にアクセッシブルなように溶液中に直接向いていなけ ればならないものでもない。
偽へ量体の構築に使われるほかに、表面システィン突然変異には別の使用法があ る。例えば（１）２つ以上の反応部位がある合成スルフヒドリル反応ペプチドを 使用することによって多量体ヘモグロビン（ｎ＞２）を構築すること、（２）撮 像用の放射性同位体に結合するキレートを付けるため表面システィン残基を利用 することができること、（３）表面システィンは循環半減期を延長するため、ま たはその運搬を目標特定するため、バイオアクティブなペプチド、その他の治療 剤に付けるのに利用することができる。もし薬物の付加がジスルフィドによるも のなら、そのキャリヤからのペプチド放出速度は近隣の残基で制御することがで きる。上記（２）と（３）の利用については、ジアルファま正常ヒトヘモグロビ ンのβ９３のシスティンを除去することは、システィンは例えばセリン、アラニ ンまたはトレオニンによって置き換えることができる。所望なら上記以外の野生 型システィンも置き換えることができるが、それが四量体形成後に架橋反応に参 加することは考えにくい。
ハプトグロビン結合を減少させる突然変異ハプトグロビン結合かヘモグロビン代 謝に一定の役割をなすことは今日信じられていることである。もしそうであるな ら、ヘモグロビンの血管的保持はハプトグロビン結合を阻害する突然変異によっ て促進できるかもしれない。オキシヘモグロビンがα−β二量体に解離すると、 二量体はハプトグロビンに結合される。結合エネルギの大半は四量体中には埋も れるが二量体中では露出する残基への結合に費消されるが、四量体の表面には二 次的結合部位もあるようである。そのメカニズムは明らかになっていないが、ハ プトグロビン結合二量体は肝臓のＫｕｐｆｆｅｒ細胞へと輸送され、そこで代謝 される。
ハプトグロビン結合に関与し、別の四量体を付加するのに適する部位に突然変異 させることが最も望ましい。候補となる突然変異部位は正常ヒトαグロビンのα 鎖中にある、残基１．６．７４．８２．８５．８９．９０．９３．１１８．１２ ０〜１２７および１３９〜１４１、そしてβ鎖中にある残基２．１１〜４０およ び１３１〜１４６である。
ハプトグロビン結合が遺伝子的にコードされる１つのアミノ酸を別のものに置き 換えるという単一の置換突然変異だけで阻止できるとは考えにくい。しかしもし 上記残基がシスティンで置き換えられ、そのシスティンが通常のアミノ酸の側鎖 より有意に大きい別の分子に架橋されれば、立体効果［５ｔｅｒｉｃ　ｅｆｆｅ ｃｔ］は相当に倍加されハプトグロビン結合は阻害され得る。勿論、重合制御を 維持するため、四量体１個につきただ１つの架橋しかないように、これらの突然 変異は偽オリゴマーのポリペプチド中で非対称的に行われなければならない。
共有結合して架橋されたヘモグロビンでもハプトグロビンによって処理できるこ とか知られているが、問題のサブユニットインターフェイスの通常埋もれた残基 にハプトグロビンが近づくことを可能にする、四量体がそのオキシ形にあるとき 「呼吸」する結果であると考えられる。グロビンサブユニットにしっかりと架橋 することによってこれが妨げられ、そのため解離が実際的時間内に行われないの である。上述した突然変異ではなく、これらの突然変異が最大効率的とされる下 記サブユニットの全てに発現される。
β３７−”Ｃｙｓそしてα９２→Ｃｙｓβ４０→Ｃｙｓそしてα９２−Ｃｙｓ β９７−Ｃｙｓそしてα４ｌ−Ｃｙｓ 上記突然変異は全てα１β２およびβ１α２のインターフェイスに存在し、ハプ トグロビンが近づくのを「呼吸」が許さないようにそれらインターフェイスを閉 じたままにしている。
「呼吸」はまた低酸素親和性突然変異によっても阻害することがてきる。これに より四量体はデオキシ状態でより長い時間を過ごすから、ハプトグロビンの攻撃 を受けにくくなる。
多量体ヘモグロビン様タンパク質の調製における中間体としての偽量体グロビン 様ポリペプチド及び偽四量体ヘモグロビン様タンパク質 リガンドした形では、腎臓の腎糸球体を通過するに十分少さいαβ二量体にヘモ グロビンは容易に解離し、それによってへるのに必要な量にはるかに満たない量 のヘモグロビンを静脈内投与することは長期的にみたとき腎臓障害を及ぼし得る ものである。Ａｃｋｅｒｓ、　Ｇ、に、　ａｎｄ　ｔｌａｌｖｏｒｓｏｎ、　Ｈ ，Ｒ，、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　７１．４３１２−１６　（１９７４）；　Ｂｕｎｎ、　 Ｅ［、Ｆ、、　Ｊａｎｄｌ、　Ｊ、、　Ｊ。
Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１２９．９２５−３４　（１９６９）、もし二量体への解 離を阻止できるとすれば、血管内半減期を延長し相当程度の腎臓毒性緩和が期待 される。Ｌｅｅ、　Ｒ，、Ａｔｓｕｍｉ、　Ｎ、、　Ｊａｃｋｂｓ、　Ｅ、、　 Ａｕ５ｔｅｎ。
Ｗ、、　Ｖｌａｈａｋｅｓ、　Ｇ、、　Ｊ、　Ｓｕｒｇ、　Ｒｅｓ、　４７．４ ０７−１１　（１９８９）　本発明のヘモグロビン様タンパク質はペプチド結合 を破壊することなしにはαβ二量体へ解離ができないので、より長い血管内半減 期および腎臓毒性の緩和という有利性がある。
デオキシヘモグロビンとオキシヘモグロビン双方の結晶構造では、１つのαサブ ユニットのＮ末端Ｖａｌ残基と別のαサブユニットのＣ末端Ａｒｇ残基とは僅が ２〜６人しか離れておらず、デオキシヘモグロビン中の塩橋で相互に結合されて いる。Ｖｅｒｒｎｉ、　Ｇ、、　Ｐｅｒｕｔｚ、　Ｍ、、　５ｈａａｎａｎ、　 Ｂ、、　Ｆｏｕｒａ＋ｅ、　Ｒ，、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。
、　１７５．１５９−７４　（１９８４）；　５ｂａａｎａｎ、　Ｂ、、　Ｊ、 　Ｍｏ１．　Ｂｉ、ｏｌ、　１７１．３１−５９　（１９８３）、この距離は１ つまたは２つのアミノ酸で埋めることができる。１つの余分なアミノ酸を、αサ ブユニツトのＣ末端Ａｒｇ残基にトリプシン触媒逆加水分解［ｔｒｙｐｓｉｎ　 ｃａｔａｌｉｚｅｄｒｅｖｅｒｓｅ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｌによって酸素結合 特性を根本的に変更せずに付加することができる。Ｎａｇａｉ、　Ｋ、、　Ｅｎ ｏｋｉ、　Ｙ、、　Ｔｏｍｉｔａ　Ｓ。
ａｎｄ　Ｔｅｓｈｉｍａ、　Ｔ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｂｅｍ、、　２５７ ．１６２２−２５　（１９８２）好ましくはジアルファリン力−（１つが使われ たときは）は同一もしくは異なる１〜３個のアミノ酸からなるのがよい。モノー Ｇｌｙリンカ−ならなおよい。このようなリンカ−を作るに当たっては、２つの サブユニットに柔軟に接続し、１個のジアルファグロピンポリベブチドのドメイ ンに変換するする、１または２つ以上のアミノ酸を使うことが重要である。
「シベータ」突然変異体の調製も考察される。１つのβサブユニットのＮ末端と 別のβサブユニットのＣ末端とはデオキシ構造では１８．４人離れており、オキ シ構造では５，２人である。
好ましくはシベータリンカーは同一または異なる２〜９のアミノ酸であるのがよ い。グリシンアミノ酸ならなおよい。
ジベータヘモグロビン中の１つのβ鎖のＮ末端（βＩ、ＩＶａｌ）と別のβ鎖の Ｃ末端（β２．１４６Ｈｉｓ）とを遺伝子的に融合したリンク（−ｇｌｙ−）、 の長さは１〜約９グリシンの間であろう。ヒトヘモグロビンＡ。のオキシ結晶構 造、デオキシ結晶構造では、これら末端間の距離は各々５．２２人、１７．９３ 人である（Ｎ末端窒素からカルボキシルのＣ末端炭素まで）。長さ４人より少し 短い１個のグリシンリンカ−は、オキシ構造中で２つの末端をリンクするのに近 づくことができるが、このリンカ−はデオ　。
キシ構造では一１４人だけ足りないと計算されている。デオキシ構造とオキシ構 造とのより一層のパーターベーション（摂動）かこのリンカ−からは予想される 。酸素結合特性上の何らかの変更は２末端における正電荷および負電荷の除去、 およびこれらのアミド結合への取り込みによって引き起こされるものと考えられ る。またリンカ−分子自身はデオキシ構造よりもオキシ構造を不安定化せず、そ れによって酸素親和性を相対的に増加させる。リンカ−として挿入された２つの グリシンも同様にオキシ構造を特異的に安定化するので、上述したメカニズムに より酸素親和性を相対的に増加させる。
リンクするグリシン数が５に増えたとき、リンカ−はデオキシ構造中のβ鎖末端 間の間隙にちょうど張り渡すことかで′きるし、オキシ構造中の末端間に付加し た立体バルク［５ｔｅｒｉｃ　ｂｕｌｋｌを挿入することができるから、デオキ シの相対的安定化（またはオキシの不安定化）となり、酸素親和性の付随的減少 ［ａ　ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ　ｄｅｃｒｅａｓｅｌをもたらすであろう。デオ キシにおける（オキシ構造ではなく）β末端間は大きく離れているので、６〜９ 個という範囲でのグリシンリンカ−の付加はオキシ構造をさらに安定化し、同様 に酸素親和性をさらに減少させる。
グロビン偽二量体の第３形はαグロビンドメイン及びβグロビンドメインの両方 からなるものである。α１をβ２に融合しα１β１／α２β２二量体形成に対し てヘモグロビンを安定化する１方法は、α１のＣ末端残基をβ２Ｃヘリツクスの Ｎ末端残基に融合してβ２Ｂへリックスの最後に新しいＣ末端を作ることである 。もとのβＮ末１Ｖａｌｌはタンパク質の新しい部分を介在させることによって 、もとのβサブユニツトＣ末端残基、Ｈｉｓ１４６に融合され、こうして異なる 二量体のαサブユニットとβサブユニットからなる連続したポリペプチド鎖を作 り出す。この鎖は次のように記すことができるであろう。α（１１４）−Ｇｌｙ ｘ−β（３５１４６）−Ｇ１ｙ＋−３−Ａ１ａ＋３−Ｇｌｙ＋−３−β（１−３ ４）；　図９参照。
分子グラフツクコンピュータを使ってヒトデオキシヘモグロビン構造を調査する と、次のような距離が計算される。αＩＡｒｇ１４１カルボキシル炭素とβ２Ｔ Ｖｒ３５　Ｎ原子との間は約８．６人。
完全に手を広げた直線状トリグリシンペプチドはＮ末端残基からＣ末端残基まで が約１０．１人。これは３個のグリシン残基が、好ましくない立体的相互作用［ ５ｔｅｒｉｃ　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ］を最小限に抑え、コンフォメーション 上の自由を最大限に利用して、Ａｒｇ１４１残基とＴｙｒ３５残基間の距離を張 り渡すために使うことができることを示唆している。距離的要件はオキシヘモグ ロビンでは異なり得るが、もしそうなら、融合ペプチドの配列は両構造の要求を 受け入れるのに最適なように変更することができる。
ヒトのデオキシヘモグロビンでは、β２Ｈｉｓ１４６カルボキシル炭素とβ２Ｖ ａｌｌ窒素原子間の距離は約２５人である。１３アラニン残基の直線配列から構 成される石巻の３．６αヘリツクスはＮ末端からＣ末端までが２２λであった。
１〜３個のグリシン残基をこのヘリックスの各端に付加すると（Ｇｌｙ、　（Ａ ｌａ）　１ｔＧ１ｙ。
となる、ただしｎ＝１〜３）必要な距離に張り渡すことができ、また危険な三次 的バッキングコンフリクトを回避するのに十分なコンフォメーション上の柔軟性 をもつ。さらにこのヘリックスのアミノ酸配列は、たたまれたタンパク質中にパ ックする新塩橋を取り入れるよう変更することができる。このような相互反応は 加工されたタンパク質の安定性を促進し得るものである。
グリシンは、非常に柔軟性が高＜　（Ｃａｎｔｏｒ　ａｎｄ　５ｃｈｉ＋ｎｍｅ ｌ、　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　ｐａｒｔ　１．　ｐｌ ）、２６６−９　（１９８０））、さらに鎖をコンパクトな構造をとるためグリ シンを鎖に組み込むことを可能にするものであるから、リンカ−中でも好ましい アミノ酸である。しかしリンカ−を構成する残基はグリシンに限定されるもので はない。他の残基もグリシンに代えて、またはグリシンに加えて考えられる。例 えばアラニン、セリン、トレオニンである。これらのアミノ酸はタンパク質中に おいてより制限的なコンフォメーション上のスペースしかもたないから、より融 通のきかない結合鎖［１ｉｎｋｉｎｇ　ｃｈａｉｎｓ］となりやすく、したがっ てオキシ／デオキシ構造の相対的安定化／不安定化に一層明確な影響をもたらす 。
リンカ−中のアミノ酸の最小数／最大数は、選ばれたアミノ酸のオキシ／デオキ シ形両方に張り渡される距離の関数であり、その特定アミノ酸の配列の二次構造 形成性向であることが理解されなければならない。ランダムコイルが通常好まれ るが、そうでなければならないものではなく、二次構造中でたくさんのアミノ酸 のリンカ−が少ないアミノ酸のランダムコイルリンカ構造をもつ配列が続く１〜 ３のグリシンが１〜３の別のグリシンで続けられるものである。残基１個当たり はオンゲスドームに翻訳するとポリプロリンＩにつき１．９、ポリプロリンＨに つき３．１２、ポリグリシンＨにつき３，１、逆平行βシートにつき３．４、平 行βシートにつき３．２、右側α−へリックスにつき１．５．３１０ヘリツクス につき２．０、πヘリ°ツクスにつき１．１５である。完全に伸びきった鎖では 、反復ユニットが互い違いに配列されれば［６ｔａｇｇｅｒｅｄｌ、１残基当た りの最大翻訳は３．６３人で、ペプチド結合がｕμ胆なら３．８人である。
リンカ−中のアミノ酸の数は上記のようなものなので、α−ヘリックスまたはβ シートのような二次構造形成は、張り渡りが減少すると望ましくない。ある種の アミノ酸はこのような構造に参加する傾向を強くもっている。Ｃｈｏｕ　ａｎｄ 　Ｆａｓｍａｎ、　Ｂｉｏｃｈｅ＊＋１ｓｔｒｙ、　１３：２２２−２４５　（ １９７４）。アミノ酸を参加減少順にランク分けして以下に示す。好ましいリン カ−アミノ酸は太字で示す。
グリシンはこの目的にとっては最適なアミノ酸である。最も好ましいジアルファ リンカーはＧｌｙまたはＧＩＹ−Ｇｌｙである。
αヘリックス形成基　βシート形成基 αヘリックス形成基　βシート形成基 （文字表記は次の通り。Ｈα、強いα形成基：ｈα、α形成基、■α、弱いα形 成基：ｉα、普通のα；ｂα、α破壊基（ブレーカ−）、Ｂα、強いα破壊基。
β印は類似体。Ｔｒｐはβシート領域のＣ末端に近ければｂβ。） ポリペプチド鎖のα−へリックスは１ターンにつき平均３．６　゛残基である。
球状タンパク質では、１１残基または３ヘリツクスターンに対応して平均長さは 約１７人。αとβグロビンではへリックスの長さは７〜２１アミノ酸（Ａ、　Ａ 、　）となる。βプリーツシートは１ターンにつき２．３残基、平均長さは約２ ０人ま−たは６残基。
ＣｈｏｕとＦａｓ＋＋ａｎはα−へリツクス核を次のように定義した。すなわち ４つのへリックス形成する残基と、１つ以下のヘリックス破壊基（ブレーカ−） とを有するヘクサペプチドと。また、βシート核は、３つのβシート形成残基と １つ以下のシート破壊基（ブレーカ−）、ｌ！：を有するペンタペプチドと。
シアルファリンカー近辺のアミノ酸配列は下記の通り。
ヘリックスポット（Ｐｏｔ）０７９　１０７　０６１　０７９　１１４　１３４ 　０７９　０５９シートポツト（ｐｏｔ）　０７２　０７４　１２９　０９０　 １６５　１２２　０７２　０６２（注、ヘリックス−およびシートをなすポテン シャル［ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓｌは印字上の理由から１００倍するものとする） シアルファリンカーは好ましくはたった１〜３のアミノ酸である。このようにそ れはリンカ−「末端」に接続してのみα−へリックスを形成することかできる。
１つまたは２つの残基リンカ−は、たとえ強い二次構造性向があるアミノ酸から できていても、例えばＡｒｇ１４１とか５ｅｒ３のようなものの混乱効果に鑑み るとα−へリックスまたはβシートのコンフィグレーションをとるとは考えにく い。もしリンカ−が３残基の長さなら、リンカ−が強いα−へリックス破壊基を 有するものでない限り、１以上の残基か強いα−へリツクス形成基でないことか 好ましい。
シベータリンカー近辺のアミノ酸配列はより融通のきかなｌ、ｑ制約を課されて いる傾向かある。
シベータリンカーは比較的長くなる（好ましくは１〜９　Ａ、　Ａ、　）傾向か あるので、二次構造形成からそれだけ影響を受けやすし）。
もし二次構造形成か好ましくないなら、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕのα−へリック ス性向に鑑みＶａｌ−１に隣接するアミノ酸がα−へリックス破壊基（例、グリ シン）であるのか好ましい。より一般には、リンカ−はα−ヘリックス核または βシート咳を含まない（またはそれらを形成するように最も近くにリンクされた アミノ酸と協同する）のが好ましい。
二次構造か望まれないときは、もし「ヘリックス破壊」するアミノ酸を伴うなら 、α−ヘリックス形成する強い性向があるアミノ酸がリンカ−に使われるのがよ い。同様にβシート形成は「シート妨害」アミノ酸によって阻害される。
勿論、ＣｈｏｕとＦａｓｍａｎの方法を使って二次構造を予想することには限界 があり、リンカ−の受容能についての最終的テストはジアルファまたはシベータ ヘモグロビンが所望の酸素親和性をもっているか否かをしることである。特にポ リアラニンジンカ−は、そのα−へリックス形成への性向があるとされているに も拘わらず、アラニン基はコンパクトなため十分に価値のあるものであって、し たかってリンカ−はもし二次構造が形成されないときはきわめて柔軟性がある。
特に好ましい実施例では、ジアルファグロビン遺伝子とβグロビン遺伝子が１個 のポリジストロニックオペロンに結合されている。しかしポリジストロニックオ ペロンの使用は本発明の実施にとって必須のものではなくα（またはジアルファ ）グロビン遺伝子およびβ（またはジベータ）グロビン遺伝子が同じまたは異な る別々のプロモーターから発現されてもよい。
本発明の好ましい「遺伝子的に融合されたヘモグロビン」は、シアルファ及び／ 又はシベータグロビンからなるが、その他のグロビン鎖が遺伝子的に融合されて ＨｇｂＡｌ（α２β２）以外の種のヘモグロビンの多量体を産生ずるのに使用さ れてもよい。
ジスルフィド橋のある偽へ量体（２つの四量体）ヘモグロビン様タンパク質 １つのジアルファポリベブチドと２つのβ鎖（または１つのジベータポリペプチ ドと２つのα鎖）からなる偽四量体の組換量体を産生ずる特別な機会を提供する 。２つのαグロビンドメインが１つのポリペプチドとして発現されるので、その αグロビンドメインの１つを、他方を変えることなく変えることができる。その 結果、その最終的にたたみこまれた状態では正確に１．１の割合で２つの異なる αグロビンドメインを有するタンパク質となる。このタイプの非対称的ヘモグロ ビン分子は、特殊な化学的特性があって、これ以外の方法では簡単に産生ずるこ とができない。本発明の好ましい実施例では、システィンがたたみこまれた組換 えヘモグロビン分子の表面になる５ＧＥ１．１　（β鎖Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａ ｎ突然変異のあるシアルファヘモグロビン）のようなジアルファヘモグロビンの ２つのαグロビンドメインの１つの中のシスティン残基を置き換える部位特異的 な突然変異生成を起こすことを含む。偽へ量体ヘモグロビンの均一な調製は、精 製した偽四量体の単純な酸化反応によって直接にか、架橋分子との反応によるか して（図３）、２つの偽四量体のヘモグロビン間リンケージで形成される。
２つの「モノシス」四量体間にジスルフィド結合を直接形成することは化学的架 橋の必要性を回避するため好ましいことであるが、自然発生する還元剤は有意な 割合でインビボジスルフィド結合を還元することができるであろう。予備実験は この結合結果の還元速度はヘモグロビン表面のシスティン突然変異の位置如何で 左右されることを示唆した。
表面システィン突然変異体（ＭＷ＝６４　ｋＤａ）は酸化可能な条件、下でジス ルフィド結合した二量体に酸化され得る。これは、ｐＨ８の純酸素、４°Ｃの室 温、暗室で、発現したタンパク質の濃縮溶液を撹拌することで得ることができる 。酸化反応に触媒作用を及ぼすためにＣｕ＋２のような遷移金属イオンの微量レ ベルを１μＭ以下のレベルまで添加する（１）。１２８　ｋＤａのへ量体の形成 がゲル濾過でモニターできる。上昇させたｐＨｌでその溶液を酸素飽和させると 組換えヘモグロビンの自己酸化を最小限に止める。
こうした反応を触媒する方法として好ましい以上のものに代わる方法は、還元型 グルタチオン及び酸化型グルタチオン、あるいは還元型及び酸化型ジチオトレイ トールのようなレドックス緩衝液を使用することである（２）。ジスルフィド交 換によるこうした反応の触媒作用は微量遷移金属の触媒を制御するために必要な ことなのであろう（３）。第二の同様な方法は、精製する前に６５　ｋＤａ種の 表面システィンをスルホネートに変換し［ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ］　（精製中に １２８　ｋＤａの種形成を回避するため）、次に還元型グルタチオンでジスルフ ィド結合した１２８　ｋＤａの種へト変換する過程を入れることである（２）。
（１）　Ｆｒｅｅｄｍａｎ、　Ｒ，Ｂ、　ａｎｄ　Ｈｌｌｌｓｏｎ、　Ｄ、Ａ、 　（１９８０）”Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　Ｂｏｎｄｓ ”工Ｎ：　Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｐｏ５ｔＴｒａｎｓｌａｔｉ ｏｎａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　Ｖｏｌ、　 １．　ｐ、　１５７　ｆｆ。
（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）。
（２）　ＤｉＭａｒｃｈｉ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、（１９８８）Ｃｈａｍｉｃａｌ 　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆｈｕｍａｎ　＠ｐｉｄｅｒｍａｌ　ｑｒＯＷｔｈ　 ｆａｃｔｏｒ　（ＥＧＦ）　ａｎｄ　ｈｕｍａｎ　ｔＹＰａ　ａｔｒａｎｓｆｏ ｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　（ＴＧＦａ）工Ｎ：　Ｐｅｐｔｉｄ ａｓ＋　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（Ｇ、Ｒ，Ｍａｒｓｈａ ｌｌ、　ａｄ、）　ｐｐ、　２０２−２０３（Ｌｅｉｄｅｎ：ＥＳＣＯＭ）。
（コ）　Ｃｒａｉｇｈセｏｎ、　ＴＥ　（１９７８）　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎセａ ｌ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｏｌｄｉｎｇ　ａｎｄ　ｕｎｆｏ ｌｄｉｎｇ、　Ｐｒｏｇ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｍｏ１ａｃ、　Ｂｉｏｌ。
その他の内部システィンリンケージかある多量体ヘモグロビン様タンパク質 ２つのモノシス分子をホモニ官能架橋剤で結合して、還元不能な結合を経てリン ケージすることも勿論可能である。重合の度合はモノシスジアルファかジベータ ■ｇｂの開始物質を使用することによってなお制御される。　” ｂｉ−、ｔｒｉ−、ｔｅｔｒａ−、ｂｅｘａ−、またはｏｃｔａ−の官能的クロ スリンカ−を使うことによって、より長い血清半減期に貢献するであろう多量体 ヘモグロビンのいくっがの特性を制御できる。そうしたクロスリンカ−は２つの 四量体間を還元不能結合するように作ることができるので、ｎ＞２の偽四量体（ 例、１２量体なと）の高い分子量の多量体を作ること、及び／又はヘモグロビン 八量体の全体的な等電点を落としてその半減期をさらに延ばすこともてきる。
分子量と、ＩＬ−２のようなタンパク質の血清半減期との相関関係は、タンパク 質の分子量が増加すると有意的により長い半減期、特に５０〜７０　ｋＤａとい う腎臓の濾過作用限界以上のものが期待できることを示す。しかし四量体間のジ スルフィド結合によって形成される多量体ヘモグロビンの半減期を潜在的に制限 する因子は、血清中にある内因性［ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ］チオール還元剤にょ るｃｙｓ−ｃｙｓジスルフィド結合の還元である。血漿中にある小さな分子のチ オールのレベルを見積れば、１７μＭ〜５μＭで変化している。主要な種［５ｐ ｅｃｉｅｓ］は還元型グルタチオンである。血・葉中にあるその他のチオール化 合物としては、システィン、ホモシスティン、及びγ−グルタミルシスティンで ある。このように、小さな分子の血漿チオールはジスルフィド結合の還元に用い られる。このことは立体的に阻害された、し、たがって還元がしにくいα−メチ ルジスルフィド（４２，５時間）でリンクされた接合体に比較し、通常のジスル フィド（６，７時間）によってリンクされた抗体−リシンＡ鎖抱合体に見られる 縮小された半減期に反映されている。
このように、１実施例では、へ量体ヘモグロビンはチオエーテル結合又はチオー ルーマレイイミド付加物のような還元不能な硫黄含有架橋を特徴とする。これら は多量体の半減期をかなり延ばすことができる。簡単なホモニ官能的クロスリン カ−またはポリエチレングリコール（ｐｅｇ）誘導体がこの目的にとって有益と なる可能性もある（後に詳述する）。三官能的システィン特異的クロスリンカ− とモノシスのジアルファ■ｇｂまたはシベータＨｇｂとの反応は、反応産物をダ ンベル様へ量体ヘモグロビンならびに無反応ヘモグロビンに制限してしまうこと がある。
この反応は、Ｈｇｂとクロスリンカ−が高い濃度で存在し、ＨｇｂがｐＨ６，５ 〜７．０のクロスリンカーマレイイミドより僅かに多くあるときは、化学量論的 となる。さらにグロビンのいりジンとの反応によって実質的に干渉されるような ことがあってはならない。
チオールのリジンに対する優先的反応性［ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｒｅａｃ ｔｉｖｉｔｙ］は、それらのモル比とマレイイミドのチオール対アミンに対する 固有反応性［１ｎｔｒｉｎｓｉｃ　ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ］の比の産物として概 略計算することができる。この産物はｐＨ７で、約（１ｃｙｓ／４０１ｙｓ）　 Ｘ　（１０００）＝２５である。副産物は、１つの付加部位が第２アミンで、し たがって官能的にＳ−架橋したへ量体に同等なへ量体である。マレイイミド付加 物のｐＨ７での加水分解は遅く、開環は架橋をそのままにしておくものであろう 。
チオエーテルＲＣ（＝０）ＣＨ２工のスルフヒドリルがついたタンパク質（Ｒ’ 　５ＩＮ）との反応は、架橋ＲＣ（＝０）ＣＨ２−５−Ｒ″をもたらす。マレイ イミドがこのタンパク質と反応すると、フレイイミド５員環の二重結合にわたっ てＲ’　Ｓｌ’ｌを付加し、チオマレイイミド付加物をもたらす。
下記は複数のモノシスティン偽四量体間に代謝的に安定な架橋を形成するホモニ 官能的クロスリンカ−の例である。
１　）　１．２−ｂｉｓ−（２−ヨードエトキシ）エタン２）　４．４’−シマ レイイミジルベンゼン、又はＮ、　Ｎ’−ｐ−フ二二しンジマレイイミド ３　）　Ｎ、　Ｎ’−ｂｉｓ−（３−マレイイミドープロビオニル）−２−ヒド ロキシ−１，３−プロパンシアミン より長い半減期は、長架橋剤［ａ　ｌｏｎｇ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ　ａｇ ｅｎｔ］を使って単に２つのリンクされた四量体間の距離を伸ばすことによって 見掛は上の分子量を増加させれば得ることができる。
ＳＧＥ、　１モノシスと反応するホモニ官能的クロスリンカ−のような可能性の ある新しいポリエチレングリコール誘導体を使えば、そのクロスリンカ−単独の 長さによってへ量体ヘモグロビンの分子量を有意に増加する１メカニズムを提供 することができる。
この目的に適するクロスリンカ−は次のようなものである。
マレイイミドーＣｔｌｚＣＨｚＣ（＝Ｏ）　（ＯＣｔｈＣＨｚ）、、ＱＣ（＝Ｏ ）Ｃ［ｈＣ■２−マレイイミ　ド 構造　最大長さ　ソース ｎ　”　２２　−４９人　Ｐ＠’ｊ　−１０００ｎ票７６　−１６６人　ｐａｇ 　−３３５０ｎ　ｍ　２２）　−４９９Ａ　ｐａｇ　−ｘｏｏｏ。
ホモニ官能的Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドで活性化されたｐｅｇを、前辺てヘ モグロビンを誘導しておくために使った。Ｙａｂｕｋｉら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉ ｏｎ、　３０：５１６　（１９９０）　この反応はｐｅｇ／ヘモグロビンの平均 化学量論数が６．２の一量体、二量体、三量体の各種の多分散混合物をもたらし た。しかしｐｅｇによって誘導されたヘモグロビンの８３％は別のヘモグロビン 分子に架橋されていなかった。野生型ヘモグロビンのｐｅｇ誘導による制御は不 可能であった。というのはヘモグロビン出発物質の部位特異的な標識がなかった からである。
逆に５ＧＥ１．１モノシス出発物質とｐｅｇクロスリンカ−との組合せはほぼ単 分散なダンベル（偽へ量体）産物牽生成する。クロスリンカ−付加部位の部位特 異性は、クロスリンカ−の大きさに従う見かけ分子量の正確な制御をもたらす。
さらに組換えヘモグロビンの表面でのｃｙｓ突然変異部位を慎重に制御すれば誘 導されたヘモグロビンの機能性が維持されることを確実にする。
より高次の多量体ヘモグロビン −上記のクロスリンカ−は全てクロスリンカ−の各端に１つの四量体が付加され ている。１つのクロスリンカ−に２つ以上の四量体を付加することができれば、 それはより多量の酸素運搬能を生み出し、また分子量を一層増大させるのに有利 となろう。
１つの多量体ヘモグロビンは、ヘモグロビン四量体または偽四量体のシスティン 残基が直接、間接に付加された活性部位の制御された数を各々がもっている、１ つまたは２つ以上のリンカーヘプチドの助けて組合せることかできる。
ある程度の長さのペプチドリンカ−には、それか血清プロテアーゼにより分解さ れ、それで多量体ヘモグロビンをその成分四量体に分解するというおそれかある 。この問題は、もしそのとおりに有意味であるのなら、タンパク質加水分解に感 受性が比較的低いペプチドリンカ−を使用することによって解決することができ る。このようなリンカ−を非制限的リストに挙げれば、Ｄ−アミノ酸からなるペ プチド、安定した伸びた二次構造のペプチド、枝分かれしたペプチドなどがある 。
Ｄ−アミノ酸からなるペプチドの場合、Ｄ−ＧｌｕまたはＤ−Ａｓｐを使うこと か特に好ましい。
多（の安定な、伸びた二次構造が知られている。最も簡単なのはポリプロリンで あろう。もう一つの例は、２本のペプチド鎖が相互に巻き付く２本鎖のねじりら せんである。４らせんのまたは４本鎖のねじりらせんもある得る。
リジンの二次アミノ基の誘導［ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ］から得られたものなどの 枝分れ構造は、典型的にプロテアーゼに抵抗性がある。
所望なら上記アプローチの複数のものを組合せることができる。例えば何本かの ねじりらせんを枝分かれ構造の先にするとか、Ｄ−アミノ酸をねじりらせん中に 組み込むなどできる。
仮説的な４−四量体ねしりらせんリンカ−複合体［ｃｏｍｐｌｅｘ］を図４（ａ ）に示す。これらのねじりらせんペプチドの設計および合成は既に試みられてい る（例えばＣｏｂｅｏとＰｅｒｒｙの、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ。
７：１−１５　（１９９０）参照）。ねじりらせんの理論的解釈［ｒａｔｉｏｎ ａｌｅ］は２本の相互に巻き付いたαヘリックスは、伸びたペプチド（プロテア ーゼによって急速に切断される）、αヘリックスまたはβシートのような１つの 裸二次構造よりタンパク質加水分解切断に感受性か少ないだろうということであ る。　分子モデルを使って説明する゛と、鎖同士が共有結合によって付加される ように内部的ジスルフィドを三官能的ねじりらせんリンカ−の中央部で設計する ことができる。これはモノシスジアルファまたはンベータＢｇｂ（例えばｓｇｅ ｌ、１　ｃｙｓ）が付加される前に、正しいねじりらせんクロスリンカ−の形成 を安定化する。また、三官能的クロス＋１ンカーは、タンパク質的に不活性な二 次構造の中央部におけるジスルフィドよりも、直交的に保護されたリジン（１ｙ ｓ−ＦＭＯＣ）を使用することによって安定化できる。ポリプロリンらせんをリ ンカ−として使うこともてき、側鎖を除去した後】ｙｓ−ＦＭＯＣにおける合成 を枝分かれさせることによって安定化することができる。枝分かれしたペプチド 中の３つの残ったリジンは次に、無水ヨード酢酸またはＮ−スクシンイミジルヨ ード酢酸［Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｉｏｄＮ−５ｕｃｃｉｎｉ］のいずれ かを使ってチオール反応基に部位特異的に付加し、その後ｓｇｅ１．１−ｃｙｓ と反応させるためヨードアセチル化される。類似の四官能的クロスリンカ−が２ つの内的に枝分かれするリジン間に１〜２個のプロリンを挿入してそれらを直交 的に保護されたリジンがら伸びた２つの内的に枝分かれした鎖か（はぼ）反対方 向に向くように回転させることによって合成することができる。類似体構造はプ ロテアーゼ抵抗を与えるためＤ−グルタミン酸（Ｅ）またはＤ−アスパラギン酸 （Ｄ）を使って作ることができ、これらはｐＨ７で伸びたポリアニオン鎖を形成 する。
仮説的なαヘリカルのねじりらせんの配列は５ｅｎｃｈｕｃｋ　ｉｎ　Ｐｅｐｔ ｉｄｅｓ：　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ；　５６６　（Ｒｉｖｅｒ　ａｎｄＭａｒｓｂａｌｌ、　ｅｄｓ：１９９０ ）の説に従い各端に２つのリジン（Ｋ）だけを残すというように修正される。
ＡｗｌＣＣＩＥＬＥＧＲＬＥＡＬＥＧＲＩＪＪＬＥＧＲＬＥＡＩＪ：ＧＲＬＥＡ ＬＥＧＸＬ−７ミドこのねじりらせんはへソックスに約１０のターンを有してお り、したがって約５４人の長さであって、立体的干渉なしに各側に２つの四量体 が付加することを可能にしている。４つの四量体を適切に配置することを可能に する正確な配列および長さは分子モデルの結果次第で決まる。
示唆される三官能的、四官能的なりロスリンカ−は次の通りである。
三官能 四官能 ｎ＞　６−８．、ｒｎ−１ｏｒ２ （Ｄはより大きなプロテアーゼ抵抗のＤ−アミノ酸でもよい）（★★は反応部位 を示す：にはリシン：Ｐはプロリン：Ａｃはアセチル：■はヨウ素：ＤはＤ−ア スパラギン酸またはＬ−アスパラギン酸：それぞれのＫは偽四量体がねじりらせ んの対向面に付加するように対面している） 図４Ａ参照。
もう一つの可能性は８−ヘモグロビン複合体である（図４Ｂ）。
この種の複合体について考察する理論的解釈は、「クロスリンカ−」の著しい安 定性と複合体の実質的により高い分子量とのゆえに、これが非常に長い半減期を 得る方法であろうということである。クロスリンカ−は枝分かれを可能にするた め、鎖の真ん中にあるＡｒｇをＬｙｓ（ＦＭＯＣ）で、また、その枝分かれする 部分をなすポリプロリンへソックスまたはその他のプロテアーゼ抵抗の二次構造 で、取り替えて二重に枝分かれしたねじりらせんの形をとるかもしれない。この 構造はクロスリンカ−１つにつき６つの５ＧＥ１．１の付加を可能にする。ある いは４−ヘリカル東タンパク質（図４０参照）、またはＤｅＧｒａｄｏ、　５ｃ ｉｅｎｃｅ、　２４３：６２２　（１９８９）が合成したような、４−ヘリカル 束中の各ヘリックスはコンセンサス配列ＧＥＬＥＥＬＬＫＫＬＫＥＬＬＫＧ、　 （配列番号９）を有し、それらのへソックスは３つのＰＲＩ？ループまたはＲＰ Ｒループでリンクされたものである、４本鎖のねじりらせんが、このリンカ−の ための適切な核として利用できる。これは、たたまれた状態をたたまれていない 状態から分けるＧ　＝−２２ｋｃａｌ／Ｉ［１ｏｌｅを有する、知られている最 も安定なタンパク質の一つである。各ヘリックスは４＋ターンすなわち約２２人 の長さである。これではへソックスの各端にアンカーされた１つに２つのヘモグ ロビンをフィツトさせるに十分な空間［ｒｏｏｍ］とならないので、同じへソッ クスの違う面に付加されなければならず、各ヘリックスの極性面の各端に配置さ れたリジンに付加される。各ヘリックスは両親媒性であるから、全部で８つのリ ジン（それ以上でない）をもち、残りのリジンをアルギニンに変える相対的自由 度を可能にする。
ヘリックス１つ当たり（ｉ＋４）個の塩橋があるとき、ｉの少なくとも２つがタ ンパク質の安定性のため保持される。外部がら架橋できるシスティンのある四量 体の付加はりジンεアミノ基のヨードアセチル化、そしてシスティンのチオール 基との反応を経て行われ、る。
複数の四量体間によりおおきな空間［ｒｏｏｍ＋］を可能にする修飾［ｍｏｄｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ］の１例はＡへソックスおよびｃヘリックスのＮ末端、ならび にＢへソックスおよびＤヘリックスのＣ末端に、ヘリックスの１ターンを付加す ることで行われる。この修飾ならびにこれに類似の修飾はモデルを考えたり実験 を行ったりするときの制約に従って変更されるべきものである。
類似のコアタンパク質を、８つの（トポロジー的に可能なら９つ以上の）リシン （ヘリックス１つ当たり２つ）が後の修飾および四量体の付加のため表面に存在 するように、ミオヘメリスリン［Ｉｏｙｏｈｅｎｅｒｙｔｈｒｉｎ］またはアポ フェリチン［ａｐｏｆｅｒｒｉｔｉｎ］のような知られた４−ヘリカル束タンパ ク質の突然変異体として作ることができる。
等電点を下げたポリ（四量体）ヘモグロビンもし架橋された全接合体の等電点が 血清の半減期にも影響を及ぼすものなら、腎臓濾過の「細孔」からの静電気排除 ［ｅｌｅｃｔｒ。
５ｔａｔｉｃ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ］を経て、その架橋自体に（分子の機能を変 更することができるヘモグロビン中ではなく）追加的な負電荷が含まれ、架橋し た粒子［ｐａｒｔｉｃｌｅｌ全体の等電点を下げる。これのさらなる利益は、カ チオン化されたアルブミンのｐＩ関数である細網内皮系［ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎ ｄｏｔｈｅｌｉａｌ　５ｙｓｔｅｃｌによる取込みを少なくすることである。
等電点と修飾したリジン数とを関連させる５ＧＥ１．１のサクシニル化からの予 備的証拠を我々はもっている。これは５またはそれ以下のｐＩにとどくに必要な ｇｌｕ突然変異に対するｌｙｓ、及び／又はａｓｐ突然変異に対するｌｙｓの数 の大略の予想となるもので、ここでいうｐＩの範囲は我々が半減期を有意に延ば す必要があると考えているものである。８つほどのリジンを修飾すれば（１６ユ ニツトの全シフト）ｐｌをおおよそ２ユニツト落とすと考えている。αグロビン サブユニットおよびβグロビンサブユニット自体の突然変異によるよりもペプチ ドクロスリンカ−でこれを行う方がヘモグロビンの機能特性をそれほど混乱させ ないですむと考えられる。しかしある種の突然変異はクロスリンカ−およびサブ ユニット中の残りで行われ得る。前と同じようにして、ｐｔ１６．５〜７．０で 反応させることにより５ＧＥ１．１−ｃｙｓがヨードアセチル化リジンεアミノ 基に付加される。
ラット中のヒト血清アルブミンについては、半減期は生アルブミン（ｐＩ＝４） についての値約４．６時間から９．５以上のｐＩで０．８時間まで、タンパク質 のｐｉと概ね直線的に変化した。増大したｐＩで細網内皮系への潜在的に増大し た取込みを含んでクリアランス［ｃｌｅａｒａｎｃｅ］はおそらく倍数的なもの だった。ラットトリプシノーゲンにとって、５．−０のｐＩ（４分のｔｌ／□） 変化を伴う血清半減期の違いはより長いものだった。このように低いｐｘはこれ らタンパク質の血清半減期における重要な変数であることが明らかに認められた 。
次の表には複合体全体の等電点を減少させる複数のモノシス四量体間のクロスリ ンカ−の例を挙げている。
Ｘ＝Ｄ−またはＥ− たくさんの提案されたクロスリンカ−は、少なくとも２、おそらくは３のこれら 属性を相加効果として組合せることができる。
樹脂上でリジンアミン基を脱保護後、ヨード酢酸を付加されるべき最後のアミノ 酸として処理することでペプチド合成している間に、ペプチドクロスリンカ−中 の特定のアミン基が直接ヨードアセチル化され得る。この場合、リシンは直交的 にＮ−ＦＭＯＣ基、Ｎ−ニトロピリジンスルフェニル基またはＢＮＰＥＯＣで保 護される。これは大いに合成を簡素化する。
合成の１工程として行うヨードアセチル化の別の方法論としては、ｓｇｅｌ、１ −３ｔｌまたはペプチドクロスリンカ−のいずれかを、スルホ−３ＭＣＣその他 のＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、比）から入手 できる同様な試薬のような、スルフヒドリルとかアミンに特異性のへテロニ官能 的クロスリンカ−と反応させることである。
遺伝子的に融合したポリ（四量体）へモグロビン多量体（例、ポリ四量体）ヘモ グロビンの調製へのもう一つの方法は、個々の四量体を別のリンカ−を使って遺 伝子的に融合することである。所望の分子量および最終的な分子のたたみこみ効 率［ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｏｆ　ｆｏｌｄｉｎｇ］次第で、２つまたは３つ以 上の四量体をリンクできる。ジアルファまたはシベータＨｇｂの別々の四量体か ら得られるジアルファ（またはシベータ）サブユニットを各々の偽四量体ドメイ ンをリンクする伸ばされたボタンバク分解に対して安定な広げられたポリペプチ ドリンカ−は、思い描くことができる。所望のリンカ−の特徴は１）ジアルファ （またはシベータ）末端ドメインに入るとき柔軟性を付与する多数のグリシンが 各端にあること、２）ポリプロリンヘリックスのような広げられた構造で、また はポリグルタミン酸、またはポリアスパラギン酸によって得ることができる四量 体を分離する固さ［５ｔｉｆｆｎｅｓｓ］、そして３）プロテアーゼに対する耐 性（上記参照及びコラーゲン配列にみられるように）、である。かかる配列の例 を下にいくつか挙げる。本明細書中に述べたペプチドリンカ−以外のものも、融 合したジアルファ（またはジベータ）末端環境をはじめに立体的に設計した後で 試みることができることは明らかである。リンクは、あるシアルコアのＣ末端か ら次のジアルファのＮ末端へとわたっており、単一遺伝子として合成される。プ ロテアーゼ耐性または負荷電された二次構造のセグメントを設計するほかに、１ または２以上のＡｒｔｅｍｉａリンカ−が四量体間に設計されるべきである。β 鎖もこのようにして結合され得る、尤もそのタンパク質機能への結果は不明であ るが。追加的な路内架橋を伴うか伴わないで細胞内シベータ（ｓｇｅｌ、　１） を作ることが最も考えられる所である。
起源　配列 ポリプロリン　シαまたはジβＣ末端−（Ｇ）ｎ−（Ｐ）ｎ−（Ｇ）ｎ−ヘリッ クス　シα又はβＮ末端、おそらくｎ≧３、おそらく■≧１０〜１２ ポリアスパラギン酸　−（Ｇ）ｎ−（Ｄ）ｎ−（Ｇ）ｎ−又は−グルタミン酸　 （複合体のｐＩは落ちる）ヘリカルね゛じれ　−（Ｇ）ｎ−ＫＣＡＥＬＥＧ（Ｋ ＬＥＡＬＥＧ）　４らせん　−末端に融合されない（ねじれらせん架橋でへ量体 を形成する）（配列番号３）我々は最小限の四量体内リンカ−を次のように決定 した。Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋから取り寄 せるか組合せたヒトヘモグロビンＡ。の２つの構造（両者がオキシ形か、両者が デオキシ形かのいずれか）は、プログラムＩｎｓｉｇｈｔ（Ｂｉｏｓｙｍ、　Ｉ ｎｃ、。
Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）を使って、どんな残基間にもファンデルワールス オーバーラツプなしに出来る限り近接させてドックされた。
α鎖Ｃ末端残基ａｒｇ１４１からα鎖Ｎ末端残基ｖａｌｌ（１構造て）のアミノ 末端窒素までの距離が次に測定された。この距離は両分子がオキシ構造のとき約 ２２人で、両分子がデオキシ構造のとき約１８人だった。オキシとデオキシ構造 ては、α鎖Ｎ末端のバリンはその構造の裂は目［ｃｌｅｆｔ］の側部［５ｉｄｅ ］に露出し、ａｒｇのカルボキシルは裂は目の底にあった。このようにこれら２ つの末端を末端アミノ酸のいずれの周りの残基をも大きな構造的交換［ａ　ｌａ ｒｇｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ］　Ｌないで遺伝子 的に融合することは可能である。適切な四量体同士のリンカ−は少なくとも長さ １８〜２２人であること、好ましくはその構造に余裕のある柔軟性を付与するた めにそれより長いのがよい。リンカ−の長さについてはなんら固定的な上限はな いが、リンカ−が長ければ長いほどプロテアーゼにそれだけ感受性があるし、も しその分子が十分に長いと見えるものなら、細網内皮系のマクロファージによっ て食細胞されることができる。適切なリンカ−の例をいくつか下に挙げてみる。
以上とは違う融合を第１のヘモグロビンの一端が切り取られたα鎖と第２のヘモ グロビンのＮ末端αｖａｌ　１との間に思い描くことができる。第１の分子はｓ ｅｒ　１３８で切断できる。この分子内のＮ末端からＣ末端まての距離は約１７ 人（デオキシ）、約２２人（オキシ）である。この距離を張り渡す遺伝子的に挿 入されたリンカ−を下に挙げる。
このようにして２つのヘモグロビン分子を（２つの分子間αドメインを融合する ことで）リンクすることができ、正常ヒトヘモグロビンの大きさの約２倍の融合 遺伝子を作り出す。二量体中へのヘモグロビンの解離を阻止するためｒＨｂｌ、 　１中に導入される追加的な分子内架橋も含めることができるが、これは４つの αドメインのある融合となる。
遺伝子的に挿入されたリンクは、その結合を囲む２つのヘモグロビンによる立体 的閉鎖［５ｔｅｒｉｃ　ｏｃｃｌｕｓｉｏ口］があるため、プロテアーゼの存在 下で安定する。殆どのプロテアーゼはグリシン（これは側鎖として水素しがもた ないがら、プロテアーゼのための基質は弱いに＋＋＋となる）以外の残基に対し て側鎖特異性をもつので、この耐性は、プロテアーゼに感受性を少ししか示さな い結合をなすグリシンの使用によってさらに促進される。ポるために使うことか できる。ポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸のリンカ−としての融合は 、その複合体にずっと低い等電点を許すことになり、したかって血清に長い半減 期を与えるものとなる。
偽オリコマ−ポリペプチド内への封入［１ｎｃｌｕｓｉｏｎ］のための四量体間 リンカーリンカ−両端間　コンフオ　注釈 の距離　メーション （ｇｌｙ）ｔ　２５人　伸長　オキシ及びデオキシ構造中の末端をスパンするｇ ｌｙリンカ−の最短長さ。それより長いリンカ−（２０〜５０残基まで）もうま く使用できる。
（ｇｌｙ）＋−３２０八〜　右巻きのα　ＧｌｙをＮ及びＣ末端と融合するとき のＨｇ構−（ａｌａ）ｔ□−４ＯＡ　ヘリックス　造の柔軟性及び加害を最／Ｊ ｌ艮にするため（ｇｌｙ）＋−３中のＡｌａ　Ｇｌｙか付加される。長さはグリ シンの数、−ヘリックス　及び伸びる程度に依って異なる。
−（ｇｌｙ）＋−３２１八〜　左巻のポリ　１２．１４．１６ブロリン。長さは プロリンと−（ｐｒｏ）　＋□−１６４８人　プロリン　グリジンの数に依って 異なる。
（ｇｌｙ）＋−３−２６λ〜　Ａｓｐ残基は負電荷を追加する。
（ａｓｐ）ｔ−３ｏ−４９人 （ｇｌｙ＋−３）− 外来タンパク質として多量体を認識することを妨げるため、ヘモグロビンのよう なその他の知られたヒトタンパク質の配列から取った完全なリンカ−などのその 他の残基も、長さを本質−的に同一にしたままでこれらのリンカ−中に置き換え られ得る３最大長さ１８Å以上、２２Å以下のリンカ−の使用はデオキシ構造を 際立って安定化することかでき、その多量体の酸素親和性を低める結果になる。
偽オリゴマーグロビンを使わずに形成された六量体ヘモグロ旦２ より高次の多量体を実際に産生ずることなく、α鎖またはβ鎖のいずれかの適当 なシスティン突然変異によってへ量体ヘモグロビンを産生ずることは可能である （図５参照）。
システィンに突然変異された残基が共にそのサブユニット表面上または表面近傍 であって、それらサブユニットを分離している二回対称軸に近い、β鎖遺伝子中 （四量体光たり２つ）またはα鎖遺伝子中（四量体光たりゃはり２つ）にあるＸ がらｃｙｓへの突然変異を有するヘモグロビン突然変異体は、２つのジスルフィ ドでリンクされたへ量体（２つのヘモグロビン）を形成する。
１つのジスルフィドの形成後第三の入ってくるヘモグロビンが２つのもとのヘモ グロビンのいずれかのフリーなシスティンと反応することを立体的に＊阻害する がら、かがる突然変異体の重合は２つのジスルフィドが互いに近接しているため 遅らされる。
この突然変異体かより高次のポリマーを形成する可能性があるので（単にへ量体 ではなく）、ジスルフィド結合の形成のた１　め希釈溶液を使うことができる。
ヘモグロビン重合の運動力学［ｋｉｎｅｔｉｃｓ］はヘモグロビン濃度が少なく とも二次のオーダーであるが（またはより高いオーダー）、１つのジスルフィド が形成された後は、２つの四量体間の二次ジスルフィド形成はヘモグロビンで零 オーダーとなる。このように重合生成物のへ量体に対する比は、ヘモグロビン濃 度が減少するき減少する。もしへ量体形成を酸素供給条件下で行えば、２つのｃ ｙｓ突然変異間の距離はデオキシヘモグロビン構造におけるよりもオキシヘモグ ロビン構造においての方か常に相対的に小さいから、ポリマーに対するへ量体の 回収率は一層増加するだろう。
β鎖およびα鎖両者における好ましい突然変異部位は下記の通りである。
ジスルフィド結合でリンクされたへ量体ヘモグロビンを形成するＸからｃｙ６へ の突然変異のためのβ及びα鎖の突然変異部位βＡｓｎ　２２　１８　何ら有害 な突然変異はリストされてぃ８０−”ｃｙｓ　ない。ａｓｎ８０は表面にある。
βＡｓｐ　２４　２２　Ｈｂ　Ｔａｍｐａ■（ａｓｐ−ｔｙｒ）に重大な異常７ Ｏ−ｃｙｓ　特性は認められない。Ｈｂ　Ｇ−Ｈｉｓ−ＴｓｏｕαＡｓｎ　２４ 　２０　表面にある。ａｓｎ７８の公知の突然塵７８−ｃｙｓ　異において重大 な＠異常特性は認められない。
αＡｓｐ　２２Ａ　１８　表面にある。ａｓｐ７５の公知の突然塵７５−”ｃｙ ｓ　異において重大な異常特性は認められない。
αＡｓｐ　２６　２０　表面にある。ａｓｐ７４の公知の突然塵７４−ｃｙｓ　 異において重大な＠異常特性は認められない。
■Ｆ１．Ｎ、　ｌＦｒｉｇｂｔｓｔｏｎｅ、　Ｐｏ１ｉｃｉｅｓ　ｏｆ　ｔｂｅ 　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ｉ獅■盾窒氏{ａ ｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　（Ｉ［Ｃ）、　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　５ｉｃ ｋｌｅ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏ撃撃bｏ１ １ｅ　Ｇｅｏｒｇｉａ、　１９８８ 遺伝子の構築および発現 個々のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列はゲノム、ｃＤＮＡおよび合成物 を起源とするが、それらいずれかの組合せである。
ゲノムグロビン遺伝子はイントロンを含むので、ゲノムＤＮＡはプレメツセンシ ャーＲＮＡを正しくスプライスできる宿主中で発現されるか、イントロンを切り 出す［ｅｘｃｉｓｅ］ことによって改変されなければならない。少なくさも部分 的に合成された遺伝子を使うことはいくつかの理由がらして好ましいことである 。第一に所望のアミノ酸をコードするコドンが、その配列中の便利な点に特殊な 、ないし幾分特殊な制限部位を提供する観点から選択することができるから、カ セット突然変異生成による配列の迅速な変更を行うことができる。第二にコドン は、選択した宿主中に発現を最大限行えるようなものを選択することができる。
Ｅ、　ｃｏｌｉ中の好ましいコドンについてはＫｏｎｉｇｓｂｅｒｇ、　ＰＮＡ Ｓ。
８０：６８７−９１　（１９８３）参照。第三にメツセンジャＲＮＡ転写物で形 成される二次構造は、転写または翻訳の障害となり得る。もしそうなら、こうし たにコドン選択を変更することで解消することわれるときは、リンカ−は合成り ＮＡで普通にコードされる。
本発明には特定の宿主細胞や、ベクターあるいはプロモーターを使わなければな らない制限がない。宿主細胞は原核生物でも真核生物でもよく、後者の場合には 植物、昆虫、または哺乳類（ヒトを含む）いずれの細胞でもよい。細胞はどんな 組織型［ｔｉｓｓｕｅ　ｔｙｐｅ］でもよいが、特に赤血球がよい。しかし好ま しい宿主細胞は細菌（特にＥ、ｃｏｌｉ）および酵母（特にＳ、　ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ）の細胞がよい。選択されるプロモーターは所望の宿主細胞中で機能す るものでなければならない。それは誘導のとき高率で転写を行う誘導可能なプロ モーターが好ましい。好ましい細菌プロモーターとしては、ＤｅＢｏｅｒ、米国 特許第４５５１４３３号に記載さイブリッドがある。使用可能なその他のプロモ ーターとしては温度に感受性のλＰｔ、およびＰ、プロモーター、ｌａｃ、　ｔ ｒｐ、　ｔｒｃ。
ｐＩＮ（リポタンパク質プロモーターおよびｌａｃオペレーターのハイブリッド ）、　ｇａｌおよび熱シヨツクプロモーターがある。使用されるプロモーターは 自然発生プロモーターのいずれかと同一でなければならない必要はない。プロモ ーターを設計するためのガイダンスはＢａｒｌｅｙとＲｅｙｎｏｌｄｓ、　Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１５：２３４３−６１　（１９８７） 、およびそこに引用されている文献を参照せよ。
第一の構造遺伝子に対するプロモーターの位置は最適化することができる。ＲＯ ｂｅｒｔＳらのＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、　７６：７６０−４　（１９７９）参照 。
単一のプロモーターを使うのが好ましい。適切な酵母発現系については後に詳述 する。
使用されるベクターは、宿主細胞中で機能する複製開始点を有するものでなけれ ばならない。また好ましくはグロビン遺伝子および所望の調節エレメントを挿入 するための特殊な制限部位ならびに従来の選択性マーカーももっているのがよい 。ベク部位を導入または除去するように改変されるのがよい。
多量体ヘモグロビンの成分ポリペプチド鎖は、直接、または融合タンパク質の一 部分として発現される。融合タンパク質として発現されるときは、後者は外部か らのポリペプチドがないグロビン関連部分を放出するため分割される部位を有す る。もしそうなら、Ｎａｇａｉ及びＴｈｏｒｇｅｎｓｏｎ、　ＥＰ　Ａｐｐｌ　 １６１９３７に記載さい。あるいは、融合タンパク質は合成することもでき、た たみこまれ、ヘムを組み込んでヘモグロビン類似体を得ることもできる。成分ポ リペプチドの直接的な発現が好ましい。
細菌［ｌＲＮＡでは、リポソームがメツセンジャに結合する部位は開始（ＡＵＧ ）コドンの上流４〜７塩基にあるポリプリンストレッチ［ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ 　５ｔｒｅｔｃｂ］である。このストレッチのコンセンサス配列は５′、　、　 、　ＡＧＧＡＧＧ、　、　、　３’で、シャイン・ダルガルノ配列と呼ばれてい るものである。５ｈｉｎｅとＤａｌｇａｒｎｏＳＮａｔｕｒｅ、　２５４：　３ ４　（１９７５）。ＳＤ（シャインダルガルノ）配列と翻訳開始コドンとの間の 正確な距離、およびこの「スペーサー」領域の塩基配列は、翻訳能力に影響する もので、経験的に最適化することができょう。
５ｈｅｐａｒｄら、ＤＮＡ　１：１２５　（１９８５）；　ＤｅＢｏｅｒら、Ｄ ＮＡ　２：　２３１　（１９８３）ＨＨｕｉら、ＥＭＢＯＪ、、　３：　６２３ 　（１９８４）さらにＳＤ配列は発現を変更するためにそれ自体を修飾してもよ い。ＨｕｉとＤｅＢｏｅｒ、　ＰＮＡＳ　（ＵＳＡ）、　８４：４７６２−６６ 　（１９８７）。
リポソーム結合部位の比較研究は、５ｃｈｅｒｅｒらのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓＲｅｓ、、　８：３８９５−３９０７　（１９０７）に見られるように、適 切な塩基の変更に関しカイダンスを提供するものとなろう。ヘモグロビンかＥ、 　ｃｏｌｉ以外の宿主中で発現されるときは、その宿主に好まれるリポソーム結 合部位が供給されていなければならない。Ｚａｇｈｂｉｌ及びＤｏｉ、　Ｊ、　 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１６８：１０３３−３５　（１９８６）。
選択したプロモーターとリポソーム結合部位を認識することができ、またヘムを 合成し取り込む能力を有しているならどんな宿主も使用することができる。細菌 宿主および酵母宿主が好ましい。
細胞内で組合せられるヘモグロビンはその産生細胞から回収することができ、な んらかの方法で精製することができる。
細胞中でのポリシストロンの発現 必要とされているわけではないが、サブユニットは細菌中で発現されるとき、同 −細胞中から同時発現されることが好ましく、さらにそれらがポリシストロンと して発現されればなお好ましい。ポリシストロンオペ石ンは１つのプロモーター 配列を有し、翻訳可能な配列をはっきりと確定する開始コドンおよび終止コドン の２つまたは３つ以上の対を有する１つのメツセンシャーＲＮＡ転写物をコート する。かかる配列の各々は「シストロン」として知られているが、こうしたシス トロンに対応するポリペプチドは１つのプロモーターを制御することによって同 時に発現される。
細菌オペロンの大部分はポリシストロンであって、いくつかの異なる遺伝子かそ れらのオペロンから単一のメツセージとして複写される。例えば３つのリンクさ れた遺伝子（ｌａｃｅ、　１ａｃＹ。
ペロンがある。これらのオペロンでは、メツセンジャーＲＮＡの合成はプロモー ターで開始され、その転写物内で、コード頭載はさまざまな長さのシストロン間 領域によって分割されている。
（オペロンは１つの転写可能な遺伝子ユニットとして制御される遺伝子のかたま りである）。翻訳能力はシストロンごとに異なる。Ｋａｓｔｅｌｅｉｎら、Ｇｅ ｎｅ、２３：　２４５−５４　（１９８３）シストロン間領域がリポソームのス パン［５ｐａｎ］（約３５塩基）より長いときは、１シストロンの終止コドンに おける解離に続いて次のシストロンにおいて独立的に翻訳開始される。相対的に 短いシストロン領域では、あるいはオーバーラツプするシストロンでは、末端リ ポソームの３ＯＳサブユニツトがポリシストロンのｍＲＮＡから解離し損ない、 次の翻訳開始部位に瞬間に引き付けられる。Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ、１４３−１４８’０ｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆５ｏｎｓ：　１９７７ ） 細菌ｍＲＮＡとは異なり、真核生物のｌｌｌＲＮＡは一般に本質的にモノシスト ロンである。Ｌｅｗｉｎ、　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　１５７１実施 例では、２つ又は３つ以上の成分ポリペプチドをコニトする遺伝子の発現は１つ のプロモーターによって行われ、遺伝子はポリシストロンのメツセンジャーＲＮ Ａ転写物が転写されるようにアレンジされ、そこから別々のグロビン様ポリペプ チドが後に翻訳される。しかし本発明は別々のプロモーターから異なるポリペプ チドを同時に発現すること、すなわち宿主が別々のαグロビンｍＲＮＡおよびβ グロビンｍＲＮＡを転写することを含む。
理想的には、αおよびβグロビン様ドメインが化学量論的に等量で発現されるの がよい。単一のプロモーターを使うことは均等性［ｅｑｕａ　１　ｉ　ｔｙ］を 保証するものではないが、１つの不均衡な影響−ｍ−プロモーターの強さや働き やすさの差に起因する転写の相違−ｍ−をなくすものである。プロモーターの強 さの相違が、同一プラスミドにつき２つの同一のプロモーターを使うことによっ て最小限に抑えることができるなら、相同領域の組換えに向かう性向があるので プラスミドの安定性は減少させられるであろう。
αおよびβグロビン様ドメインをコードする遺伝子は、リポソームがαグロビン シストロンを最初に翻訳するようにアレンジされるのが好ましい。理由はαグロ ビンがβグロビンのおりたたみに影響すると考えられることに根拠がある。しか しそれでも遺伝子の位置は、βグロビン様ドメインか最初に合成されるように切 り替えられるのがよい。
ポリジストロニックｍＲＮＡ転写物の安定性、αおよびβグロビン様ポリペプチ ドへのその翻訳の有効性［ｅｆｆｉｃａｃｙ］、およびグロビン鎖の四量体ヘモ グロビン中へのおりたたみは、シストロン間領域（１シストロンの終止コドンと 次のシストロンの開始コドンとの間の領域）の長さおよび塩基配列、第１のシス トロンに対する第２のシストロンの位相［ｐｈａｓｉｎｇ’］、あるシストロン の前のシストロンに対するリポソーム結合部位の位置ならびに配列、を変更する ことによって改変することができる。
好ましい実施例では、αおよびβグロビン様ポリペプチド遺伝子は、短い「導入 」シストロンまたは「リポソームローダ−」によって各々先行され、それに続（ グロビンシストロンの後の翻訳を促進する。図２において、領域Ａは２つのシス トロンと各シストロンに先行するシャインダルガルノ配列を有している。
第１のシャインダルガルノ配列（ＳＣＨ３）はリポソームにより結合され、次に それはオクタペプチドをコードする短いシストロンである第１シストロンを翻訳 する。（このシストロンは導入ストロンはグロビン遺伝子で、ここではＦＸαグ ロビン遺伝子である。第２のシストロンの翻訳を促進するシャインダルガルノ配 列（ＳＣＨ２）は第１シストロン内にある。このため、これら２つは「翻訳的に 連結されたＪ　［ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ　ｃｏｕｐｌｅｄｌと呼ばれ る。領域Ｂは第２シストロンがＦＸβグロビンをコードする点を除いて構造が同 一である。領域Ａ、Ｂ間には４３塩基シストロン間領域がある。領域Ａ、Ｂの導 入シストロンは５ｃｈｏｎｅｒら、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１５３：　 ４０１−１６　（１９８７）に示されているｐｃＺ１４４と呼ばれる２つのシス トロン発現系の第１シストロンに対応する。
しかし本発明は５ｃｈｏｎｅｒらの開示した特定の「スターター」シストロンに 限定されるものではない。続くシストロンの高レベルの翻訳を再開始させるそれ 以外の導入シストロンも使うことができるのである。
シストロン間配列の設計およびＳＤ配列の位置に関するカイダンスは、同じポリ ジストロニックオペロンの自然発生的または制御下で得た突然変異体の翻訳効率 を比較することで得ることかできる。その例については５ｃｈｏｎｅｒら、ＰＮ ＡＳ、　８３：　８５０６−１０　（１９８０）参照。さまざまなオペロンのシ ストロン間領域に関するコンセンサスの得られた特徴について調査することもで きる。ＭｃＣａｒｔｈｙら、ＥＭＢＯＪ、、　４：　５１９−２６　（１９８５ ）はＥ、ｃｏｌｉ　ａｔｐオペロン内での翻訳促進シストロン間配列を同定して いる。゛本発明は封入体［１ｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｉｅｓｌ中へのヘモグロ ビンまたはその成分ポリペプチドの局在［１ｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｌを減少な いし回避しようとするものである。したがって本発明の他の特徴は機能的ヘモグ ロビンか細胞の可溶性画分中に大量（好ましくは８０％以上）に認められること である。本発明に足れば、上述したようにしてテトラシストロンオペロンから同 時に発現されたα−およびβ−グロビン鎖からα２β２ヘモグロビンが作られた とき、９０％以上の機能的ヘモグロビンがそのように方向付けできると考えられ る。シアルファでは、β２ヘモグロビンは、発現が２５℃で誘導されたときほと んど１００％に近くのものが可溶性で、誘導温度がそれ以上に高温になると低い 割合になる。
これらのパーセンテージは細胞の可溶性画分中に認められる全てのジアルファ鎖 とβ鎖との割合であって、その細胞からのタンパク質の実際の回収ではない。
酵母中での発現 別の実施例では本発明は酵母中でヘモグロビン様分子を産生ずる。酵母中で発現 させるのに好ましい宿主は５ａｃｃｈａ匹ｇｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。しか しｂ匹」注ｕ四とがＰｉｃｈｉａなどの株、その他の菌類または酵母も同目的に 使うことかできる。適切な宿主の酵母としては組み換えベクターで形質転換可能 でなければならす、複製型［ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　ｔｙｐｅ］または組み込 み型［ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ　ｔｙｐｅ］のいずれかである。これは目的とす る遺伝子の所望のＤＮＡ配列を挿入することを可能にする。所望の遺伝子産物を 所望の反応容器から単離するに十分なように大量に細胞を高密度で細胞成長する ことかできなければならない。さらにそこでは成長は栄養組成、撹拌、酸素移入 および温度によって容易に制御できるのか理想的である。また培地、温度の操作 で、あるいはある特定の化学剤の添加や使用によってタンパク質合成の発現を引 き起こすことができるのが理想的である。最後に適切な宿主であるためには、そ の酵母は好ましくは全細胞タンパク質の１％以上の組換えタンパク質を産生ずる ことができなければならない。そうすれば所望の組み換えタンパク質を容易に単 離することができる。
Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体株または二倍体株のいずれかを使うことが できる。例えば次の二倍体株が好ましい。
ＢＪＹ３５０５　Ｘ　Ｒ５Ｙ３３０ ＢＪＹ３５０５　Ｘ　ＢＪＹ　１９９１これら以外の交配［ｍａｔｉｎｇ］も同 様に本発明を実施するのに使うことがでる。
プロテアーゼ欠損株の使用もまた有益である。
酵母発現系は次の２つの範−に分けることができる。（１）系がタンパク質を分 泌するように設計されていること、（２）系がタンパク質を細胞質中に発現する ように設計されていること、である。酵母細胞はインビボでグロビン鎖をおりた たみ、ヘムを組み込んでヘモグロビンを産生ずるから、現在では細胞質発現が好 まれている。しかしαグロビン鎖およびβグロビン鎖を別々に発現し分泌してヘ モグロビンをインビボ生成することが可能である。
グロビン遺伝子は適切なプロモーターの制御下に置かなければならない。通常用 いられる酵母プロモーターとしては一般に次の２つに大別される。即ち調節［ｒ ｅｇｕｌａｔｅｄ］プロモーターか構成的プロモーターかである°。広く使われ ている構成的プロモーターとしては、ＧＡＰ、　Ｐ（Ｊ（ホスホグリセレートキ ナーゼ）、およびα因子プロモーターがある。調節プロモーターもよく使われる が、酵母メタロチオネインプロモーター（銅によって調節される）、Ｇａｌ　１ −１０プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター（ガラクトースとグルコースで調節 される）、ＡＤＯＩＩプロモーター（エタノート調節）およびＰｔ１０５−ＧＡ Ｐ、　ＧＡＬ−ＰＧＫ、　ＡＤＨｎ−ＧＡＰ、　ＧＡＬ−ＣＹＣＩのような、い くつかのハイブリッドプロモーターがある。
ＧＡＬ−ＧＡＰハイブリッドプロモーターの使用が好ましい。両エレメント（Ｇ ＡＬｕＡ５とＧＡＰ転写開始部位）ともによく調べられている。ＧＡＬレギユロ ンの転写調節メカニズムの研究は広い分野にわたる。ガラクトースレギユロンは ガラクトースの利用に必要な酵素をコードする５つの遺伝子を含む。これら遺伝 子のうち４つ（ＧＡＬＩ、　ＧＡＬ７．　ＧＡＬＩＯ，ＧＡＬ２）はガラクトー スの存在下でしか発現しない。ガラクトース誘導は、酵母株がＲＥＧＩ遺伝子中 に突然変異を有していない限りグルコースの存在下では生起されない。ＧＡＬｌ 、７．１０および２の遺伝子は少なくとも２つのほかの遺伝子ＧＡＬ８０トＧＡ Ｌ４Ｇｍ　、Ｊ、　−）　で調節サレル。ＧＡＬ４遺伝子ハＧＡＬ１．７．１゜ および２の上流活性化因子配列（ＵＡＳＧＡＬ）がらのｍＲＮＡ合成を活性化す る転写活性化因子タンパク質である。ＧＡＬ４は構成的に発現するがガラクトー スの不存在下では機能的にサイレントである。
ＧＡＬ４活性の抑制はガラクトースの不存在下ではＧＡＬ８０遺伝子産物によっ て維持される。ＧＡＬ８０タンパク質はＧＡＬ４と物理的に相互反応して転写活 性を阻害する。おそらくガラクトースまたはガラクトース誘導体は、こうした相 互反応を阻害してＧＡＬ４で仲介された誘導を可能にするものと考えられる。
Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの半数体株は、酵素グリセルアルデヒド−３−リン 酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）をコードする３つの異なる遺伝子をもっている。
これらの遺伝子はＴＩ）［１，ＴＤＨ２，ＴＤｔ１３と命名され、２８％を、産 生ずる（ＭｃＡｌｌｉｓｔｅｒ、　Ｌ　ＭＪ、　Ｈｏ１ｌａｎｄ、　１９８５． 　Ｊ、Ｂｉ。
Ｉ　Ｃｈｅｍ、　２６０：　１５０１９−１５０２７）。Ｈｏ１ｌａｎｄのグル ープ（Ｈｏｌｌａｎｄら、１９８１、　Ｊ、Ｂｉｏｌ　ＣｈｅＩｌｌｌ、　２５ ６；１３８５−１３９５；　Ｈｏ１ｌａｎｄら、１９８３．　Ｊ　Ｂｉ。
Ｉ　Ｃｈｅｍ　２５８：５２９１−５２９９）はＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの ３つのＧＡＰ遺伝子をクローニングして特徴調査した。これらのクローンはｐＧ ＡＰｌｌ、　ｐＧ＾Ｐ６３．　ｐＧＡＰ４９１と命名された。ｐＧＡＰ４９１は ＴＤＨ３遺伝子に相当し、したがって最もよく発現する。
このプロモーターは６００−８５０ｂｐフラグメントとして一般に使われており 、本質的に非調節的である。その長い形では非常に強いプロモーターとなる。我 々か使った形は翻訳開始部位の５゛側２ｏｏｂｐだけでてきている。この形は、 その他の付加したエンハンサ−の配列なしにプロモーターのより長い形より実質 的に活性が小さかった（Ｅｄｅｎｓ、　ＬらＣｅ１ｌ、　３７：６２９　（１９ ８４））。ＧＡＬエンハンサ−領域に付加すると調節および高レベルの発現の双 方を示した。ＧＡＰ４９１プロモーターだけて、αおよびβグロビンが全細胞タ ンパク質の０．２％以下のレベルで産生された。ＧＡＬ−ＧＡＰ４９１ハイブリ ットプロモーターでは発現は全細胞タンパク質の７〜１０％へと飛躍した。
特に関心のあるその他のいくつかのプロモーターは、ＧＡＬ−３ＩＧＭＡ、　Ｓ ＩＧＭＡ−ＧＡＰ、　ＧＡＬ−ＥＦ　ｍ；　ＳＩＧＭＡ−ＥＦ　ＩＩＩである。
ほかのプロモーター系を考え出すことも容易にてきよう。種々の構成的プロモー ターかある。例えば酵母交配因子（メイティＫ）、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキ ナーゼ２、グルコキナーゼ、パイルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイ ソメラーゼ、ホスホグリセレートイソメラーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、 ホスホフルクトースキナーゼ、アルドラーゼプロモーターか全て使用可能である 。要するによく発現された酵母プロモーターなら何でも酵母中てのヘモグロビン 発現をするのである。
さまざまな自然発生の調節プロモーターも使える。例えばＧＡＬＬ−１０，ＧＡ Ｌ７．　ＰＨ０５，ＡＤＨｎは全て酵母中に異種タンパク質を産生ずるのに使わ れてきた。ＧＡＬ−ＰＧＫ、　ＧＡＬ−ＭＦ　ａ−１、ＧＡＬ−ＭＦａｌ、　Ｇ ＡＬ−５ＩＧＭＡのような種々の合成、半合成の酵母プロモーターも使うことか できる。ＡＤＨｎ調節配列もさまざまなプロモーターから出てくる強い転写開始 部位に結合することができる。ＰＨ０５調節配列またはσエレメント調節配列も 強力なハイブリッドプロモーターを構築するのに使用することができる。酵母プ ロモーターのほかに、Ｔ７プロモーターのような強力な原核生物プロモーターを 使うこともてきる。この場合には、Ｔ７ポリメラーゼを厳格に調節された酵母プ ロモーターの制御下におくことができる。
Ｔ７プロモーター調節下にヘモグロビン遺伝子を有する酵母細胞中にファージポ リメラーゼを導入することは、この非常に効率的なファージポリメラーゼによる 遺伝子の転写を可能にする。
上述の酵母調節配列の大部分は転写の正のレギュレータであるタンパク質のター ゲットとして機能するから、こうしたタンパク質が、ターゲット配列がたくさん のコピー中に存在する状態では転写を制限することがあるというこ吉も有り得る 。かかる状態は１細胞当たり２００コピー多く存在するｐｃＩＢ、　ｐＣＩＴ、 　ｐｃＩＵ、　ｐｃＩＮのようなベクターで得ることができる。正のレギュレー ター（例えばＧＡＬ４）の過度の発現は発現を促進することがある。
ＧＡＬ４遺伝子がそのプロモーターを除去するように変更され、そのプロモータ ーか、共にＧＡＬ４プロモーターより効率的に転写されるＧＡＬ７またはＧＡＬ Ｉ−１０プロモーターで代えた株を構築することが可能である。この状態では、 正の転写活性化因子タンパクより高次の真核生物リポソーム結合部位のコンセン サス配列はＫｏｚａｃｋ（Ｃｅ１１．４４：２８３−２９２　（１９８６））に より、ＧＡＡｃｃｃＡＵＧＧ（配列番号１０）と決定されている。この配列から の分岐、特に−３部位（ＡまたはＧ）での分岐は、あるｍＲＮＡの翻訳に多大な 影響をもっている。実質的にすべての高次に発現される哺乳類遺伝子はこの配列 を使っている。一方、高次に発現される酵［ｍＲＮＡは、この配列とは異なり配 列ＡＡＡＡＡＵＧＵ（ＣｉｇａｎとＤｏｎａｈｕｅ、　Ｇｅｎｅ、　５９：１− １８　（１９８７））を代わりに使っている。αおよびβ−グロビン発現のため に我々が使うリポソーム結合部位は、より高次の真核生物リポソーム結合部位に 対応している。酵母のＲＢＳ　［リポソーム結合部位］により近く類似させるよ うな変化による効果をテストするＲＢＳを系統的に変更することも本発明の範囲 内である。しかし−２゜−１＋３部位における変更は一般に、酵母における、ま た哺乳類における翻訳効果に僅かにしか影響しないことが発見されている。
Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中の遺伝子の細胞内発現はその遺伝子に結合したプ ロモーターの力、プラスミドコピー数（プラスミドで生まれた遺伝子）、転写タ ーミネータ−１宿主株、およびその遺伝子のコドン選択性パターンに、主として 影響される。遺伝子産物の分泌が入用なときは、分泌リーダー配列が重要になる 。マルチコピープラスミドで分泌効率は強いプロモーター構築によって減少し得 ることんみ注意すべきである。Ｅｒｎ５ｔ、　ＤＮＡ　５：４８３−４酵母細胞 を形質転換［ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅ］するのに種々の染色体外複製ベクター（プ ラスミド）を利用できる。最も有効なマルチコピー染色体外酵母ベクターは、Ｅ 、ｃｏｌｉプラスミドに連結された全長２μｍサークルを使うシャトルベクター である。これらのベクターは適切な酵母突然変異体中にあるプラスミドを維持す ることができるようにする遺伝子、及びＥ、　ｃｏｌｉ中での選択を可能にする 抗生物質耐性マーカーをもっている。全長２μのサークルを使用することは単に 部分的な２μ配列を有するベクターと対照的に、ずっと高次のプラスミド安定性 を一般にもたらすもので、特に内因性２μプラスミドを取り除かれている酵母株 中にあってそうである。ここに記載したベクターのｐｃシリーズはこのタイプの ベク多−′である。
酵母組込みベクターを使って染色体中にＧＡＬＧＡＰヘモグロビン発現カセット を組み込む方法で株を構築することができる。ヘモグロビン遺伝子のコピー数は プラスミドベクターのものより低いてあろうが、ヘモグロビン遺伝子は極めて安 定であって、おそら（宿主細胞中に維持されていなければならない選択を必要と しないであろう。酵母組み込みベクターとしてはＹｉｐ５（Ｓｔｒｕｈｌ　ＰＮ ＡＳ、　７６：１０３５−３９．１９８９）、　Ｙｉｐｌ　（Ｉｄ、）、　ＰＧ Ｔ６　（ＴｃｈｕｒｎｐｅｒとＣａｒｂｏｎ、　Ｇｅｎｅ、　１０：１５７−１ ６６、１９８０）がある。これらの酵母ベクターならびにその他の酵母ベクター についてはＰｏｕｗｅｌｓら、凱ｏｎｉｎ　Ｖｅｃｔｏｒ、　ＶＩ−Ｉ　蛙」朋 、　（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　１９８５）参照。
所望のグロビン様ドメインをコードする遺伝子は、別々のプラスミドにより、ま たは同一のプラスミドて同時に導入することがてきるてあろう。
高レベルに発現される酵母遺伝子は非常に高いコドンバイアス［ｃｏｄｏｎ　ｂ ｉａｓ］を示す。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼとＡＤＩＴ −１をコードする遺伝子は、例えば２５個のコドンセットにつき９０％のバイア スを示す。高次に発現する酵母遺伝子（全ｍＲＮＡの〉１％）は〉、９０の酵母 コドンバイアスインデックスである。緩慢に発現する遺伝子（全ｍＲＮＡの０． １〜．０５％）は０゜６〜０．８のバイアスインデックスで、低いレベルで発現 する遺伝子（全細胞タンパク質の＞０．０５％）は０．１０〜０．５０（Ｂｅｎ ｎｅｔｚｅｎ　ａｎｄＨａｌｌ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５７：３０２６ −３０３１　（１９８２））のコドンバイアスである。ヒトαグロビンｃＤＮＡ のコドンの計算値は０．２３である。同様な値をβグロビンｃＤＮＡにも計算で きる。よく使われているコドン間には非常に高い相関関係［ｃｏｒｒｅｌａｔｉ ｏｎ］があるので、酵母中のヒトｃＤＮＡからのヘモグロビン発現は適したｔＲ ＮＡ分子の入手程度に依って制限されるであろう。もしそうであるなら、最適の 酵母コドンを使った遺伝子の完全合成は発現レベルを改良することができよう。
ｃＤＮＡ中に使われるコドンの存在率が低い存在率のｔＲＮＡに代表されるよう なものであれば、不利なコドンを使用する最悪の結果となることは簡単に予想さ れることである。この場合にはヘモグロビンの高レベルの発現はｔＲＮＡ分子の プールを完全に排出させてしまい、ヘモグロビンの翻訳だけてなく、そのコドン もたまたま使うことになる酵母タンパク質の翻訳をも減少させてしまうものとな る。αグロビンヒトｃＤＮＡの場合には、最もよく使われるロイシンコドンはＣ ＴＧ（２１の１４）であるが、このコドンは高次に発現される酵母遺伝子中にこ れまで使われたことがない（ＧｕｔｈｒｉｅとＡｂｅｌｓｏｎ、　Ｔｈｅ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒ ｏｍｙｃｅｓ、Ｅｄｓ、５ｔｒａｔｅｒｎ、Ｊｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｂｒｏａｃｈ 、　１９８２．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）。グロビン ｃＤＮＡ中の低いコドンバイアスのインデックスと希少酵母コドンの存在は、好 ましい酵母コドンを使ったα−１β−グロビン遺伝子の修飾形を合成するための 十分な誘因であった。
ｉ９他 後述の特許請求の範囲は、さらに列挙した好ましい実施例としてここに言及して おくことで記載したものとする。またここに記載の参考文献も本発明を実施する に当だって必要な限度でここに記載したものとする。
特許請求された多量体ヘモグロビンの生成に用いるのに適した発現ベクターの調 製は、次のベクターをブタペスト条約寄託するこ吉で行われるものとする。これ らは全てＲｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　ＵＳＡのＡｍｅｒｉｃａｎ 　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに１９９０年５月１０日に 寄託した。
ＡＴＣＣ６８３２３ｐＤＬ　ｌｌｌ−１４ｃこれは　１つのＴａｃプロモーター によって駆動されるポリシストロニックオペロンの部分としてのｄｅｓ−Ｖａｌ αグロビン及びｄｅｓ−Ｖａｌβグロビンの合成遺伝子を有するｐＫＫ２２３− ３　（Ｐａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒ ｓｅｙ、　ＵＤ＾）とｐＧＥＭｌ　（Ｐｒｏｉ＋ｅｇｕ　Ｃｏｒｐ、。
Ｍａｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、　ＵＳＡ）の誘導体である。
ＡＴＣＣ６８３２４ｐＤＬ　ＥＶ−８ａこれは、ｄｅｓ−Ｖａｌβグロビンをコ ードする第二遺伝子のほかに、αグロビン部分、グリシンおよび第二αグロビン 部分をコードする融合遺伝子を有するＰＤＬ　ＩＩ［−１４Ｃの誘導体である。
ＡＴＣＣ２０９９２ｐＧＳ　３８９ これはＧＡＬＧＡＰプロモーターの制御下にαとβグロビンを発現する酵母ベク ターである。
これらのベクターの寄託は製造、使用または販売を許可したものと解釈されては ならない。
例」２ ジアルファグロピンモノシステイン（Ａ７ＩＣ，Ｄ７５Ｃまたは５８１Ｃ）突然 変異体発現ベクターの構築 次のプラスミドが本例において使われた。なおこれらのプラスミドについてはｔ ｌｏｆｆｍａｎらの１０８８１０９１７９に十分開示されている。
プラスミドｐＤＬ　ＩＩ−ｌｌ− ８３ａ開始コドン、ファクターＸ部位（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）、お よびヒトαグロビンをコードする遺伝子を集合的にＦＸ−Ａと呼ぶが、これは合 成されＭ１３ｍｐ１９のＸｍａ　Ｉ　／Ｐｓｔ　Ｉ部位にクローニングされた。
ＦＸ−Ａ遺伝子をもっＥｃｏＲＩ　−Ｐｓｔ　Ｉフラグメントを切り出し、それ をＴａｃプロモーターの制御下にあるようにｐＫＫ　２２３−３中に再、クロー ニングした。この誘導体をｐＤＬ　ＩＩ　−６２＋ｏ　（！：呼ぶ。ＦＸ−Ａ遺 伝子をｐＤＬ　ｌｌ−６２ｎから取り出し、ＥｃｏＲＩ　／　Ｐｓ　ｔ　Ｉで線 状化したｐＧＥＭｌと連結してｐＧＥＭ−ＦＸ−Ａを形成した。これをＮｄｅ　 ＩとＥａｑ　Ｉで消化しファクターＸａをコードする配列（およびαグロビンを コードする配列の一部）を除去した。切り出されたフラグメントは、失ったαグ ロビンコドンを回復する合成オリゴヌクレオチドで交換した。その結果帯たプラ スミドをｐＤＬ　Ｕ−８３ａと呼ぶ。発現されたタンパクはｒｌｌｅｔ−ｖａｌ −Ｌｅｗ−、、、Ｊであった。
遺伝子がｒＭｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ　Ｊの代わりにｒＭｅｔ−Ｌｅｕ、　、　、 Ｊをコードするプラスミドｐｏｔ、　ｎ−９１ｆを、同様に、しがしＶａｌコド ンを欠いた別の合成置換オリゴヌクレオチドをもっｐＧＥＭ−ＦＸ−Ａがら構築 した。
プラスミドｐＳＧＥ　１．　Ｉ　Ｅ４ このプラスミド（ＳＧＥｌ、　１とも呼ばれる）は図１に示しである。
プラスミドｐＤＬｒＶ−８＾を下記の手順で５ＧＥ１．　ＩＦ５に変換してもよ い。
発現プラスミドｐＤＬＩＶ−８ａは、１つのＰｔａｃプロモーターの制御下にα グロビンが１つのグリシンコドンによってリンクされているジアルファをコード する配列と、ｄｅｓ−Ｖａｌβグロビン遺伝子とをもっている。このプラスミド はアンピシリン耐性をコードするが、機能的なテトラサイクリン耐性遺伝子をも たず、Ｒ。
ｐ＋とＬａｃである。ＤｏｕｂｌｅＴａｋｅ（商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、 　Ｉｎｃ、）のような市販のキットを使ったオリゴヌクレオチドによる部位特異 性突然変異が、Ｐｒｅｓｂｙｔｅｒｉａｎ突然変異体をβグロビン配列に挿入す るのに使うことができる。
ＡＡＣＡＡＡ ＴＴＧ　→−ＴＴＴ ａＳｎ１０８１ｙｓ 次に、機能的テトラサイクリン耐性遺伝子と、誘導剤［ｉｎｄｕｃｉｎｇ　ａｇ ｅｎｔ］で誘導するまてＰｔａｃプロモーターを抑制するｌａｃリプレッサータ ンパク質をコードする１ａｃｌ遺伝子との双方を挿入して、最後の発現プラスミ ドのＳＧＥ　１．ＩＦ５（ａｎｐ’　Ｒ，ｔｅｔ　Ｒ，Ｒａｐ−。
Ｌａｃ　＋）を構築する。
このプラスミドに対する最初の修飾はＩａｃ　Ｉ遺伝子の挿入である。この遺伝 子は、Ｅ、　ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９（ＦｔｒａＤ３６．　ｐｒｏＡＢ、　ｌａｃ 　Ｉ℃△Ｍ１５）のＦエピソームを基質として使って製造者のプロトコル（Ｐｅ ｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ）に合わせてポ リメラーゼチェインリアクション（Ｐｃｔ？）を増幅することによって合成する ことができる。次のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使うことができる。
順方向［Ｆｏｒｗａｒｄ］　： ５　’　ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＭＧＡＧＴＣＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＧＴＧ　３ １逆方向［Ｒｅｖｅｒ６ｅ１ ５１　ＧＣＧＧＣＣＧＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡ　 ３１このプライマーはその５“末端にＮｏｔＩ制限酵素部位をコードする配列を 有している。ＰＣＢ増幅反応産物は平滑末端化され、発現プラスミドのＰｕｖ　 ＩＩ部位にクローニングすることができる。
このＰｕｖ　Ｕ部位はこのクローニングエ稈中に再構築されないので、ライゲー ションに続（ＰｕｖＩＩによる消化により、ｌａｃ　Ｉ配列を取り込んでいない プラスミドは線状化される。プライマーは１ａｃＩ遺伝子の翻訳部分にだけ相捕 的だから、このフラグメントはそれ自身のプロモーターをもたない。ヘモグロビ ンの誘導可能性および発現はＩａｃ　Ｉ遺伝子の配向に依存しているから、配向 はｌａｃ　Ｉ遺伝子挿入後にチェックされなければならない。
正しい方向は誤った方向よりも小さいＥｃｏＲ５フラグメントをもっている。さ らにｌａｃ　Ｉリプレッサー遺伝子のＰｕｖ　ＩＩ制限部位への挿入はｒｏｐ遺 伝子産物を不活性化するもので、プラスミドのコピー数を増加させる結果となる 。
このプラスミドに対する最終的改変は機能的テトラサイクリン耐性遺伝子の回復 である。これは市販されているｐＢＲ３２２をＥｃｏＲＩて消化し、ＥｃｏＲＩ のオーバーハングに相捕的な５′、３°末端および内部にＢａｍＨ１部位を有す る合成りＮＡクリンカのライゲーションを介して挿入される。テトラサイクリン 抵抗遺伝子の５°末端をコートする配列を有する、この改変されたｐＢＲ３２２ ベクターかで精製され、上記改変したｐＤＬ　ＩＶ−８ａプラスミドのＢａ１ｌ ｌ＋ＨＩ部位に挿入される。ｔｅｔ１１フラグメントの１方向だけがテトラサイ クリン耐性をもたらす。正しい配向を有する株を、適切な培地で生育させること によりスクリーニング（選択）することができる。
ｔｅｔＲフラグメントの改変ベクターへの挿入はテトラサイクリン耐性を回復し ５ＧＥＩ。ＩＦ５を産生ずる。
プラスミドｐＧＥＭジアルファ ５ＧＥ１．　ＩＦ５のＳｍａＩ／ＰｓｔＩフラグメントを有するジアルファ遺伝 子は、ＳＩ［ＩａＩ／Ｐｓｔｌで切断したｐＧＥＭ　１に連結されてｐＧＥＭジ アルファが形成された。
ｄｅｓｆｘ　ｐＧｅｍ　（ｐＤＬＩＩ−８３ａ）ベクターをＥｃｏＲｌとＰｓｔ ｌのエンドヌクレアーゼで切断し、ＥｃｏＲ１／Ｐｓｔｌで消化したファージス クリプト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手）中に連結した。Ｅ、ｃｏｌｉ株の ＤＨ５ａをライゲーション混合液で形質転換し、細胞を１０μｍ　１００ｍＭ　 ＩＰＴＧ。
ＤＭＳＯ中の２５ｕｌ　２％Ｘ−Ｇａ１、および１５ｈｌ　ＸＬ−１セル（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ社）を含む重層寒天３ｍｌを重層した２ＸＹＴプレート上にプ レートした。透明なプラークを採取し３７°ＣＸＬ−１細胞を含むで２ＸＹＴ中 で成長させた。二本鎖ＤＮＡをその培養物から単離し、制限分析［ｒｉｓｔｒｉ ｃｔｉｏｎ　ａｎａｌ、ｙｓｉｓ］およびアカロースゲル電気泳動によって５ｏ ｏｂｐα遺伝子の存在を調べた。１本鎖ＤＮＡをｄｅｓｆｘαファージスクリプ ト形質転換体［ｔｒａｎｓｆｏｒｒｎａｎｔｓ］の１つ（ｆ１９１と命名）から 単離した。ファージスクリプト中にｄｅｓｆｘα遺伝子が存在するか確認するた め、この１本鎖ＤＮＡの配列を決定した。
３つの変異源オリゴヌクレオチドを３つの別々の突然変異反応において使用した 。これらオリゴヌクレオチドの配列は次の通りである（変異コドンにはアンプ・ −ラインしである）。
Ｎｉｇｅｒｉａ突然変異 α５８１Ｃ 配列番号１４ α０７５（ ５’　ＧＧＴ　ＧＣＴ　ＣＡＣＧＴＴ　ＧＡＴ　ｇ　ＡＴＧ　ＣＣＧ　ＡＡＣＧ ＣＧ　３　’配列番号１５ αＡ７１Ｃ １μｍオリゴヌクレオチド（約３００ｐｍｏｌ）２ａｌ　１０ｍＭ　ＡＴＰ含有 の１０×キナーゼ緩衝液０．５μｌ　Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／ μｍ、　Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ） １５．５μｌＨ２Ｏ １μｍ　１０ＩＩＩＭスペルミジン 反応液を３７°Ｃで１時間インキュベートし、８０μｍのＨ２Ｏを添加し、反応 液を６５°Ｃ１１０分間の熱失活で終了させた。
ｌμｌ　ｆｗ　１９１　ｓｓ　ＤＮＡ　（０，５ｐｍｏｌ）３μｍリン酸化オリ ゴヌクレオチド（Ａ７１Ｃ，Ｄ７５Ｃ，Ｓ８］、Ｃのいずれか約４５１１１１１ ０１　） ２μｍ１０Ｘアニーリング緩衝液（プロメカ）１４μｌＨ２Ｏ 以下はプライマーを含まないコントロール（対照）＝ｌμｌ　ｆｗ　１９１　ｓ ｓ　ＤＮＡ ２μｍ１０×アニーリング緩衝液 １７μ１Ｈ２０ 反応液を６５°Ｃに加熱し、３５℃まで徐冷しく約７０分で）、５分間水上に放 置。次の試薬を添加し反応液を３７°Ｃで９０分間インキュベートした。
３８ｍ１０×合成緩衝液（プロメガ） １μ］、　Ｔ４遺伝子３２タンパク質（０，５ａｇ／ｕｌ、Ｂｉｏｒａｄ）１μ Ｉ　Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ／μｍ、　ＮＥＢ）０．５μＩ　Ｔ４　Ｄ ＮＡ　リガーゼ（１０口／μｍ、ＮＥＢ）５μｌＨ２Ｏ ２０ｈｌ　７１−１８　ｍｕｔ　５８１Ｃコンピテントセル（Ｐｒｏｍｅｇａ　 Ａｌｔｅｒｅｄ　Ｓｉ　ｔｅｓ法に従い作成）を各変異反応液１０μｌで形質転 換し、３０分間氷上に放置し、４２°Ｃで２分間熱シヨツクを加えた。この形質 転換混合液を３ｍ１２ＸＹＴ培地に加え、３７℃で５．５時間（振盪して）生育 させた。インキュベーション後、これら３つの培養物［ｃｕｌｔｕｒｅｓ］の各 々からｌｌ１１を取り出し、遠心機にがけ、８００μｍを清潔なチューブ中で４ ℃で突然変異体ファージのストック溶液として貯蔵した。
１．５ｐ７５Ｃ突然変異体のスクリーニングＤ７５Ｃ突然変異体ファージストッ クの１０−５希釈液１００μｍを０．５ｍＩＸＬ−１細胞含何の重層寒天で重層 した１５３ｍｍ　２ＸＹＴプレート上にプレートした。プレートを３７°Ｃで約 ５時間インキュベートした。
２連のニトロセルロースフィルタを各プレートがら持ち上げ、そのプラークを６ 　［＋１０．５　Ｍ　Ｎａ０１１／１．５　Ｍ　ＮａＣ１テ溶解し、１０　ｍｌ ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０／１．５　Ｍ　ＮａＣｌ中で中和し、５０ ０　ｍｌ　６ＸＳＳＣて洗浄した。フィルターはエア乾燥し７５°Ｃで４５分間 ベータした。
フィルターを次にプリハイブリダイゼーション［ｐｒｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ ｏｎ］に先立って１％ＳＤＳ中で簡単にボイルした。フィルターを２０ｍ１溶液 中で６８℃で４時間ブリハイブリダイゼーションした。このプリハイブリダイゼ ーション溶液は次の通りである。
５　Ｘ　ＳＣＣ（Ｍａｎｉａｔｉｓ（７）調合法に従イ調製しり２０　ｘ　５Ｓ Ｃ）０．１％（ｗ／ｖ）　Ｎ−ラウロイルサルコシン［’Ｎ−１ａｕｒｏｙｌｓ ａｒｃｏｓｉｎｅ］０．０２％（ｗ／ｖ）　５ＤＳ ０．５％ブ０７キング試薬（Ｇｅｎｉｕｓ　Ｋｉｔ、　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　 Ｍａｎｎｈｅｉｍ）Ｄ７５Ｃオリゴヌクレオチドを次のπｆ３２１ＡＴｐで標識 した。
１μｍオリゴヌクレオチド（８０ｐｍｏｌ）１０μｍ１０Ｘキナーゼ緩衝液 １ｕｌｙｒ　Ｉ３２’ＡＴＰ　（１ｈＣ／ｇ１．比活性＞３０００　Ｃｉ／Ｉｏ ｍｏｌ）８７μｌ　Ｈ２Ｏ ｌμｌ　−＋ｆ−セ（１００／μ１．　ＮＥＢ）反応液を３７℃で５時間インキ ュベートした。取り込まれなかったＡＴＰを遠心によりＢｉｏｓｐｉｎ　３０　 ｃｏｌｕＩＩｎ　（Ｂｉｏｒａｄ）を通して分離して除去した。全プローブ（１ ７，０００ｃｐｍ／μｌ）をプリハイブリダルのフィルターと共にフィルターを ４６℃で一晩ハイブリダイゼーションした。翌日フィルターを１０分間室ａ　（ ＲＴ）で６　Ｘ　ＳＳＣ中で洗浄し、−７０℃でＫｏｄａｋ　Ｘ−Ｏｍａｔ　ｆ ｉ１ｍ上に一晩露光させた。フィルターを１０分間５７℃で６　Ｘ　ＳＳＣ中で 洗浄し、乾燥させ一晩露光し、また６　ｘ　５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で６７° Ｃで１０分間洗浄し、乾燥しさらに一晩再露光した。最後に６　Ｘ　５ＳＣ１０ ，１％ＳＤＳ中で７０°Ｃで１０分間洗−ルのプラークと比較して）段階的（デ ィファレンシャル）にハイブリダイズした１０のプラークを採取した。これらの プラークを０．２５１１ＩＩ　ＸＬ−１細胞を含有する５ｕ＋１２ｘＹＴ培地に 植え付けた。
培養物を３７°Ｃで７．５時間シェークしながらインキュベートし、各培養物の １ｍＭを移し取り、５分間遠心機にかけ、新鮮なチューブ中におき４°Ｃでスト ックして後日の配列決定およびプラーク精製に備えた。
１．６　Ａ７１Ｃおよび５８１Ｃ突然変異体のスクリーニングＡ７１Ｃファージ 変異反応液のストック１０−３希釈液１μｍと５８１Ｃ変異反応液の１０−５希 釈液２０μｍを３ｍ１重層寒天と１００μＩ　ＸＬ−１細胞とで重層した４つの 別々の８２ｎ＋ｍ　２Ｘ　ＹＴ／１ｅｔ（１０Ｉ［１ｇ／ｍｌ）プレート上にプ レートした。プライマーを含まないコントロールも同様にプレートした。これら のプレートを３７℃で５時間インキュベートに移し、そのフィルターを室温で一 晩乾燥させた。翌日プラークを０．５　Ｍ　ＮａＯＨ／１．５　Ｍ　ＮａＣ１で ３分間溶解し、ＬＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，０／１．５　Ｍ　ＮａＣ１中 で３分間中和し、そして６　Ｘ　ＳＳＣ中で５分間洗浄した。１０［１１のプリ ハイブリダイゼーション溶液中で上記と同様に６０℃で６時間のプリハイブリダ イゼーションをする前に、フィルターを１．５％ＳＤＳ中で簡単にボイルした。
（試薬のすへてはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉａ＋より購入した）２ ｕｌ　Ａ７１Ｃ（１００ｐｍｏｌ）またはｌμｌ　５８１Ｃ（１１０ｐｍｏｌ） １０μｍターミナルトランスフェラーゼ緩衝液５μｍ　２５ｍ１ｌ　ＣＯＣｌ２ ｌμｌ　１ｍＭ　ｄＵＴＰ−シボキシゲニン３０μｍ又は３１μｍ■２０（各々 、Ａ７１Ｃと、５８１Ｃの反応液）１μｌターミナルトランスフエラーゼ（２５ Ｕ／μｌ）反応液を３７℃で３時間インキュベートし、続いて室温で６時間イン キュベートした。シブ。キシゲニンで標識したＡ７ＩＣ，５８１Ｃプローブ（２ ０μｍ）を、プライマーを含まないコントロールのフィルターと共に１０１１１ １のプリハイブリダイゼーション溶液中にある適当なフィルターに加えた。これ らのフィルターを４７°Ｃで一晩ハイブリダイズした。
１．８フイルター洗浄と発色 フィルター全てを６ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中て１５分間３０℃で洗浄し、つ いで４２℃で１５分間洗浄した。標識したＡ７ＩＣまたは５８１Ｃオリゴヌクレ オチドのいずれかでプローブしておいた４つのフィルターを別々にし、各々をプ ライマーを含まないコントロールのフィルターと共に温度を上昇させながら洗浄 した。Ａ７１Ｃおよび５８１Ｃフイルターの各々を１０ｍ１の６　Ｘ　５ＳＣ１ ０，１％ＳＤＳを入れたプラスチック袋中に入れ、５０°Ｃ１６０°Ｃ１または ６５°Ｃの４温度のいずれかで１０分間洗浄した。高温洗浄後、フィルターの各 セットをＧｅｎ１ｕｓＫｉｔプロトコルに従って発色させた。
まずフィルターを入れた袋を１０ｍ１の１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨｃｌＳｐＥｌ 　７．５／１５０ｉ＋Ｍ　ＮａＣ１（緩衝液Ａ）で満たし、１５分間インキュベ ートした。
その緩衝液を除去し０．５％ブロッキング試薬含有の緩衝液Ａ　１０ｍ１で置き 換え、シェークせずに室温で１５分間さらにインキュベートした。抗ジゴキシゲ ニン抗体（２μｍ）を容袋に直接添加し室温で３０分間インキュベートした。そ れらフィルターを袋から取り出し室温で１５分間緩衝液Ａ　１０．０５％のブロ ッキング試薬１００ｍ１中で一緒に洗浄し、さらに室温で緩衝液Ａ単独中で１５ 分間洗浄した。最後の洗浄は１００ｍ１の１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐ ｆｌ　９．５／１００ｍＭ　ＮａＣ１１５０ｒｎＭ　ＭｇＣ１２（緩衝液Ｂ）で ５分間室温で行った。所定温度で得られたフィルターの各セットを着色展開液５ ｆｆ１１の発色液（２２，５μｍの７５　ｍｇ／ｍｌ　ＮＢＴ、　１５　μｌの ５０　ｍｇ／Ｉｌ］ｌ　Ｘホスフェートを含有する緩衝液８５ｍ１）と共に別々 の袋に入れた。これらフィルターを間中で室温で３０分間インキュベートした。
３０分後、フィルターを発色液から取り出し１００ｍ１１０ＸＴＥ中で５分間、 また、１００ｍＩＩＸＴＥ中で５分間０Ｃ各々室温で洗浄した。フィルターを室 温で乾燥させた。
オリゴヌクレオチドＡ７１Ｃまたは５８１Ｃに段階的（差分的）　［ｄｉｆｆｅ ｒｅｎｔｉａｌｌｙｌにハイブリダイズした１０のプラー゛りを採取し、０．２ ５ｎ＋Ｉ　ＸＬ−１細胞を含有する一１２ＸＹＴ培地に植え付け、３７°Ｃでシ ェークしなから７．５時間インキュベートした。各培養物のｌｎｌを取り出し、 ５分間遠心機にかけ、清潔なチューブに入れて４°Ｃで貯蔵し、後日の配列決定 およびプラーク精製に備えた。
１．９配列決定による突然変異の確認 ゛１本鎖ＤＮＡを８００μｌ突然変異体ファージストック上澄みから単離し、プ ライマーとしてのα１７９才・リボヌクレオチドと５ｅｑｕｅｎａｓｅ　ｋｉｔ （ＵＳＢ）を使って配列決定した。α１７９オリゴヌクレオチドはその突然変異 部位より約１００ｂｐｓ上流の領域への１８量体ヘモログ［ｈｅｍｏｌｏｇ］　 ｃｙｓである。配列はａ　Ａ７１Ｃ，ａ　Ｄ７５Ｃ，およびａ　５８１Ｃ突然変 異の存在を確認した。
ファージストックを、２００μｍのＸＬ−１細胞を含有する３１０１重層寒天を 被覆した２　Ｘ　ＹＴ／ｌｅｔ　（１０ｍｇ／ｍｌ）プレート上で１０−８希釈 液および１０−１０希釈液の１０μｍをプレートすることによりプラークを精製 した。３７℃で７時間インキュベート後、各突然変異体プレートから１つの単離 したプラークを採取し、１０＋ｎｌのＸＬ−１細胞を含有する９０ｍ１の２　Ｘ 　ＹＴ／ｌｅｔ（１０Ｉｎｇ／ｌ１１１）培地に接種するのに使った。
培養物を一晩３７°Ｃでシェークしながら生育させた。各突然変異体ファージ培 養物の１ｇ＋１を取り出し、遠心機にかけ、その上澄みを各々の精製突然変異体 ファージストックとして一８０°Ｃで凍結（７た。二本鎖ＤＮＡを残りの培養物 から調製して最終的発現ベクター１゜ＩＥＡへ後日サブクローニングするのに使 うことに備えた。
１．１０αｃｙｓ突然変異体の１．１Ｅ４へのサブクローニングシアルファタン パク質のＮ末端またはＣ末端のドメインのいずれかの３つのシスティン突然変異 各々を有するジアルファ遺伝子を構築するには次の３つのサブクローニング工程 が必要であった。
１　）　Ｅａｇｌ−ＰｓｔｌフラグメントとしてのファージスクリプトからＣｙ ｓ突然変異α遺伝子をＥａｇｌ−Ｐｓｔｌ消化されたｄｅｓｖａｌ　ａ　ｐＧｅ ＩＯベクター（ｐＤＬＩＩ−９１ｆ）への移行。この工程は突然変異α遺伝子に 正しい５′末端を与える。
２）３°α遺伝子のｃｙｓ突然変異各々をもつ突然変異シアルファ遺伝子をジア ルファｐＧｅｍ（ｐＧｅｍジアルファ）からのＥａｇｌＤＮＡフラグメントを相 当するｃｙｓ突然変異体ｄｅｓｖａｌαｐＧｅｍプラスミドのＥａｇ１部位に挿 入して構築する。５°α遺伝子にＣｙｓ突然変異のある突然変異シアルファ遺伝 子が、シアルファｐＧｅｔｎからのＢｓｔＢＩＤＮＡフラグメントをｃｙｓ突然 変異体ｄｅｓｖａｌαｐＧｅｍプラスミドのＢｓｔＢ１部位に挿入することで構 築される。
３）最後に突然変異ジアルファ遺伝子各々がＳｍａｌ−Ｐｓｔ’ｌフラグメント として１．　ＩＥ４発現ベクター中にクローニングされる。
以上 サブクローニング作業の各工程におけるＤＨ５αへの形質転換［ｔｒａｎｓｆｏ ｒｍａｔｉｏｎｌは、１．ＩＦ５へのβＧ３３Ｃ突然変異のサブクローニング法 として記載したのと同じ方法で行う（後述する）。正しいα遺伝子中に当てはま るｃｙｓ突然変異が存在していることは、サブクローニング作業の各段階で配列 決定することで確認した。
１、　ＩＦ５のジアルファＣＶＳ突然変異体の各々をＥ、ｃｏｌｉ　１２７株中 に形質転換し、ＴＢ完全培地で生育させＩＰＴＧで誘導した。ジアルファおよび βタンパク質の発現は５Ｏ８−ＰＡＧＥおよびウェスタンプロットアッセイで確 認した。
例２ Ａへ１生豚敷輩隘杵輩λ１男浬↓工乱ム芸渭進９ノ二上三匹 Ｉ　ＰＴＧで誘導後、目的のヘモグロビン突然変異体を標準的な醗酵培地中で生 育させたＥ、ｃｏｌｉで発現させた。この細胞をペレット化し、３ｍｏｌの４０ ｍＭ　Ｔｒｉｓベース、２ＩＩＩＭベンザミジン／ｇｍの細胞ペースト中で再懸 濁し、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（商標）　（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ 。
Ｉｎｃ、　）に２回通して溶菌［１ｙｓｅｄ］させた。この溶菌液を遠心機にか け細胞破片を除去し、上澄みを回収した。この上澄みがらＭａｔｈｅｗらの方法 （Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）を使っ て四量体ヘモグロビンを精製した。簡単に述べると、導電率［ｃ（Ｉｎ、、ｄｕ ｃｔｉｖｉｔｙ］か２００μｍｈＯ８に達するまで上澄みを５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、 　ｐＨ７，０で希釈し、その溶液を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，０で平衡化 したＱ　５ｅｐｂａｒｏｓｅ流動ベツドに通した。この通過液を回収し、濃いＮ ａ０１１溶液を使って溶液のｐｉ（を８．０に上げ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐ Ｈ８，０中で平衡化された第二のＱ　５ｅｐｈａｒｏｓｅカラムに乗せる。この カラムで捕らえたヘモグロビンをカラム体積の２倍の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐ ｔ１８．ｏテ洗浄し、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，０で溶出する。フラクシ ョンを回収し吸光度の比（Ａ５□ｓ／Ａｓｎｏ＞１．０３）に基づいてプールす る。次にその溶液をＭｉｎｉｔａｎ（商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、 　）で１４ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８〜８．５／１５０ｍＭ、約１００ｍｇ ／ｍｌに緩衝液交換する。精製のこの段階で突然変異ヘモグロビン四量体のいく つかは、分子中に加工されたシスティンの単なる空気酸化によってかなりのレベ ルのへ量体（〉２０％）を既に形成していることに注意されたい。
しかし残りのシスティンチオールのジスルフィドへの酸化を行うには、溶液が４ °Ｃて約４８時間、空気または酸素供給下にインキュベートされる。
インキュベート後、へ量体を無反応の単量体ならびに高いオーダーのポリマーか ら、１４Ｉｌ］Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ８〜８．５／１５０ｍＭ　ＮａＣ１ 中て平衡化された５ｅｐｈａｒｃｒｙｌ　Ｓ−２００を直線的流速６０ｃｍ／ｈ ｒで使って分離した。フラクションを回収し分析縁５ｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム を使ってプーリングを確認した。
システィンによる置換が負電荷に近い場所にあるか、ジスルフィド形成かそうで なければ不完全な、これらのヘモグロビン突然変異体にとって、上記作業は好ま しくはジスルフィド形成を促進するように改変されるのがよい。上述の作業を行 って５０ｍｇ／ｍｌへ濃縮後、ヘモグロビン溶液をＣＯとの緩慢なバブリングに よって一酸化炭素ヘモグロビンに変換する。５つのＣｕ＋＋／ヘムを１００ｍＭ 　ＣｕＣ１□を使ってその溶液に添加し、そのヘモグロビンをＣｏ下、水上で５ 分間インキュベートする。反応番え、５倍モル余分な（銅に対して）Ｎａ−ＥＤ ＴＡを添加することによって止めた。
その結果得たへ量体を上述のようにして精製した。
例３ Ｃ１−β２、またはＣ２−に量体インターフェイス領域にわたる融合によって二 量体形成に対して安定化させたヘモグロビン分子構築のための仮説的プロトコル 現在行われている、１αサブユニツトのＣ末端とそれに隣接するαサブユニット のＮ末端との間の二量体間ジアルファ融合は、二量体形成に対するヘモグロビン を安定化する成功したタンパク質工学の１つである。この場合、別々の二量体に 由来する２末端が都合よく並置されていることを利用している。したがって上述 したようにジベータポリペプチド、または、これも上述したようにシアルファお よびジベータポリペプチド両方があるヘモグロビン、あるいはジアルファおよび シベータかリンクしたサブユニットのあるヘモグロビンを生成してもよい。ある いは１つのα／β二量体のαサブユニットかほかの二量体のβサブユニットに融 合されている上記以外の融合型を思い描くこともできる（図６）。この場合には 、２つの個々のリンクされたポリペプチドを三量化して偽四量体ヘモグロビンを 形成する。
この方法は三量化が、一般にα１β１およびα２β２と呼ばれているサブユニッ トの特異的な同一対を含むという事実に基づいている。
このような融合方法の例として、二量体１のαサブユニットＣ末端残基（Ａｒｇ 　１４１）は、直接にまたは融合配列を介して、二量体２のβサブユニツトＣヘ リックス（Ｔｙｒ　３５）のＮ末端アミノ酸に融合することができる。これはβ Ｂへリックス（Ｖａｌ　３４）の末端に新しいＣ末端残基を創出するもので、β ＡヘリックスおよびβＢへリックス（残基１〜３４を含めて）からなるポリペプ チドの「フリー」なピース［ｐｉｅｃｅｌを残す。こうした別法はβサブユニッ トへリックスＣ−Ｈに融合されたαサブユニットへリツクスＡ−Ｈからなるタン パク質を産生ずる。βサブユニットＡへリックスおよびＢヘリックスを有するポ リペプチドは新しいヘリックスを分子中に取り込むことによってタンパク質に共 有結合される。そのヘリックスはへリックスＡ（Ｖａｌ　１）のβＣ末端（Ｈｉ ｓ　１４６）ともとのβＮ末端間の距離に掛は渡るように作られる。こうした変 更に続いて、新しいタンパク質のＮ末端からＣ末端までのへリックス配列は（α ）Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｅ−Ｆ’−Ｆ−Ｇ−Ｈ−（β）−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ’−Ｆ−Ｇ−Ｈ −ＮＥＷ−Ａ−Ｂである。協同性に重大に影響するような、構造の新領域か二量 体と二量体とのインターフェイス領域内に伸びないように、融合領域の実際の調 整には慎重な設計か要求されるであろう。塩基性残基または酸性残基を含むアミ ノ酸をある特定の箇所にある分子中に導入することは、正常Ｎ末端およびＣ末端 を加工する結果失われることがある機能的に重要な塩橋および水素結合をある程 度維持することを可能にする。上記の方法は全ヘモグロビン分子または単一ポリ ペプチド鎖としての個々の二量体を産生ずることにまで応用することができる。
尤も後者の場合二量体形成に対する安定化を提供するものとは考えられない。
ジスルフィド結合形成の熱力学力を提供する目的で、システィンをα１β２偽二 量体のαまたはβグロビンドメイン中に導入することができる。
証号皿Ａ 組換えαグロビンおよび組換えβグロビンのヘムとの再構築法および人工ヘモグ ロビンを得るための化学還元性人工ヘモグロビンのこれまでの調製法は例えば次 のような手順で行われている。
凍結乾燥した組み換えαグロビンおよびβグロビン（各１００ｍｇ）を８Ｍ尿素 １５抛Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ、　ｐｔｌ　８．０１／１ｎＭ　ＥＤＴＡ／　１１［ ｌｉＩ　ＤＴＴ中に各々溶解し、５ｍｇ／ｍｌ濃度に希釈し、３〜４時間室温で インキュベートする。αグロビンを冷やした２０ｍＭ　ｔｃ２ｕｐｏ、、　ｐ［ Ｉ　５．７／１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ＩＩＤＭ　ＤＴＴで０．３ｍｇ／＋ｏｌに希釈 する。ヘミン（２５ｍｇ）を２．４ｍｇ　Ｏ，ＬＭ　ＫＯＨ中で溶解し、等量の ＩＭ　ＫＣＮで希釈し、この溶液をヘミンおよび２０ｍＭ　ＫＪＰＯｎ、　ｐＨ ６，７中で保存リン酸緩衝液と共に０−１１１ｇ／ｍ１作る。この溶液から冷し なαグロビンより２．８モル余分にヘミンを添加し、等モル量のβグロビンを添 加し、その溶液を０．ＩＭＥ２ＨＰＯ４，ｐＨ７，６／１ｍＭ　ＥＤＴＡ／　１ ｍＭ　ＫＣＮに一晩４°Ｃて透析する。この人工ヘモグロビン溶液をＰト１０メ ンブレン（Ａｍｉｃｏｎ）を使って限外濾過濃縮し、２００＋＋＋１のゴム隔壁 かあるネジ蓋付き試験管中に移す。ヘモグロビン溶液を抜気［ｅｖａｃｕａｔｉ ｏｎ］　Ｌ、て脱酸素し、Ｎ２を通し、溶液をＣＯて飽和する。１００ｍＭナト リウムジチオナイトを２０ｍ１のゴム隔壁があるネジ蓋付き試験管中で嫌気的に 調製する。ジチオナイトの４．５当量をシリンジでヘモグロビン溶液に添加し、 混合物を氷上で１５分間インキュベートする。ヘモグロビン溶液を１０ｍＭリン 酸ナトリウム緩衝液ｐｔ［６，０で４Ｘ４０ｃｍ　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５ （ｆｉｎｅ）カラムでゲル濾過する。着色した溶液を同緩衝液で平衡化された２ ｘｌＯｃｍ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）カラムにかけ、そのクロマトグラフィを５ ００ｍ１１０Ｉ［１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，眠および７０ＩＩ＋Ｍリ ン酸ナトリウム緩衝液ｐｎＥｉ、　９の５００＋＋＋１の直線グラジェントで展 開する。ＣＯをヘモグロビンから酸素流中の［ｕｎｄｅｒ　ａ　５ｔｒｅａ！［ ｌｏｆ　ｏｘｙｇｅｎｌ光分解［ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ］で除去する０このよう に調製した人工ヘモグロビンは、融合ペプチドから僅か約２５％の回収率で単離 されるか、なお主酸素結合特性を示すものである。
参考例Ｂ’：Ｐ５０決定 添付の特許請求の範囲の目的のための精製ヘモグロビン溶液のＰ５ｏを測定する 我々の好ましい方法は、次の通りである。
ヘモグロビン・酸素、平衡曲線をｆｌｅｌｌＩｏｘ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標） 　（ＴＣ５Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、　 ＰＡ）を使って５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液１０．１１１　ＮａＣ１，ｐＨ７， ４中で２５℃または３７℃＋０．１℃で測定する。
酸素平衡曲線を水飽和の０２（例えばＰ　５ｏ　＞　１０ｔ□ｒｒ）、または水 を飽和した圧縮空気で前置て平衡化しておいたオキシヘモグロビン溶液のＮ２脱 酸素によって測定する。サンプル中のオキシヘモグロビン割合の決定操作中５６ ８および５５８ｎｍにおける吸光度を測定する。ヘモグロビン百分率はｌｏｇ　 Ａ≠５５８／ｌｏｇ　Ａ≠５６８に直接比例し、パスの長さ［ｐａｔｈ　ｌｅｎ ｇｔｈ］には非依存である。吸光度および酸素圧を双方ともプログラマブルゲイ ン［ｐｒｏｇｒａＩＩＩ［ｌａｂｌｅ−ｇａｉｎ］の１２ビットアナログ−デジ タルコンバーター（Ｌａｂｍａｓｔｅｒ　ＰＧＩＴ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　 ５ｏｌｕｔｉｏｎｓ、　５ｏｌｏｎ、　ＯＨ）でコンピュータ制御下にサンプリ ングする。酸素平衡曲線は低いａｐｓｓの［１ｏｗ−ｐａＳＳ］デジタルフィル タにかける。Ｐｒｏ値（酸素結合部位の５０％飽和を必要とする０２分圧）とＨ ｉｌｌ係数（“ｍａｘ）を我々の研究所で開発したソフトウェアを用いてデジタ ル濾過したデータから計算する。Ｈｉｌｌ係数は関数ｄｌｏｇ［ｙ／（１−ｙ） ］／ｄｌｏｇ　ｐの最大傾斜と定義する。ただしｙは酸素飽和百分率でｐは０２ の分圧である。
Ｐ５ｏはほかの条件下でも測定できるか、たくさんの環境因子がヘモグロビンの 酸素親和性に影響することは注意されなければならない。ｐｆｌ、　ＣＯ２，無 機結合［ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｕｎｉｏｎｓ］、有機リン酸およびＰ２Ｏての温 度につき、ＢｕｎｎとＦｏｒｇｅｔのＨＥＭＯＧＬＯＢＩＮ：ＭＯＬＥＣＵＬＡ Ｒ，ＧＥＮＥＴＩＣＡＮＤ　ＣＬＩＮＩＣＡＬ　ＡＳＰＥＣＴＳ　３７−４７． ９５−９８　（ＬＢ、　５ａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏ、、　１９８６）に考察されて いる。
全血酸素結合曲線に係るたくさんの事項につき標準生理学的条件下（３７℃、ｐ Ｈ，？、４．　ＰＣＯ□４ｈＩＩＨｇ）で決定されているので、文字記号を調節 することが必要であろう。この意味で１０℃の上昇はＰ、。を殆ど２倍増加させ るが、Ｐ５゜のｐＨに対する非依存性はδｌｏｇ　Ｐ　ｓｏ　／δｐＨ＝　−０ ，５とおおよそいえる。
精製したヘモグロビン調製物のＰ、。値を全血のＰ、。値と比較すると、問題が 多いことがわかる。全血または単離したＲＢＣのＰ５゜はヘモグロビン・酸素結 合曲線の形を自然に変調するたくさんの要素を有している。ヘモグロビンが酸素 に対して著しく低い親和性をもつようにする分子であるエフェクター分子２．３ ＝ＤＰＧが高濃度で存在するときは、ＲＢＣはヘモグロビンをカプセル封入する ［ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｌ。その他の赤血球白成分も結合曲線の形に影響する 。例えばＡＴＰ、　ＣＩ−Ｃｏ□、Ｈ＋、オルトリン酸塩、メトヘモグロビン、 カルボキシヘモグロビンである。これらの物質のレベルは年齢、性、体調によっ て変化する。それらの物質は精製ヘモグロビン溶液中には通常存在しないから、 精製ヘモグロビンのＰ５１１値は全血のｐｓｏ値よりも低い。ｎｇｂ−酸素親和 性の非常に重要なモジュレータの１つはＣ１−イオンである。ＣＩイオンは約０ ．１５Ｍの生理学的濃度で血液血清中の赤血球外に認められる。Ｃ１−は酸素親 和性を低くするので、インビトロ測定でのＰＳＯをもつヘモグロビン溶液は血流 中に注入されるとずっと低い酸素親和性となることか十分予想される。全血の酸 素結合測定に関するもう一つの問題はＲＢＣが非常に壊れやすく、酸素結合性を 測定するために使用する機器に赤血球を入れようとする過程で少なくとも赤血球 の一部は溶出してしまうことである。
溶出したＲＢＣはヘモグロビンを２．３−ＤＰＧから遠い周囲の培地中に漏れ出 るから、フリーなヘモグロビンは赤血球内ヘモグロビンよりも高い親和性をもつ ことになり、全血のＰ５゜決定にとり虚偽の低いＰ、。値を示す原因となる。生 理学的条件下で全血は２６〜２８ｍｍ　ＨｚのＰＳＯ値であることが広く認めら れている。ヘモグロビンが全血から単離されるときは、測定されるＰＳＯは研究 者の実験条件次第で変化するが、１〜１０ｍｍ　Ｆｉｇのオーダーである。
こうした理由から、精製したＨｇｂ分子のＢｇｂ−０，平衡［ｅｑｕｉｌｉｂｒ ｉａ］は緩衝液、ｐＨ，および塩濃度の厳密な条件下で測定するのが最も正確で ある。残念ながら、研究者にとってインビトロ系における［１ｇｂ−０□結合を 測定する「基準」として認められたものはない。
しかし多くの突然変異体ヘモグロビンが患者の全血中に同定されているので、全 血と精製ヘモグロビン調製物との、生ｆ１ｇｂおよび突然変異ｎｇｂの０□に対 する相対的親和性を比較することができることが望まれる。この１例がＨｇｂ　 Ｃｂｉｃｏ（β１ｙｓ６６−ｔｂｒ）である。もし精製した突然変異体ヘモグロ ビン（１０，１ｉｍＨｇ）のＰ５゜値だけを検査するなら、Ｈｇｂは正常全血（ ２７，２＋ｕ＋ＦＩｇ）のＰ５゜値より低い値であることに気がつくであろう。
しかし、そのヘモグロビンを生理学的条件下でＲＢＣ中で測定すれば、それが正 常の全血（３８ｍｄｇ）より高いＰＳＯであることは明らかである。もし代用血 液として血流中に注入したとすれば、Ｐ、。値は全血ｃｈｊｃｏと精製Ｈｇｂ　 Ｃｈｉｃｏとで変化するか否かにつき予測することはできないことである。しか しＰ５゜値は精製形のものより高く、突然変異体Ｈｇｂを有機リン酸と反応させ れば、そのｐｓｏ値はさらに高くなると結論することができる。　以上−ＣＩ− Ｉ：Ｊ　Ｑ＋市飄為コーコｈ■コク―−一＞５．！ｇ坪；己口ぢ浜３己ぶｔｌｆ ｆ１５８≧Ｆ−Ｉ　Ｃ：Ｐ４　ａ　〜　−Ｎ　ス　コ　−　コ　飄　か　コ　り 　−　−−〜 ＞；；；認；♂己四；３己５５Ｂ；≧ ＞　α　ｏ　ｒＡ　Ｉ−Ｉ　切　に　φ　ト　ψ　Ｗ　−コ　−　−の　飄　− ｄ　ΦＩ−１１１１１−１＞　ｌｌｊ　＞　−・−一為飄Ｃの：の二ＨクーＨＣ ５＜ｌ１ｌＬＩｐ＞、ａ＜＝ａ−ｐ＞ｐｈり山じ゛＜＜Ｈ＞　Ｃｏ　ω　Ｐ−１ ０づ　ψ　≧　ψ　り　−　コ　≧　−ω　−ａ　飄　コＦ−Ｉ　ＩＱ　ｌ−１ ＞１１１　＞−−，４ｔ＠　＞＞１０　Ｑ＋＋−＝Ｑ　ＩＩＩＰ−Ｉ　Ｑじ＜− 一〉＝４＝じ一一＞−ａ＜−φ＜＠−ローＮＭすＬＩ″Ｉψさ口の さ−へＦｌ　？　Ｌ′１１４）さ口０１１−１−＋−＋　＋　＋　Ｆ−１＋−１ ＋　ｓ　＋ロ国！国国−国に）菌に）に）口闇田に）に）国国田ロー　ω　：Ｉ 　Ｏ，Ｃ＝　コ　ω　〉−−ω　−＝　コ　−　コ　コ　Φ　ω　島　り一一Φ Φ切り冶−二＝Φ−φω−Φ・−≧Φ≧＜＝ｐ＜＜ｐ−ロト山りＵ−のＱ−二（ Ｊ（−’ｅａｗ：ＩｏａＩ：＝ｖｒ＞ｕａａｒａ　−り　−　ｓ　ｓ　Ｏ）　（ １１ｏ、ａｔ−一ψφψｃｌ冶−二＝−二ωΦＨω−≧り諷＜＝ｐ＜＜ａ−ロト −くトークローエ（Ｊ（＋、）リトロのローへ０寸いりｉ口■ローへｎ寸Ｇさ１ ％ｒ＋＋１”＋ωロ中ロロロロロロロ色の■いＣＧ表２のための参考文献 １）　Ｈ９Ｊ式と工１ｓｌλＬｎ　１９８７．　Ｑ、２４１−３０８゜２１　０ ｈｂａ、　Ｙ−；　Ｍｉｙａｊｉ、Ｔ、；　Ｍａｔｓｕｏｋａ、Ｍ、；　Ｙｏｋ ｏｙａｍａ、Ｍ、；Ｎｕｍａｋｕｒａ、Ｈ，；　Ｎａｇａｔａ、Ｋ、；　Ｔａｋ ａｈａ、Ｙ、；　工ｚｕｍｕ、Ｙ、；５ｈｉｂａｔａ、　Ｓ、　Ｂ’ｏｃｈｅ７ １’、　Ｂ’ｏｏ　ｖｓ、　Ａｃ”−＝　１９７５．４０５．１５５−１６０゜ ：）　Ｅｅｒｅｔｔａ、Ａ、；　ｐｒａｔｏ、ｖ、；　Ｇａ１ｌｏ、Ｅ、；　Ｌ ａｈｍａｎｎ、　Ｈ。
出代＝１１９６８．２１７．１０１６−１０１８゜４１　Ｋｎｕｔｈ、　Ａ、　 ；　Ｐｒ１ｂｉｌｌａ、　Ｗ、　；　Ｍａｒｔｉ、　Ｈ，′：Ｌ、、　；　Ｗｉ ｎｔａｒｈａｌｔａｒ。
Ｋ、Ｈ，Ａｃｔａ　ａｅｍａｔｏ　１９７９．６Ｌ、１２１−１２４゜５］　５ ｃｈｎａｉｄｅｒ、Ｒ，Ｇ、；　Ａｔｋｉｎｓ、ＥＪ、；　Ｈａｓ；ｙ、Ｔ、Ｓ 、；　Ｔｏｍｌｉｎ。
Ｇ、　；　Ｃａ５ｅｙ、　Ｒ，；　Ｌｅｈｍａｎｎ、　Ｈ−；　Ｌｏｒｋｉｒ、 、　Ｐ、Ａ、　；　Ｎａｇａｉ、　Ｋ。
’ＯＣｒ　ａｍ　’０ＤｈＶＳ　ＡＣｆ−ａ　１９７５ｒ　４００ｒ　コロ５− ３７３゜６１　Ｍｏｏ−Ｐｅｎｎ、Ｗ、Ｆ、；　Ｂｅｃｈｔａｌ、Ｋ、Ｃ，；　 Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｒ，Ｍ、；Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｍ、Ｈ，；　Ｊｕｇ、Ｄ、Ｌ、； 　Ｓｃｈｍｉａｉ、Ｄ、Ｅ、；　Ｄｕｎｌａｐ。
ｗ＋Ｍ、；　０ｐａｌｌａ、Ｓ、Ｊ、；　Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒａ、　：、；　 Ｂｏｎａｖｅｒｌｔｕｒａ。
Ｃ１匙囚可達ユ謙ｊヱ１９７７、貝、　４８７２−４６７９゜７）　Ｍａｏ−Ｐ ａｎｎ、Ｗ、Ｆ、；　ＭｃＰｈｅｄｒａｎ、Ｐ、；　Ｂｃｂｒｏｗ、Ｓ、；　Ｊ ＯｈｎＳＯｎ。
Ｍ、Ｈ，；　Ｊｕｅ、Ｄ、Ｌ、；　０１ｓａｎ、Ｋ、Ｗ−ｊｌｉｅ　；　Ｊ、ｅ ｍａｔ。
１９８１、　ｌ、　１３７（４５゜ ８）　工ｄａｌｓｏｎ、Ｌ、工、；　Ｄｉｄｋｏｗｓｋｙ、Ｎ、Ａ、；　Ｃａ５ ａｙ、Ｒ，；　Ｌｏｒｋｉｎ。
Ｐ、Ａ、；　Ｌｅｈｍａｎｎ、　Ｈ，Ｎａｔｕｒａ　１９７４．２４９．、７６ ８−７７０゜９）　Ｇａｃｏｎ、Ｇ、；　Ｂａ１ｋｈｏｄｊａ、Ｏ，；　Ｗａｊ ｃｍａｎ、Ｈ，；　Ｌａｂｉｅ、Ｄ。
！９遷５二」−１（ｔ　１９７７、Ｑ、２４３−２４６゜１０）　Ｂｌｏｕｑｕ ｉｔ、　；　Ｄｅｌａｎｏｅ、　−Ｇａｒｉｎ、　Ｊ、　；　Ｌａｃｏｍｂｅ、 　Ｃ，；Ａｒｏｕｓ、Ｎ、；　ｃａｙｒａ、Ｙ＋；　Ｐｅｄｕｚｚｉ、Ｊ、；Ｂ ｒａｃｏｎｎｉａｒ、　Ｆ、；　Ｇａ１ａｃｔｅｒａｓ、　Ｆ、；　Ｌイ旦ユｅ ｔｔ。
１９８４、よＬシ１５５−４５８゜ １１）　Ｄａｃｉｅ、　Ｊ、Ｖ、；　５ｈｉｎｔｏｎ、　Ｎ、に、；　Ｇａｆｆ ｎｅｙ、　Ｐ、Ｊ、；ｃａｒｒｅｌｌ、Ｒ，Ｗ、；　Ｌｅｈｍａｎｎ、Ｈ，出聾 菖１１９６７゜刀玉、６６３−６６５゜ １２）　Ｋａａｌｉｎｇ、　Ｍ、Ｍ、；　Ｏｇｄｅｎ、Ｌ、Ｌ、；　Ｗｒｉｇｈ ｔｓｔｏｎｅ。
Ｒ，Ｎ、；　Ｗｉｌｓａｎ、Ｊ、Ｂ、；　Ｒａｙｎｏｌｄｓ、　Ｃ−Ａ、；Ｋｉ セｃｈａｎｓ、Ｊ、Ｌ、；　Ｈｕｉｓｚａｎ、τ、１（、シ、−」２ｋＬａ１Ｌ 止旦戯＝１９７１．シｌ、２３９５−２４０２゜１コ）　Ｂｒａｔｕ、　Ｖ、； 　Ｌａｒｋｉｎ、　Ｐ、λ、；　Ｌａｈｍａｎｎ、　Ｈ，；Ｐｒａｄａｓｃｕ、 　Ｃ，’ｏｃｈｅｍ、＋ｃｃｈ　ｓ、　Ａｃｔａ、　１９７１゜１４）　Ｏｇａ ｔａ、　Ｋ、；　Ｈｏ、　Ｔ、；　０ｋａｚ此ｉ、　Ｔ、：　Ｄａｎ、　Ｋ、； Ｎｏｍｕｒａ、　Ｔ、；　Ｎｏｚａｖａ、　Ｙ、；　Ｋａうｉｔａ、　Ａ。
比ロ空ニ旦國Ｊｌ　１９８６．旦、４６９７４８１゜１５）　Ｙｅａｇｅｒ、Ａ −Ｍ、；　Ｚｉｎｋｈａｍ、Ｗ、Ｌ；　Ｊｕｅ、Ｄ、Ｌ、；Ｗｉｎｓｌｏｗ、Ｒ ，Ｍ、；　Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｍ、Ｈ，；　ＭｃＧｕｆｆａｙ。
Ｊ、Ｅ、；　Ｍｏｏ−Ｐａｎｎ、　Ｗ、Ｆ、を絋、旦ａｓ、１９８３．　ｒシ５ ０３−５０７゜ １６）　Ｃｈａｒａｃｈｅ、Ｓ、；　Ｂｒｉｍｈａｌｌ、　Ｂ、；　Ｍｉｌｎａ ｒ、ｐ、；Ｃｏｂｂ、　Ｌ−Ｊ、　Ｃ’　、　ｖｅｓｔ、　１９７３．　且、　 ２Ｅ１５８−２８６４゜ １７）Ｍａｒｉｎｕｃｃｉ、Ｍ、；　Ｇｉｕｌｉａｎｉ、　Ａ、；　Ｍａｆｆｉ 、Ｄ、；ＭａＳＳａ、Ａ、；　Ｇｉａｍｐｏｌ司Ａ、；　Ｍａｖｉｌｉ口、Ｆ、 ；Ｚａｎｎｏｔｔｉ、Ｍ、；　Ｔａｎｔｏｒｉ、Ｌ、　カ＆五ｍＬｏｏ　ｓ−ｃ ｔａ、　１９８１．　シ坦、　２０９−２１５゜１８）　Ｇａｒｅｌ、Ｍ、Ｃ， ；　Ｈａｓｓｏｎ、Ｗ、；　Ｃｏｑｕｅｌａｔ、Ｍ、Ｔ、；Ｇｏｏｓａｎｓ、　 Ｍ、；　Ｒｏｓａ、　Ｊ＋；　Ａｒｏｕｓ、　Ｎ、１鋤旦〜卸シ且ユｏｎ　ｓ、 Ａ　ｔａ、１９７６、　．４１λｑ、　タフ−４０４゜１つ）　５ｈｉｈ、　Ｄ 、Ｔ、；　Ｊｏｎｅｓ、　Ｒ，Ｔ、；　５ｈｉｈ、　Ｍ、Ｆ、Ｃ，；Ｊｏｎｅｓ 、　Ｍ、Ｂ、；　Ｋｏｌｅｒ、　Ｒ，Ｄ、；　）ＪｇＢｇ３ニ９旧１１９Ｂ７゜ 上よ、　４５コー４６４゜ ２０）　Ｓｔａａｄｍａｎ、Ｊ−ｈ−ＨＹａｔａｓ、λ、ＨＨｕｅｈｎｓ、Ｅ、 Ｒ，；Ｂｒ１ｔ、、Ｊ、シ但四聾田、１９７０．Ｑ、４３５−４４６゜２１）　 Ｓｔａｍｏｔｏｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｇ、　；　Ｐａ＝ａｒ、　Ｊ＋τ、 　；　Ｆｉｎｃｈ。
Ｃ，Ｎｅｗ　Ｅ　ａ、Ｊ、ａｄ、１９６９．２ｊ３Ｊ−，９１，５−９１９゜２ ２）　Ａｎｄａｒｓｏｎ、　Ｎ、Ｌ、；　Ｐｉｒｕｔｚ、　Ｍ、Ｆ、；−Ｓｔａ ｍａｔａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ、Ｇ、Ｎａｔｕ　ａ　Ｎｅｗ　Ｂ’ｏ　。
１９７コ、２≦、ｌ、、２７５−２７６゜２３）　Ｊｏｎｅｓ、　、Ｒ，Ｔ、； 　Ｂｒ１２１１ｈａｌｌ、Ｂ、；　Ｐｏｏｔｒａｋｕｌ、Ｓ、；Ｇｒａｙ、Ｇ、 　Ｊ、Ｍｏ１ｍ　１９７６１　１１　コアー４４゜２４）　Ｋｏｎｏｔａｙ−Ａ ｈｕｌｕ、Ｆ、工、Ｄ、；　ＧａＬｌｏ、Ｅ、；　Ｌａｈｍａｎｎ。
Ｈ，；　Ｒｉｎｇａｌｈａｎｎ、　Ｂ、　、、ａｄ、　Ｇｅｎａｔ、　１９６Ｂ 、　５゜１０７（１−１゜ ２５）　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｒ，Ｇ、；　Ｈａｓｔｙ、Ｔ、Ｓ、；　τｏｍｌ 土ｎ、Ｇ、；Ａｔｋｉｎｓ、Ｒ，；　Ｂｒｉｍｈａｌｌ、Ｂ、；　Ｊｏｎｅｓ、 Ｒ，Ｔ。
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Ｒ，Ｊ、Ｃ’　、　ｖｅｓｔ、１９８５．　ヱ６．　１１６ター１１７３゜２７ ）　Ｔａｔｓｉｓ、　Ｂ−；　５ｏｆｒｏｎｉａｄｏｕ、　Ｋ、　；　Ｓｔａｒ ｇｉｏｐｏｕｌａｓ。
Ｃ０工、　旦［Ｋ亘１９７６　、丘ヱ、８２７−８：１２゜２Ｓ）　Ｍｅｒａｕ ｌｔ、　Ｇ、　；　Ｋａｃｌａｒｄ、　Ｌ、　ＨＳａｉｎｔ−Ｍａｒｔｉｎ、　 Ｃ，；Ｊａｓｍｉｎ、　Ｋ、　；　Ｃａｍｐｉｅｒ、　Ａ、　；　Ｄｅｌａｎｏ ｅ　Ｇａｒｉｎ、　Ｊ、　；Ａｒｏｕ、ｓ、Ｎ、；　Ｆｏｒｔｕｎｅ、Ｒ，；　 Ｔｈｅｏｄｏｒａ、Ｍ、；５ｅｙｔｏｒ、Ｓ、；　Ｒｏｓａ、Ｊ、；　Ｂｌｏｕ ｑｕｉｔ、Ｙ弓Ｇａ１ａｃｔａｒｏｓ、　Ｆ、ｆｉ　１９８５．ＡＬＬ　１ｏ− ２９ン　工ｍａｒ、　Ｋ、；　Ｍｏｒｉｍｏｔｏ、　Ｈ，；　Ｋｏｔａｎｉ、　 Ｍ、；５ｈｉｂａｔａ、　Ｓ、；　Ｍｉｙａｊｉ、　Ｔ、Ｌ　Ｍａｔｓｕｔｏｍ ｏ、　Ｋ。
’Ｏｃ　ｅ　、’　ｃｈｖｓ、ｃｔ　、　１９７０．２００．１９７−２０２゜ ３０）　Ａｈａｒｎ、Ｅ、；　Ａｈｅｒｎ、Ｖ、；　ＨｉＬｔｃｎ、Ｔ、；　５ ｅｒｊｅａｎｔ。
Ｇ−Ｄ、；　ｓｅｒ’）ａａｎｔ、　Ｂ、Ｅ−；　Ｓ５１賎１ｎｊ　Ｍ−；　Ｌ ａｎｑ＋Ａ、；　Ｍｉｄｄｌａｔｏｎ、　Ａ、；　Ｌａｈｍａｎｎ、　Ｈ，Ｄ■ １ユｅｔ、ｔ。
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１９７ｇ、！丘、５７７−５８５゜ コロ）　工ｍａｍｕｒａ、’ｒ、；　Ｆｕｊｉｔａ、Ｓ、；　０ｈｔａ、Ｙ、； 　Ｈａｎａｄａ。
Ｍ、；　Ｙａｎａｓｅ、　Ｔ、Ｊ−Ｃニオニー訪μ丼代、１９６９ｔ　４ＪＬ２ コ４１−２３４８゜ コア）　Ｍｏｏ−Ｐａｎｎ、　Ｗ、Ｆ、；　Ｗｏｌｆｆ、Ｊ、Ａ、；　５ｉｍｏ ｎ、　Ｇ、；Ｖａｃｅｋ、　Ｍ、；　Ｊｕｔ、　Ｄ、Ｌ、；　Ｊｃ′：Ｊｌｓｏ ｎ、　Ｍ、Ｈ，浪し！Ｌ１９７ｇ、　ｎ、　５３−５６゜３８）　Ｋｉｎｇ、Ｍ 、Ａ、Ｒ，；　Ｗｉｌｌｓｈｉｒｅ、ミ、ｃ、；　Ｌａｈｍａｎｎ、Ｈ，；Ｍａ ｒｉｍｏｔｏ、　Ｈ，、Ｊ、　、ａ＝＝、　１９７２．．２２．１２５−１３４ ゜ コ９）　Ｒａｎｎｅｙ、　Ｈ，Ｍ、；　Ｊａｃｏｂｓ、　λ、ｓ、；　Ｎａｇａ ｌ、　Ｒ，Ｌ。
Ｎ二車９１且　１り６７．２ユｌ、８７６−Ｆｉ７ａ。
４１）　ｏｈｂａ、Ｙ、；　Ｍｉｙａｊｉ、Ｔ、；　Ｍｕｒａｋａｍｉ、Ｍ、； Ｋａｄｏｗａｋｉ、ｓ、；　Ｆｕｊｉｔａ、　Ｔ、；　Ｏｉｍｏｎｉ、Ｍ、；Ｉ （ａｔａｎａｋａ、Ｈ−ｚ　工ｓｈｉｋａｗａ、　Ｋ、；　Ｂａｂａ、Ｓ、；Ｈ ｉｔａｋａ、　ＩＣ，；　Ｉｍａｉ、　ＩＣ，比に一−１９８６１雄。
１０９−１２６゜ 表３　非自然発生の低親和性へモグロビン突然変異体の候補α鎖 ４６　ｐｈａ−−＞ｔｈｒ ４６　ｐｈａ−−＞５ａｒ ４６　ｐｈａ−−＞ａｌａ ｓａ　ｈｉｓ−−＞ｐｈｅ ５ａ　ｈｉｓ−−＞ｔｒｐ ６１１ｙｓ−−＞セｈｒ ６１１ｙｓ−−＞５ｉｒ ６１１ｙｓ　−−＞ｍｅｔ ６エ１ｙｓ−−＞ａｓｎ ６２　ｖａｌ−−＞１ｅｕ ６２　ｖａｌ−−＞１ｌｅ ６２　ｖａｌ−−＞ｐｈｅ ６２　ｖａｌ−−＞ｔｒｐ ６５　ａｌａ−−＞ａｓｐ ９４　ａｓｐ−−＞ｇｌｎ ９４　ａｓｐ−−＞ｔｈｒ ９４　ａｓｐ−−＞５ｅｒ ９４　ａｓｐ−−＞１ｙｓ ９４　ａｓｐ−−＞ｇｌｙ ９４　ａｓｐ−−＞ａｒｇ β鎖 ２１、　ａｓｐ−−＞ａｌａ ２１ａｓｐ−−＞５ａｒ ４５　ｐｈａ−−＞ａｌａ ４５ｐｈａ−−＞廿「 ４５　ｐｈｅ−−＞ｖａｌ ６コ　ｈｉｓ−−＞ｐｈａ ６３ｈｉｓ−−＞セτ ６６１ｙｓ−−＞Ｓ＠ｒ ６６１ｙｓ−−＞ａｓｎ ６フ　ｖａｌ−−＞ｐｈａ ６７ｖａｌ−−＞セ１ ６７　ｖａｌ−−＞１ｌａ ７０　ａｌａ−−＞ｇｌｕ ７０　ａｌａ−−＞ｓａｒ フ０ａｌａ−−＞ｔｈｒ り６　１ａｕ−−＞ｐｈｅ ９６１、ａｕ−−＞ｈｉｓ ９６１ａｕ−−＞１ｙｓ ９ｉＪｖ碑１−一〉セτ ９８　ｖａｌ　−−＞ｐｈｅ １０２　ａｓｎ−−＞ａｓｐ ＬＯ２ａｓｎ−−＞ｇｌｕ １０２　ａｓｎ−−＞ａｒｇ １０２　ａｓｎ−−＞ｈｉｓ １０２　ａｓｎ−−＞ｇｌｙ １０８　ａｓｎ−−＞ａｒ（Ｊ １０８　ａｓｎ−−＞ｇｌｕ 表４００ 高酸素親和性、自然発生ヘモグロビン突然変異体Ａ、　α鎖突然変異体 ６　（Ａ４）　Ａｓｐ−＞ＡｌａＳａｗａ：ａＡｓｐ−＞ＡｓｎＤｕｎｒＩ ＡＳ　ｐ−＞Ｖａ　ｌＦ＠ｒｎＣＯＷｎＡｓｐ−＞ＴｙｒＷｏｏｄｖｉｌｌａ Ｌｙｓ−＞ＡｓｎＡｌｂａ二ｙ−Ｓｕｍａ４０　（Ｃ５）　Ｌｙｓ−＞ＧｌｕＫ ａｒｉ７ａ４４　（ＣＨ２）　Ｐｒｏ−＞ＬａｕＭｉｌｌａｄｑｅｖｉｌｌｅＰ ｒｏ−＞ＡｒｇＫａｗａｃｈｉ ４５　（ＣＨ３）　Ｈｌｓ二＞ＡｒｇＦｏｒｔ　ｄａ　Ｆｒａｎｃａ８５　（Ｆ ６）　Ａｓｐ−＞ＡｓｎＧ−Ｎｃｒｆｏ１ｋｇ２　（ＦＧ４）　Ａｒｑ−＞Ｇｌ ｎＪ−Ｃ醇＠Ｔｏｗｎ−Ａｒｇ−＞Ｌ＠ｕＣｈ＠５ａｐａａ）ｃａ９５　（Ｇ２ ）　Ｐｒｏ−＞Ｌ＠ｕＧ−Ｇ＠ｃｒｇｉａＰｒｏ＝＞ＡｒｇＳｔ、　ＬωＣ＠’ Ｓ　−９７（Ｇ４）　Ａｓｎ−＞ＬｙｓＤａｌｌａｓ１２６　（）！９）　Ａｓ ｐ−＞ＡｓｎＴａｒｒａｎｔ１４１　（ＨＣコ）　Ａｒｑ−＞ＨｉＳＳＬＵ：＠ ５ｎｌｉ！ＳＢ、　β鎖突然変異体 ２　（ＮＡ２）　Ｈｉｓ−＞ＡｒｇＤａｅｒ　ＬｏｄｇｅＨｉｓ−＞ＧｌｎＯｋ ａｙａｍａ ２０　（Ｂ２）　Ｖａｌ−＞ＭｅｔＯ１ｙｍｐｉａ２３　（Ｂ５）　Ｖａｌ−＞ ＡｓｐＳｔｒａｓｂｏｕｒｇＶａｌ−＞ＰｈｅＰａｌｍａｒｓｔｏｎ　Ｎｏｒｔ ｈ３４　（Ｂ１６）　Ｖａｌ−＞ＰｈｅＰｉｔｉａ−５ａｌｐｅｔｒｉｅｒｅ３ ｇ　（Ｃ２）　Ｐｒｏ−＞ＴｈｒＬｉｎ、ｌｃｏｐｉｎｇコア　（Ｃコ）　Ｔｒ ｐ−＞５ａｒＨｉｒｏｓａ４０　（Ｃ６）　Ａｒｇ−＞ＬｙｓＡｔｈａｎｓ−Ｇ ａＡｒｑ−＞　Ｓ　ＱｒＡｕＳＥｌｎ ５１　（Ｃ２）　Ｐｒｏ−＞ＡｒｇＷｉｌｌａｍａｔｔａＬａｕ−＞ＨｉｓＢｒ ｉｓｂａｎｅ ７９　（ＥＦＴ）　ＡＳＰ−＞ＧＩＹ　Ｇ−Ｈｓｉ−ＴｓｏｕＬｙｓ−＞Ｔｈｒ Ｒａｈｅｒｅ Ｌｙｓ−＞ＭａｔＨａｌｓｉｎ）ｃｉ ８９　（Ｆ５）　５ｅｒ−＞ＡｓｎＣｒｅｔａｉｌＳａｒ−＞ＡｒｇＶａｎＣ： ａｒｂｉｌｔ９４　（ＦＧＩ）　Ａｓｐ−＞ＨｉｓＢａｒｃａｌｏｎａＡｓｐ− ＞Ａｓｎぷ訂山コ了 り６　（ＦＧ３）　Ｌａｕ−＞Ｖａｌ　Ｒａｇｉｎａタフ　（ＦＧ４）　Ｈｉｓ ｓ−＞ＧｌｎＭａｌｍ。
Ｈｉｓ−＞ＬａｕＷｏｏｄ ９９　（Ｇｌ）　Ａｓｐ−＞ＡｇｎＫａｍｐｓａｙＡｓｐ−＞Ｈ４５Ｙａｋｉｘ ａ Ａｓｐ−＞ＡｌａＲａｄｃｌｉｆｆａ Ａｓｐ−＞Ｔｙｒ　ＹｐｓｉｌａｎｔｉＡｓｐ−＞ＧｌｙＨｏｔａｌ−Ｄｉａｕ Ａｓｐ−＞Ｖａｌ　Ｃｈａ！ｌｌ１ｌｌｙ１００　（Ｇ２）　Ｐｒｏ−＞Ｌａｕ Ｂｒｉｇｈａｍｌｏｌ　（Ｇ３）　Ｇｌｕ−＞ＬｙｓＢｒｉｔｉｓｈ　Ｃｏｌｕ ｍｂｉａ１０コ　（Ｇ５）　Ｐｈ＠−＞ＬｅｕＨｅａｔｈｒｏｗ１０９　（Ｇｌ ｌ）　Ｖａｌ−＞ＭｅｔＳａｎ　Ｄｉｅｇ。
１２１（ＣＨ４）　Ｇｌｕ−＞Ｇｌ’ｎＤ−Ｌｏｓ　ＡｎｑｅｌａｓＰｒｏ−＞ に１ｎＴｕ　°Ｃａｒｄ Ａｌａ−＞ＰｒｏＣｒａｔａ １４０　（Ｂ１８）　Ａｌａ−＞ＴｈｒＳｔ、−Ｊａｃｑｕｅｓ１４２　（Ｂ２ ０）　Ａｌａ−＞ＡｓｐＯｈｉ。
１４コ　（Ｂ２１）　１（ｉｓ−＞ＡｒｇＡｂｒｕｚｚ。
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ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ 、ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３゜Ｄ Ｅ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ 、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＡ、 ＵＳＩ ／／（Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ａ ＣＩ２Ｒ１：９１） （７２）発明者　ステラトラ−、ゲイリー、エル。
アメリカ合衆国、８０３０２　コロラド州、ボウルダー、キング　アベニュー　 １９５０

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. １．４つのグロビン様ドメインを有する非自然発生的、偽四量体ヘモグロビン様 タンパク質であって、前記偽四量体は２つの実質的に同一のグロビン様ドメイン を有する偽二量体ポリペプチドを含み、グロビン様ドメインの１つは偽二量体ポ リペプチドの他のグロビン様ドメインにはない非対称的に架橋できるシステイン 残基を提供できるように変異され、 前記偽四量体はさらに少なくとも１つの他のグロビン様ドメインを有するポリペ プチドを含むことを特徴とするタンパク質。
  2. ２．第１の偽四量体の非対称的に架橋可能なシステイン残基が第２の偽四量体の 非対称的に架橋可能なシステイン残基に架橋されている、２つまたは３つ以上の 偽四量体ヘモグロビン様タンパク質をもつ請求項１記載の非自然発生的多量体へ モグロビン様タンパク質。
  3. ３．架橋がジスルフィド結合である請求項２記載のタンパク質。
  4. ４．架橋が偽四量体の多官能チオール特異的架橋試薬との反応によって形成され る請求項３記載のタンパク質。
  5. ５．架橋試薬が、血漿に内因性の還元剤によって同じ残基間のジスルフィド結合 より実質的に少なくしか還元可能でない架橋を形成する請求項４記載のタンパク 質。
  6. ６．架橋がチオエーテル、またはチオーマレイイミドの架橋である請求項４記載 のタンパク質。
  7. ７．架橋試薬がチオール特異的反応部分のあるポリエチレングリコール誘導体で ある請求項４記載のタンパク質。
  8. ８．タンパク質が２つの偽四量体からなる請求項２記載のタンパク質。
  9. ９．タンパク質が２より多い偽四重体からなる請求項４記載のタンパク質。
  10. １０．架橋剤がペプチド部分を有する請求項４記載のタンパク質。
  11. １１．架橋剤が１つまたは２つ以上のＤ−アミノ酸を有する請求項１０記載のタ ンパク質。
  12. １２．ペプチド部分が安定な、広げられた、二次構造を有する請求項１０記載の タンパク質。
  13. １３．ペプチド部分がポリプロリンヘリックスを有する請求項１２記載のタンパ ク質。
  14. １４．架橋剤が２本鎖ねじれらせんである請求項１２記載のタンパク質。
  15. １５．ねじれらせんの２本鎖がジスルフィド架橋されている請求項１４記載のタ ンパク質。
  16. １６．架橋剤が４−ヘリカルまたは４−本領のねじれらせんである請求項１２記 載のタンパク質。
  17. １７．ペプチド部分が枝分かれ鎖を有する請求項１２のタンパク質。
  18. １８．架橋が負荷電部分をなし、それによってタンパク質の等電点が減少させら れている請求項１４記載のタンパク質。
  19. １９．負荷電部分が複数のＡｓｐ及び／又はＧｌｕの残基である請求項１８記載 のタンパク質。
  20. ２０．４つまたは５つ以上のグロビン様ドメインを有している非自然発生的偽オ リゴマーポリペプチド。
  21. ２１．ポリペプチドがドメイン間スペーサーとしてポリプロリンヘリックスを有 している請求項２０記載のポリペプチド。
  22. ２２．ドメイン間スペーサーとしてポリアスパラギン酸またはポリグルタミン酸 ヘリックスポリペプチドを有する請求項２０記載のポリペプチド。
  23. ２３．ドメイン間スペーサーとしてＡｒｔｅｍｉａリンカーを有する請求項２０ 記載のポリペプチド。
  24. ２４．ドメイン間スペーサーとしてヘリカルねじれらせんを有する請求項２０記 載のポリペプチド。
  25. ２５．グロビン様ドメインがヒトαグロビン様ドメインであり、ドメイン間スペ ーサーが約２０〜５０Åである請求項２０記載のポリペプチド。
  26. ２６．ドメイン間スペーサーが−（Ｇｌｙ）７，−（Ｇｌｙ）１−３（Ａｌａ） １２−（Ｇｌｙ）１−３，−（Ｇｌｙ）１−３（Ｐｒｏ）１２−１６−（Ｇｌｙ ）１−３−，または−（Ｇｌｙ）１−３（Ａｓｐ）１−３０−（Ｇｌｙ）１−３ である請求項２５記載のポリペプチド。
  27. ２７．請求項２０〜２６に記載のいずれかのポリペプチドと、１つまたは２つ以 上の追加されたグロビン様ドメインのあるポリペプチド鎖とを有する、非自然発 生多量体ヘモグロビン様タンパク質。
  28. ２８．各四量体が２つのヒトαグロビン様ドメインと２つのヒトβグロビン様ド メインとからなる２つの四量体と、１つの四量体中のシステインが第２の四量体 中の対応するシステインにジスルフィド結合しているそのようなシステインとを 有し、第３の四量体の架橋が、その架橋されたシステインがβ８３（ヘモグロビ ンＴａＬｉ）にないという条件下で必須に立体的な阻害をうけていることを特徴 とする非自然発生八量体ヘモグロビン様タンパク質。
  29. ２９．架橋されたシステインが図２にマークされた突然変異部位にある請求項２ ８記載のタンパク質。
  30. ３０．タンパク質が２４〜３２ｔｏｒｒのＰ５０を有する請求項２〜１９および 同２１〜２９のいずれかに記載のタンパク質。
  31. ３１．タンパク質が血漿中で正常の無ヘモグロビンのものより実質的に長い血管 内保持を有している、請求項２〜１９および同２１〜２９のいずれかに記載のタ ンパク質。
  32. ３２．請求項３２による組成物、または請求項２〜１９および同２１〜２９のい ずれかに記載のタンパク質からなる組成物を患者に投与することを特徴とする血 液の酸素運搬能力補助方法。
  33. ３３．請求項２〜１９および同２１〜３１のいずれかに記載のタンパク質を代用 血液組成物の製造に使用する方法。
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