JPH11506314A

JPH11506314A - 低酸素親和性突然変異ヘモグロビン

Info

Publication number: JPH11506314A
Application number: JP8533456A
Authority: JP
Inventors: ホ，チエン; キム，ヒュン−ウォン; シェン，トン−ジアン
Original assignee: Carnegie Mellon University
Current assignee: Carnegie Mellon University
Priority date: 1995-05-01
Filing date: 1996-04-30
Publication date: 1999-06-08
Anticipated expiration: 2016-04-30
Also published as: EP0826064A1; US5843888A; CN1183120A; EP0826064B1; WO1996034974A1; JP3170289B2; CN1159450C; EP0826064A4; ATE283288T1; AU5720596A; DE69633918D1

Abstract

(57)【要約】未変性のヘモグロビンより低い酸素親和性を示すが酸素結合における高い協同性を示す、天然に存在しない突然変異ヘモグロビン（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）が提供される。突然変異ヘモグロビンは好ましくは組換えＤＮＡ技術により得られる。このような突然変異ヘモグロビンは血液代替物の成分として使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】低酸素親和性突然変異ヘモグロビン謝辞本発明は、一部は助成金ＨＬ−２４５２５号により政府の支持により開発された。政府は本発明に一定の権利を有する。本発明の分野本発明は、一般的に新規の突然変異ヘモグロビン、さらに詳しくは、低い酸素親和性を示すが酸素結合における高い協同性を示す組換え突然変異ヘモグロビン「ｒＨＢ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）」に関する。本発明はさらに、組換えＤＮＡ技術を用いる、赤血球代替物として有用な突然変異ヘモグロビンの製造に関する。発明の背景ヒト血液製剤の赤血球におけるＨＩＶや肝炎のような感染性物質の流行が適当な供与者がいないことによる血液の不足と相まって、赤血球代替物、特にヒトヘモグロビン（「Ｈｂ」）およびその誘導体の開発に対する関心を高めている。ヘモグロビンは血液の酸素運搬成分であり、赤血球内に存在して血流中を循環している。健常な成人ヘモグロビン（「ＨｂＡ」）は、各１４１アミノ酸残基を有する２つのα鎖と各１４６アミノ酸残基を有する２つのβ鎖を含有し、またヘムとして知られている補欠分子族を有する４量体タンパク質である。赤血球は、ヘモグロビンが還元型、機能型を維持することを助ける。ヘム−鉄原子は酸化を受けやすいが、赤血球内の２つのシステム（サイトクロームｂ５およびグルタチオン還元系）のうちの１つにより再び還元される。酸素運搬性赤血球代替物の候補としてのヘモグロビンの無細胞溶液の使用は、長い間研究されている。例えば、エー・ジー・ムルダー（Muldr，A.G．）ら、Ｊ．ＣｅｌｌＣｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５：３８３（１９３４）を参照されたい（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）。赤血球から精製される非修飾無細胞ヒトヘモグロビンの使用は、上記の汚染や供給不足の問題以外にいくつかの限界を有する。例えば、補助因子２，３−ジホスホグルセレート（「２、３−ＤＰＧ」）の喪失による酸素親和性の上昇、および腎臓の濾過により排出され長期の腎臓障害を引き起こすαβダイマーへのヘモグロビン４量体の解離がある。例えば、エィチ・エフ・ブン（Bunn，H.F.）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１２９：９０９（１９６９）を参照されたい（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）。ヘモグロビンは、アロステリック制御物質である２、３−ＤＰＧに依存して、その酸素親和性を変化させ、こうして体内での酸素輸送の効率を上昇させることができる。２、３−ＤＰＧは、結合した酸素をヘモグロビンが組織に放出することを促進する濃度で赤血球内に存在する。２、３−ＤＰＧが存在しない場合、ヘモグロビンはより強固に酸素に結合し、結合した酸素を容易に放出しない。すなわち、未変性の健常成人ヘモグロビン（「ＨｂＡ」）は被験体に導入されると、血漿中に２、３−ＤＰＧが欠如しているため、酸素を正しく運搬できない。ヒトグロビンおよびヘモグロビンは、以下のもので発現されている：トランスジェニックマウス、例えばケー・チャダ（Chada，K．）ら、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３１４：３７７（１９８５）およびティー・エム・トウネス（Townes，T. M.）ら、ＥＭＢＯＪ．４：１７１５（１９８５）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）；エム・イー・スワンソン（Swanson，M.E．）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：５５７（１９９２）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）に記載のトランスジェニックブタ；ディー・アール・グレーベ（Groebe，D.R.）ら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ３：１３４（１９９２）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）に記載の昆虫細胞培養物；エム・ワゲンバッハ（ Wagenbach，M．）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：５７（１９９１）およびジェイ・ジェイ・デリアノ（DeLiano，J.J．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：９１８（１９９３）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）に記載の酵母；エス・ジェイ・ホフマン（Hoffman，S .J．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：８５２１（１９９０）、アール・エー・ヘルナン（Hernan，R.A.）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：８６１９（１９９２）、およびティー・ジェイ・シェン（Shen，T.-J．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８１０８（１９９３）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）に記載の大腸菌（Escherichia coli）（「E．coli」）。多くの点で、大腸菌（E．coli）系は発現効率が優れており部位特異的突然変異誘発の実施が容易なため、このような目的には最適の選択である。ヒトα−グロビンまたはβ−グロビンを融合蛋白として発現する最初の大腸菌（E．coli）系は、ケー・ナガイ（Nagai，K．）ら、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３０９：８１０（１９８４）およびケー・ナガイ（Nagai，K．）ら、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５３：４６１（１９８７）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）により記載されたように開発されたが、この系の生成物処理方法は非常に手間がかかり低収率である。従って、特に生化学的、生物物理的、および生物学的研究に組換えヘモグロビン（「ｒＨｂ」）が多量に必要な場合は、この発現系は好ましくない。エス・ジェイ・ホフマン(Hoffman，S.J.)ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：８５２１（１９９０）は、α−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子が単一のシストロンで構築され、等量発現される同時発現系を報告した。発現されたα−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子の両方は、大腸菌（E ．coli）内で内因性ヘムとともに正しく４量体Ｈｂ分子に構築される。アール・エー・ヘルナン（Hernan，R.A.）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：８６１９（１９９２）は、大腸菌（E．coli）内で非融合の単一β−グロビンの発現を報告した。これらの２つの系はいくつかの面でうまく作用するが、α−グロビンとβ−グロビンの両方のアミノ（Ｎ）−末端に余分のメチオニン残基が保持されている。エィチ・エフ・ブン（Bunn，H.F.）ら編、「ヘモグロビン：分子的、遺伝的、および臨床的側面」（Hemoglobin: Molecular ，Genetic and Clinical Aspects ）（ダブリュー・ビー・サンダーズ社（W.B．Saunders，Co.）、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）３７〜６０頁（１９８６）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）が報告した、ＨｂＡの天然のＮ−末端のバリン残基は、酸素親和性の制御（ボーア（Bohr）効果）やアロステリックエフェクターや陰イオンとの相互作用において重要な役割を果たすことが知られている。ジェイ・エス・カバナウ（Kavanaugh，J.S．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：８６４０（１９９２）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）が報告したように、余分のメチオニンはヘモグロビン分子のＮ−末端コンフォメーションを変化させ得る。従って、ヘモグロビンの酸素添加性はＮ−末端残基の完全性に依存し、そのため所望の非修飾および突然変異ヘモグロビンの産生のために大腸菌（ E．coli）系を有効に使用する前に、発現されたヘモグロビンのα−グロビンと β−グロビンの両方のＮ−末端から余分のメチオニン残基を除去することが必要となる。メチオニンアミノペプチダーゼ（「Ｍｅｔ−ＡＰ」または「ＭＡＰ」）は、大腸菌（E．coli）、サルモネラ（Salmonella）、バシラス（Bacillus）、および酵母において、新生ペプチド鎖からのＮ−末端メチオニン残基の除去に関与していることが見いだされており、多様な生物からのＭｅｔ−ＡＰは精製され性状解析されている。例えば、エー・ベン−バサート（Ben-Bassat，A.）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７５１（１９８７）、および米国特許第４，８６５，９７４号、４，８７０，０１７号、および５，０１３，６６２号を参照されたい（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）。これらの酵素は、ペプチドまたはタンパク質のＮ−末端メチオニンに対する独特の特異性を有し、大腸菌（E．coli）やサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）のＭｅｔ−ＡＰは、多くの発現された外来タンパク質からＮ−末端メチオニンを除去することが報告されている。エー・ベン−バサート（Ben-Bassat，A.）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７５１（１９８７）。ヒル（Hill）係数（「ｎ」）で測定されるヘモグロビンの協同的酸素添加は、そのアロステリック性のいくつかの便利な尺度である。アール・イー・ディカーソン(Dickerson，R.E.)ら、「ヘモグロビン：構造、機能、進化、および病理」（Hemoglobin: Structure ，Function，Evolution，and Pathology）（ベンジャミンカミングスパブリッシング社（Benjamin Cummings Publishing Co.）、メンロパーク（Menlo Park）、カリホルニア州）（１９８３）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）を参照されたい。ＨｂＡは、通常の実験条件下でＯ₂との結合においてｎ_max値は約３である。α₁β₂（またはα₂β₁）サブユニット界面においてアミノ酸置換を有するヒトの異常ヘモグロビンは、ＨｂＡに比較して高い酸素親和性とＯ₂結合性において協同性の低下を示す。例えば、アール・イー・ディカーソン（Dickerson，R.E．）ら、同上（１９８３）；エィチ・エフ・ブン（Bunn，H.F.）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：７４０２（１９７４）；およびエム・エフ・ペルツ（Perutz，M.F.）ら、「タンパク質における協同性とアロステリック制御の機構」(Mechanisms of Cooperativity and Allos teric Regulation in Proteins )、ケンブリッジ大学プレス（Cambridge Univers ity Press）（１９９０）を参照されたい。すなわち、α₁β₂サブユニット界面はヘモグロビンの機能性に重要であることが示唆されている。例えば、β９９Ａｓｐでアミノ酸置換を有するヒト突然変異ヘモグロビンは、ＨｂＡに比較して協同性が大きく低下し酸素親和性が上昇している。このような突然変異ヘモグロビンの例は、ヘモグロビンケンプセイ（Hb Kempsey）（β９９Ａｓｐ→Ｈｉｓ）（シー・エス・リード（Reed，C.S.）ら、Ｂｌｏｏｄ３１：６２３（１９６９））；ヘモグロビンヤキマ（Hb Yakima）（β９９Ａｓｐ］→Ｈｉｓ）（アール・ティー・ジョーンズ（Jones，R.T．）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．４６：１８４０（１９６７））；およびヘモグロビンラドクリフ（Hb Radcliff）（β ９９Ａｓｐ→Ａｌａ）（ディー・ジェイ・ウェザーオール（Weatherall,D.J.）ら、ＢｒｉｔｉｓｈＪ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．３５：１７７（１９７７））（（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）がある。ジー・フェルミ（Fe rmi，G．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７５：１５９（１９８４）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）は、デオキシ−ＨｂＡ（酸素分子のないＨｂＡ）のＸ線結晶解析を行い、β９９Ａｓｐはα₁β₂サブユニット界面でα ４２Ｔｙｒとα９７Ａｓｎの両方に水素結合していることを示している。これは、β９９Ａｓｐの基本的な役割は、サブユニット間水素結合を形成してデオキシ −ヘモグロビン分子を安定化させることであることを示唆する。最近、得られた突然変異体における非常に異なる性質を与えるα４２Ｔｙｒの突然変異が関与する２つの組換えヘモグロビン（「ｒＨｂ」）が作成されている。ケー・イシモリ（Ishimori，K.）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６２４（１９８９）とケー・イマイ（Imai，K.）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．ＢＩｏｌ．２１８：７６９（１９９１）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）のｒＨｂ（α４２Ｔｙｒ→Ｈｉｓ）は、酸素の結合（ｐＨ６．８でｎ＝２）においてある程度の協同性と中程度の酸素親和性を示す。ｒＨｂ（α４２Ｔｙｒ→Ｐｈｅ）（ケー・イシモリ（Ishimori，K.）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６２４（１９８９）とケー・イマイ（Imai，K.）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．ＢＩｏｌ．２１８：７６９（１９９１））（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）のｒＨｂ（α４２Ｔｙｒ→Ｐｈｅ）は、酸素の結合（ｎ＝１．２）において協同性を示さず、非常に高い酸素親和性を有する。これらの２つの突然変異体の性質の差は、ｒＨｂ（α４２Ｔｙｒ→Ｈｉｓ）のデオキシ状態ではα４２Ｈｉｓとβ９９Ａｓｐの間に弱い水素結合が存在するが、デオキシ−ｒＨｂ（α４２Ｔｙｒ→Ｐｈｅ）では存在しないためであるとされている。サブユニット間の水素結合が喪失したβ９９Ａｓｐまたはα４２Ｔｙｒのいずれかでアミノ酸置換を有する異常ヘモグロビンはまた、その機能性を喪失していることが知られており、従ってこれらの水素結合はヘモグロビン分子の構造と機能に決定的に重要であるかも知れないことが示唆されている。ビー・シャーナン（Shaanan，B．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７１：３１（１９８３）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）に報告されるように、そのオキシ型のＨｂＡ（酸素分子を有するＨｂＡ）は、α₁β₂サブユニット界面のα９４Ａｓｐとβ１０２Ａｓｎの間の特徴的な水素結合を有する。ヘモグロビンチツスビル(Hb Titusville)（α９４Ａｓｐ→Ａｓｎ）（アール・ジー・シュナイダー(Schneider，R.G.)ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．４００：３６５（１９７５）、この開示内容は参考のため本明細書に引用される）のようなα９４Ａｓｐ位に、またはヘモグロビンカンザス（Hb Kansa s）（β１０２Ａｓｎ→Ｔｈｒ）（ジェイ・ボナベンチュラ（Bonaventura，J．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：９８０（１９６８）、この開示内容は参考のため本明細書に引用される）のようなβ１０２Ａｓｎ位にアミノ酸置換を有するヒトヘモグロビン、ならびに他のヘモグロビンは、非常に低い酸素親和性を示す。しかし、ヘモグロビンのオキシ型のα９４Ａｓｐとβ１０２Ａｓｎの間の水素結合を直接破壊するこれらのすべてのヘモグロビン突然変異体は、酸素の結合の協同性が大幅に低下しており、さらに結合状態ではダイマーに容易に解離する。 α９４Ａｓｐまたはβ１０２Ａｓｎのいずれも関与しない低い酸素親和性のヒト突然変異ヘモグロビンも存在する。例えば、ヘモグロビンプレスビテリアン（ Hb Presbyterian）（β１０８Ａｓｎ→Ｌｙｓ）（ダブリュー・エフ・ムー−ペン（Moo-Penn，W.F.）ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．９２：５３（１９７８）およびジェイ・ケー・オドネル（O'Donnell，J.K．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２７６９２（１９９４）；ヘモグロビンヨシズカ（Hb Yoshizuka）（β１０８Ａｓｎ→Ａｓｐ）（ジェイ・ケー・オドネル（O'Donnell，J.K．）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２７６９２（１９９４））、および組換えヘモグロビンメクオン（Hb Mequon）（β４１Ｐｈｅ→Ｔｙｒ）（ブイ・バウディン（B audin，V.）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１１５９：２２３（１９９２）（これらの開示内容は参考のため本明細書に引用される）はすべて、ＨｂＡに比較して低い酸素親和性を示すが、これらはすべて、ヒル係数で測定する時ｎが１．８〜２．９で変動する可変の協同性を示す。未変性のタンパク質と突然変異タンパク質の差の自由エネルギーを計算するために、分子動力学（「ＭＤ」）シミュレーションが使用されている。例えば、エル・エックス・ダング（Dang，L.X.）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８５０５（１９８９）、およびジェイ・ガオ（Gao，J．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０６９（１９８９）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される））を参照されたい。ジェイ・ガオ（Gao，J．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０６９（１９８９）に報告されているように、ヘモグロビンラドクリフ（ Hb Radcliff）（β９９Ａｓｐ→Ａｌａ）は、測定された熱力学値と計算された値がよく一致している。エィチ・ダブリュー・キム（Kim，H.-W．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１５４７（１９９４）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）に報告されているように、ＭＤシミュレーションを用いて、そのアロステリック性を回復する異常ヘモグロビンで、補償アミノ酸置換がうまく設計されている。ティー・ジェイ・シェン（Shen，T.-J．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８１０８（１９９３）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）は、合成ヒトα−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子が、別別のｔａｃプロモーターの制御下で大腸菌（E．coli）メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子とともに同時発現されている、大腸菌（E．coli）発現プラスミド（ｐＨＥ２）を記載している。このプラスミドで形質転換される大腸菌（E．c oli）細胞は、ｒＨｂＡを発現し、ここからＮ−末端メチオニンが、同時発現されたＭＡＰにより有効に切断されている。Ｎ−末端メチオニンの欠如した得られる組換えＨｂＡは、多くの構造および機能が未変性のＨｂＡと同一である。しかし、ヘモグロビンに基づく血液代替物または治療薬の成分として使用できる突然変異ヘモグロビン種に対するニーズがある。特に興味のあるのは、低い酸素親和性を有するが酸素結合において高い協同性を有し、結合した時異常なサブユニット解離を示さない突然変異ヘモグロビンである。さらに、組換え法で産生されるこのようなヘモグロビン、および特に血液代替物として使用するために高収率でそのような突然変異ヘモグロビンを産生するための効率的な発現系に対するニーズがある。発明の要約従って、本発明の主な目的は、低い酸素親和性を有する突然変異ヘモグロビンを提供することである。本発明の別の目的は、低い酸素親和性を有する天然に存在しない突然変異ヘモグロビンを提供することである。本発明の別の目的は、人工的に、好ましくは組換え手段で産生される、正しいヘムコンフォメーションを有する低酸素親和性突然変異ヘモグロビンを提供することである。本発明のさらに別の目的は、低い酸素親和性を有するが酸素結合において高い協同性を有する突然変異ヘモグロビンを提供することである。本発明の別の目的は、無細胞環境で赤血球中の健常成人ヘモグロビンと同様の酸素結合性を有する突然変異ヘモグロビンを提供することである。本発明のさらに別の目的は、そのような突然変異ヘモグロビンを産生するための発現系を提供することである。本発明のさらに別の目的は、ヘモグロビンに基づく赤血球代替物または治療薬として使用される人工ヘモグロビンを提供することである。本発明のこれらおよび他の目的は、以下の実施態様の１つまたはそれ以上により達成される。１つの面において、本発明は、α鎖の９６位のバリン残基がトリプトファン残基により置換されている、天然に存在しない突然変異ヒトヘモグロビンを特徴とする。好適な実施態様において、ヘモグロビンは健常成人ヘモグロビンと比較して低い酸素親和性を有し、かつ酸素結合の高い協同性を有し、そして組換え法で産生される。別の面において、本発明は、アロステリックエフェクター２、３−ＤＰＧの存在下で健常成人ヘモグロビンのそれに匹敵する酸素結合性を有する、天然に存在しない低酸素親和性突然変異ヘモグロビンを特徴とする。好適な実施態様において、突然変異ヘモグロビンではα鎖の９６位のバリン残基はトリプトファン残基で置換されている。本発明の他の特徴および利点は、以下の好適な実施態様の説明および請求の範囲から明らかであろう。図面の簡単な説明図１は、プラスミドｐＨＥ２０２で形質転換した大腸菌（E．coli）ＪＭ１０９細胞（「ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９」）の超音波処理物から得られるｒＨｂ（ α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のモノＳカラムからのクロマトグラフィー溶出プロフィールであり、ピークａ、ｂ₁、およびｂ₂を示す。画分は５４６nmで追跡した。図２Ａ〜２Ｄは、プラスミドｐＨＥ２０２から得られたピークａ（図２Ａ）；ピークｂ₁（図２Ｂ）；およびピークｂ₂（図２Ｃ）からのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ →Ｔｒｐ）；ならびに参照としてＨｂＡ（図２Ｄ）の電子噴霧質量スペクトルである。図３Ａと３Ｂは、２９℃でｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸塩水溶液中のＣＯ型のｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９から得られる４％ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）および４％ＨｂＡの環電流シフトプロトン共鳴を示す¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。図３Ａは、ＣＯ型のモノＳカラムから精製された画分（ａ、ｂ₁、ｂ₂）を示す。図３Ｂは、ＣＯ型からＦｅ⁺³状態に変換し、次にＣＯ型に戻した、ピークａ、ｂ₁、ｂ₂から精製されたｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）を示す。図４Ａと４Ｂは、２９℃（両方の図）と３６℃（図４Ｂのみ）でのｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸塩水溶液中のデオキシ型のｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９から得られるピークからの４％ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）、および４％ＨｂＡの¹ Ｈ−ＮＭＲ共鳴を示す。図４Ａは、近位ヒスチジン残基の超微細シフトＮ_δＨ交換可能なプロトン共鳴を示す。図４Ｂは超微細シフトおよび交換可能な共鳴を示す。図４Ｂ中の「デオキシ−ｒＨｂ」は、デオキシｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）を示す。図５Ａ〜５Ｄは、１０、２１、２９および３６℃でのｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸塩水溶液中の１０mMイノシトール六リン酸（「ＩＨＰ」）の存在下での、ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９から得られるピークからの４％ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）と４％ＨｂＣＯＡの３００−ＭＨｚプロトン共鳴に及ぼす温度の影響を示す。図５Ａと５Ｂは、それぞれピークａからの４％ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）と４％ＨｂＣＯＡの交換可能なプロトン共鳴を示す。図５Ｃと５Ｂは、それぞれピークａからの４％ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）および４％ＨｂＣＯＡの環電流シフトプロトン共鳴である。図６Ａ〜６Ｄは、１０、１５、２１、および２９℃でのｐＨ７．０のＩＨＰ水溶液の非存在下でのｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９から得られるピークからの４％ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）と４％ＨｂＣＯＡの３００−ＭＨｚプロトン共鳴に及ぼす温度の影響を示す。図６Ａと６Ｂは、それぞれピークａからの４％ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）と４％ＨｂＣＯＡの交換可能なプロトン共鳴を示す。図６Ｃと６Ｄは、それぞれピークａからの４％ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）と４％ＨｂＣＯＡの環電流シフトプロトン共鳴である。図７Ａと７Ｂは、２９℃でｐＨ範囲６．３〜８．９の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中のｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９から得られる、０．１mMのＨｂＡまたはｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）で得られるｐＨの関数としてプロットした５０％飽和のＯ₂分圧（Ｐ₅₀）（mmHg）を有する酸素親和性を示す。図７Ａは、ＨｂＡ（○）およびモノＳカラムからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の精製された画分（ピークａ（■）、ｂ₁（△）、およびｂ₂（＋））を示す。図７Ｂは、ＨｂＡ（○）およびＣＯ型からＦｅ⁺³状態に変換され次にＣＯ型に戻された、モノＳカラムからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の精製された画分（ピークａ（ ■）、ｂ₁（△）、およびｂ₂（＋））を示す。図８Ａと８Ｂは、２９℃でｐＨ範囲６．５〜８．４の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中のｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９から得られる、０．１mMのＨｂＡまたはｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）で得られる酸素解離データ中のｐＨの関数としてのヒル係数（ｎ_max）を示す。図８Ａは、ＨｂＡ（○）およびモノＳ−精製画分（ピークａ（■）、ｂ₁（△）、およびｂ₂（＋））を示す。図８Ｂは、ＨｂＡ（○）、およびＣＯ型からＦｅ⁺³状態に変換され次にＣＯ型に戻された、モノＳカラムからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の精製された画分（ピークａ（■ ）、ｂ₁（△）、およびｂ₂（＋））を示す。図９は、ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９から得られるピークからのモノＳ−精製したｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のｐＨ７．４で２９℃の０．１Ｍリン酸緩衝液中の０．１mM Ｈｂおよびアロステリックエフェクター（２mM ２、３−ＤＰＧと２mM ＩＨＰ）の存在下でピークａからのモノＳ−精製ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）と比較したＨｂＡを示す。図１０Ａと１０Ｂは、それぞれ酸素親和性（Ｐ₅₀）の温度依存性、およびｐＨ７．４で１６、２０、２５、２９、および３７℃の０．１Ｍリン酸緩衝液中の０．１mM ＨｂＡまたはｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）で得られるヒル係数（ｎ_max ）を示す。使用したＨｂは：ＨｂＡ（○）、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）（△）、２mM ＩＨＰの存在下でのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）（＋）、および２mM ＩＨＰの存在下でのＨｂＡ（□）である。図１１Ａと１１Ｂは、ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９から得られるピークｂ２からの４％ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）、ｐＨＥ７０２／ＪＭ１０９から得られるピーク２からの４％ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）、およびＨｂＡ（すべて、ｐＨ７．０で２９℃の０．１Ｍリン酸塩水溶液中のＣＯ型）の、交換可能なプロトン共鳴（図１１Ａ）と環電流シフトプロトン共鳴（図１１Ｂ）である。両方のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）試料は、ＮＭＲ測定を行う前に酸化 −還元反応を受けた。発明の詳細な説明Ｉ．定義本明細書において「ＨｂＡ」または「未変性のＨｂＡ」とは、ヒト被験体から得られる健常成人ヘモグロビンを意味する。「組換え健常成人ヘモグロビン」、「ｒＨｂＡ」および「非修飾ｒＨｂＡ」とは、組換えＤＮＡ技術により産生され、かつティー・ジェイ・シェン（Shen，T. -J．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８１０８（１９９３）に記載のように未変性のＨｂＡと基本的に同じ構造と機能を有する健常成人ヘモグロビンを意味する。「ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）」は、組換えＤＮＡ技術により産生され、 α₁β₂（またはα₂β₁）界面に位置するα鎖の９６位のバリン残基がトリプトファン残基で置換されている、突然変異健常成人ヘモグロビンを意味する。このヘモグロビンは、低い酸素親和性を示すが、酸素結合において高い協同性を有し、結合した時異常なサブユニット解離を示さない。「デオキシ」および「オキシ」は、ＨｂＡおよびｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）中のヘム−鉄原子の酸素添加状態を意味する。オキシヘモグロビン「オキシ −Ｈｂ」または「ＨｂＯ₂」は、ヘム基に結合した４つの酸素分子を有する。デオキシヘモグロビン（「デオキシ−Ｈｂ」）は、酸素分子を含有しない。正常な動脈血では、健常成人のヘモグロビンＡ（「ＨｂＡ」）はオキシ型（「オキシ− ＨｂＡ」）である。静脈血では、ＨｂＡの一部はデオキシ型である（「デオキシ −ＨｂＡ」）である。「カーボンモノオシ−Ｈｂ」、「ＨｂＣＯＡ」、「ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）」および「ＣＯ型」はすべて、酸素分子ではなく一酸化炭素分子に結合したヘモグロビンを意味する。「フェリ−ヘモグロビン」、「フェリ−Ｈｂ」、「第二鉄型」、「メトヘモグロビン」、「Ｍｅｔ−Ｈｂ」、および「Ｆｅ⁺³状態」はすべて、その各ヘム−鉄原子が第二鉄（Ｆｅ³⁺）状態に酸化されているＨｂＡおよびｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）を意味する。フェリ−Ｈｂは酸素に結合しない。「フェロ−ヘモグロビン」、「フェロ−Ｈｂ」、「Ｆｅ⁺²状態」、および「第一鉄型」は、その各ヘム−鉄原子が未変性の還元第一鉄（Ｆｅ⁺²）状態であるＨｂＡ、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）、ＨｂＣＯＡ、およびｒＨｂＣＯ（α ９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）を意味する。フェロ−Ｈｂは酸素または一酸化炭素に結合することができる。「対照」は、ＤＮＡ分子の調節領域中の別の遺伝子（特に、プロモーター）に影響される遺伝子コード配列を意味し、こうしてコード配列はプロモーターの支配下で発現され制御される。そのような調節がない場合、コード配列は、宿主生物中で高すぎまたは低すぎるレベルで、または正しくない時期に発現される。「メト−アミノペプチダーゼ」、「Ｍｅｔ−Ａｐ」および「ＭＡＰ」は、ペプチド配列からアミノ（Ｎ）末端メチオニン残基を特異的に切断する酵素メチオニンアミノペプチダーゼを意味する。「四次構造遷移」は、デオキシ型からオキシ型に進むα₁β₂のような、ヘモグロビンのサブユニット界面中の構造転位を意味する。「酸素親和性」は、ヘモグロビン分子への酸素の結合の強さを意味する。高酸素親和性は、ヘモグロビンがその結合酸素分子を容易に放出しないことを意味する。Ｐ₅₀は、酸素親和性の尺度である。「協同性」は、ヘモグロビンのシグモイド酸素結合曲線を意味し、すなわち四量体ヘモグロビン分子内の１つのサブユニットへの酸素の結合は、他の非結合サブユニットへの酸素分子の結合を増強する。これはヒル係数（ｎ_max）で測定することが便利である。ＨｂＡでは、ｎ_max＝３．０である。ヘモグロビンのＲ−型もしくはＲ−様およびＴ−型もしくはＴ−様構造は、特徴的な四次構造マーカーを示すヘモグロビン（例えば、Ｒ−構造マーカーとしてＤＳＳから１０．７ppmでのプロトン共鳴、およびＴ−構造マーカーとしてＤＳＳから１４ppmでのプロトン共鳴）を示すヘモグロビンを意味する。いくつかの突然変異体および化学的修飾されるＨｂは、Ｔ−またはＲ−四次構造マーカーを有するが、変化した四次構造を有する。 II．方法および結果本発明において、天然に存在しない低い酸素親和性の突然変異体ヒトヘモグロビン、およびそのようなヘモグロビンを組換え法で産生させるための手段が提供される。さらに詳しくは、本発明は、組換え法で産生されるＨｂＡの突然変異体（本明細書において、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）として表す）（ここで、 α₁β₂（またはα₂β₁）サブユニット界面領域に位置するα鎖の９６位のバリン残基はトリプトファン残基により置換されている）に関する。この新しい人工ヘモグロビン（すなわち、完全に血液以外の供給源から得られる）は、低い酸素親和性を示すが酸素結合において高い協同性を示す。さらに、これは結合する時、異常なサブユニット解離を示さない。無細胞環境中で、本発明のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）は、赤血球中のＨｂＡと同様の酸素結合性を示す。組換え法で産生されるこのような低い酸素親和性のヘモグロビン突然変異体は、ヘモグロビンに基づく血液代替物の成分として有用である。このような突然変異体はまた、腫瘍の放射線治療、外傷、および手術における血液希釈において有用である。また、他の適当な突然変異を有する他の低い酸素親和性のヘモグロビンの調製および使用も、本発明の範囲内である。特に本発明の方法は、追加の利点を有する他の突然変異ヘモグロビンを産生するために使用してもよい。α₁β₂界面中の他の突然変異およびヘモグロビンの中央の空洞は、他の有用な低い酸素親和性の突然変異体を与えると考えられる。血液代替物または治療への使用についてのこのような突然変異体の適切性を評価する方法は、本明細書で後述される。下記の分子動力学シミュレーションは、本発明のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の独特の酸素結合性は、ｒＨｂのデオキシ型（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）中の α₁β₂サブユニット界面のα９６Ｔｒｐとβ９９Ａｓｐの間の余分の水素結合に帰因することを示唆する。 α₁β₂サブユニット界面中の小アミノ酸残基であるバリンが大きなトリプトファン残基でる置換されるにもかかわらず、この人工ヘモグロビンは、健常成人ヘモグロビンに比較して、ヘムポケットの周りの非常によく似た三次構造とα₁ β₂サブユニット界面中の非常によく似た四次構造を示すことが、以下に証明される。ヘモグロビン分子の三次構造は、各鎖がそれ自身の上で折り畳むようにさせる線状の鎖の配列中で遠く離れているアミノ酸残基の立体関係を意味し、四次構造は、サブユニット鎖が互いに相互作用する方法を意味する。以下に証明されるように、本発明の人工ヘモグロビンは、このヘモグロビンの結合型（例えば、オキシ−（Ｒ−）型四次構造中のカーボンモノキシ型）は、アロステリックエフェクターの添加により結合状態を変化させることなく、デオキシ−（Ｔ−）型四次構造に変換できる性質を有する。この変換はまた、イノシトール六リン酸の非存在下で温度を低下させることにより行われる。従って本発明の組換えヘモグロビンは、α₁β₂界面中のサブユニット相互作用の本質およびヘモグロビンのアロステリック機構の分子的基礎に関して新しい知見を得るのに使用できる。明らかに、本発明の方法は、異なる性質を有する他の突然変異人工ヘモグロビンならびに天然に存在する突然変異体を補償する突然変異を有するヘモグロビンを産生するのに使用できる。ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）を得るための好適な材料と方法は、以下の参考例で与えられる。本発明のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→ Ｔｒｐ）は、好適には組換え法で産生されるが、非組換え法も利用できることを理解すべきである。参考例Ａ．プラスミドｐＨＥ２０２発現プラスミドｐＨＥ２０２の作製本発明において、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）を発現する２つのプラスミド（プラスミドｐＨＥ２０２とプラスミドｐＨＥ７０２）が作製された。プラスミドｐＨＥ２０２のプロトコールンと結果は、以下の通りである。合成ヒトα−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子を含有するＨｂＡ発現プラスミドｐＨＥ２を、出発物質として使用した。プラスミドｐＨＥ２の作製および産生されるｒＨｂＡの性質は、ティー・ジェイ・シェン（Shen，T.-J．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８１０８（１９９３）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）に詳細に記載される。プラスミドｐＨＥ２の作製において、合成α−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子は、プラスミドｐＤＬIII−１３ｅ（ソマトゲン社（Somatogen，Inc．）、ボールダイ（Boulder）、コロラド州、から供与された、またエス・ジェイ・ホフマン( Hoffman，S.J.)ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：８５２１（１９９０）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）に詳細に記載されている）から得られた。大腸菌（E．coli）Ｍｅｔ−ＡＰ遺伝子のコード配列は、プラスミドｐＳＹＣ１１７４（大腸菌（E．coli）ＭＭ２９４中のｐＳＹＣ１１７４は、シータス社(Cetus Corp.)、エメリイビル（Emeryville）、カリホルニア州、からの供与である）から得られ、この株は受託番号ＡＴＣＣ５３２４５号でアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Cu lture Collection）に寄託されており、一般的に入手できる。また、米国特許第４，８６５，９７４号、４，８７０，０１７号、および５，０１３，６６２号を参照されたい。プラスミドｐＨＥ２は、別のｔａｃプロモーターの支配下で大腸菌（E．coli）Ｍｅｔ−ＡＰ遺伝子とともに、合成ヒトα−グロビンおよびβ− グロビン遺伝子を同時発現する。次に部位特異的突然変異誘発を行って、α鎖の９６位のバリン残基を下記のようにトリプトファン残基で置換した。合成ヒトα−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子（プラスミドｐＤＬIII−１３ｅから）を、当該分野で公知の方法により、ファージミドｐＴＺ１８Ｕ（バイオラッドラボラトリーズ（Bio-Rad Laborato ries）、ハーキュリーズ（Hercules）、カリホルニア州）に挿入した。配列５’ −ＴＴＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＣＡＡＣ−３’（突然変異コドンに下線を引いてある）の合成オリゴヌクレオチドを、ピッツバーグ大学のＤＮＡ合成施設（DNA Synthesizing Facility）で合成し、プライマーとして使用して標準的ＤＮＡ合成法により突然変異（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）を導入した。オリゴヌクレオチド合成の方法は当該分野で公知であり、本発明は特定の方法に限定されない。部位特異的突然変異誘発は、ティー・エム・クンケル（Kunkel，T.M.）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８（１９８５）およびティー・ジェイ・シェン（Shen，T.-J．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８１０８（１９９３）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）に記載のように行った。次にプラスミドｐＨＥ２中のヒト正常α−グロビン遺伝子を、突然変異した遺伝子で置換してプラスミドｐＨＥ２０２を得た。宿主細胞大腸菌（E．coli）ＪＭ１０９中のプラスミドｐＨＥ２０２はｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９と名付け、ＡＴＣＣ６９７９２号で１９９５年４月２６日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Typ e Culture Collection）（ロックビル（Rockville）、メリーランド州）に寄託した。細胞の増殖プラスミドｐＨＥ２０２を当該分野で公知の方法により大腸菌(E．coli)ＪＭ１０９細胞（プロメガ(Promega)、マジソン(Madison)、ウィスコンシン州）に形質転換した。細胞を、１．２％バクトトリプトン、２．４％バクトイーストエキス、０．４％グリセロール、１７mM ＫＨ₂ＰＯ₄、７２mM Ｋ₂ＨＰＯ₄、および１００μgアンピシリン（シグマ(Sigma)、セントルイス、ミズーリ州）を含有するＴＢ培地中で、２０リットルのマイクロファームモデル（Microferm Model）ＭＦ２０発酵槽（ニューブランズウィックサイエンティフィック（New Brnswick Scientific）、エジソン（Edison）、ニュージャージー州）中で３０℃で、細胞密度が１〜２×１０⁹細胞/mlに達するまで増殖させた。ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の発現は、０．２mMの濃度になるようにイソプロピルβ−チオガラクトピラノシドを加えて誘導した。次に培養物にヘミン（２０mg/l）（シグマ（Sigma）、セントルイス、ミズーリ州）とグルコース（１０g/l）を補足し、少なくともさらに４時間増殖を続けた。次に遠心分離して細胞を集め、さらなる精製に必要になるまで−８０℃で１００ｇずつ凍結保存した。本発明の組換え突然変異ヘモグロビンの発現と産生には、現在大腸菌（E．col i）細胞が好適であるが、本発明は大腸菌(E．coli)細胞に限定されない。他の適当な発現系（例えば、酵母、昆虫細胞、およびブタやウシのようなトランスジェニック動物）を使用して突然変異ヘモグロビンを発現することも有効である。プラスミドｐＨＥ２０２は大腸菌(E．coli)細胞について最適化されているが、以下に詳述するｐＨＥ７０２はヒト遺伝子から作成され、従ってプラスミドｐＨＥ７０２中に含有されるヒト遺伝子とともに他の発現系が有効に使用できる。組換えヘモグロビンの単離と精製プラスミドｐＨＥ２０２で形質転換した細胞から得られるｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）を、ティー・ジェイ・シェン（Shen，T.-J．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８１０８（１９９３）の方法を若干修飾して精製した。凍結保存した細胞ペーストを溶解緩衝液（３ml/gの細胞ペーストで４０mMトリス塩基／１mMベンズアミジン（シグマ（Sigma））に入れ、完全に懸濁されるまで攪拌した。１０mlの４０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．０）に溶解したリゾチーム（シグマ（Sigma））（１mg/g細胞ペースト）を細胞懸濁液に加え、４℃で約４５分間放置した（溶液は非常に粘性が高くなる）。ＭｇＣｌ₂とＭｎＣｌ₂を最終濃度がそれぞれ１０mMと１mMになるように添加した。約３〜５μg/mlのＤＮＡｓｅ（アイシーエヌバイオケミカル社（ICN Biochemical，Inc．）、コスタメサ（ Costa Mesa）、カリホルニア州）を加え、粘性が低下するまで３０〜６０分間攪拌した。次に溶解物をブランソン４５０ソニファイアー（Branson 450 sonifier ）（ブランソン(Branson)、ダンベリー(Danbury)、コネチカット州）で氷浴中で６５〜７５Ｗで３分間のサイクル（溶解物の低温を維持するためにサイクルの間で停止した）を３回超音波処理した。次に溶解物をソーバル（Sorvall）ＧＳＡロータ（イー・アイ・デュポン（E.I．duPont）、ウィルミントン（Wilmington ）、デラウェア州）で４℃で１４，０００rpmで４５分間遠心分離した。次に上清をＣＯガスで飽和させ、４℃で３〜４日間放置した。上清のｐＨを１Ｍトリス塩基で８．０に調整し、１０％ポリエチレンイミン（シグマ（Sigma））（容量／容量）をゆっくり加えて、最終濃度を０．５％にして核酸を沈殿させた。これをＣＯガス下で１５分間攪拌し、次に前記のように１４，０００rpmで遠心分離した。上清のｐＨを１Ｍトリス塩基で８．３に調整し、容量が約１５０mlになるまでミリポアミニタンアクリリック（Millipore Minitan Acrylic）限外濾過装置（ミリポア社（Millipore Corp．）、ベッドフォード（Bedford）、マサチューセッツ州）に通した。濃縮した溶液を２０mMトリス− 塩酸／０．１mMトリエチレンテトラアミン（「ＴＥＴＡ」）（ｐＨ８．３）（以後「Ｑ２」緩衝液と呼ぶ）で一晩、緩衝液を交換して透析した。Ｑ２緩衝液と同じになるように通常２０mMトリス−塩酸／０．１mMＴＥＴＡを加えて、ｐＨと伝導度を調整した。最終精製工程でファルマシアファーストプロテイン液体クロマトグラフィー（ Pharmacia fast protein liquid chromatography）（「ＦＰＬＣ」）装置（ファルマシアバイオテク社（Pharmacia Biotech，Inc．）、ピスカタウェイ（Piscat away）、ニュージャージー州）を用いて、２つのカラムを使用した。最初のカラムはＱ−セファロースファーストフローカラム（ファルマシア（Pharmacia）陰イオン交換樹脂）（５cm×２８cm）であり、これはヘモグロビンを結合させるのに使用した。試料をカラムにのせてから、Ｑ２緩衝液（２０mMトリス−塩酸／０．１mMＴＥＴＡ、ｐＨ８．３）で洗浄し、混入している核酸が溶出するまで２６０nmで追跡した。次にヘモグロビン画分を、２０mMトリス−塩酸（ｐＨ７．２）で溶出させた。溶出液を１０mMリン酸塩／０．１mMエチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）（ｐＨ６．８）（緩衝液Ａ）で濃縮した。使用した第２のカラムは、モノＳカラム（ファルマシア（Pharmacia）陽イオン交換樹脂、ＨＲ６／１０）である。１０mMリン酸ナトリウム／０．１mMエチレンジアミン四酢酸（「ＥＤＴＡ」）（ｐＨ６．８）（緩衝液Ａ）から２０mMリン酸ナトリウム／０．１mMＥＤＴＡ（ｐＨ８．３）（緩衝液Ｂ）の勾配を流して平衡化した試料をモノＳカラムで精製した。画分を５４６nmで追跡した。ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）を図１に示す２つの主要なピーク（対称のピーク（ピークａ）の後に２つの重複するピーク（ピークｂ₁とｂ₂））で示されるように溶出した。前記のように得たこれらのピークは、図１に示すように以後「ピークａ」、「ピークｂ₁」、および「ピークｂ₂」と呼ぶ。ヘモグロビン濃度は、イー・アントニーニ（Antonini，E.）ら、「リガンドとの反応におけるヘモグロビンとミオグロビン」（Hemoglobin and Myoglobin inTheir Reactions with Ligands ）（ノースホランド（North Holland）、アムステルダム）、第１９頁（１９７１）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）に記載の公表されている吸光係数を用いて求めた。ヘモグロビンの型フラスコ中のＨＢＯ₂またはデオキシ−Ｈｂ溶液にＣＯガスを流して、ヘモグロビンのＣＯ型（例えば、ＨｂＡとｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ））を調製した。この操作は、喚起されたドラフト内で行った。デオキシ−Ｈｂは、通常ティー・アール・リンドストローム（Lindstrom，T.R．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９：１７０７（１９７２）に詳述されているように、４℃で窒素ガス下でロータリーエバポレーター中で、ＨｂＣＯまたはＨｂＯ₂ を脱酸素型に変換して調製した。オキシ−Ｈｂは、デオキシ−Ｈｂ溶液を空気または酸素ガスに暴露して調製した。タンパク質配列決定アール・エム・ヘウィック（Hewick，R.M.）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：７９９０（１９８１）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）に記載のように、オンラインのフェニルチオヒダントイン−アミノ酸アナラーザー（モデル１２０Ａ）を取り付けたアプライドバイオシステム（Applied Bios ystm）気／液相シーケンサー（モデル４７０／９００Ａ）を用いて、エドマン分解の自動サイクルを行った。質量スペクトル質量スペクトルに付したヘモグロビン試料を、蒸留水に対して充分透析し、次に凍結乾燥した。解析の直前に、試料を水に溶解して、１２５pmolのヘモグロビン／μl水（７．８mg/ml）の濃度にした。次にこれらの溶液のアリコートを希釈して、最終濃度を１０pmol/μlの５０：５０水／０．２％ギ酸含有アセトニトリルとした。これらの最終溶液のアリコート（１０μl）を、５μl／分で電子噴霧イオン源に導入した。電子噴霧分析は、ブイジー・クアトロ−ビーキュー（VG Quattro-BQ）（フィソンズインスツルメンツ（Fisons Instruments）、ブイジーバイオテク（VG Bio tech）、アルトリンチャム（Altrincham）、英国）（単一の荷電イオンの質量範囲が４０００の三重４極子装置）で行った。スキャンは、１スキャン当たり１０秒間でｍ／ｚ９８０〜１４００で行った。２０スキャンから得られたデータを、まとめて最終スペクトルを得た。質量スケール較正では、外部参照としてＨｂＡのα鎖（分子量＝１５，１２６．４）からの複数の荷電したイオンピークを使用した。正常のα鎖および正常のβ鎖のアミノ酸配列から計算した分子量は、それぞれ１５，１２６．４と１５，９６７．２である。これらの値は、以下の原子質量に基づく：Ｃ＝１２，０１１；Ｈ＝１，００７９４；Ｎ＝１４，００６７４；０＝１５，９９９４；およびＳ＝３２，０６６（これらは、原子質量と同位体存在に関する委員会（Commission on Atomic Weights and Isotopic Abundanc es）、ＰｕｒｅＡｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．６３：９７５（１９９１）により報告されている；この開示内容は参考のため本明細書に引用される）。得られた電子噴霧質量スペクトルは、図２Ａ〜２Ｄに示す。ヘム−鉄原子の酸化状態の変換ヘモグロビンを酸化（この場合、ＨｂＡとｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のＣＯ型をＦｅ³⁺状態に）するために、０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ６．５）中のヘモグロビン溶液の濃度を測定した。３モル過剰のＫ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆（フィッシャーサイエンティフック（Fisher Scientific））または他の適切な酸化剤を加え、室温で１時間攪拌した。この間、ヘモグロビン溶液は赤色から褐色に変化した。得られた酸化されたヘモグロビン（Ｆｅ³⁺）を、０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ６．５）を用いてセファデックスＧ−２５（中間）カラム（シグマ（Sigma））に通して、過剰のＫ₃Ｆｅ（ＣＮ）₆を除去し、室温で一晩放置した。次に酸化されたヘモグロビン（Ｆｅ³⁺）を、まず試験管中で０．１Ｍリン酸塩（ｐＨ約７．０）を調製して、緩衝液に窒素を泡立たせて酸素を除去して溶存酸素を除去する。別の試験管に、充分量の亜ジチオン酸ナトリウム（フルカケミー（Fluka Chemie）、スイス）を計りとって亜ジチオン酸塩の０．１Ｍ溶液を得る。次に試験管に窒素をフラッシュして酸素を除去する。次にデオキシリン酸塩緩衝液を嫌気的にデオキシ亜ジチオン酸塩に移して０．１Ｍの最終濃度を得る。酸化されたヘモグロビン溶液の上（泡立たせない）にＣＯ流を吹き付ける。色が明るい赤色に戻るまで、酸化されたヘモグロビン溶液にデオキシ亜ジチオン酸塩緩衝液を加えた。この時点で、すべてのヘモグロビン（Ｆｅ³⁺）がヘモグロビン（Ｆｅ²⁺）に還元されていることを確認するために、光学スペクトルをチェックすることができる。ヘモグロビンの還元に使用したものと同じＣＯガスを吹き付けた緩衝液で、セファロースＧ−２５カラムを平衡化させた。次に還元したヘモグロビン溶液を、同じＣＯガスを吹き付けた緩衝液を用いてセファロースＧ−２５カラムに通過させた。得られた酸化／還元されたヘモグロビンを次に、好ましくは前述のＦＰＬＣモノＳカラムに通して精製した。得られた酸化された、還元された、モノＳ精製されたｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）またはＨｂＡを、前述のように必要に応じてカーボンモノキシまたはオキシ型に変換した。フェロ−ヘモグロビン（Ｆｅ²⁺）からフェリ−ヘモグロビン（Ｆｅ³⁺）への酸化のために他の適切な酸化剤を使用してもよい（例えば、フェリシアン化物、銅、過酸化水素、ヒドロキシルアミン、亜硝酸塩、ヒドラジン、チオール、アリールアミン、または電気化学電位（「Ｅｍ」）が０．１４ボルトより大きい任意の化合物）。フェリ−ヘモグロビン（Ｆｅ³⁺）からフェロ−ヘモグロビン（Ｆｅ²⁺ ）への還元のために使用できる他の適切な還元剤は、（ｉ）非酵素的還元のためには、亜ジチオン酸塩、メタ重亜硫酸塩、システイン、還元型グルタチオン、およびアスコルビン酸（メチレンブルーの存在下で）、および（ii）酵素的還元のためには、サイトクロームｂ₅還元酵素、ＮＡＤＰＨ−フラビン還元酵素、およびＥｍが０．１４ボルト未満の任意の他の化合物が使用できる。エィチ・エフ・ブン（Bunn，H.F.）ら編、「ヘモグロビン：分子的、遺伝的、および臨床的側面」（Hemoglobin: Molecular ，Genetic and Clinical Aspects）（ダブリュー・ビー・サンダーズ社（W.B．Saunders，Co.）、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）６３４〜６６２頁（１９８６）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）を参照されたい。ＮＭＲ測定 ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル法は、ヘムポケットを含む三次構造、およびサブユニット界面である四次構造のようなＨｂＡの構造的特徴を研究するための優れた手段であることが証明されている。シー・ホー（Ho，C.）ら、Ａｄｖ．ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ．４３：１５３（１９９２）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）を参照されたい。ヘモグロビンの環電流シフト¹Ｈ共鳴は、ＣＯ型のｒＨｂＡのヘム配向と環境に影響を受けることが知られている（シー・ホー（Ho，C.）ら、Ａｄａｎｃ．ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ．４３：１５３（１９９２）、およびティー・ジェイ・シェン（Shen，T.-J．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８１０８（１９９３）、これらの開示内容は参考のため本明細書に引用される）。 ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ブルカー（Bruker）ＡＭ−３００分光光度計を３００MHzで１０℃〜３６℃で操作して得られた。すべてのヘモグロビン試料は、ｐＨ７．０の０．１リン酸ナトリウム緩衝液（１００％の水中）に入れた。ヘモグロビン濃度範囲は約４％であった。水のシグナルは、ピー・プラトー（Platea u，P．）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０４：７３１０（１９８２）（これらの開示内容は参考のため本明細書に引用される）に報告されているように、「ジャンプ−アンド−リターン」パルスシーケンスを用いて抑制した。特定のカーボンモノキシ−Ｈｂ（「ＨｂＣＯ」）とデオキシ−Ｈｂ試料の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、９．７μ秒の９０°パルス、スペクトル幅８kHz（デオキシ−Ｈｂについては１６kHz）を有する５−mm複数核プローブ（ブルカー（Bruker））のプロトンデカプリングコイルと８０００のデータ点を用いて得られた。典型的には、２５６または１０２４スキャンを平均してシグナル対ノイズ比を改良した。プロトン化学シフトは、２，２−ジメチル−２−シラペンタン−５スルホネート（「ＤＳＳ」）のナトリウム塩のメチルプロトン共鳴を参照とし、２９℃でＤＳＳのシグナルのダウンフィールドの４．７６ppmにシグナルが存在する水のシグナルを内部標準とした。得られた¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、図３〜６と図１１に示す。ＨｂＡ試料の酸素結合酸素解離曲線は、ヘモックス−アナライザー（Hemox-Analyzer）（ティーシーエスメディカルプロダクツ（TCS Medical Products）、ハンチントンバレイ（Hu ntington Valley）、ペンシルバニア州）により、ｐＨ６．０〜８．３の範囲の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で１６〜３７℃で測定した。エー・ハヤシ（ Hayashi，A．）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．３１０：３０９（１９７３）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）に記載のメトヘモグロビン還元酵素系を、フェリ−Ｈｂの生成を防ぐために加えた（３０〜６０μl）。５０％酸素添加時の分圧（Ｐ₅₀）とヒル係数（ｎ_max）を、各曲線から求めた。これらの試験の結果を図７〜１０に示す。ＭＤシミュレーションＭＤシミュレーションは、シー・エル・ブルークス（Brooks，C.L.）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８：１５９（１９８９）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）の確率的境界法を使用して、極性水素タンパク質モデルについて標準的パラメータ（ｐａｒａｍ１９）を有するＣＨＡＲＭＭ２２（ビー・アール・ブルークス（Brooks，B.R.）ら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．４：１８７（１９８３）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される））を使用して、行った。異なるヘモグロビンコンフォメーションの安定性の比較のために、半径１０オングストロームと１５オングストロームを有するそれぞれＭＤ領域とランゲビン（Langevin）領域に、分子を分離した（これらはその中心が、ジー・フェルミ（ Fermi，G．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７５：１５９（１９８４）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）の示したデオキシ−ＨｂＡの結晶構造の参照座標上にある）。これらの座標は、２つのα９６Ｖａｌ側鎖のＣβのほぼ中間にある。シミュレーションの自由エネルギーの計算のために、半径１０オングストロームと１５オングストロームを有するそれぞれＭＤ領域とランゲビン（Langevin）領域に、分子を分離した（これらはその中心が、ヘモグロビンのデオキシ（ジー・フェルミ（Fermi，G．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７５：１５９（１９８４））とオキシ結晶構造（ビー・シャンナン（Shannan，B．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７１：３１（１９８３）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）のβ９９Ａｓｐ側鎖のＣβの質量の中心座標にある）。内部の球を、ダブリュー・エル・ジョルゲンセン（Jorgensen，W.L．）ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．７９：９２６（１９８３）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）に記載のように、ｃｈａｒｍｍ−適合プレ平衡化ＴＩＰ３Ｐ水分子で充填した。デオキシシミュレーションは、１０３の水分子を含有し、オキシシミュレーションは８３の水分子を含有した。Ｈｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の利用可能な結晶構造がないため、初期のコンフォメーションのためにα９６Ｔｒｐのいくつかの異なる局所的コンフォメーションを考慮した。１０％を超える頻度［χ₁＝−７０．４、χ₂＝−１００．５（３７．９％）；χ₁＝６４．８、χ₂＝−８８．９（２０．７％）；χ₁＝−１７７．３、χ₂＝−９５．１（１３．８％）；χ₁＝−１７９．５、χ₂＝−８７．５（１０．３％）］を示す、回転異性体ライブラリー（ジェイ・ダブリュー・ポンダー（Ponder,J.W．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３：７７５（１９８７）、（この開示内容は参考のため本明細書に引用される））からのトリプトファンの４つの可能な側鎖角を、ＭＤシミュレーションの初期配向として使用した。同じ数のタンパク質原子と水分子を各コンフォメーションで使用した。野生型と突然変異タンパク質の間の形質転換は、ハイブリッドポテンシャル関数Ｖ_λ＝（１−λ）Ｖ_A＋λＶ_B（ジェイ・ガオ（Gao，J.）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０６９（１９８９）およびビー・チドー（Tidor，B．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：３２１７（１９９１）、これらの開示内容は参考のため本明細書に引用される）（ここでλは、０と１の間のカプリング因子である）を使用して行われる。Ｖ_AとＶ_Bは、それぞれＨｂＡと突然変異ヘモグロビンのカプリング因子である。シミュレーションは９つのλ_i（λ＝０．１、０．２、．．．．．０．９）で行い、５ｐｓの平衡化の後に５ｐｓの製造動力学を用いて、但しλ＝０．１とλ＝０．９では１０ｐｓの平衡化を用いて、行った。非結合相互作用は８．５Åでゼロまで端を切り取り、一定の誘電率（ε＝1）を使用した。水素原子が関与するすべての結合は、ジェイ・ピー・ライケート(Ryckaert ，J.-P.)ら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｐｈｙｓ．２３：３２７（１９７７）、この開示内容は参考のため本明細書に引用される）のシェーク（ＳＨＡＫＥ）アルゴリズムにより束縛した。１０ｐｓのシミュレーションは、ｌｆｓの組み込み時間でサンスパーク（SunSparc）ワークステーション１０で約２時間かかる。シミュレーションの自由エネルギーは、ジェイ・ジー・カークウッド（Kirkwo od，J.G.）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．３：３００（１９３５）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）の記載した熱力学的組み込み法を使用して、ヘモグロビンのデオキシ型とオキシ型の両方についてＭＤシミュレーションの軌跡ファイルから、式：（式中、ΔＶ＝Ｖ_B−Ｖ_Aであり、熱力学的平均＜ΔＶ＞_λはハイブリッド系にわたるＶ_λの平均を示す）を用いて得ることができる。熱力学的式の線形型は、シミュレーションの総自由エネルギーは各付加的寄与に分解しできることを示す。突然変異に帰因する協同性の自由エネルギーの変化は、すでにジェイ・ガオ（Ga o，J．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０６９（１９８９）により示されたように、熱力学的サイクルから間接的に得られる。構造解析を行うために、野生型（λ＝０）と突然変異系（λ＝１）の平均構造は、シー・エル・ブルークス（Brooks，C.L.）ら、Ｐ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９０：６６８０（１９８６）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）の指数式：（式中、Ｘはデカルト座標を示し、Ｘ₀とＸ₁はシミュレーション平均野生型と突然変異座標を示し、それぞれβ＝１／ｋ_BＴ、および＜＞_λはポテンシャルＶ_λ 下の合計平均である）を用いてシミュレーション（それぞれ、λ＝０．１および λ＝０．９）された最も近い状態から計算した。Ｂ．結果ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の生化学的性質前述のように、プラスミドｐＨＥ２０２を有する大腸菌（E．coli）ＪＭ１０９の超音波処理した細胞から発現されたｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のモノＳクロマトグラフィーにより、図１に示すようにモノＳカラムクロマトグラフィー上で２つの主要なピーク（ピークａとｂ）が得られた。対照的なピーク（ピークａ）がまず出てきて、次に２つの重複するピーク（ピークｂ₁とｂ₂）が出てくる。モノＳクロマトグラフィーによりこうして得られたピークは、以後「ピークａ」、「ピークｂ₁」、「ピークｂ₂」と呼ぶ。ＣＯ型のこれらのピークのすべては、ＨｂＡに等しい３５０〜７００nmの範囲で可視の光学的スペクトルを示す（結果は示していない）。前述のように行った電子噴霧質量スペクトルは、図２に示すように、すべての３つのピークのアミノ末端メチオニン残基は、同時発現されるＭｅｔ−ＡＰにより有効に切断されていることを示す。ピークａについては、α鎖の少なくとも９８％は質量１５，２１３（これは、トリプトファン残基によるバリン残基の置換についての計算値である）を有し、および約９０％までのβ鎖は質量１５，８６７（これは、ＨｂＡのβ鎖の計算された質量である）を有する。その質量（１５，９９８）が正常のβ鎖＋メチオニン残基の質量に対応する小さな成分（＜１０％）がある。しかし、ピークｂ₁とピークｂ₂については、α鎖とβ鎖の両方とも検出されない（＜２％）Ｎ−末端メチオニンとともに正しい質量を有する。ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の¹Ｈ−ＮＭＲ試験ｉ．ＣＯ型から第二鉄型への変換、次にヘモグロビンのＣＯ型へ戻る変換ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９由来の各ＣＯ型とＨｂＣＯＡのモノＳ精製したｒＨｂｓ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の３つのすべてのピーク（ａ、ｂ₁、およびｂ₂ ）の環電流シフト¹Ｈ共鳴の比較を、図３Ａに示す。スペクトルは、前述のようにその各ＣＯ型に変換された、２９℃でｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸塩水溶性中の４％ｒＨｂｓ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）と４％ＨｂＡを用いて得られた。図３Ｂのスペクトルを得るために、すべてのヘモグロビンはそのＣＯ型からＦｅ³⁺状態に変換し、ＣＯ型に戻した。ＤＳＳから０〜２．０の¹Ｈ共鳴は、ヘモグロビン分子とポルフィリンのヘムポケットの近傍に位置するアミノ酸残基のいくつかのプロトンに由来する（シー・ホー（Ho，C.）ら、Ａｄｖａｎｃ．ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ．４３：１５３（１９９２）（この開示内容は参考のため本明細書に引用される））。図３Ａから明らかなように、ピークａ、ｂ₁、およびｂ₂からのｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の環電流シフト¹Ｈ共鳴はすべて、ＨｂＣＯＡのそれとは少し異なる。またＨｂＣＯＡには見られない追加の共鳴ならびにＤＳＳから０〜−１．１ppmの領域上にいくつかの共鳴の強度の変化がある。しかし、ピークａからのＨｂＣＯＡのα鎖とβ鎖のＥ１１Ｖａｌ（遠位Ｖａｌ）のγ₂−メチル基に割り当てられている−１．７〜−１．８p pmの共鳴（ティー・アール・リンドストローム（Lindstrom，T.R．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１１：１６７７（１９７２）およびシー・ダルビット（Da lvit，C.）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４：３３９８（１９８５）、これらの開示内容は参考のため本明細書に引用される）は、ＨｂＡのそれと基本的に同じであるが、ピークｂ₁とピークｂ₂からの共鳴ははるかに大きい。大腸菌（E．coli）中のヘモグロビン発現プラスミドｐＨＥ２を使用する、発現されたグロビンへのヘムの正しい挿入の現象は、ティー・ジェイ・シェン（Sh en，T.-J．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８１０８（１９９３）で考察されている。かれらは、酸化および還元工程によるｒＨｂの精製成分の１つのヘムポケットの未変性のＨｂＡのそれへの変換を記載した。同様に、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の異常¹Ｈ共鳴をヘモグロビンの未変性型のそれへ変換する可能性を本発明において検討した。すべての３つのピークからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）を、まずその各第二鉄状態に酸化し、次に前述のように各ＣＯ型またはオキシ型に還元して戻した。図３Ｂに示すように、酸化と還元工程後のすべての３つのピークからのこのような「変換されたヘモグロビン」は、変換前のピークａからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のそれと同様である、同一のＮＭＲスペクトル（各遠位バリンの環境は同じである）を示す（図３）。これは、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のピークａは、正しいヘムコンフォメーションとサブユニット界面を有することを示唆する。従って特に明記しない場合は、ピークａからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）は、本明細書に記載のすべてのさらなる研究に使用された。 ii．ヘム環境とサブユニット界面前述のように図４Ａと４Ｂの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ピークａからのｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９から、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸塩水溶性中の４％モノＳ精製したｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）および４％ＨｂＡ（いずれもデオキシ型）について得られた。図に記載のように、図４Ａスペクトルは、２９℃で得られ、図４Ｂのスペクトルは２９℃と３６℃で得られた。近位ヒスチジン残基の超微細シフトＮ_δＨ交換可能なプロトン共鳴を、図４Ａに示す。図４Ａについて、〜６３ppmの共鳴は、デオキシ−ＨｂＡのβ鎖の近位Ｈｉｓ残基（α８７Ｈｉｓ）の超微細シフトＮ_δＨ交換可能なプロトンに割り当てられ、〜７７ppmの共鳴は、デオキシ−ＨｂＡのβ鎖（β９２Ｈｉｓ）の対応する残基に割り当てられた（エス・タカハシ（Takahashi，S．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１９：５１９６（１９８０）、およびジー・エヌ・ラ・マール（La Mar，G.N.）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．９６：１１７２（１９８０）、これらの開示内容は参考のため本明細書に引用される）。ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のピークａ中のこれらの２つの近位ヒスチジン共鳴の化学シフト位置は、図４Ａで見られるＨｂＡのそれと同じである。これは、ｒＨｂ（α ９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の近位ヒスチジンのまわりに摂動がないことを示す。デオキシ型のピークａのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）とＨｂＡの第一鉄超微細シフトおよび交換可能なプロトン共鳴を、図４Ｂに示す。超微細シフト共鳴は、ヘム−鉄原子中のプロトンとＦｅ（II）の対になっていない電子の間の超微細相互作用により、ヘム基とその近くのアミノ酸残基のプロトンに由来する。２９℃のピークａからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の超微細シフト共鳴は、ＤＳＳから〜２２．５と〜１８．７ppmの共鳴（デオキシ−ＨｂＡのβ鎖に関連するプロトンに割り当てられている）（タカハシ（Takahashi）ら、１９８０）およびＤＳＳから〜１７ppmの共鳴（デオキシ−ＨｂＡのα鎖に関連するプロトンに割り当てられている）（タカハシ（Takahashi）ら、１９８０）の周りのいくつかの化学シフト変化を、２９℃でのＨｂＡのそれと比較して示す。ＤＳＳから１１〜１４ppmのスペクトル領域上の交換可能な¹Ｈ共鳴は、ＨｂＡのデオキシ −四次構造の優れたマーカーであることが知られている（シー・ホー（Ho，C.）ら、Ａｄｖａｎｃ．ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ．４３：１５３（１９９２））。〜１４ppmの共鳴は、α４２Ｔｙｒとβ９９Ａｓｐの間のサブユニット間水素結合（デオキシ−四次（Ｔ）構造の特徴）に割り当てられている（エル・ダブリュー・エム・フング（Fung，L.W.-M）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１４：２５２６（１９７５）、この開示内容は参考のため本明細書に引用される）。図４Ｂに見られるように、デオキシ型のピークａからのＨｂＡとｒＨｂ（α９６Ｖａｌ →Ｔｒｐ）の間のＤＳＳから〜１４ppmの共鳴には顕著な差がなく、これは、デオキシ型のこのα₁β₂サブユニット間水素結合は、突然変異により影響を受けないことを示している。ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）では、図４Ｂに見られるように２９℃でＤＳＳから〜１２．６ppmに新しい共鳴が現れ、これはデオキシ−ＨｂＡには存在しない。しかし、高温（３６℃）で¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルをとった時、ＤＳＳから〜１２．６ppmでの共鳴はシフトした。温度感受性の化学シフト位置は、この新しい共鳴は、交換可能な共鳴であるより超微細シフト共鳴である可能性を示している（ジェイ・ピー・ジェッソン（Jesson，J.P.）ら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．４７：５７９（１９６７）；アール・ジェイ・カーランド（Kurland，R.J．）ら、Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．２：２８６（１９７）：エム・イー・ジョンソン（Johnson，M.E．）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９９：１２４５（１９７７）、これらの開示内容は参考のため本明細書に引用される）。以上の結果は、ＭＤシミュレーションが野生型（ＨｂＡ）から突然変異ヘモグロビン（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）への形質転換にうまく応用できることを示している。 iii．結合状態を変化させない四次構造のスイッチングイノシトール六リン酸（「ＩＨＰ」）（シグマ（Sigma））の存在下でのＣＯ型のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の交換可能なプロトン共鳴は、ＨｂＡのそれに比較してある非常に興味深く独特の特徴を示す。ｐＨ７．０で０．１Ｍリン酸水溶液中の１０mM ＩＨＰの存在下で３００MHzで、ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９ピークから得られる４％ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）および４％ＨｂＣＯＡの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルが得られた。１０、２１、２０、および３６ ℃でスペクトルが得られた。図５Ａと５Ｂは、それぞれｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）とＨｂＣＯＡの交換可能なプロトン共鳴を示す。図５Ｃと５Ｄは、それぞれｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）とＨｂＣＯＡの環電流シフト共鳴を示す。オキシ−四次（Ｒ）構造（α９４Ａｓｐとβ１０２Ａｓｎの間のサブユニット間水素結合）（エル・ダブリュー・エム・フング（Fung，L.W.-M．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１４：２５２６（１９７５）；ビー・シャーナン（Shaana n，B．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７１：３１（１９８３）、これらの開示内容は参考のため本明細書に引用される）の特徴であるＤＳＳから〜１０．７ppm の共鳴は、ＩＨＰの存在下では、２９℃でのｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の¹Ｈ−スペクトルにおいて消失している（図５Ａ）。その代わりに図５Ａは、ＨｂＣＯＡ（図５Ｂ）に比較すると、デオキシ−四次（Ｔ）構造（α４２Ｔｙｒとβ９９Ａｓｐの間のサブユニット間水素結合）（フング（Fung）ら、１９７５；ジー・フェルミ（Fermi，G．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７５：１５９（１９８４）、この開示内容は参考のため本明細書に引用される）の特徴であるＤＳＳから〜１４ppmの共鳴が出現していることを示す。図５に関して後述されるように、強力なアロステリックエフェクターであるＩＨＰの存在は、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のデオキシ型を安定化し、従って平衡をデオキシ型にシフトさせ得るようである。α₁β₂とα₂β₁サブユニット界面における新規な水素結合の存在は、さらに安定性を付与して、特に低い温度で、ＩＨＰの存在下で非常に容易に四次構造遷移をデオキシ−四次構造に向けることができる。図５Ａにおいて、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のスペクトルのＤＳＳから〜１４ppmの共鳴の強度は、温度が２９から１０℃に低下するにつれて、徐々に増大する。３６℃で、ＤＳＳから〜１４ppmの共鳴は消失し、そしてオキシ−四次（Ｒ）構造の特徴であるＤＳＳから〜１０．７ppmの共鳴は、肩（shoulder）として再出現する。１０℃の〜１４ppmの共鳴の相対強度は、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のデオキシ型における交換可能な共鳴のそれと同等である。ＤＳＳから〜１４ppmのこの共鳴の化学シフト位置は、温度により変化せず、このことは、この共鳴の由来が、超微細シフトするのではなく交換可能であることを示唆している。ＤＳＳから〜１４ppmの共鳴の出現は、〜１１から〜２４ppmの超微細シフト共鳴の出現に伴うものではなく、このことは、ヘム鉄がなお低スピンの反磁性状態（すなわち、リガンド結合型）にあることを示している。デオキシ −（Ｔ−）およびオキシ−（Ｒ−）四次構造の特徴である共鳴の温度による強度の変化は、可逆的である。図５Ｂは、図５ＡにおいてｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）について観察されるのとは対照的に、温度の関数としての１０mM ＩＨＰ中のＨｂＣＯＡの交換可能なプロトン共鳴にはほとんど変動がないことを示している。１０℃においてさえ、ＨｂＣＯＡについては〜１４ppmに非常に小さなシグナルが見られるのみであり、ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のそれと強度を比較して非常に異なっている。２１℃や２９℃のような中間の温度では、ＩＨＰの存在下のｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の交換可能なプロトン共鳴は、オキシ−四次構造の特徴である〜１０．７ppmの共鳴は基本的に消失するが、デオキシ−四次構造の特徴である〜１４ppmの共鳴は非常に弱い強度を示すことを、示している。これらの結果は、〜１０．７ppmの共鳴により明示されるようにα９４Ａｓｐとβ１０２Ａｓｎの間の水素結合を失っているが、〜１４ppmの共鳴により明示されるようにα４２Ａｓｐとβ９９Ａｓｐの間の水素結合が未だ形成されていない、中間の四次構造が存在するかもしれないことを示唆している。本発明のこのｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）は、強力なアロステリックエフェクターであるＩＨＰの添加のみにより、および／または温度の低下により、結合状態を変化させることなくデオキシ−様四次構造に緩やかに変換することができる。１０mM ＩＨＰの存在下のＣＯ型のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）およびＨｂＡの環電流シフトプロトン共鳴はまた、図５Ｃと５Ｄに示されるように異なる温度で比較した。ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のＤＳＳから０〜−１．１ppmの領域にわたる共鳴の相対強度および化学シフト位置は、ＨｂＡのそれらが相対的にほとんど変化しないのに対して、温度によりかなりの変化が見られた。ＨｂＣＯＡのαおよびβ鎖のＥｌｌＶａｌ（遠位バリン）のγ₂−メチル基（ティー・アール・リンドストロム（Lindstrom，T.R．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１１：１６７７（１９７２）；シー・ダルビット（Dalvit，C.）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４：３３９８（１９８５）、これらの開示内容は参考のため本明細書に引用される）に割り当てられるＤＳＳから−１．７〜−１．８ppmの共鳴は、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）およびＨｂＡの両方のＣＯ型において低温で１つのピークに合体する。ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のＤＳＳから−１１．７〜−１．８ppmの共鳴は、ＨｂＡのそれよりもはるかに広幅化していることが判る。ＤＳＳから０〜−１．１ppmの領域にわたる共鳴の相対強度および化学シフト位置における変化、およびｒＨｂ（ α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の−１．７〜−１．８ppmの共鳴の広幅化は、ＨｂＡでは観察されない構造の遷移を反映するものと考えられる。ＩＨＰが存在が無しで、ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸水溶液中で３００MHzで、ピークａからの４％ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）および４％ＨｂＣＯＡの¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルも得られた。異なる温度におけるＩＨＰの非存在下のＣＯ型のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）およびＨｂＡの交換可能なプロトン共鳴で得られたスペクトルを図６Ａと６Ｂにおいて比較する。温度が低下するにつれて、ＤＳＳから〜１４ppmの共鳴は、ＩＨＰの非存在下のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）で出現するが、一方ＨｂＡでは１０℃でもＤＳＳから〜１４pp mの共鳴の出現は見られない。図６Ｃと６Ｄは、ＩＨＰの非存在下の、それぞれＣＯ型のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）とＨｂＣＯＡの環電流シフト共鳴を示す。これらの図はまた、温度に依存するスペクトル変化を示す。ｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のＤＳＳから０〜−１．１ppmの領域にわたる共鳴の相対強度および化学シフト位置は、温度により大きな変化が見られたが、ＨｂＣＯＡのそれらはほとんど変化しなかった。低温における、デオキシ−四次構造の特徴であるＤＳＳから〜１４ppmの交換可能な共鳴の出現（図６Ａと６Ｂ）、およびｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のＤＳＳから０〜−１．１ppmの環電流シフト領域にわたる共鳴の相対強度および化学シフト位置（図６Ｃと６Ｄ）は、ＩＨＰの非存在下でもデオキシ−四次構造変換が起こることを示唆している。ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の酸素結合性ｐＨ７．０の０．１Ｍリン酸中の、ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９（ピークａ、ｂ₁ 、およびｂ₂）から得られるｒＨｂＣＯ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の３つのピークの０．１mMの各Ｈｂを、セファデックス（Sephadex）Ｇ−７５のカラムに適用した。それぞれ、ＨｂＯ₂ Ａに対応する位置で対称性ピークとして溶出し、このことは、オキシ型のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の３つの全ての型が、本実験条件下で四量体であることを示している（結果は示していない）。ｐＨの関数としてのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のピークａ、ｂ₁、およびｂ₂の酸素結合性を、前述のように検討した。簡単に述べると、２９℃でｐＨ範囲６．３〜８．９で０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で使用される０．１mM 濃度の各特定のＨｂにより酸素解離データを得た。５０％飽和（Ｐ₅₀）のＯ₂分圧は、各曲線から求めた。図７Ａのデータは、ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９から得たモノＳ（Mono S）精製画分、ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９からのピークａ、ｂ₁ 、およびｂ₂およびＨｂＡから得た。図７Ｂのデータは、ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９から得たモノＳ（Mono S）精製画分、ピークａ、ｂ₁、およびｂ₂およびＨｂＡから得たが、これらは、前述のように、各ＣＯ型からＦｅ⁺³型に変換し、次にＣＯ型に戻る。図７Ａと７Ｂの両方について、ＨｂＡは（○）；ピークａからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）は（■）；ピークｂ₁からのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）は（△）；そしてピークｂ₂からのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）は（＋）である。図７Ａと７Ｂに見られるように、ピークｂ₁とｂ₂からのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）は、酸化と還元の過程の前のＨｂＡと同様なＰ₅₀ （５０％飽和のＯ₂分圧）値を示し、これに対して、ピークａからのｒＨｂ（α ９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）およびピークｂ₁およびｂ₂からの「変換された」Ｈｂは、著しく低い酸素親和性を示す。ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９から得たモノＳ（Mono S）精製ピークａ、ｂ₁、およびｂ₂並びにＨｂＡについて、両方のそれぞれその非修飾型、さらにはその各ＣＯ型からそのＦｅ⁺³状態に変換し次にそのＣＯ型に戻した型の、ヒル係数（ｎ_max ）を求めた。酸素解離データは、前述のように得られた。簡単に述べると、各Ｈｂ試料のデータは、２９℃でｐＨ範囲６．５〜８．４の０．１Ｍリン酸ナトリウム中の０．１mM濃度のＨｂにより得られた。各曲線からヒル係数を求めた。図８Ａは、種々の非修飾ヘモグロビンから得られたデータを示し；図８Ｂは、ＣＯ型からＦｅ⁺³状態に変換し、次にそのＣＯ型に戻したヘモグロビンから得られたデータを示す。両方の図において、ＨｂＡは（○）；ピークａからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）は（■）；ピークｂ₁からのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→ Ｔｒｐ）は（△）；そしてピークｂ₂からのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）は（＋）である。図８Ａと８Ｂから、ピークａからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）および「変換された」Ｈｂが、約９０％のＨｂＡのボーア効果（Bohr effect）（ΔｌｏｇＰ₅₀／ΔｐＨ）を示し、ＨｂＡが約３であるのに対してｐＨによって約２．２〜２．６のｎ_max値の協同性を示すことが判る。下記の表１は、ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９から得たピークａからのｒＨｂ（α ９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）、ｒＨｂＡ（ティー・ジェイ・シェン（Shen，T.-J．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８１０８（１９９３）に従って我々の研究室で調製した）、ＨｂＡ、および５mMの２，３−ＤＰＧの存在下のＨｂＡについて、Ｐ₅₀およびｎ_maxの値を比較する。すなわち、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の独特の構造により、アロステリックエフェクターが存在しないときでさえ、アロステリックエフェクターの存在下のＨｂＡと同等の性質を有すると考えらる。また、酸素解離データは、ｐＨ７．４で２９℃の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の０．１mMの以下の各ヘモグロビン試料により得られた。曲線は、ＨｂＡ、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）（ｐＨＥ２０２／Ｊｍ１０９）、２mM ２，３−ＤＰＧの存在下のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）、および２mM ＩＨＰの存在下のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）について求めた。結果は図９に示す。低い酸素親和性と高い協同性に加えて、ピークａからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→ Ｔｒｐ）の酸素結合曲線は、独特の酸素結合性を示す。非常に低い酸素圧では、２，３−ＤＰＧまたはＩＨＰのようなアロステリックエフェクターの存在下のピークａからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の酸素結合は、二相性曲線を示す。ピークａからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）およびＨｂＡの酸素親和性（Ｐ₅₀）およびヒル係数（ｎ_max）に及ぼす温度の影響は、ぞれぞれ図１０Ａと１０Ｂにおいて比較される。種々のＨｂ試料の酸素解離データは、前述のように、ｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の０．１mM濃度の各Ｈｂ試料により得られた。温度は、１６、２０、２５、２９、および３７℃とした。Ｐ₅₀およびヒル係数（ｎ_max）は、各曲線から求めた。ＨｂＡ（○）；ピークａからのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→ Ｔｒｐ）（ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９）（△）；２mM ＩＨＰの存在下のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）（ｐＨＥ２０２／ＪＭ１０９）（＋）；および２mM ＩＨＰの存在下のＨｂＡ（□）のデータを得た。図１０Ａは、酸素親和性（Ｐ₅₀ ）を示し；図１０Ｂは、ヒル係数（ｎ_max）を示す。図１０Ａに示されるように、酸素親和性は、温度が低下するにつれて、ＩＨＰが存在してもＩＨＰが存在しなくとも、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）およびＨｂＡにおいて有意に増大している。しかし、図１０Ｂは、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）およびＨｂＡのｎ_max値が、温度の関数としてあまり変化しないことを示している。１５〜３７℃の温度範囲にわたって、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→ Ｔｒｐ）およびＨｂＡは、約２．０〜２．９のｎ_max値の協同性を示す。Ｂ．プラスミドｐＨＥ７０２発現プラスミドｐＨＥ７０２の作成同様のα９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ突然変異を、オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＴＧＧＧＴＣＣＡＣＣＣ−３’（ディーエヌエー・インターナショナル社（DNA International，Inc．）、レーク・オスウェゴ（Lake Osw ego）、オレゴン州）によりプラスミドｐＨＥ７中に導入して、報告された方法（ティー・エム・クンケル（Kunkel，T.M.）、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：４８８−４９２；ティー・ジェイ・シェン（ Shen，T.-J．）ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８１０８）によりプラスミドｐＨＥ７０２を形成した。プラスミドｐＨＥ７は、ヒトα−およびβ−ｃＤＮＡと大腸菌（E．coli）Ｍｅｔ−ＡＰ遺伝子を同時発現するプラスミドである。これは、前述のｐＨＥ２と同じ方向にタンデムに配列された２つの発現カセットを含む：（ｉ）ｔａｃプロモーター−大腸菌（E．coli）Ｍｅｔ−ＡＰコード配列−５ＳＴ１Ｔ２ターミネーター、および（ii）ｔａｃプロモーター−α−グロビンｃＤＮＡコード配列− β−グロビンｃＤＮＡコード配列−５ＳＴ１Ｔ２ターミネーター。プラスミドｐＨＥ７０２は、（１）合成ヒトα−グロビン遺伝子をヒトα−グロビンｃＤＮＡに置き換え；（２）合成ヒトβ−グロビン遺伝子をヒトβ−グロビンｃＤＮＡに置き換え；そして（３）大腸菌（E．coli）Ｍｅｔ−ＡＰコード配列を、プラスミドｐＳＹＣ１１７４からではなく大腸菌（E．coli）ゲノムＤＮＡから直接得た以外は、前述のようにｐＨＥ２を作成するのに使用されるのと同様の方法で作成した。ヒトα−グロビンｃＤＮＡコード配列は、ｐＫＴ２１８−αｃ（エール大学のビー・ジー・フォーゲット（B.G．Forget）から供与されたが、希望すれば入手可能である）を鋳型として、２つの合成プライマー５’−ＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣ−３’および５’−ＣＣＧＡＧＧＣＡＣＴＡＧＴＴＴＡＡＣＧＧＴＡＴＴＴＧＧＡＧＧＴＣ−３’（両方ともディーエヌエー・インターナショナル社（DNA International，Inc．）から）（これらは、ヒトα−グロビンｃＤＮＡの５’−および３’−末端配列に相補的であり、それぞれＮｄｅＩ部位およびＳｐｅＩ部位を含む）を用いてＰＣＲにより得られた。ヒトβ−グロビンｃＤＮＡコード配列は、グローベ（Groebe）ら（ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ３：１３４（１９９２））のプロトコールにより作成したｐβを鋳型として、２つの合成プライマー５’−ＣＡＡＡＣＡＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＴＧＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧ−３’および５’−ＡＧＣＡＡＧＡＡＴＧＣＡＴＧＣＴＴＡＧＴＧＡＴＡＣＴＴＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧ−３’（両方ともディーエヌエー・インターナショナル社（DNA International，Inc．）から）（これらは、ヒトβ−グロビンｃＤＮＡの５’−および３’−末端配列に相補的であり、それぞれＮｄｅＩ部位およびＮｓｉＩ部位を含む）を用いてＰＣＲにより得られた。大腸菌（E．coli）Ｍｅｔ−ＡＰ遺伝子のコード配列は、大腸菌（E．coli）ゲノムＤＮＡを鋳型として、２つの合成プライマー５’−ＴＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＣＴＣＡＡＴＣＡ−３’および５’−ＴＧＧＣＴＴＡＡＧＣＴＴＡＴＴＣＧＴＣＧＴＧＣＧＡＧ−３’（両方ともピッツバーグ大学のＤＮＡ合成施設から）（これらは、大腸菌（E．coli）Ｍｅｔ−ＡＰ遺伝子の５’− および３’−末端配列に相補的であり、それぞれＥｃｏＲＩ部位およびＨｉｎｄ III部位を含む）を用いてＰＣＲにより得られた。ｐＨ７０２／ＪＭ１０９と名付けた、宿主細胞大腸菌（E．coli）ＪＭ１０９中のプラスミドｐＨＥ７０２は、１９９５年４月２６日にＡＴＣＣ６９７９３の番号で、メリーランド州ロックビル（Rockville）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ameri can Type Culture Collection）に寄託した。プラスミドｐＨＥ２０２およびｐＨＥ７０２からのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の比較ｐＨＥ７０２を有する大腸菌（E．coli）ＪＭ１０９の増殖条件は、ｐＨＥ２０２について前述したものと同一である。ｐＨＥ７０２から得られるｒＨｂ（α ９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の収率は、前述のｐＨＥ２０２から得られるｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の約５０％である。上記のように、ｐＨＥ７０２はヒト遺伝子から作成したため、他の発現系の使用が有利かもしれない。ｐＨＥ７０２から得たｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の溶出プロフィールは、モノＳ（Mono S）クロマトグラフィー後に２つのピーク（ピーク１およびピーク２と呼ぶ）を与える（結果は示していない）。同様に、ｐＨＥ２０２から得たｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）について前述した他の全ての分析法を、ｐＨＥ７０２から得られたヘモグロビンにも同様に実施した。２つの異なるプラスミドｐＨＥ２０２とｐＨＥ７０２から得た酸素親和性が低いｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の機能上および構造上の性質の両方を比較した。ｐＨＥ２０２から得たｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の詳細な説明は前述されている。ｐＨＥ２０２およびｐＨＥ７０２から得たｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→ Ｔｒｐ）を前述のように酸化して還元し、ｐＨ６．８と７．４で２９℃で０．１Ｍリン酸ナトリウム中でＰ₅₀およびｎ_max値を測定して、ＨｂＡと比較した。下記表２に、ｐＨ６．８と７．４の、ＨｂＡ、ｐＨＥ２０２から得たｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）、およびｐＨＥ７０２から得たｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の酸素結合性を要約する。両方のプラスミドから得たｒＨｂ（α９６Ｖａｌ →Ｔｒｐ）が示す機能性は本質的に同一であることは明らかである。図１１は、詳細には前述のように、ｐＨ７．０で２９℃で実施した０．１Ｍリン酸塩中のＣＯ型のＨｂＡおよびｐＨＥ２０２とｐＨＥ７０２から得たｒＨｂ（ α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す。図１１Ａは、ＣＯ型のＨｂＡおよびｐＨＥ２０２（ピークｂ２）とｐＨＥ７０２（ピーク２）から得たｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の交換可能なプロトン共鳴を示し、図１１Ｂは、環電流シフトプロトン共鳴を示す。両方のセットの¹Ｈ−ＮＭＲ結果は、これら２つのｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の間で¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルに観察可能な差がないことを示している。すなわち、ｐＨＥ２０２とｐＨＥ７０２から得たｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の間に観察可能な構造上または機能上の差がないことが結論される。Ｃ．ＭＤシミュレーションデオキシＨｂＡの結晶構造中の２つのα９６Ｖａｌ残基のＣαの間の距離は、１０．３オングストロームである（ジー・フェルミ（Fermi，G．）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７５：１５９（１９８４）、この開示内容は参考のため本明細書に引用される）。ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）のα９６位に位置するトリプトファン残基の大きさにより、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の安定性が、トリプトファン残基の側鎖角の配向に強く依存するであろうことが予測される。デオキシ型の最初のコンピュータモデルは、回転異性体ライブラリー（ジェイ・ダブリュー・ポンダー（Ponder，J.W.）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３：７７５（１９８７）、この開示内容は参考のため本明細書に引用される）からの１０％を超える発生率を示すトリプトファンの４つの側鎖角の中で、側鎖角χ₁＝６４．８およびχ₂＝−８８．９（２０．７％）を有するトリプトファンのみが、安定なコンホメーションを与えることを示している。他の３つのトリプトファンコンホメーションは、全て相互に向き合い、好ましくない非結合相互作用を与えている。野生型および変異型Ｈｂの間の形質転換は、トリプトファン残基の４つ全ての可能な側鎖角で行われた。デオキシ型の平均模擬構造における２つのα鎖におけるＮε１Ｔｒｐ９６残基の間の距離および各α９６Ｔｒｐ残基の側鎖角を、下記表３に要約する。 χ₁＝６４．８およびχ₂＝−８８．９の最初のトリプトファン側鎖角からの模擬構造のみが、相対的に対称なコンホメーションの両方のα９６Ｔｒｐを示す。このコンホメーションにおける両方のα９６Ｔｒｐ残基の側鎖角は、相対的によく保存されており、２つのα９６Ｔｒｐ残基のＮε１間の距離は、α９６Ｔｒｐ残基が十分に分離されているため、相互に影響しないことを示している。これらの結果は、χ₁＝６４．８およびχ₂＝−８８．９のトリプトファン側鎖角が、天然のコンホメーションに最も近いことを示唆している。すなわち、協同性の自由エネルギーの計算のため、自由エネルギーのシミュレーションの分析を容易にするために、このｒＨｂのデオキシおよびオキシ型の両方の結晶構造のβ９９ＡｓｐのＣβの質量座標の中心を中心とする球上で、χ₁ ＝６４．８およびχ₂＝−８８．９の側鎖角によりＭＤシミュレーションを行った。この球は、計算目的のため１つだけのα９６Ｔｒｐ残基を含む。デオキシ型のＨｂＡおよびｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の平均模擬構造を、ペンシルバニア州ピッツバーグのピッツバーグスーパーコンピューティングセンター（Pittsburgh Supercomputing Center）で開発された分子グラフィクスプログラムのグラフエックス（GRAPHX）により準備した。これらの側鎖角からのデオキシ型の平均模擬構造は、β９９Ａｓｐとα４２Ｔｙｒ間およびβ９９Ａｓｐと α９７Ａｓｎ間に存在する水素結合に加えて、α９６Ｔｒｐとβ９９Ａｓｐ間の新規な界面水素結合を示唆する。さらに、デオキシ型の形質転換した変異体Ｈｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の１００−ps ＭＤシミュレーションは、α₁β₂サブユニット界面のこれらの水素結合が、非常に安定であることを示唆しており、すなわち、２．２５±０．１９オングストロームの平均模擬距離であり、そしてそれぞれα４２Ｔｙｒとβ９９Ａｓｐ間は２．３２±０．２２オングストローム、 α９７Ａｓｎとβ９９Ａｓｐ間は２．２２±０．３４オングストロームである。ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の協同性の自由エネルギーの実験による測定値はないが、ＨｂＡに十分匹敵するｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の相対的に高いヒル係数（ｐＨ７．４でｎ_max＝２．６）は、ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）の協同性の自由エネルギーが、ＨｂＡ（ｐＨ７．４でｎ_max＝３．０）の協同性の自由エネルギーに近いことを示唆している。ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）とＨｂＡの間の協同性の自由エネルギーにおける差の計算値は、下記表４に示されるように、界面当たり−１．５kcal/molであり、これは、ＨｂＡよりわずかに低い協同性を有するＨｂのほぼ期待値である（ジー・ジェイ・ターナー（Tu rner，G.J.）ら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：１４３３３（１９９２）、この開示内容は参考のため本明細書に引用される）。すなわち、ＭＤシミュレーションの結果は、協同性の全自由エネルギーに寄与する特異的な相互作用に関する情報を得るために有利に使用することができる。協同性の全自由エネルギーへの個々のアミノ酸の寄与も表４に示される。多くの個々のアミノ酸は、１．０kcal未満の寄与であり、このことは、α₁β₂界面に導入されるトリプトファンが、大きなコンホメーション変化を引き起こさないことを示している。協同性の全自由エネルギーへの最も大きな寄与は、β９９Ａｓｐとの相互作用（１４．８kcal）に由来し、これは恐らくデオキシ構造における安定化からもたらされる（−１２．２kcal）。これらの結果は、α９６Ｔｒｐと β９９Ａｓｐの間の新規な水素結合が、このｒＨｂのデオキシ構造の安定化を担当しうることを示唆している。本発明のｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）は、本分子の二量体への解離を防止するために、代替血液または治療薬の成分として使用する前に、架橋する必要がある。赤血球中の事実上全てのヘモグロビンは四量体状態にあるが、代替血液のように細胞から遊離して循環するヘモグロビンは、腎臓の糸球体膜の閉塞、さらには注入した四量体ヘモグロビンの循環からの連続排出を引き起こす程度まで、二量体に解離することがある。ヘモグロビンは、解離によるクリアランスを防止するために架橋する必要がある。ヘモグロビンは、α鎖の間を、ジイソチオシアナトベンゼンスルホネートなどにより、ヘモグロビン四量体内を、ピリドキサールや誘導体およびアシルリン酸類などにより、架橋してもよい。アール・エム・ウィンスロウ（Winslow，R.M. ）ら編、「代替血液、有効性の生理学的基礎」(Blood Substitutes Physiologic al Basis of Efficacy) （バークハウザー（Birkhaeuser）、ボストン、マサチューセッツ州）、８２−８４頁（１９９５）を参照のこと（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）。また、アール・エム・ウィンスロウ（Winslow，R .M.）、「ヘモグロビンに基づく代替赤血球」（Hemoglobin-Based Red Cell Sub stitutes）（ジョンズ・ホプキンス大学出版（Johns Hopkins University Press ）、ボルチモア、メリーランド州）；エル・アール・マニング（Manning，L.R．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２７：６６４０（１９８８）；アール・イー・ベネシュ（Benesch，R.E．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５６：９（１９８８）；イー・ブッチ(Bucci，E.)ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６１９１（１９８９）；ティー・エム・エス・チャン（ Chang，T.M.S．）ら編、代替血液に関する第２回国際シンポジウムの抄録（Proc eeding of II International Symposium on Blood Substitutes），Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ａｒｔｉｆ．ＣｅｌｌｓＡｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ（１９８８）；アール・クルーガー（Kluger，R.）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：７５５１（１９９２）；およびエフ・デベヌート（DeVenuto，F.）ら、Ｓｕｒｇ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．１５５：３４２（１９８２）をも参照のこと（これらの開示内容は参考のため本明細書に引用される）。適切に架橋されている、精製された架橋ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）は、次に当該分野で公知の方法により生理学的に許容しうるヘモグロビンに基づく代替血液に組み込むことができる。アール・エム・ウィンスロウ（Winslow，R.M. ）ら編、「代替血液、有効性の生理学的基礎」(Blood Substitutes Physiologic al Basis of Efficacy) （バークハウザー（Birkhaeuser）、ボストン、マサチューセッツ州）（１９９５）を参照のこと（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）。本発明は例示の目的で詳細に記載されているが、このような詳細な説明は、単にその目的のためであり、当業者には本発明の精神と範囲から逸脱することなく本発明の変法を行うことができ、そして本発明は請求の範囲により限定されることは理解されたい。

【手続補正書】【提出日】１９９８年７月２９日【補正内容】請求の範囲１．α鎖の９６位のバリン残基がトリプトファン残基により置換されている、天然に存在しない突然変異ヒトヘモグロビン。２．健常成人ヘモグロビンに比較して低い酸素親和性を有する、請求の範囲第１項記載のヘモグロビン。３．酸素結合における高い協同性をさらに有する、請求の範囲第２項記載のヘモグロビン。４．組換え法で産生される、請求の範囲第３項記載のヘモグロビン。５．ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）。６．人工的突然変異ヘモグロビンを含む非毒性組成物からなる血液代替物又は血液希釈剤。７．健常成人ヘモグロビンに比較して突然変異ヘモグロビンは低い酸素親和性を有する、請求の範囲第６項記載の血液代替物又は血液希釈剤。８．突然変異ヘモグロビンはまた、酸素結合において高い協同性を有する、請求の範囲第７項記載の血液代替物又は血液希釈剤。９．突然変異ヘモグロビンは組換え法で産生される、請求の範囲第８項記載の血液代替物又は血液希釈剤。１０．突然変異ヘモグロビンは、α鎖の９６位でバリン残基の突然変異を含有する、請求の範囲第９項記載の血液代替物又は血液希釈剤。１１．突然変異ヘモグロビンはｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）である、請求の範囲第１０項記載の血液代替物又は血液希釈剤。１２．発現可能なα−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子からなる組換えＤＮＡ発現プラスミドであって、α−グロビン遺伝子は突然変異、および別個のｔａｃプロモーターの支配下でタンデムに配置された大腸菌（E．coli）のＭｅｔ−ＡＰ遺伝子を含有し、該配列は、ヒトα−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子およびＭｅｔ−ＡＰ遺伝子について別々に発現され、かつヘムを導入して、突然変異以外は、未変性のＨｂＡと基本的に同じアミノ酸配列およびヘムコンフォメーションを有する組換えヘモグロビンを形成する、上記プラスミド。１３．請求の範囲第１２項記載のプラスミドであって、α−グロビン遺伝子は、 α鎖の９６位のバリン残基は、発現されたタンパク質中でトリプトファン残基により置換されているように突然変異される、上記プラスミド。１４．人工ヘモグロビンの製造方法であって、請求の範囲第１３項記載の発現プラスミドを、赤血球以外の適切な宿主に導入し、形質転換細胞を増殖させる工程、ＤＮＡを発現させて人工ヘモグロビンを産生させる工程、およびヘモグロビンを回収し精製する工程、からなる上記方法。１５．宿主細胞は大腸菌（E．coli）である、請求の範囲第１４項記載の方法。１６．プラスミドはｐＨＥ２０２である、請求の範囲第１５項記載の方法。１７．プラスミドはｐＨＥ７０２である、請求の範囲第１５項記載の方法。１８．薬剤学的に許容される担体中の天然に存在しない突然変異ヘモグロビンからなる、非毒性薬剤組成物。１９．無細胞環境中のヘモグロビンは、健常成人ヘモグロビンより低い酸素結合性を有する、請求の範囲第１８項記載の組成物。２０．ヘモグロビンはｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）である、請求の範囲第１９項記載の組成物。２１．プラスミドｐＨＥ２０２。２２．プラスミドｐＨＥ７０２。２３．無細胞環境中で、赤血球中の健常成人ヘモグロビンに匹敵する酸素結合性を有する、人工突然変異ヒトヘモグロビン。２４．ヘモグロビンはα鎖の９６位のバリン残基の突然変異を有する、請求の範囲第２３項記載のヘモグロビン。２５．バリン残基はトリプトファン残基で置換されている、請求の範囲第２４項記載のヘモグロビン。２６．組換え法で産生される、請求の範囲第２５項記載のヘモグロビン。２７．ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）である、請求の範囲第２６項記載のヘモグロビン。２８．健常成人ヘモグロビンより低い酸素親和性を有することを特徴とする、分子のα₁β₂サブユニット界面領域中に突然変異を有する、天然に存在しない低酸素親和性突然変異ヘモグロビン。２９．アロステリックエフェクター２、３−ＤＰＧの存在下で健常成人ヘモグロビンに匹敵する酸素結合性を有する、天然に存在しない低酸素親和性突然変異ヘモグロビン。３０．α鎖の９６位のバリン残基はトリプトファン残基で置換されている、請求の範囲第２９項記載の突然変異ヘモグロビン。３１．表１に示す性質を有する、天然に存在しない突然変異ヘモグロビン。３２．プラスミドｐＨＥ２０２で形質転換される細胞から得られたｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）。３３．プラスミドｐＨＥ７０２で形質転換される細胞から得られたｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シェン，トン−ジアンアメリカ合衆国 15213 ペンシルバニア州ピッツバーグ，アトウッドストリート 337，アパートメント２

Claims

【特許請求の範囲】１．α鎖の９６位のバリン残基がトリプトファン残基により置換されている、天然に存在しない突然変異ヒトヘモグロビン。２．健常成人ヘモグロビンに比較して低い酸素親和性を有する、請求の範囲第１項記載のヘモグロビン。３．酸素結合における高い協同性をさらに有する、請求の範囲第２項記載のヘモグロビン。４．組換え法で産生される、請求の範囲第３項記載のヘモグロビン。５．ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）。６．人工的突然変異ヘモグロビンからなる非毒性組成物を投与することからなる、ヒト被験体の治療方法。７．健常成人ヘモグロビンに比較して突然変異ヘモグロビンは低い酸素親和性を有する、請求の範囲第６項記載の方法。８．突然変異ヘモグロビンはまた、酸素結合において高い協同性を有する、請求の範囲第７項記載の方法。９．突然変異ヘモグロビンは組換え法で産生される、請求の範囲第８項記載のヘモグロビン。１０．突然変異ヘモグロビンは、α鎖の９６位でバリン残基の突然変異を含有する、請求の範囲第９項記載の方法。１１．突然変異ヘモグロビンはｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）である、請求の範囲第１０項記載の方法。１２．発現可能なα−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子からなる組換えＤＮＡ発現プラスミドであって、α−グロビン遺伝子は突然変異、および別個のｔａｃプロモーターの支配下でタンデムに配置された大腸菌（E．coli）のＭｅｔ−ＡＰ遺伝子を含有し、該配列は、ヒトα−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子およびＭｅｔ−ＡＰ遺伝子について別々に発現され、かつヘムを導入して、突然変異以外は、未変性のＨｂＡと基本的に同じアミノ酸配列およびヘムコンフォメーションを有する組換えヘモグロビンを形成する、上記プラスミド。１３．請求の範囲第１２項記載のプラスミドであって、α−グロビン遺伝子は、 α鎖の９６位のバリン残基は、発現されたタンパク質中でトリプトファン残基により置換されているように突然変異される、上記プラスミド。１４．人工ヘモグロビンの製造方法であって、請求の範囲第１３項記載の発現プラスミドを、赤血球以外の適切な宿主に導入し、形質転換細胞を増殖させる工程、ＤＮＡを発現させて人工ヘモグロビンを産生させる工程、およびヘモグロビンを回収し精製する工程、からなる上記方法。１５．宿主細胞は大腸菌（E．coli）である、請求の範囲第１４項記載の方法。１６．プラスミドはｐＨＥ２０２である、請求の範囲第１５項記載の方法。１７．プラスミドはｐＨＥ７０２である、請求の範囲第１５項記載の方法。１８．薬剤学的に許容される担体中の天然に存在しない突然変異ヘモグロビンからなる、非毒性薬剤組成物。１９．無細胞環境中のヘモグロビンは、健常成人ヘモグロビンより低い酸素結合性を有する、請求の範囲第１８項記載の組成物。２０．ヘモグロビンはｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）である、請求の範囲第１９項記載の組成物。２１．プラスミドｐＨＥ２０２。２２．プラスミドｐＨＥ７０２。２３．無細胞環境中で、赤血球中の健常成人ヘモグロビンに匹敵する酸素結合性を有する、人工突然変異ヒトヘモグロビン。２４．ヘモグロビンはα鎖の９６位のバリン残基の突然変異を有する、請求の範囲第２３項記載のヘモグロビン。２５．バリン残基はトリプトファン残基で置換されている、請求の範囲第２４項記載のヘモグロビン。２６．組換え法で産生される、請求の範囲第２５項記載のヘモグロビン。２７．ｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）である、請求の範囲第２６項記載のヘモグロビン。２８．健常成人ヘモグロビンより低い酸素親和性を有することを特徴とする、分子のα₁β₂サブユニット界面領域中に突然変異を有する、天然に存在しない低酸素親和性突然変異ヘモグロビン。２９．アロステリックエフェクター２、３−ＤＰＧの存在下で健常成人ヘモグロビンに匹敵する酸素結合性を有する、天然に存在しない低酸素親和性突然変異ヘモグロビン。３０．α鎖の９６位のバリン残基はトリプトファン残基で置換されている、請求の範囲第２９項記載の突然変異ヘモグロビン。３１．表１に示す性質を有する、天然に存在しない突然変異ヘモグロビン。３２．プラスミドｐＨＥ２０２で形質転換される細胞から得られたｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）。３３．プラスミドｐＨＥ７０２で形質転換される細胞から得られたｒＨｂ（α９６Ｖａｌ→Ｔｒｐ）。