JP3170289B2

JP3170289B2 - 低酸素親和性突然変異ヘモグロビン

Info

Publication number: JP3170289B2
Application number: JP53345696A
Authority: JP
Inventors: ホ，チエン; キム，ヒュン−ウォン; シェン，トン−ジアン
Original assignee: Carnegie Mellon University
Current assignee: Carnegie Mellon University
Priority date: 1995-05-01
Filing date: 1996-04-30
Publication date: 2001-05-28
Anticipated expiration: 2016-04-30
Also published as: JPH11506314A; ATE283288T1; EP0826064B1; WO1996034974A1; AU5720596A; US5843888A; CN1159450C; DE69633918D1; CN1183120A; EP0826064A4; EP0826064A1

Description

【発明の詳細な説明】謝辞本発明は、一部は助成金HL−24525号により政府の支
持により開発された。政府は本発明に一定の権利を有す
る。

本発明の分野本発明は、一般的に新規の突然変異ヘモグロビン、さ
らに詳しくは、低い酸素親和性を示すが酸素結合におけ
る高い協同性を示す組換え突然変異ヘモグロビン「rHb
（α96Val→Trp）」に関する。本発明はさらに、組換え
DNA技術を用いる、赤血球代替物として有用な突然変異
ヘモグロビンの製造に関する。

発明の背景ヒト血液製剤の赤血球におけるHIVや肝炎のような感
染性物質の流行が適当な供与者がいないことによる血液
の不足と相まって、赤血球代替物、特にヒトヘモグロビ
ン（「Hb」）およびその誘導体の開発に対する関心を高
めている。ヘモグロビンは血液の酸素運搬成分であり、
赤血球内に存在して血流中を循環している。

健常な成人ヘモグロビン（「HbA」）は、各141アミノ
酸残基を有する２つのα鎖と各146アミノ酸残基を有す
る２つのβ鎖を含有し、またヘムとして知られている補
欠分子族を有する４量体タンパク質である。赤血球は、
ヘモグロビンが還元型、機能型を維持することを助け
る。ヘム−鉄原子は酸化を受けやすいが、赤血球内の２
つのシステム（サイトクロームb5およびグルタチオン還
元系）のうちの１つにより再び還元される。

酸素運搬性赤血球代替物の候補としてのヘモグロビン
の無細胞溶液の使用は、長い間研究されている。例え
ば、エー・ジー・ムルダー（Muldr,A.G.）ら、J.Cell
Comp.Physiol.５:384（1934）を参照されたい（この開
示内容は参照のため本明細書に引用される）。赤血球か
ら精製される非修飾無細胞ヒトヘモグロビンの使用は、
上記の汚染や供給不足の問題以外にいくつかの限界を有
する。例えば、補助因子2,3−ジホスホグルセレート
（「２、３−DPG」）の喪失による酸素親和性の上昇、
および腎臓の濾過により排出され長期の腎臓障害を引き
起こすαβダイマーへのヘモグロビン４量体の解離があ
る。例えば、エィチ・エフ・ブン（Bunn,H.F.）ら、J.E
xp.Med.129:909（1969）を参照されたい（この開示内容
は参照のため本明細書に引用される）。

ヘモグロビンは、アロステリック制御物質である、
２、３−DPGに依存して、その酸素飽和性を変化させ、
こうして体内での酸素輸送の効率を上昇させることがで
きる。２、３−DPGは、結合した酸素をヘモグロビンが
組織に放出することを促進する濃度で赤血球内に存在す
る。２、３−DPGが存在しない場合、ヘモグロビンはよ
り強固に酸素に結合し、結合した酸素を容易に放出しな
い。すなわち、未変性の健常成人ヘモグロビン（「Hb
A」）は被験体に導入されると、血漿中に２、３−DPGが
欠如しているため、酸素を正しく運搬できない。

ヒトグロビンおよびヘモグロビンは、以下のもので発
現されている：トランスジェニックマウス、例えばケー
・チャダ（Chada,K.）ら、Nature（ロンドン）314:377
（1985）およびティー・エム・トウネス（Townes,T.
M.）ら、EMBO J.４:1715（1985）（この開示内容は参
考のため本明細書に引用される）；エム・イー・スワン
ソン（Swanson,M.E.）ら、Bio/Technology 10:557（19
92）（この開示内容は参考のため本明細書に引用され
る）に記載のトランスジェニックブタ；ディー・アール
・グレーベ（Groebe,D.R.）ら、Protein Expression
and Purification ３:134（1992）（この開示内容は
参考のため本明細書に引用される）に記載の混虫細胞培
養物；エム・ワゲンバッハ（Wagenbach,M.）ら、Bio/Te
chnology ９:57（1991）およびジェイ・ジェイ・デリ
アノ（DeLiano,J.J.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9
0:918（1993）（この開示内容は参考のため本明細書に
引用される）に記載の酵母；エス・ジェイ・ホフマン
（Hoffman,S.J.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:852
1（1990）、アール・エー・ヘルナン（Hernan,R.A.）
ら、Biochemistry 31:8619（1992）、およびティー・
ジェイ・シェン（Shen.T.−J.）ら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 90:8108（1993）（この開示内容は参考のため本
明細書に引用される）に記載の大腸菌（Escherichia co
li）（「E.coli」）。多くの点で、大腸菌（E.coli）系
は発現効率が優れており部位特異的突然変異誘発の実施
が容易なため、このような目的には最適の選択である。

ヒトα−グロビンまたはβ−グロビンを融合蛋白とし
て発現する最初の大腸菌（E.coli）系は、ケー・ナガイ
（Nagai,K.）らNature（ロンドン） 309:810（1984）
およびケー・ナガイ（Nagai,K.）ら、Methods Enzymo
l.153:461（1987）（この開示内容は参考のため本明細
書に引用される）により記載されたように開発された
が、この系の生成物処理方法は非常に手間がかかり低収
率である。従って、特に生化学的、生物物理的、および
生物学的研究に組換えヘモグロビン（「rHb」）が多量
に必要な場合は、この発現系は好ましくない。

エス・ジェイ・ホフマン（Hoffman S.J.）ら、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 87:8521（1990）は、α−グロビン
およびβ−グロビン遺伝子が単一のシストロンで構築さ
れ、等量発現される同時発現系を報告した。発現された
α−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子の両方は、大腸
菌（E.coli）内で内因性ヘムとともに正しく４量子Hb分
子に構築される。アール・エー・ヘルナン（Hernan,R.
A.）ら、Biochemistry 31:8619（1992）は、大腸菌
（E.coli）内で非融合の単一β−グロビンの発現を報告
した。これらの２つの系はいくつかの面でうまく作用す
るが、α−グロビンとβ−グロビンの両方のアミノ
（Ｎ）−末端に余分のメチオニン残基が保持されてい
る。

エィチ・エフ・ブン（Bunn,H.F.）ら編、「ヘモグロ
ビン：分子的、遺伝的、および臨床的側面」（Hemoglob
in:Molecular,Genetic and Clinical Aspects）（ダブ
リュー・ビー・サンダーズ社（W.B.Saunders,Co.）、フ
ィラデルフィア、ペンシルバニア州）37〜60頁（1986）
（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）が
報告したHbAの天然のＮ−末端のバリン残基は、酸素親
和性の制御（ボーア（Bohr）効果）やアロステリックエ
フェクターや陰イオンとの相互作用において重要な役割
を果たすことが知られている。ジェイ・エス・カバナウ
（Kavanaugh,J.S.）ら、Biochemistry 31:8640（199
2）（この開示内容は参考のため本明細書に引用され
る）が報告したように、余分のメチオニンはヘモグロビ
ン分子のＮ−末端コンフォメーションを変化させ得る。
従って、ヘモグロビンの酸素添加性はＮ−末端残基の完
全性に依存し、そのため所望の非修飾および突然変異ヘ
モグロビンの酸性のために大腸菌（E.coli）系を有効に
使用する前に、発現されたヘモグロビンのα−グロビン
とβ−グロビンの両方のＮ−末端から余分のメチオニン
残基を除去することが必要となる。

メチオニンアミノペプチダーゼ（「Met−AP」または
「MAP」）は、大腸菌（E.coli）、サルモネラ（Salmone
lla）、（バシラスBacillus）、および酵母において、
新生ペプチド鎖からＮ−末端メチオニン残基の除去に関
与していることが見いだされており、多様な生物からの
Met−APは精製され性状解析されている。例えば、エー
・ベン−バサート（Ben−Bassat,A.）ら、J.Bacteriol.
169:751（1987）、および米国特許第4,865,974号、4,87
0,017号、および013,662号を参照されたい（この開示内
容は参考のため本明細書に引用される）。これらの酵素
は、ペプチドまたはタンパク質のＮ−末端メチオニンに
対する独特の特異性を有し、大腸菌（E.coli）やサルモ
ネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）の
Met−APは、多くの発現された外来タンパク質からＮ−
末端メチオニンを除去することが報告されている。エー
・ベン−バサート（Ben−Bassat,A.）ら、J.Bacteriol.
169:751（1987）。

ヒル（Hill）係数（「ｎ」）で測定されるヘモグロビ
ンの協同的酸素添加は、そのアロステリック性のいくつ
かの便利な尺度である。アール・イー・ディカーソン
（Dickrson,R.E.）ら、「ヘモグロビン：構造、機能、
進化、および病理」（Hemoglobin:Structure,Function,
Evolution,and Pathology）（ベンジャミンカミングス
パブリッシング社（Benjamin Cummings Publishing C
o.）、メンロパーク（Menlo Park）、カリホルニア州）
（1983）（この開示内容は参考のため本明細書に引用さ
れる）を参照されたい。HbAは、通常の実験条件下でO₂
との結合においてn_max値は約３である。α_１β_２（また
はα_２β_１）サブユニット界面においてアミノ酸置換を
有するヒトの異常ヘモグロビンは、HbAに比較して高い
酸素親和性とO₂結合性において協同性の低下を示す。例
えば、アール・イー・ディカーソン（Dickerson,R.E.）
ら、同上（1983）；エィチ・エフ・ブン（Bunn,H.F.）
ら、J.Biol.Chem.249:7402（1974）；およびエム・エフ
・ペルツ（Perutz,M.F.）ら、「タンパク質における協
同性とアロステリック制御の機構」（Mechanisms of Co
operativity and Allosteric Regulation in Protein
s）、ケンブリッジ大学プレス（Cambridge University
Press）（1990）を参照されたい。すなわち、α_１β_２
サブユニット界面はヘモグロビンの機能性に重要である
ことが示唆されている。例えば、β99Aspでアミノ酸置
換を有するヒト突然変異ヘモグロビンは、HbAに比較し
て協同性が大きく低下し酸素親和性が上昇している。こ
のような突然変異ヘモグロビンの例は、ヘモグロビンケ
ンプセイ（Hb Kempsey）（β99Asp→His）（シー・エス
・リード（Reed,C.S.）ら、Blood 31:623（1969））；
ヘモグロビンビンヤキマ（Hb Yakima）（β99Asp］→Hi
s）（アール・ティージョーンズ（Jones,R.T.）ら、J.C
lin.Invest.46:1840（1997））；およびヘモグロビンラ
ドクリフ（Hb Radcliff）（β99Asp→Ala）（ディー・
ジェイ・ウェザーオール（Weatherall,D.J.）ら、Briti
sh J.Heametol.35:177（1977））（（この開示内容は
参考のため本明細書に引用される）がある。ジー・フェ
ルミ（Fermi,G.）ら、J.Mol.Biol.175:159（1984）（こ
の開示内容は参考のため本明細書に引用される）は、デ
オキシ−HbA（酸素分子のないHbA）のＸ線結晶解析を行
い、β99Aspはα_１β_２サブユニット界面でα42Tyrとα
97Asnの両方に水素結合していることを示している。こ
れは、β99Aspの基本的な役割は、サブユニット間水素
結合を形成してデオキシ−ヘモグロビン分子を安定化さ
せることであることを示唆する。

最近、得られた突然変異体における非常に異なる性質
を与えるα42Tyrの突然変異が関与する２つの組換えヘ
モグロビン（「rHb」）が作成されている。ケー・イシ
モリ（Ishimori,K.）ら、J.Biol.Chem.264:14624（198
9）とケー・イマイ（Imai,K.）ら、J.Mol.Biol.218:769
（1991）（この開示内容は参考のため本明細書に引用さ
れる）のrHb（α42Tyr→His）は、酸素の結合（pH6.8で
ｎ＝２）においてある程度の協同性と中程度の酸素親和
性を示す。rHb（α42Tyr→Phe）（ケー・イシモリ（Ish
imori,K.）ら、J.Biol.Chem.264:14624（1989）とケー
・イマイ（Imai,K.）ら、J.Mol.Biol.218:769（199
1））（この開示内容は参考のため本明細書に引用され
る）のrHb（α42Tyr→Phe）は、酸素の結合（ｎ＝1.2）
において協同性を示さず、非常に高い酸素親和性を有す
る。これらの２つの突然変異体の性質の差は、rHb（α4
2Tyr→His）のデオキシ状態ではα42Hisとβ99Aspの間
に弱い水素結合が存在するが、デオキシ−rHb（α42Tyr
→Phe）では存在しないためであるとされている。サブ
ユニット間の水素結合が喪失したβ99Aspまたはα42Tyr
のいずれかでアミノ酸置換を有する異常ヘモグロビンは
また、その機能性を喪失していることが知られており、
従ってこれらの水素結合はヘモグロビン分子の構造と機
能に決定的に重要であるかも知れないことが示唆されて
いる。

ビー・シャーナン（Shaanan,B.）ら、J.Mol.Biol.17
1:31（1983）（この開示内容は参考のため本明細書に引
用される）に報告されるように、そのオキシ型のHbA
（酸素分子を有するHbA）は、α_１β_２サブユニット界
面のα94Aspとβ102Asnの間の特徴的な水素結合を有す
る。ヘモグロビンチツスビル（Hb Titusvill）（α94As
p→Asn）（アール・ジー・シュナイダー（Schneider,R.
G.）ら、Biochim.Biophys.Acta.400:365（1975）、この
開示内容は参考のため本明細書に引用される）のような
β94Asp位に、またはヘモグロビンカンザス（Hb Kansa
s）（β102Asn→Thr）（ジェイ・ボナベンチュラ（Bona
ventura,J.）ら、J.Biol.Chem.243:980（1968）、この
開示内容は参考のため本明細書に引用される）のような
β102Asn位にアミノ酸置換を有するヒトヘモグロビン、
ならびに他のヘモグロビンは、非常に低い酸素親和性を
示す。しかし、ヘモグロビンのオキシ型のα94Aspとβ1
02Asnの間の水素結合を直接破壊するこれらのすべての
ヘモグロビン突然変異体は、酸素の結合の協同性が大幅
に低下しており、さらに結合状態ではダイマーに容易に
解離する。

α94Aspまたはβ102Asnのいずれも関与しない低い酸
素親和性のヒト突然変異ヘモグロビンも存在する。例え
ば、ヘモグロビンプレスビテリアン（Hb Presbyteria
n）（β108Asn→Lys）（ダブリュー・エム・ムー−ペン
（Moo−Penn,W.F.）ら、FEBS Lett.92:53（1978）およ
びジェイ・ケー・オドネル（O'Donnell,J.K.）ら、J.Bi
ol.Chem.269:27692（1994）；ヘモグロビンヨシズカ（H
b Yoshizuka）（β108Asn→Asp）（ジェイ・ケー・オド
ネル（O'Donnell,J.K.）ら、J.Biol.Chem.269:27692（1
994））および組換えヘモグロビンメクオン（Hb Mequo
n）（β41Phe→Tyr）（ブイ・バウディン（Baudin,V.）
ら、Biochim.Biophys.Acta.1159:223（1992）（この開
示内容は参考のため本明細書に引用される）はすべて、
HbAに比較して低い酸素親和性を示すが、これらはすべ
て、ヒル係数で測定する時ｎが1.8〜2.9で変動する可変
の協同性を示す。

未変性のタンパク質と突然変異タンパク質の差の自由
エネルギーを計算するために、分子動力学（「MD」）シ
ミュレーションが使用されている。例えば、エル・エッ
クス・ダング（Dang,L.X.）ら、J.Am.Chem.Soc.111:850
5（1989）、およびジェイ・ガオ（Gao,J.）ら、Science
244:1069（1989）（この開示内容は参考のため本明細
書に引用される））を参照されたい。ジェイ・ガオ（Ga
o,J.）ら、Science 244:1069（1989）に報告されてい
るように、ヘモグロビンラドクリフ（Hb Radcliff）
（β99Asp→Ala）は、測定された熱力学値と計算された
値がよく一致している。エィチ・ダブリュー・キム（Ki
m,H.−W.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11547（19
94）（この開示内容は参考のため本明細書に引用され
る）に報告されているように、MDシミュレーションを用
いて、そのアロステリック性を回復する異常ヘモグロビ
ンで、補償アミノ酸置換がうまく設計されている。

ティー・ジェイ・シェン（Shen,T.−J.）ら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 90:8108（1993）（この開示内容は参
考のため本明細書に引用される）は、合成ヒトα−グロ
ビンおよびβ−グロビン遺伝子が、別別のtacプロモー
ターの制御下で大腸菌（E.coli）メチオニンアミノペプ
チダーゼ遺伝子とともに同時発現されている、大腸菌
（E.coli）発現プラスミド（pHE2）を記載している。こ
のプラスミドで形質転換される大腸菌（E.coli）細胞
は、rHbAを発現し、ここからＮ−末端メチオニンが、同
時発現されたMAPにより有効に切断されている。Ｎ−末
端メチオニンの欠如した得られる組換えHbAは、多くの
構造および機能が未変性のHbAと同一である。

しかし、ヘモグロビンに基づく血液代替物または治療
薬の成分として使用できる突然変異ヘモグロビン種に対
するニーズがある。特に興味のあるのは、低い酸素親和
性を有するが酸素結合において高い協同性を有し、結合
した時異常なサブユニット解離を示さない突然変異ヘモ
グロビンである。さらに、組換え法で産生されるこのよ
うなヘモグロビン、および特に血液代替物として使用す
るために高収率でそのような突然変異ヘモグロビンを産
生するための効率的な発現系に対するニーズがある。

発明の要約従って、本発明の主な目的は、低い酸素親和性を有す
る突然変異ヘモグロビンを提供することである。

本発明の別の目的は、低い酸素親和性を有する天然に
存在しない突然変異ヘモグロビンを提供することであ
る。

本発明の別の目的は、人工的に、好ましくは組換え手
段で産生される、正しいヘムコンフォメーションを有す
る低酸素親和性突然変異ヘモグロビンを提供することで
ある。

本発明のさらに別の目的は、低い酸素親和性を有する
が酸素結合において高い協同性を有する突然変異ヘモグ
ロビンを提供することである。

本発明の別の目的は、無細胞環境で赤血球中の健常成
人ヘモグロビンと同様の酸素結合性を有する突然変異ヘ
モグロビンを提供することである。

本発明のさらに別の目的は、そのような突然変異ヘモ
グロビンを産生するための発現系を提供することであ
る。

本発明のさらに別の目的は、ヘモグロビンに基づく赤
血球代替物または治療薬として使用される人工ヘモグロ
ビンを提供することである。

本発明のこれらおよび他の目的は、以下の実施態様の
１つまたはそれ以上により達成される。

１つの面において、本発明は、α鎖の96位のバリン残
基がトリプトファン残基により置換されている、天然に
存在しない突然変異ヒトヘモグロビンを特徴とする。

好適な実施態様において、ヘモグロビンは健常成人ヘ
モグロビンと比較して低い酸素親和性を有し、かつ酸素
結合の高い協同性を有し、そして組換え法で産生され
る。

別の面において、本発明は、アロステリックエフェク
ター２、３−DPGの存在下で健常成人ヘモグロビンのそ
れに匹敵する酸素結合性を有する、天然に存在しない低
酸素親和性突然変異ヘモグロビンを特徴とする。

好適な実施態様において、突然変異ヘモグロビンでは
α鎖の96位のバリン残基はトリプトファン残基で置換さ
れている。

本発明の他の特徴および利点は、以下の好適な実施態
様の説明および請求の範囲から明らかであろう。

図面の簡単な説明図１はプラスミドpHE202で形質転換した大腸菌（E.co
li）JM109細胞（「pHE202/JM109」）の超音波処理物か
ら得られるrHb（α96Val→Trp）のモノＳカラムからの
クロマトグラフィー溶出プロフィールであり、ピーク
ａ、b₁、およびb₂を示す。画分は546nmで追跡した。

図2A〜2Dは、プラスミドpHE202から得られたピークａ
（図2A）；ピークb₁（図2B）；およびピークb₂（図2C）
からのrHb（α96Val→Trp）；ならびに参照としてHbA
（図2D）の電子噴霧質量スペクトルである。

図3Aと3Bは、29℃でpH7.0の0.1Mリン酸塩水溶液中のC
O型のpHE202/JM109から得られる４％rHb（α96Val→Tr
p）および４％Hb Ａの環電流シフトプロトン共鳴を示
す¹H−NMRスペクトルである。図3Aは、CO型のモノＳカ
ラムから精製された画分（ａ、b₁、b₂）を示す。図3B
は、CO型からFe⁺³状態に変換し、次にCO型に戻した、ピ
ークａ、b₁、b₂から精製されたrHb（α96Val→Trp）を
示す。

図4Aと4Bは、29℃（両方の図）と36℃（図4Bのみ）で
pH7.0の0.1Mリン酸塩水溶液中のデオキシ型のpHE202/JM
109から得られるピークからの４％rHb（α96Val→Tr
p）、および４％HbAの¹H−NMR共鳴を示す。図4Aは、近
位ヒスチジン残基の超微細シフトＮ_δＨ交換可能はプロ
トン共鳴を示す。図4Bは超微細シフトおよび交換可能な
共鳴を示す。図4B中の「デオキシ−rHb」は、デオキシr
Hb（α96Val→Trp）を示す。

図5A〜5Dは、10、21、29および36℃でのpH7.0の0.1M
リン酸塩水溶液中の10mMイノシトール六リン酸（「IH
P」）の存在下での、pHE202/JM109から得られるピーク
からの４％rHbCO（α96Val→Trp）と４％HbCO Ａの300
−MHzプロトン共鳴に及ぼす温度の影響を示す。図5Aと5
Bは、それぞれピークａからの４％rHbCO（α96Val→Tr
p）と４％HbCO Ａの交換可能なプロトン共鳴を示す。
図5Cと5Bは、それぞれピークａからの４％rHbCO（α96V
al→Trp）および４％HbCO Ａの環電流シフトプロトン
共鳴である。

図6A〜6Dは、10、15、21、および29℃でのpH7.0のIHP
水溶液の非存在下でのpHE202/JM109から得られるピーク
からの４％rHbCO（α96Val→Trp）と４％HbCO Ａの300
MHzプロトン共鳴に及ぼす温度の影響を示す。図6Aと6B
は、それぞれピークａからの４％rHbCO（α96Val→Tr
p）と４％HbCO Ａの交換可能なプロトン共鳴を示す。
図6Cと6Dは、それぞれピークａからの４％rHbCO（α96V
al→Trp）と４％HbCO Ａの環電流シフトプロトン共鳴
である。

図7Aと7Bは、29℃でpH6.3〜8.9の0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液中のpHE202/JM109から得られる、0.1mMのHbAま
たはrHb（α96Val→Trp）で得られるpHの関数としてプ
ロットした50％飽和のO₂分圧（P₅₀）（mmHg）を有する
酸素親和性を示す。図7Aは、HbA（○）およびモノＳカ
ラムからのrHb（α96Val→Trp）の精製された画分（ピ
ークａ（■）、b₁（△）ｂ、およびb₂（＋））を示す。
図7Bは、HbA（○）およびCO型からFe⁺³状態に変換され
次にCO型に戻された、モノＳカラムからのrHb（α96Val
→Trp）の精製された画分（ピークａ（■）、b
₁（△）、b₂（＋））を示す。

図8Aと8Bは、29℃でpH範囲6.5〜8.4の0.1Mリン酸ナト
リウム緩衝液中のpHE202/JM109から得られる、0.1mMのH
bAまたはrHb（α96Val→Trp）で得られる酸素解離デー
タ中のpHの関数としてのヒル係数（n_max）を示す。図8A
は、HbA（○）およびモノＳ−精製画分（ピークａ
（■）、b₁（△）、およびb₂（＋））を示す。図8Bは、
HbA（○）、およびCO型からFe⁺³状態に変換され次にCO
型に戻された、モノＳカラムからのrHb（α96Val→Tr
p）の精製された画分（ピークａ（■）、b₁（△）、b₂
（＋））を示す。

図９は、pHE202/JM109から得られるピークからのモノ
Ｓ−精製したrHb（α96Val→Trp）のpH7.4で29℃で0.1M
リン酸緩衝液中の0.1mM Hbおよびアロステリックエフ
ェクター（2mM ２、３−DPGと2mM IHP）の存在下でピ
ークａからのモノＳ−精製rHb（α96Val→Trp）と比較
したHbAを示す。

図10Aと10Bは、それぞれ酸素親和性（P₅₀）の温度依
存性、およびpH7.4で16、20、25、29、および37℃の0.1
Mリン酸緩衝液中の0.1mM HbAまたはrHb（α96Val→Tr
p）で得られるヒル係数（n_max）を示す。使用したHbは;
HbA（○）、rHb（α96Val→Trp）（△）、2mM IHPの存
在下でのrHb（α96Val→Trp）（＋）、および2mM IHP
の存在下でのHbA（□）である。

図11Aと11Bは、pHE202/JM109から得られるピークb2か
らの４％rHbCO（α96Val→Trp）、pHE202/JM109から得
られるピーク２からの４％rHbCO（α96Val→Trp）、お
よびHbA（すべて、pH7.0で29℃の0.1Mリン酸塩水溶液中
のCO型）の、交換可能なプロトン共鳴（図11A）と環電
流シフトプロトン共鳴（図11B）である。両方のrHb（α
96Val→Trp）試料は、NMR測定を行う酸化−還元反応を
受けた。

発明の詳細な説明 I.定義本明細書において「HbA」または「未変性のHbA」と
は、ヒト被験体から得られる健常成人ヘモグロビンを意
味する。

「組換え健常成人ヘモグロビン」、「rHbA」および
「非修飾rHbA」とは、組換えDNA技術により産生され、
かつティー・ジェイ・シェン（Shen,T.−J.）ら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 90:8108（1993）に記載のように未
変性のHbAと基本的に同じ構造と機能を有する健常成人
ヘモグロビンを意味する。

「rHb（α96Val→Trp）」は、組換えDNA技術により産
生され、α_１β_２（またはα_２β_１）界面に位置するα
鎖の96位のバリン残基がトリプトファン残基で置換され
ている、突然変異健常成人ヘモグロビンを意味する。こ
のヘモグロビンは、低い酸素親和性を示すが、酸素結合
において高い協同性を有し、結合した時異常なサブユニ
ット解離を示さない。

「デオキシ」および「オキシ」は、HbAおよびrrHb
（α96Val→Trp）中のヘム−鉄原子の酸素添加状態を意
味する。オキシヘモグロビン「オキシ−Hb」または「Hb
O₂」は、ヘム基に結合した４つの酸素分子を有する。デ
オキシヘモグロビン（「デオキシ−Hb」）は、酸素分子
を含有しない。正常な動脈血では、健常成人のヘモグロ
ビンＡ（「HbA」）はオキシ型（「オキシ−HbA」）であ
る。静脈血では、HbAの一部はデオキシ型である（「デ
オキシ−HbA」）である。

「カーボンモノオシ−Hb」、「HbCO Ａ」、「rHbCO
（α96Val→Trp）」および「CO型」はすべて、酸素原子
ではなく一酸化炭素原子に結合したヘモグロビンを意味
する。

「フェリ−ヘモグロビン」「フェリ−Hb］、「第二鉄
型」、「メトヘモグロビン」、「Met−Hb」、および「F
e⁺³状態」はすべて、その各ヘム−鉄原子が第二鉄（Fe
³⁺）状態に酸化されているHbAおよびrHb（α96Val→Tr
p）を意味する。フェリ−Hbは酸素に結合しない。

「フェロ−ヘモグロビン」、「フェロ−Hb」、「Fe⁺²
状態」、および「第一鉄型」は、その各ヘム−鉄原子が
未変性の還元第一鉄（Fe⁺²）状態であるHbA、rHb（α96
Val→Trp）、HbCO Ａ、およびrHbCO（α96Val→Trp）
を意味する。フェロ−Hbは酸素または一酸化炭素に結合
することができる。

「対照」は、DNA分子の調節領域中の別の遺伝子（特
に、プロモーター）に影響される遺伝子コード配列を意
味し、こうしてコード配列はプロモーターの支配下で発
現され制御される。そのような調節がない場合、コード
配列は、宿主生物中で高すぎまたは低すぎるレベルで、
または正しくない時期に発現される。

「メト−アミペプチダーゼ」、「Met−AP」および「M
AP」は、ペプチド配列からアミノ（Ｎ）末端メチオニン
残基を特異的に切断する酵素メチオニンアミノペプチダ
ーゼを意味する。

「四次構造遷移」は、デオキシ型からオキシ型に進む
α_１β_２のような、ヘモグロビンのサブユニット界面中
の構造転位を意味する。

「酸素親和性」は、ヘモグロビン分子への酸素の結合
の強さを意味する。高酸素親和性は、ヘモグロビンがそ
の結合酸素分子を容易に放出しないことを意味する。P
₅₀は、酸素親和性の尺度である。

「協同性」は、ヘモグロビンのシグモイド酸素結合曲
線を意味し、すなわち四量体ヘモグロビンの分子内の１
つのサブユニットへの酸素の結合は、他の非結合サブユ
ニットへの酸素分子の結合を増強する。こんれはヒル係
数（n_max）で測定することが便利である。HbAでは、n
_max＝3.0である。

ヘモグロビンのＲ−型もしくはＲ−様およびＴ−型も
しくはＴ−様構造は、特徴的な四次構造マーカーを示す
ヘモグロビン（例えば、Ｒ−構造マーカーとしてDSSか
ら10.7ppmでのプロトン共鳴、およびＴ−構造マーカー
としてDSSから14ppmでのプロトン共鳴）を示すヘモグロ
ビンを意味する。いくつかの突然変異および化学的修飾
されるHbは、Ｔ−またはＲ−四次構造マーカーを有する
が、変化した四次構造を有する。

II.方法および結果本発明において、天然に存在しない低い酸素親和性の
突然変異ヒトヘモグロビン、およびそのようなヘモグロ
ビンを組換え法で産生させるための手段が提供される。
さらに詳しくは、本発明は、組換え法で産生されるHbA
の突然変異体（本明細書において、rHb（α96Val→Tr
p）として表す）（ここで、α_１β_２（またはα
_２β_１）サブユニット界面領域に位置するα鎖の96位の
バリン残基はトリプトファン残基により置換されてい
る）に関する。この新しい人工ヘモグロビン（すなわ
ち、完全に血液以外の供給源から得られる）は、低い酸
素親和性を示すが酸素結合において高い協同性を示す。
さらに、これは結合する時、異常なサブユニット解離を
示さない。無細胞環境中で、本発明のrHb（α96Val→Tr
p）は、赤血球中のHbAと同様の酸素結合性を示す。組換
え法で産生されるこのような低い酸素親和性のヘモグロ
ビン突然変異体は、ヘモグロビンに基づく血液代替物の
成分として有用である。このような突然変異体はまた、
腫瘍の放射線治療、外傷、および手術における血液希釈
において有用である。

また、他の適当な突然変異を有する他の低い酸素親和
性のヘモグロビンの調製および使用も、本発明の範囲内
である。特に本発明の方法は、追加の利点を有する他の
突然変異ヘモグロビンを産生するために使用してもよ
い。α_１β_２界面中の他の突然変異およびヘモグロビン
と中央の空洞は、他の有用な低い酸素親和性の突然変異
体を与えると考えられる。血液代替物または治療への使
用についてのこのような突然変異体の適切性を評価する
方法は、本明細書で後述される。

下記の分子動力学シミュレーションは、本発明のrHb
（α96Val→Trp）の独特の酸素結合性は、rHbのデオキ
シ型（α96Val→Trp）中のα_１β_２サブユニット界面の
α96Trpとβ99Aspの間の余分の水素結合に帰因すること
を示唆する。

α_１β_２サブユニット界面中の小アミノ酸残基である
バリンが大きなトリプトファン残基でる置換されるにも
かかわらず、この人工ヘモグロビンは、健常成人ヘモグ
ロビンに比較して、ヘムポケットの周りの非常によく似
た三次構造とα_１β_２サブユニット界面中の非常によく
似た四次構造を示すことが、以下に証明される。ヘモグ
ロビン分子の三次構造は、各鎖がそれ自身の上で折り畳
むようにさせる線状の鎖の配列中で遠く離れているアミ
ノ酸残基の立体関係を意味し、四次構造は、サブユニッ
ト鎖が互いに相互作用する方法を意味する。

以下に証明されるように、本発明の人工ヘモグロビン
は、このヘモグロビンの結合型（例えば、オキシ−（Ｒ
−）型四次構造中のカーボンモノキシ型）は、アロステ
リックエフェクターの添加により結合状態を変化させる
ことなく、デオキシ−（Ｔ−）型四次構造に変換できる
性質を有する。この変換はまた、イノシール六リン酸の
非存在下で温度を低下させることにより行われる。従っ
て本発明の組換えヘモグロビンは、α_１β_２界面中のサ
ブユニット相互作用の本質およびヘモグロビンのアロス
テリック構造の分子的基礎に関して新しい知見を得るの
に使用できる。

明らかに、本発明の方法は、異なる性質を有する他の
突然変異人工ヘモグロビンならびに天然に存在する突然
変異体を補償する突然変異を有するヘモグロビンを産生
するのに使用できる。rHb（α96Val→Trp）を得るため
の好適な材料と方法は、以下の参考例で与えられる。本
発明のrHb（α96Val→Trp）は、好適には組換え法で産
生されるが、非組換え法も利用できることを理解すべき
である。

参考例 A.プラスミドpHE202 発現プラスミドpHE202の作製本発明において、rHb（α96Val→Trp）を発現する２
つのプラスミド（プラスミドpHE202とプラスミドpHE70
2）が作製された。プラスミドpHE202のプロトコールン
と結果は、以下の通りである。

合成ヒトα−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子を含
有するHbA発現プラスミドpHE2を、出発物質として使用
した。プラスミドpHE2の作製および産生されるrHbAの性
質は、ティー・ジェイ・シェン（Shen,T.−J.）ら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 90:8108（1993）（この開示内容
は参考のため本明細書に引用される）に詳細に記載され
る。プラスミドpHE2の作製において、合成α−グロビン
およびβ−グロビン遺伝子は、プラスミドpDL III−13e
（ソマトゲン社（Somatogen,Inc.）、ボールダイ（Boul
der）、コロラド州、から供与された、またエス・ジェ
イ・ホフマン（Hoffman,S.J.）ら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 87:8521（1990）（この開示内容は参考のため本
明細書に引用される）に詳細に記載されている）から得
られた。大腸菌（E.coli）Met−AP遺伝子のコード配列
は、プラスミドpSYC1174（大腸菌（E.coli）MM294中のp
SYC1174は、シータス社（Cetus Corp.）、エメリイビル
（Emeryville）、カリホルニア州からの供与である）か
ら得られ、この株は受託番号ASCC 53245号でアメリカ
ンタイプカルチャーコレクション（American Type Cult
ure Collection）に寄託されており、一般的に入手でき
る。また、米国特許第4,865,974号、4,870,017号、およ
び5,013,662号を参照されたい。プラスミドpHE2は、別
のtcaプロモーターの支配下で大腸菌（E.coli）Met−AP
遺伝子とともに、合成ヒトα−グロビンおよびβ−グロ
ビン遺伝子を同時発現する。

次に部位特異的突然変異誘発を行って、α鎖の96位の
バリン残基を下記のようにトリプトファン残基で置換し
た。合成ヒトα−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子
（プラスミドpDL III−13e）からを、当該分野で公知の
方法により、ファージミドpTZ18U（バイオラッドラボラ
トリーズ（Bio−Rad Laboratories）、ハーキュリーズ
（Hercules）、カリホルニア州）に挿入した。配列５′
−TTTGAAGTTCCATGGATCAAC−３′（突然変異コドンに下
線を引いてある）の合成オリゴヌクレオチドを、ピッツ
バーグ大学のDNA合成施設（DNA Synthesizing Facilit
y）で合成し、プライマーとして使用して標準的DNA合成
法により突然変異（α96Val→Trp）を導入した。オリゴ
ヌクレオチド合成の方法は当該分野で公知であり、本発
明は特定の方法に限定されない。部位特異的突然変異誘
発は、ティー・エム・クンケル（Kunkel,T.M.）ら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 82:488（1985）およびティー・
ジェイ・シェン（Shen,T.−J.）ら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 90:8108（1993）（この開示内容は参考のため本
明細書に引用される）に記載のように行った。次にプラ
スミドpHE2中のヒト正常α−グロビン遺伝子を、突然変
異した遺伝子で置換してプラスミドpHE202を得た。宿主
細胞大腸菌（E.coli）JM109中のプラスミドpHE202はpHE
202/JM109と名付け、ATCC 69792号で1995年４月26日に
アメリカンタイプカルチャーコレクション（American T
ype Culture Collection）（ロックビル（Rockvill
e）、メリーランド州）に寄託した。

細胞の増殖プラスミドpHE202を当該分野で公知の方法により大腸
菌（E.coli）JM109細胞（プロメガ（Promega）、マジソ
ン（Madison）、ウィスコンシン州）に形質転換した。
細胞を、1.2％バクトトリプトン、2.4％バクトイースト
エキス、0.4％グリセロール、17mM KH₂PO₄、72mM K₂H
PO₄、および100μｇアンピシリン（シグマ（Sigma）、
セントルイス、ミズーリ州）を含有するTB培地中で、20
リットルのマイクロファームモデム（Microferm Mode
l）MF20発酵槽（ニューブランズウィックサイエンティ
フィック（New Brnswick Scientific）、エジソン（Edi
son）、ニュージャージー州）中で30℃で、細胞密度が
１〜２×10⁹細胞/mlに達するまで増殖させた。

rHb（α96Val→Trp）の発現は、0.2mMの濃度になるよ
うにイソプロピルβ−チオガラクトピラノシドを加えて
誘導した。次に培養物にヘミン（20mg/）（シグマ（S
igma）、セントルイス、ミズーリ州）とグルコース（10
g/）を補足し、少なくともさらに４時間増殖を続け
た。次に遠心分離して細胞を集め、さらなる精製に必要
になるまで−80℃で100gずつ凍結保存した。

本発明の組換え突然変異ヘモグロビンの発現と産生に
は、現在大腸菌（E.coli）細胞が好適であるが、本発明
は大腸菌（E.coli）細胞に限定されない。他の適当な発
現系（例えば、酵母、混入細胞、およびブタやウシのよ
うなトランスジェニック動物）を使用して突然変異ヘモ
グロビンを発現することも有用である。プラスミドpHE2
02は大腸菌（E.coli）細胞について最適化されている
が、以下に詳述するpHE702はヒト遺伝子から作成され、
従ってプラスミドpHE702中に含有されるヒト遺伝子とと
もに他の発現系が有効に使用できる。

組換えヘモグロビンの単離と精製プラスミドpHE202で形質転換した細胞から得られるrH
b（α96Val→Trp）を、ティー・ジェイ・シェン（Shen,
T.−J.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8108（199
3）の方法を若干修飾して精製した。

凍結保存した細胞ペーストを溶解緩衝液（3ml/gの細
胞ペーストで40mMトリス塩基/1mMベンズアミジン（シグ
マ（Sigma））に入れ、完全に懸濁されるまで攪拌し
た。10mlの40mMトリス−塩酸（pH8.0）に溶解したリゾ
チーム（シグマ（Sigma））（1mg/g細胞ペースト）を細
胞懸濁液に加え、４℃で約45分間放置した（溶液は非常
に粘性が高くなる）。MgCl₂とMnCl₂を最終濃度がそれぞ
れ10mMと1mMになるように添加した。約３〜５μg/mlのD
NAse（アイシーエヌバイオケミカル社（ICN Biochemica
l,Inc.）、コスタメサ（Costa Mesa）、カリホルニア
州）を加え、粘性が低下するまで30〜60分間攪拌した。
次に溶解物をブランソン450ソニファイアー（Branson 4
50 sonifier）（ブランソン（Branson）、ダンベリー
（Danbury）、コネチカット州）で氷浴中で65〜75Wで３
分間のサイクル（溶解物の低温を維持するためにサイク
ルの間で停止した）を３回超音波処理した。次に溶解物
をソーバル（Sorvall）GSAロータ（イー・アイ・デュポ
ン（E.I.duPont）、ウィルミントン（Wilmington）、デ
ラウェア州）で４℃で14,000rpmで45分間遠心分離し
た。次に上清をCOガスで飽和させ、４℃で３〜４日間放
置した。上清のpHを1Mトリス塩基で8.0に調整し、10％
ポリエチレンイミン（シグマ（Sigma））（容量／容
量）をゆっくり加えて、最終濃度を0.5％にして核酸を
沈殿させた。これをCOガス下で15分間攪拌し、次に前記
のように14,000rpmで遠心分離した。上清のpHを1Mトリ
ス塩基で8.3に調整し、容量が約150mlになるまでミリポ
アミニタンアクリリック（Millipore Minitan Acryli
c）限外濾過装置（ミリポア社（Millipore Corp.）、ベ
ッドフォード（Bedford）、マサチューセッツ州）に通
した。濃縮した溶液を20mMトリス−塩酸/0.1mMトリエチ
レンテトラアミン（「TETA」）（pH8.3）（以後「Q2」
緩衝液と呼ぶ）で一晩、緩衝液を交換して透析した。Q2
緩衝液と同じになるように通常20mMトリス−塩酸/0.1mM
TETAを加えて、pHと伝導度を調整した。

最終精製工程でファルマシアファーストプロテイン液
体クロマトグラフィー（Pharmacia fast protein liqui
d chromatography）（「FPLC」）装置（ファルマシアバ
イオテク社「Pharmacia Biotech,Inc.）、ピスカタウェ
イ（Piscataway）、ニュージャージー州）を用いて、２
つのカラムを使用した。最初のカラムはＱ−セファロー
スファーストフローカラム（ファルマシア（Pharmaci
a）陰イオン交換樹脂）（5cm×28cm）であり、これはヘ
モグロビンを結合させるのに使用した。試料をカラムに
のせてから、Q2緩衝液（20mMトリス−塩酸/0.1mM TET
A、pH8.3）で洗浄し、混入している酢酸が溶出するまで
260nmで追跡した。次にヘモグロビン画分を、20mMトリ
ス−塩酸（pH7.2）で溶出させた。溶出液を10mMリン酸
塩/0.1mMエチレンジアミン四酢酸（「EDTA」）（pH6.
8）（緩衝液Ａ）で濃縮した。使用した第２のカラム
は、モノＳカラム（ファルマシア（Pharmacia）陽イオ
ン交換樹脂、HR6/10）である。10mMリン酸ナトリウム/
0.1mMエチレンジアミン四酢酸（「EDTA」）（pH6.8）
（緩衝液Ａ）から20mMリン酸ナトリウム/0.1mM EDTA（p
H8.3）（緩衝液Ｂ）の勾配を流して平衡化した試料をモ
ノＳカラムで精製した。画分を546nmで追跡した。

rHb（α96Val→Trp）を図１に示す２つの主要なピー
ク（対称のピーク（ピークａ）の後に２つの重複するピ
ーク（ピークb₁とb₂））で示されるように溶出した。前
記のように得られたこれらのピークは、図１に示すよう
に以後「ピークａ」、「ピークb₁」、および「ピーク
b₂」と呼ぶ。ヘモグロビン濃度は、イー・アントニーニ
（Antonini,E.）ら、「リガンドとの反応におけるヘモ
グロビンとミオグロビン」（Hemogrobin and Myoglobin
in Their Reactions with Ligands）（ノースホランド
（North Holland）、アムステルダム）、第19頁（197
1）（この開示内容は参考のため本明細書に引用され
る）に記載の公表されている吸光係数を用いて求めた。

ヘモグロビンの型フラスコ中のHBO₂またはデオキシ−Hb溶液にCOガスを
流して、ヘモグロビンのCO型（例えば、HbAとrHb（α96
Val→Trp））を調製した。この操作は、喚起されたドラ
フト内で行った。デオキシ−Hbは、通常ティー・アール
・リンドストローム（Lindstrom,T.R.）ら、Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 69:1707（1972）に詳述されているよう
に、４℃で窒素ガス下でロータリーエバポレーター中
で、HbCOまたはHbO₂を脱酸素型に変換して調製した。オ
キシ−Hbは、デオキシ−Hb溶液を空気または酸素ガスに
暴露して調製した。

タンパク質配列決定アール・エム・ヘウィック（Hewick,R.M.）ら、J.Bio
l.Chem.256:7990（1981）（この開示内容は参考のため
本明細書に引用される）に記載のように、オンラインの
フェニルチオヒダントイン−アミノ酸アナラーザー（モ
デル120A）を取り付けたアプライドバイオシステム（Ap
plied Biosystem）気／液相シーケンサー（モデル470/9
00A）を用いて、エドマン分解の自動サイクルを行っ
た。

質量スペクトル質量スペクトルに付したヘモグロビン試料を、蒸留水
に対して充分透析し、次に凍結乾燥した。解析の直前
に、試料を水に溶解して、125pmolのヘモグロビン／μ
ｌ水（7.8mg/ml）の濃度にした。次にこれらの溶液のア
リコートを希釈して、最終濃度を10pmol/μｌの50:50水
/0.2％ギ酸含有アセトニトリルとした。これらの最終溶
液のアリコート（10μｌ）を、５μl/分で電子噴霧イオ
ン源に導入した。

電子噴霧分析は、ブイジー・クアトロ−ビーキュー
（VG Quattro−BQ）（フィソンズインスツルメンツ（Fi
sons Instruments）、ブイジーバイオテク（VG Biotec
h）アルトリンチャム（Altrincham）、英国）（単一の
荷電イオンの質量範囲が4000の三重４極子装置）で行っ
た。スキャンは、１スキャン当たり10秒間でm/z980〜14
00で行った。20スキャンから得られたデータを、まとめ
て最終スペクトルを得た。質量スケール較正では、外部
参照としてHbAのα鎖（分子量＝15,126.4）からの複数
の荷電したイオンピークを使用した。正常のα鎖および
正常のβ鎖のアミノ酸配列から計算した分子量は、それ
ぞれ15,126.4と15,967.2である。これらの値は、以下の
原子質量に基づく:C＝12,011;H＝1,00794;N＝14,00674;
O＝15,9994;およびＳ＝32,066（これらは、原子質量と
同位体存在に関する委員会（Commission on Atomic Wei
ghts and Isotopic Abundances）、Pure Appl.Chem.6
3:975（1991）により報告されている；この開示内容は
参考のため本明細書に引用される）。得られた電子噴霧
質量スペクトルは、図2A〜2Dに示す。

ヘム−鉄原子の酸化状態の変換ヘモグロビンを酸化（この場合、HbAとrHb（α96Val
→Trp）のCO型をFe³⁺状態に）するために、0.1Mリン酸
塩（pH6.5）中のヘモグロビン溶液の濃度を測定した。
３モル過剰のK₃Fe（CN）_６（フィッシャーサイエンティ
フック（Fisher Scientific））まなは他の適切な酸化
剤を加え、室温で１時間攪拌した。この間、ヘモグロビ
ン溶液は赤色から褐色に変化した。得られた酸化された
ヘモグロビン（Fe³⁺）を、0.1Mリン酸塩（pH6.5）を用
いてセファデックスＧ−25（中間）カラム（シグマ（Si
gma））に通して、過剰のK₃Fe（CN）_６を除去し、室温
で一晩放置した。

次に酸化されたヘモグロビン（Fe³⁺）を、まず試験管
中で0.1Mリン酸塩（pH約7.0）を調製して、緩衝液に窒
素を泡立たせて酸素を除去して溶存酸素を除去する。別
の試験管に、充分量の亜ジチオン酸ナトリウム（フルカ
ケミー（Fluka Chemie）、スイス）を計りとって亜ジチ
オン酸塩の0.1M溶液を得る。次に試験管に窒素をフラッ
シュして酸素を除去する。次にデオキシリン酸験緩衝液
を嫌気的にデオキシ亜ジオチン酸塩に移して0.1Mの最終
濃度を得る。酸化されたヘモグロビン溶液の上（泡立た
せない）にCO流を吹き付ける。色が明るい赤色に戻るま
で、酸化されたヘモグロビン溶液にデオキシ亜ジチオン
酸塩緩衝液を加えた。この時点で、すべてのヘモグロビ
ン（Fe³⁺）がヘモグロビン（Fe²⁺）に還元されているこ
とを確認するために、光学スペクトルをチェックするこ
とができる。ヘモグロビンの還元に使用したものと同じ
COガスを吹き付けた緩衝液で、セファロースＧ−25カラ
ムを平衡化させた。次に還元したヘモグロビン溶液を、
同じCOガスを吹き付けた緩衝液を用いてセファロースＧ
−25カラムに通過させた。得られた酸化／還元されたヘ
モグロビンを次に、好ましくは前述のFPLCモノＳカラム
に通して精製した。得られた酸化された、還元された、
モノＳ精製されたrHb（α96Val→Trp）またはHbAを、前
述のように必要に応じてカーボンモノキシまたはオキシ
型に変換した。

フェロ−ヘモグロビン（Fe²⁺）からフェリ−ヘモグロ
ビン（Fe³⁺）への酸化のために他の適切な酸化剤を使用
してもよい（例えば、フェリシアン化物、銅、過酸化水
素、ヒドロキシルアミン、亜硝酸塩、ヒドラジン、チオ
ール、アリールアミン、または電気化学電位（「Em」）
が0.14ボルトより大きい任意の化合物）。フェリ−ヘモ
グロビン（Fe³⁺）からフェロ−ヘモグロビン（Fe²⁺）へ
の還元のために使用できる他の適切な還元剤は、（ｉ）
非酵素的還元のためには、亜ジチオン酸塩、メタ重亜硫
酸塩、システイン、還元型グルタチオン、およびアスコ
ルビン酸（メチレンブルーの存在下で）、および（ii）
酵素還元のためには、サイトクロームb₅還元酵素、NADP
H−フラビン還元酵素、およびEmが0.14ボルト未満の任
意の他の化合物が使用できる。エィチ・エフ・ブン（Bu
nn,H.F.）ら編、「ヘモグロビン：分子的、遺伝的、お
よび臨床的側面」（Hemoglobin:Molecular,Genetic and
Clinical Aspects）（ダブリュー・ビー・サンダーズ
社（W.B.Saunders,Co.）、フィラデルフィア、ペンシル
バリア州）634〜622頁（1986）（この開示内容は参考の
ため本明細書に引用される）を参照されたい。

NMR測定 ¹H−NMRスペクトル法は、ヘムポケットを含む三次構
造、およびサブユニット界面である四次構造のようなHb
Aの構造的特徴を研究するための優れた手段であること
が証明されている。シー・ホー（Ho.C.）ら、Adv.Prote
in Chem.43:153（1992）（この開示内容は参考のため
本明細書に引用される）を参照されたい。ヘモグロビン
の環電流シフト¹H共鳴は、CO型のrHbAのヘム配向と環境
に影響を受けることが知られている（シー・ホー（Ho.
C.）ら、Adanc.Protein Chem.43:153（1992）、および
ティー・ジェイ・シェン（Shen,T.−J.）ら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA 90:8108（1993）、これらの開示内容
は参考のため本明細書に引用される）。

¹H−NMRスペクトルは、ブルカー（Bruker）AM−300分
光光度計を300MHzで10℃〜36℃で操作して得られた。す
べてのヘモグロビン試料は、pH7.0の0.1リン酸ナトリウ
ム緩衝液（100％の最中）に入れた。ヘモグロビン濃度
範囲は約４％であった。水のシグナルは、ピー・プラト
ー（Plateau,P.）ら、J.Am.Chem.Soc.104:7310（1982）
（これらの開示内容は参考のため本明細書に引用され
る）に報告されているように、「ジャンプ−アンド−リ
ターン」パルスシーケンスを用いて抑制した。特定のカ
ーボンモノキシ−Hb（「HbCO」）とデオキシ−Hb試料の
¹H−NMRスペクトルは、9.7μ秒の90゜パルス、スペクト
ル幅8kHz（デオキシ−Hbについては16kHz）を有する５
−mm複数核プローブ（ブルカー（Bruker））のプロトン
デカプリングコイルと8000のデータ点を用いて得られ
た。典型的には、256または1024スキャンを平均してシ
グナル対ノイズ比を改良した。プロトン化学シフトは、
2,2−ジメチル−２−シラペンタン−５スルホネート
（「DSS」）のナトリウム塩のメチルプロトン共鳴を参
照とし、29℃でDSSのシグナルのダウンフィールドの4.7
6ppmにシグナルが存在する水のシグナルを内部標準とし
た。得られた¹H−NMRスペクトルは、図３〜６と図11に
示す。

HbA試料の酸素結合酸素解離曲線は、ヘモックス−アナライザー（Hemox
−Analyzer）（ティーシーエスメディカルプロダクツ
（TCS Medical Products）、ハンチントンバレイ（Hunt
ington Valley）、ペンシルバニア州）により、pH6.0〜
8.3の範囲の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液中で16〜37℃
で測定した。エー・ハヤシ（Hayashi,A.）ら、Biochim.
Biophys.Acta.310:309（1973）（この開示内容は参考の
ため本明細書に引用される）に記載のメトロヘモグロビ
ン還元酵素系を、フェリ−Hbの生成を防ぐために加えた
（30〜60μｌ）。50％酸素添加時の分圧（P₅₀）とヒル
係数（n_max）を、各曲線から求めた。これらの試験の結
果を図７〜10に示す。

MDシミュレーション MDシミュレーションは、シー・エル・ブルークス（Br
ooks,C.L.）ら、J.Mol.Biol.208:159（1989）（この開
示内容は参考のため本明細書に引用される）の確率的境
界法を使用して、極性水素タンパク質モデルについて標
準的パラメータ（param19）を有するCHARMM22（ビー・
アール・ブルークス（Brooks,B.R.）ら、J.Comp.Chem.
４:187（1983）（この開示内容は参考のため本明細書に
引用される））を使用して、行った。

異なるヘモグロビンコンフォメーションの安定性の比
較のために、半径10オングストロームと15オングストロ
ームを有するそれぞれMD領域とランゲビン（Langevin）
領域に、分子を分離した（これらはその中心が、ジー・
フェルミ（Fermi,G.）ら、J.Mol.Biol.175:159（1984）
（この開示内容は参考のため本明細書に引用される）の
示したデオキシ−HbAの結晶構造の参照座標上にあ
る）。これらの座標は、２つのα96Val側のＣβのほぼ
中間にある。シミュレーションの自由エネルギーの計算
のために、半径10オングストロームと15オングストロー
ムを使用するそれぞれMD領域とランゲビン（Langevin）
領域に、分子を分離した（これらはその中心が、ヘモグ
ロビンのデオキシ（ジー・フェルミ（Fermi,G）ら、J.M
ol.Biol.175:159（1984））とオキシ結晶構造（ビー・
シャンナン（Shannan,B.）、J.Mol.Biol.171:31（198
3）（この開示内容は参考のため本明細書に引用され
る）のβ99Asp側鎖のＣβの質量の中心座標にある）。
内部の球を、ダブリュー・エル・ジョルゲンセン（Jorg
ensen,W.L.）ら、J.Chem.Phys.79:926（1983）（この開
示内容は参考のため本明細書に引用される）に記載のよ
うに、charmm−適合プレ平衡化TIP3P水分子で充填し
た。デオキシシミュレーションは、103の水分子を含有
し、オキシシミュレーションは83の水分子を含有した。

Hb（α96Val→Trp）の利用可能な結晶構造がないた
め、初期のコンフォメーションのためにα96Trpのいく
つかの異なる局所的コンフォメーションを考慮した。10
％を超える頻度［χ_１＝−70.4、χ_２＝−100.5（37.9
％）；χ_１＝64.8、χ_２＝−88.9（20.7％）；χ_１＝−
177.3、χ_２＝−95.1（13.8％）；χ_１＝−179.5、χ_２
＝−87.5（10.3％）］を示す、回転異性体ライブラリー
（ジェイ・ダブリュー・ポンダー（Ponder,J.W.）ら、
J.Mol.Biol.193:775（1987）（この開示内容は参考のた
め本明細書に引用される））からのトリプトファンの４
つの可能な側鎖角を、MDシミュレーションの初期配向と
して使用した。同じ数のタンパク質原子と水分子を各コ
ンフォメーションで使用した。

野生型と突然変異タンパク質の間の形質転換は、ハイ
ブリッドポテンシャル関数Ｖ_λ＝（１−λ）V_A＋λV
_B（ジェイ・ガオ（Gao,J.）ら、Science 244:1069（19
89）およびビー・チドー（Tidor,B.）ら、Biochemistry
30:3217（1991）、これらの開示内容は参考のため本
明細書に引用される）（ここでλは、０と１の間のカプ
リング因子である）を使用して行われる。V_AとV_Bは、そ
れぞれHbAと突然変異ヘモグロビンのカプリング因子で
ある。シミュレーションは９つのλ_ｉ（λ＝0.1、0.
2、.....0.9）で行い、5psの平衡化の後に5psの製造動
力学を用いて、但しλ＝0.1とλ＝0.9では10psの平衡化
を用いて、行った。非結合相互作用は8.5Åでゼロまで
端を切り取り、一定の誘電率（ε＝１）を使用した。水
素原子が関与するすべての結合は、ジェイ・ピー・ライ
ケート（Ryckaert,J.−P.）ら、J.Comput.Phys.23:327
（1977）、この開示内容は参考のため本明細書に引用さ
れる）のシェーク（SHAKE）アルゴリズムにより束縛し
た。10psのシミュレーションは、1fsの組み込み時間で
サンスパーク（SunSparc）ワークステーション10で約２
時間かかる。

シミュレーションの自由エネルギーは、ジェイ・ジー
・カークウッド（Kirkwood,J.G）、J.Chem.Phys.３:33
（1935）（この開示内容は参考のため本明細書に引用さ
れる）の記載した熱力学的組み込み法を使用して、ヘモ
グロビンのデオキシ型とオキシ型の両方についてMDシミ
ュレーションの軌跡ファイルから、式：（式中、ΔＶ＝V_B−V_Aであり、熱力学的平均＜ΔＶ＞_λ
はハイブリッド系にわたるＶ_λの平均を示す）を用いて
得ることができる。熱力学的式の線形型は、シミュレー
ションの総自由エネルギーは各付加的寄与に分解しでき
ることを示す。突然変異に帰因する協同性の自由エネル
ギーの変化は、すでにジェイ・ガオ（Gao,J.）ら、Scie
nce 244:1069（1989）により示されたように、熱力学
的サイクルから間接的に得られる。

構造解析を行うために、野生型（λ＝０）と突然変異系
（λ＝１）の平均構造は、シー・エル・ブルークス（Br
ooks,C.L.）ら、P.Phys.Chem.90:6680（1986）（この開
示内容は参考のため本明細書に引用される）の指数式（式中、Ｘはデカルト座標を示し、X₀とX₁はシミュレー
ション平均野生型と突然変異座標を示し、それぞれβ＝
1/k_BT、および＜＞_λはポテンシャルＶ_λ下の合計平均
である）を用いてシミュレーション（それぞれ、λ＝0.
1およびλ＝0.9）された最近も最も近い状態から計算し
た。

B.結果 rHb（α96Val→Trp）の生化学的性質前述のように、プラスミドpHE202を有する大腸菌（E.
coli）JM109の超音波処理した細胞から発現されたrHb
（α96Val→Trp）のモノＳクロマトグラフィーにより、
図１に示すようにモノＳカラムクロマトグラフィー上で
２つの主要なピーク（ピークａとｂ）が得られた。対照
的なピーク（ピークａ）がまず出てきて、次に２つの重
複するピーク（ピークb₁とb₂）が出てくる。モノＳクロ
マトグラフィーによりこうして得られたピークは、以後
「ピークａ」、「ピークb₁」、「ピークb₂」と呼ぶ。CO
型のこれらのピークのすべては、HbAに等しい350〜700n
mの範囲で可視の光学的スペクトルを示す（結果は示し
ていない）。

前述のように行った電子噴霧質量スペクトルは、図２
に示すように、すべての３つのピークのアミノ末端メチ
オニン残基は、同時発現されるMet−APにより有効に切
断されていることを示す。ピークａについては、α鎖の
少なくとも98％は質量15,213（これは、トリプトファン
残基によるバリン残基の置換についての計算値である）
を有し、および約90％までのβ鎖は質量15,867（これ
は、HbAのβ鎖の計算された質量である）を有する。そ
の質量（15,998）が正常のβ鎖＋メチオニン残基の質量
に対応する小なさ成分（＜10％）がある。しかし、ピー
クb₁とピークb₂については、α鎖とβ鎖の両方とも検出
されない（＜２％）Ｎ−末端メチオニンとともに正しい
質量を有する。

rHb（α96Val→Trp）の¹H−NMR試験 i.CO型から第二鉄型への変換、次にヘモグロビンのCO型
へ戻る変換 pHE202/JM109由来の各CO型とHbCO ＡのモノＳ精製し
たrHbs（α96Val→Trp）の３つのすべてのピーク（ａ、
b₁、およびb₂）の環電流シフト¹H共鳴の比較を、図3Aに
示す。スペクトルは、前述のようにその各CO型に変換さ
れた、29℃でpH7.0の0.1Mリン酸塩水溶性中の４％rHbs
（α96Val→Trp）と４％HbAを用いて得られた。図3Bの
スペクトルを得るために、すべてのヘモグロビンはその
CO型からFe³⁺状態に変換し、CO型に戻した。DSSから０
〜2.0の¹H共鳴は、ヘモグロビン分子とポルフィリンの
ヘムポケットの近傍に位置するアミノ酸残基のいくつか
のプロトンに由来する（シー・ホー（Ho,C.）ら、Advan
c.Protein Chem.43:153（1992）（この開示内容は参考
のため本明細書に引用される））。図3Aから有らかなよ
うに、ピークａ、b₁、およびb₂からのrHbCO（α96Val→
Trp）の環電流シフト¹H共鳴はすべて、HbCO Ａのそれ
とは少し異なる。またHbCO Ａには見られない追加の共
鳴ならびにDSSから０〜−1.1ppmの領域上にいくつかの
共鳴の強度の変化がある。しかし、ピークａからのHbCO
Ａのα鎖とβ鎖のE11Val（遠位Val）のγ_２−メチル
基に割り当てられている−1.7〜−1.8ppmの共鳴（ティ
ー・アール・リンドストローム（Lindstrom,T.R.）ら、
Biochemistry 11:1677（1972）およびシー・ダルビッ
ト（Dalvit,C.）ら、Biochemistry 24:3398（1985）、
これらの開示内容は参考のため本明細書に引用される）
は、HbAのそれと基本的に同じであるが、ピークb₁とピ
ークb₂からの共鳴ははるかに大きい。

大腸菌（E.coli）中へのヘモグロビン発現プラスミド
pHE2を使用する、発現されたグロビンへのヘムの正しい
挿入の現象は、ティー・ジェイ・シェン（Shen,T.−
J.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8108（1993）で
考察されている。かれらは、酸化および還元工程による
rHbの精製成分の１つのヘムポケットの未変性のHbAのそ
れへの変換を記載した。同様にrHb（α96Val→Trp）の
異常¹H共鳴をヘモグロビンの未変形型のそれへ変換する
可能性を本発明において検討した。すべての３つのピー
クからのrHb（α96Val→Trp）を、まずその各第二鉄状
態に酸化し、次に前述のように各CO型またはオキシ型に
還元して示した。図3Bに示すように、酸化と還元工程後
のすべての３つのピークからこのような「変換されたヘ
モグロビン」は、変換前のピークａからのrHb（α96Val
→Trp）のそれと同様である、同一のNMRスペクトル（各
遠位バリンの環境は同じである）を示す（図３）。これ
は、rHb（α96Val→Trp）のピークａは、正しいヘムコ
ンフォメーションとサブユニット界面を有することを示
唆する。従って特に明記しない場合は、ピークａからの
rHb（α96Val→Trp）は、本明細書に記載のすべてのさ
らなる研究に使用された。

ii.ヘム環境とサブユニット界面前述のように図4Aと4Bの¹H−NMRスペクトルは、ピー
クａからのpHE202/JM109から、pH7.0の0.1Mリン酸塩水
溶液中の４％モノＳ精製したrHb（α96Val→Trp）およ
び４％HbA（いずれもデオキシ型）について得られた。
図に記載のように、図4Aスペクトルは、29℃で得られ、
図4Bのスペクトルは29℃と36℃で得られた。近位ヒスチ
ジン残基の超微細シフトＮ_δＨ変換可能なプロトン共鳴
を、図4Aに示す。図4Aについて、５〜63ppmの共鳴は、
デオキシ−HbAのβ鎖の近位His残基（α87His）の超微
細シフトＮ_δＨ交換可能なプオトンに割り当てられ、〜
77ppmの共鳴は、デオキシ−HbAのβ鎖（β92His）の対
応する残基に割り当てられた（エス・タカハシ（Takaha
shi,S）ら、Biochemistry 19:5196（1980）、およびジ
ー・エヌ・ラ・マール（La Mar,G.N.）ら、Biochem.Bio
phys.Res.Commun.96:1172（1980）、これらの開示内容
は参考のため本明細書に引用される）。rHb（α96Val→
Trp）のピークａ中のこれらの２つの近位ヒスチジン共
鳴の化学シフト位置は、図4Aで見られるHbAのそれと同
じである。これは、rHb（α96Val→Trp）の近位のヒス
チジンのまわりに摂動がないことを示す。

デオキシ型のピークａのrHb（α96Val→Trp）とHbAの
第一鉄超微細シフトおよび交換可能なプロトン共鳴を、
図4Bに示す。超微細シフト共鳴は、ヘム−鉄原子中のプ
ロトンとFe（II）の対になっていない電子の間の超微細
相互作用により、ヘム基とその近くのアミノ酸残基のプ
ロトンに由来する。29℃のピークａからのrHb（α96Val
→Trp）の超微細シフト共鳴は、DSSから〜22.5と〜18.7
ppmの共鳴（デオキシ−HbAのβ鎖に関連するプロトンに
割り当てられている）（タカハシ（Takahashi）ら、198
0）およびDSSから〜17ppmの共鳴（デオキシ−HbAのα鎖
に関連するプロトンに割り当てられている）（タカハシ
（Takahashi）ら、1980）の周りのいくつかの化学シフ
ト変化を、29℃でのHbAのそれと比較して示す。DSSから
11〜14ppmのスペクトル領域上の交換可能な¹H共鳴は、H
bAのデオキシ−四次構造の優れたマーカーであることが
知られている（シー・ホー（Ho,C.）ら、Advanc.Protei
n Chem.43:153（1992））。〜14ppmの共鳴は、α42Tyr
とβ99Aspの間のサブユニット間水素結合（デオキシ−
四次（Ｔ）構造の特徴）に割り当てられている（エル・
ダブリュー・エム・フング（Fung,L.W.−Ｍ）ら、Bioch
emistry 14:2526（1975）、この開示内容は参考のため
本明細書に引用される）。図4Bに見られるように、デオ
キシ型のピークａからのHbAとrHb（α96Val→Trp）の間
のDSSから〜14ppmの共鳴には顕著な差がなく、これは、
デオキシ型のこのα_１β_２サブユニット間の水素結合
は、突然変異により影響を受けないことを示している。

rHb（α96Val→Trp）では、図4Bに見られるように29
℃でDSSから〜12.6ppmに新しい共鳴が現れ、これはデオ
キシ−HbAには存在しない。しかし、高温（36℃）で¹H
−NMRスペクトルをとった時、DSSから〜12.6ppmでの共
鳴はシフトした。温度感受性の化学シフト位置は、この
新しい共鳴は、交換可能な共鳴であるより超微細シフト
共鳴である可能性を示している（ジェイ・ピー・ジェッ
ソン（Jesson,J.P.）ら、J.Chem.Phys.47:579（196
7）；アール・ジェイ・カーランド（Kurland,R.J.）
ら、J.Magn.Reson.２:286（197）；エム・イー・ジョン
ソン（Johnson,M.E.）ら、J.Am.Chem.Soc.99:1245（197
7）、これらの開示内容は参考のため本明細書に引用さ
れる）。

以上の結果は、MDシミュレーションが野生型（HbA）
から突然変異ヘモグロビン（α96Val→Trp）への形質転
換にうまく応用できることを示している。

iii.結合状態を変化させない四次構造のスイッチングイノシトール六リン酸（「IHP」）（シグマ（Sigm
a））の存在下でのCO型のrHb（α96Val→Trp）の交換可
能なプロトン共鳴は、HbAのそれに比較してある非常に
興味深く独特の特徴を示す。pH7.0で0.1Mリン酸水溶液
中の10mM IHPの存在下で300MHzで、pHE202/JM109ピー
クから得られる４％rHbCO（α96Val→Trp）および４％H
bCO Ａの¹H−NMRスペクトルが得られた。10、21、20、
および36℃でスペクトルが得られた。図5Aと5Bは、それ
ぞれrHbCO（α96Val→Trp）とHbCO Ａの交換可能なプ
ロトン共鳴を示す。図5Cと5Dは、それぞれrHbCO（α96V
al→Trp）とHbCO Ａの環電流シフト共鳴を示す。

オキシ−四次（Ｒ）構造（α94Aspとβ102Asnの間の
サブユニット間水素結合）（エル・ダブリュー・エム・
フング（Fung,L.W.−M.）ら、Biochemistry 14:2526
（1975）；ビー・シャーナン（Shaanan,B.）、J.Mol.Bi
ol.171:31（1983）、これらの開示内容は参考のため本
明細書に引用される）の特徴であるDSSから〜10.7ppmの
共鳴は、IHPの存在下では、29℃でのrHbCO（α96Val→T
rp）の¹H−スペクトルにおいて消失している（図5A）。
その代わりに図5Aは、HbCO Ａ（図5B）に比較すると、
デオキシ−四次（Ｔ）細胞（α42Tyrとβ99Aspの間のサ
ブユニット間水素結合）（フング（Fung）ら、1975;ジ
ー・フェルミ（Fermi,G.）ら、J.Mol.Biol.175:159（19
84）、この開示内容は参考のため本明細書に引用され
る）の特徴であるDSSから〜14ppmの共鳴が出現している
ことを示す。

図５に関して後述されるように、強力なアロステリッ
クエフェクターであるIHPの存在は、rHb（α96Val→Tr
p）のデオキシ型を安定化して、従って平衡をデオキシ
型にシフトさせ得るようである。α_１β_２とα_２β_１サ
ブユニット界面における新規な水素結合の存在は、さら
に安定性を付与して、特に低い温度で、IHPの存在下で
非常に容易に四次構造遷移をデオキシ−四次構造に向け
ることができる。

図5Aにおいて、rHb（α96Val→Trp）のスペクトルのD
SSから〜14ppmの共鳴の強度は、温度が29から10℃に低
下するにつれて、徐々に増大する。36℃で、DSSから〜1
4ppmの共鳴は消失し、そしてオキシ−四次（Ｒ）構造の
特徴であるDSSから〜10.7ppmの共鳴は、肩（shoulder）
として再出現する。10℃の〜14ppmの共鳴の相対強度
は、rHb（α96Val→Trp）のデオキシ型における交換可
能な共鳴のそれと同等である。DSSから〜14ppmのこの共
鳴の化学シフト位値は、温度により変化せず、このこと
は、この共鳴の由来が、超微細シフトするのではなく交
換可能であることを示唆している。DSSから〜14ppmの共
鳴出現は、〜11から〜24ppmの超微細シフト共鳴の出現
に伴うものではなく、このことは、ヘム鉄がなお低スピ
ンの反磁性状態（すなわち、リガンド結合型）にあるこ
とを示している。デオキシ−（Ｔ−）およびオキシ−
（Ｒ−）四次構造の特徴である共鳴の温度による強度の
変化は、可逆的である。

図5Bは、図5AにおいてrHbCO（α96Val→Trp）につい
て観察されるのとは対照的に、温度の関数としての10mM
IHPのHbCO Ａの交換可能なプロトン共鳴にほとんど
変動がないことを示している。10℃においてさえ、HbCO
Ａについては〜14ppmに非常に小さなシグナルが見ら
れるのみであり、rHbCO（α96Val→Trp）のそれと強度
を比較して非常に異なっている。21℃や29℃のような中
観の温度では、IHPの存在下のrHbCO（α96Val→Trp）の
交換可能なプロトン共鳴は、オキシ−四次構造の特徴で
ある〜10.7ppmの共鳴は基本的に消失するが、デオキシ
−四次構造の特徴である〜14ppmの共鳴は非常に弱い強
度を示すことを、示している。これらの結果は、〜10.7
ppmの共鳴により明示されるようにα94Aspとβ102Asnの
間の水素結合を失っているが、〜14ppmの共鳴により明
示されるようにα42Aspとβ99Aspの間の水素結合が未だ
形成されていない、中間の四次構造が存在するかもしれ
ないことを示唆している。本発明のこのrHbCO（α96Val
→Trp）は、強力なアロステリックエフェクターであるI
HPの添加のみにより、および／または温度の低下によ
り、結合状態を変化させることなくデオキシ−様四次構
造に緩やかに変換することができる。

10mM IHPの存在下のCO型のrHb（α96Val→Trp）およ
びHbAの環電流シフトプロトン共鳴はまた、図5Cと5Dに
示されるように異なる温度で比較した。rHbCO（α96Val
→Trp）のDSSから０〜−1.1ppmの領域にわたる共鳴の相
対強度および化学シフト位置は、HbAのそれらが相対的
にほとんど変化しないのに対して、温度によりかなりの
変化が見られた。HbCO Ａのαおよびβ鎖のE11Val（遠
位バリン）のγ_２−メチル基（ティー・アール・リンド
ストロム（Lindstrom,T.R.）ら、Biochemistry 11:167
7（1972）；シー・ダルビット（Dalvit,C.）ら、Bioche
mistry 24:3398（1985）、これらの開示内容は参考の
ため本明細書に引用される）に割り当てられるDSSから
−1.7〜−1.8ppmの共鳴は、rHb（α96Val→Trp）および
HbAの両方のCO型において低温で１つのピークに合体す
る。rHb（α96Val→Trp）のDSSから−11.7〜−1.8ppmの
共鳴は、HbAのそれよりもはるかに広幅化していること
が判る。DSSから０〜−1.1ppmの領域にわたる共鳴の相
対強度および化学シフト位置における変化、およびrHb
（α96Val→Trp）の−1.7〜−1.8ppmの共鳴の広幅化
は、HbAは観察されない構造の遷移を反映するものと考
えられる。

IHPが存在が無しで、pH7.0の0.1Mリン酸水溶液中で30
0MHzで、ピークａから４％rHb（α96Val→Trp）および
４％HbCO Ａの¹H−NMRスペクトルも得られた。異なる
温度におけるIHPの非存在下のCO型のrHb（α96Val→Tr
p）およびHbAの交換可能なプロトン共鳴で得られたスペ
クトルを図6Aと6Bにおいて比較する。温度が低下するに
つれて、DSSから〜14ppmの共鳴は、IHPの非存在下のrHb
（α96Val→Trp）で出現するが、一方HbAでは10℃でもD
SSから〜14ppmの共鳴の出現は見られない。図6Cと6D
は、IHPの非存在下の、それぞれCO型のrHb（α96Val→T
rp）とHbCO Ａの環電流シフト共鳴を示す。これらの図
はまた、温度に依存するスペクトル変化を示す。

rHbCO（α96Val→Trp）のDDSかわ０〜−1.1ppmの領域
にわたる共鳴の相対強度および化学シフト位置は、温度
により大きな変化が見られたが、HbCO Ａのそれらはほ
とんど変化しなかった。低温における、デオキシ−四次
構造の特徴であるDSSから〜14ppmの交換可能な共鳴の出
現（図6Aと6B）、およびrHbCO（α96Val→Trp）のDSSか
ら０〜−1.1ppmの環電流シフト領域にわたる共鳴の相対
強度および化学シフト位置（図6Cと6D）は、IHPの非存
在下でもデオキシ−四次構造変換が起こることを示唆し
ている。

rHb（α96Val→Trp）の酸素結合性 pH7.0の0.1Mリン酸中の、pHE202/JM109（ピークａ、b
₁、およびb₂）から得られるrHbCO（α96Val→Trp）の３
つのピークの0.1mMの各Hbを、セファデックス（Sephade
x）Ｇ−75のカラムに適用した。それぞれ、HbO₂ Ａに
対応する位置で対称性ピークとして溶出し、このこと
は、オキシ型のrHb（α96Val→Trp）の３つの全ての型
が、本実験条件下で四量体であることを示している（結
果は示していない）。

pHの関数としてのrHb（α96Val→Trp）のピークａ、b
₁、およびb₂の酸素結合性を、前述のように検討した。
簡単に述べると、29℃でpH範囲6.3〜8.9で0.1Mリン酸ナ
トリウム緩衝液中で使用される0.1mM濃度の各特定のHb
により酸素解離データを得た。50％飽和（P₅₀）のO₂分
圧は、各曲線から求めた。図7Aのデータは、pHE202/JM1
09から得たモノＳ（Mono S）精製画分、pHE202/JM109か
らのピークａ、b₁、およびb₂およびHbAから得た。図7B
のデータは、pHE202/JM109から得たモノＳ（Mono S）精
製画分、ピークａ、b₁、およびb₂およびHbAから得た
が、これらは、前述のように、各CO型からFe⁺³型に変換
し、次にCO型に戻る。図7Aと7Bの両方について、HbAは
（○）；ピークａからのrHb（α96Val→Trp）は
（■）；ピークb₁からのrHb（α96Val→Trp）は
（△）；そしてピークb₂からのrHb（α96Val→Trp）は
（＋）である。図7Aと7Bに見られるように、ピークb₁と
b₂からのrHb（α96Val→Trp）は、酸化と還元の過程の
前のHbAと同様なP₅₀（50％濃割のO₂分圧）値を示し、こ
れに対して、ピークａからのrHb（α96Val→Trp）およ
びピークb₁およびb₂からの「変換された」Hbは、著しく
低い酸素親和性を示す。

pHE202/JM109から得たモノＳ（Mono S）精製ピーク
ａ、b₁、およびb₂ならびにHbAについて、両方のそれぞ
れの非修飾型、さらにはその各CO型からそのFe⁺³状態に
変換し次にそのCO型に戻した型の、ヒル係数（n_max）を
求めた。酸素解離データは、前述のように得られた。簡
単に述べると、各Hb試料のデータは、29℃でpH範囲6.5
〜8.4の0.1Mリン酸ナトリウム中の0.1mM濃度のHbにより
得られた。各曲線からヒル係数を求めた。図8Aは、種々
の非修飾ヘモグロビンから得られたデータを示し；図8B
は、CO型からFe⁺³状態に変換し、次にそのCO型に戻した
ヘモグロビンから得られたデータを示す。両方の図にお
いて、HbAは（○）；ピークａからのrHb（α96Val→Tr
p）は（■）；ピークb₁からのrHb（α96Val→Trp）は
（△）；そしてピークb₂からのrHb（α96Val→Trp）は
（＋）である。

図8Aと8Bから、ピークａからのrHb（α96Val→Trp）
および「変換された」Hbが、約90％のHbAの、ボーア効
果（Bohr effect）（ΔlogP₅₀/ΔpH）を示し、HbAが約
３であるのに対してpHによって約2.2〜2.6のn_max値の協
同性を示すことが判る。

下記の表１は、pHE202/JM109から得たピークａからの
rHb（α96Val→Trp）、rHbA（ティー・ジェイ・シェン
（Shen,T.−J.）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8108
（1993）に従って我々の研究室で調製した）、HbA、お
よび5mMの2,3−DPGの存在下のHbAについて、P₅₀およびn
_maxの値を比較する。すなわち、rHb（α96Val→Trp）の
独特の構造により、アロステリックエフェクターが存在
しないときでさえ、アロステリックエフェクターの存在
下のHbAと同等の性質を有すると考えられる。

また、酸素解離データは、pH7.4で29℃の0.1Mリン酸
ナトリウム緩衝液中の0.1mMの以下の各ヘモグロビン試
料により得られた。曲線は、HbA、rHb（α96Val→Trp）
（pHE202/Jm109）、2mM 2,3−DPGの存在下のrHb（α96
Val→Trp）、および2mM IHPの存在下のrHb（α96Val→
Trp）について求めた。結果は図９に示す。低い酸素親
和性と高い協同性に加えて、ピークａからのrHb（α96V
al→Trp）の酸素結合曲線は、独特の酸素結合性を示
す。非常に低い酸素圧では、2,30−DPGまたはIHPのよう
なアロステリックエフェクターの存在下のピークａから
rHb（α96Val→Trp）の酸素結合は、二相性曲線を示
す。

ピークａからのrHb（α96Val→Trp）およびHbAの酸素
親和性（P₅₀）およびヒル係数（n_max）に及ぼす温度の
影響は、それぞれ図10Aと10Bにおいて比較される。

種々のHb試料の酸素解離データは、前述のように、pH
7.4の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液中の0.1mM濃度の各Hb
試料により得られた。温度は、16、20、25、29、および
37℃とした。P₅₀およびヒル係数（n_max）は各曲線から
求めた。HbA（○）；ピークａからのrHb（α96Val→Tr
p）（pHE202/JM109）（△）;2mM IHPの存在下のrHb
（α96Val→Trp）（pHE202/JM109）（＋）；および2mM
IHPの存在下のHbA（□）のデータを得た。図10Aは、
酸素親和性（P₅₀）を示し；図10Bは、ヒル係数（n_max）
を示す。

図10Aに示されるように、酸素親和性は、温度が低下
するにつれて、IHPが存在してもIHPが存在しなくとも、
rHb（α96Val→Trp）およびHbAにおいて有意に増大して
いる。しかし、図10Bは、rHb（α96Val→Trp）およびHb
Aのn_max値が、温度の関数としてあまり変化しないこと
を示している。15〜37℃の温度範囲にわたって、rHb
（α96Val→Trp）およびHbAは、約2.0〜2.9のn_max値の
協同性を示す。

B.プラスミドpHE702 発現プラスミドpHE702の作成同様のα96Val→Trp突然変異を、オリゴヌクレオチド
５′−AGCTTGAAGTTCCATGGGTCCACCC−３′（ディーエヌ
エー・インターナショナル社（DNA International,In
c.）、レーク・オスウェゴ（Lake Oswego）、オレゴン
州）によりプラスミドpHE7中に導入して、報告された方
法（ティー・エム・クンケル（Kunkel,T.M.）、1985、P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488−492;ティー・ジェイ
・シェン（Shen,T.−J.）ら、1994、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 90：（8108）によりプラスミドpHE702を形成し
た。

プラスミドpHE7は、ヒトα−およびβ−cDNAと大腸菌
（E.coli）Met−AP遺伝子を同時発現するプラスミドで
ある。これは、前述のpHE2と同じ方向にタンデムに配列
された２つの発現カセットを含む：（ｉ）tacプロモー
ター−大腸菌（E.coli）Met−APコード配列−5ST1T2タ
ーミネーター、および（ii）tacプロモーター−α−グ
ロビンcDNAコード配列−β−グロビンcDNAコード配列−
5ST1T2ターミネーター。

プラスミドpHE702は、（１）合成ヒトα−グロビン遺
伝子をヒトα−グロビンcDNAに置き換え；（２）合成ヒ
トβ−グロビン遺伝子をヒトβ−グロビンcDNAに置き換
え；そして（３）大腸菌（E.coli）Met−APコード配列
を、プラスミドpSYC1174からではなく大腸菌（E.coli）
ゲノムDNAから直接得た以外は、前述のようにpHE2を作
成するのに使用されるのと同様の方法で作成した。

ヒトα−グロビンcDNAコード配列は、pKT218−αｃ
（エール大学のビー・ジー・フォーゲット（B.G.Forge
t）から供与されたが、希望すれば入手可能である）を
鋳型として、２つの合成プライマー５′−GAGAACCCCATA
TGGTGCTGTCTCCTGCC−３′および５′−CCGAGGCACTAGTTT
AACGGTATTTGGAGGTC−３′（両方ともディーエヌエー・
インターナショナル社（DNA International,Inc.）か
ら）（これらは、ヒトα−グロビンcDNAの５′−および
３′−末端配列に相補的であり、それぞれNde I部位お
よびSpe I部位を含む）を用いてPCRにより得られた。

ヒトβ−グロビンcDNAコード配列は、グローベ（Groe
be）ら（Protein Expression and Purification ３:13
4（1992））のプロトコールにより作成したｐβを鋳型
として、２つの合成プライマー５′CAAACAGACCATATGGTG
CACCTGAGACTCCTGAGGAG−３′および５′−AGCAAGAATGCA
TGCTTAGTGATACTTGTGGGCCAGG−３′（両方ともディーエ
ヌエー・インターナショナル社（DNA International,In
c.）から）（これらは、ヒトβ−グロビンcDNAの５′−
および３′−末端配列に相補的であり、それぞれNde I
部位およびNsi I部位を含む）を用いてPCRにより得られ
た。

大腸菌（E.coli）Met−AP遺伝子のコード配列は、大
腸菌（E.coli）ゲノムDNAを鋳型として、２つの合成プ
ライマー５′−TGGACAGAATTCCATGGCTATCTCAATCA−３′
および５′−TGGCTTAAGCTTATTCGTCGTGCGAG−３′（両方
ともピッツバーグ大学のDNA合成施設から）（これら
は、大腸菌（E.coli）Met−AP遺伝子の５′−および
３′−末端配列に相補的であり、それぞれEcoR I部位お
よびHind III部位を含む）を用いてPCRにより得られ
た。pH702/JM109と名付けた、宿主細胞大腸菌（E.col
i）JM109中のプラスミドpHE702は、1995年４月26日にAT
CC 69793の番号でメリーランド州ロックビル（Rockvil
le）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（American Type Culture Collection）に寄託した。

プラスミドpHE202およびpHE702からのrHb（α96Val→Tr
p）の比較 pHE72を有する大腸菌（E.coli）JM109の増殖条件は、
pHE202について前述したものと同一である。pHE702から
得られるrHb（α96Val→Trp）の収率は、前述のpHE202
から得られるrHb（α96Val→Trp）の約50％である。上
記のように、pHE702はヒト遺伝子から作成したため、他
の発言系の使用が有利かもしれない。pHE702から得たrH
b（α96Val→Trp）の溶出プロフィールは、モノＳ（Mon
o S）クロマトグラフィー後に２つのピーク（ピーク１
およびピーク２と呼ぶ）を与える（結果は示していな
い）。同様に、pHE202から得たrHb（α96Val→Trp）に
ついて前述した他の全ての分析法を、pHE702から得られ
たヘモグロビンにも同様に実施した。

２つの異なるプラスミドpHE202とpHE702から得た酸素
親和性が低いrHb（α96Val→Trp）の機能上および構造
上の性質の両方を比較した。pHE202から得たrHb（α96V
al→Trp）の詳細な説明は前述されている。pHE202およ
びpHE702から得たrHb（α96Val→Trp）を前述のように
酸化して還元し、pH6.8と7.4で29℃で0.1Mリン酸ナトリ
ウム中でP₅₀およびn_max値を測定して、HbAと比較した。
下記表２に、pH6.8と7.7の、HbA、pHE202から得たrHb
（α96Val→Trp）、およびpHE702から得たrHb（α96Val
→Trp）の酸素結合性を要約する。両方のプラスミドか
ら得たrHb（α96Val→Trp）が示す機能性は本質的に同
一であることは明らかである。

図11は、詳細には前述のように、pH7.0で29℃で実施
した0.1Mリン酸塩中のCO型のHbAおよびpHE202とpHE702
から得たrHb（α96Val→Trp）の¹H−NMRスペクトルを示
す。図11Aは、CO型のHbAおよびpHE202（ピーク２）とpH
E702（ピーク２）から得たrHb（α96Val→Trp）の交換
可能なプロトン共鳴を示し、図11Bは、環電流シフトプ
ロトン共鳴を示す。両方のセットの¹H−NMR結果は、こ
れら２つのrHb（α96Val→Trp）の間で¹H−NMRスペクト
ルに観察可能な差がないことを示している。すなわち、
pHE202とpHE702から得たrHb（α96Val→Trp）の間に観
察可能な構造上または機能上の差がないことが結論され
る。

C.MDシミュレーションデオキシHbAの結晶構造中の２つのα96Val残基のＣα
の間の距離は、10.3オングストロームである（ジー・フ
ェルミ（Fermi,G）ら、J.Mol.Biol.175:159（1984）、
この開示内容は参考のため本明細書に引用される）。rH
b（α96Val→Trp）のα96位に位置するトリプトファン
残基の大きさにより、rHb（α96Val→Trp）の安定性
が、トリプトファン残基の側鎖角の配向に強く存在する
であろうことが予測される。デオキシ型のコンピュータ
モデルは、回転異性体ライブラリー（ジェイ・ダブリュ
ー・ポンダー（Ponter,J.W.）ら、J.Mol.Biol.193:775
（1987）、この開示内容は参考のため本明細書に引用さ
れる）からの10％を超える発生率を示すトリプトファン
の４つの側鎖角の中で、側鎖角χ_１＝64.8およびχ_２＝
−88.9（20.7％）を有するトリプトファンのみが、安定
なコンホメーションを与えることを示している。他の３
つのトリプトファンコンホメーションは、全て相互に向
き合い、好ましくない非結合相互作用を与えている。

野生型および変異型Hbの間の形質転換は、トリプトフ
ァン残基の４つ全ての可能な側鎖角で行われた。デオキ
シ型の平均模擬構造における２つのα鎖におけるＮεｌ
Trp96残基の間の距離および各α96Trp残基の側鎖角
を、下記表３に要約する。

χ_１＝64.8およびχ_２＝−88.9の最初のトリプトファ
ン側鎖角からの模擬構造のみが、相対的に対称なコンホ
メーションの両方のα96Trpを示す。このコンホメーシ
ョンにおける両方のα96Trp残基の側鎖角は、相対的に
よく保存されており、２つのα96Trp残基のＮεｌ間の
距離は、α96Trp残基が十分に分離されているため、相
互に影響しないことを示している。これらの結果はχ_１
＝64.8およびχ_２＝−88.9のトリプトファン側鎖角が、
天然のコンホメーションに最も近いことを示唆してい
る。

すなわち、協同性の自由エネルギーの計算のため、自
由エネルギーのシミュレーションの分析を容易にするた
めに、このrHbのデオキシおよびオキシ型の両方の結晶
構造のβ99AspのＣβ質量座標の中心を中心とする球上
で、χ_１＝64.8およびχ_２＝−88.9の側鎖角によりMDシ
ミュレーションを行った。この球は、計算目的のため１
つだけのα96Trp残基を含む。

デオキシ型のHbAおよびrHb（α96Val→Trp）の平均模
擬構造を、ペンシルバニア州ピッツバーグのピックバー
グスーパーコンピューティングセンター（Pittsburgh S
upercomputing Center）で開発された分子グラフィクス
プログラムのグラフィックス（GRAPHX）により準備し
た。これらの側鎖角からのデオキシ型の平均模擬構造
は、β99Aspとα42Tyr間およびβ99Aspとα97Asn間に存
在する水素結合に加えて、α99Trpとβ99Asp間の新規な
界面水素結合を示唆する。さらに、デオキシ型の形質転
換した変異体Hb（α96Val→Trp）の100−ps MDシミュ
レーションは、α_１β_２サブユニット界面のこれらの水
素結合が、非常に安定であることを示唆しており、すな
わち、2.25±0.19オングストロームの平均模擬距離であ
り、そしてそれぞれα42Tyrとβ99Asp間は、2.32±0.22
オングストローム、α97Asnとβ99Asp間は、2.22±0.34
オングストロームである。

rHb（α96Val→Trp）の協同性の自由エネルギーの実
験による測定値はないが、HbAに十分匹敵するrHb（α96
Val→Trp）の相対的に高いヒル係数（pH7.4でn_max＝2.
6）は、rHb（α96Val→Trp）の協同性の自由エネルギー
がHbA（pH7.4でn_max＝3.0）の協同性の自由エネルギー
に近いことを示唆している。rHb（α96Val→Trp）とHbA
の間の協同性の自由エネルギーにおける差の計算値は、
下記表４に示されるように、界面当たり−1.5kcal/mol
であり、これは、HbAよりわずかに低い協同性を有するH
bのほぼ期待値である（ジー・ジェイ・ターナー（Turne
r,G.J.）ら、Proteins:14 333（1992）、この開示内容
は参考のため本明細書に引用される）。

全ての値は、１つのα_１β_２界面について与えられ
る。デオキシ型まはたオキシ型のいずれでも0.5kcalを
超えて寄与する残基のみをリストする。ΔＧの正の数
は、HbAに比べてHb（α96Val→Trp）を脱安定化する寄
与を意味する。ΔΔＧは、ΔＧ（オキシ）−ΔＧ（デオ
キシ）であり、これはHb（α96Val→Trp）のHbAの間の
協同性の自由エネルギーの差に対応する。

すなわち、MDシミュレーションの結果は、協同性の全
自由エネルギーに寄与する特異的な相互作用に関する情
報を得るために有利に使用することができる。協同性の
全自由エネルギーへの個々のアミノ酸の寄与も表４に示
される。多くの個々のアミノ酸は、1.0kcal未満の寄与
であり、このことはα_１β_２界面に導入されるトリプト
ファンが、大きなコンホメーション変化を引き起こさな
いことを示している。協同性の全自由エネルギーへの最
も大きな寄与は、β99Aspとの相互作用（14.8kcal）に
由来し、これは恐らくデオキシ構造における安定化から
もたらされる（−12.2kcal）。これらの結果は、α96Tr
pとβ99Asの間の新規な水素結合が、このrHbのデオキシ
構造の安定化を担当しうることを示唆している。

本発明のrHb（α96Val→Trp）は、本分子の二量体へ
の解離を防止するために、代替血液または治療薬の成分
として使用する前に、架橋する必要がある。赤血球中の
事実上全てのヘモグロビンは四量体状態にあるが、代替
血液のように細胞から遊離して循環するヘモグロビン
は、腎臓の糸球体膜の閉塞、さらには注入した四量体ヘ
モグロビンの循環からの連続排出を引き起こす程度ま
で、二量体に解離することがある。ヘモグロビンは、解
離によるクリアランスを防止するために架橋する必要が
ある。

ヘモグロビンは、α鎖の間を、ジイソチオシアナトベ
ンゼンスルホネートなどにより、ヘモグロビン四量体内
を、ピリドキサールや誘導体およびアシルリン酸類など
により、架橋してもよい。アール・エム・ウィンスロウ
（Winslow,R.M.）ら編、「代替血液、有効性の生理学的
基礎」（Blood Substitutes Physiological Basis of E
fficacy）（バークハウザー（Birkhaeuser）、ボスト
ン、マサチューセッツ州）、82−84頁（1995）を参照の
こと（この開示内容は参考のため本明細書に引用され
る）。また、アール・エム・ウィンスロウ（Winslow,R.
M.）、「ヘモグロビンに基づく代替赤血球」（Hemoglob
in−Based Red Cell Substitutes）（ジョンズ・ホプキ
ンス大学出版（Johns Hopkins University Press）、ボ
ルチモア、メリーランド州）；エル・アール・マニング
（Manning,L.R.）ら、Biochemistry 27:6640（198
8）；アール・イー・ベネシュ（Benesch,R.E.）ら、Bio
chem.Biophys.Res.Comm.156：（1988）；イー・ブッチ
（Bucci,E.）ら、J.Biol.Chem.264:6191（1989）；ティ
ー・エム・エス・チャン（Chang,T.M.S.）ら編、代替血
液に関する第２回国際シンポジウムの抄録（Proceeding
of II International Symposium on Blood Substitute
s）,Biomater.Artil.Cells Artif.Organs（1988）；ア
ール・クルーガー（Kluger,R.）ら、Biochemistry 31:
7551（1992）；およびエフ・デベヌート（DeVenuto,
F.）ら、Surg.Gynecol.Obstet.155:342（1982）をも参
照のこと（これらの開示内容は参考のため本明細書に引
用される）。

適切に架橋されている、精製された架橋rHb（α96Val
→Trp）は、次に当該分野で公知の方法により生理学的
に許容しうるヘモグロビンに基づく代替血液に組み込む
ことができる。アール・エム・ウィンスロウ（Winslow,
R.M.）ら編、「代替血液、有効性の生理学的基礎」（Bl
ood Substitutes Physiological Basis of Efficacy）
（バークハウザー（Birkhaeuser）、ボストン、マサチ
ューセッツ州）（1995）を参照のこと（この開示内容は
参考のため本明細書に引用される）。

本発明は例示の目的で詳細に記載されているが、この
ような詳細な説明は、単にその目的のためであり、当業
者には本発明の精神と範囲から逸脱することなく本発明
の変法を行うことができ、そして本発明は請求の範囲に
より限定されることは理解されたい。

配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：ホ，チエン（Ho.Chien）キム，ヒュン−ウォン（Kim,Hyun−Won）シュン，トン−ジャン（Shen,Tong−Jian）（ii）発明の名称：低酸素親和性突然変異ヘモグロビン（iii）配列の数:8 （iv）連絡住所：（Ａ）宛名：カーネギー・メロン大学（Carnegie Mel
lon University）（Ｂ）通り:4400フォーブス・アベニュー（4400 Forb
es Avenue）（Ｃ）市：ピッツバーグ（Ｄ）州：ペンシルバニア（Ｅ）国：米国（Ｆ）郵便番号:15213 （ｖ）コンピューターで読める形式：（Ａ）媒体の型:5−1/4低密度ディスケット（Ｂ）コンピューター:IBM PCまたはコンパチブル（Ｃ）オペレーティング・シスセム:MS−DOS （Ｄ）ソフトウェア：アスキー（ASCII）（vi）現行出願のデータ：（Ａ）出願番号：利用不可（Ｂ）出願日:1996年４月30日（Ｃ）分類：利用不可（vii）先行出願のデータ（Ａ）出願番号:US08/432,071 （Ｂ）出願日:1995年５月１日（viii）弁理士／代理人情報：（Ａ）氏名：マリー−エリザベス・バックルス（Mery
−Elizabeth Buckles）（Ｂ）登録番号:31,907 （Ｃ）参照／整理番号:95−243PCT （ix）電話連絡先情報：（Ａ）電話:202/414−9200 （Ｂ）ファックス:202/414−9299 （Ｃ）テレックス:64711 （２）配列番号:1の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:21ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一般鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：合成DNA （ｘ）刊行物情報：（Ａ）著者：ヒュン−ウォン・キム（Hyun−Won Ki
m）トン−ジャン・シュン（Tong−Jian Shen）ダツェン・フィリップ・サン（Dazhen Philip Su
n）ナンシー・ティー・ホー（Nancy T.Ho）マーセラ・マドリッド（Marcella Madrid）チエン・ホー（Chien Ho）（Ｂ）名称：新規な低酸素親和性組換えヘモグロビン
（a96Val_Trp）：結合状態を変化させない四次構造のス
イッチング（Ｃ）：誌名:Journal of Molecular Biology （Ｄ）巻:248 （Ｅ）号:4 （Ｆ）頁:867−882 （Ｇ）日付:1995年５月00日（Ｋ）配列番号:1における関連する残基:1から21 （xi）配列：配列番号:1: （３）配列番号:2の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:25ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：合成DNA （xi）配列：配列番号:2: （４）配列番号:3の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:29ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：合成DNA （xi）配列：配列番号:3: （５）配列番号:4の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:32ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：合成DNA （xi）配列：配列番号:4: （６）配列番号:5の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:36ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：合成DNA （xi）配列：配列番号:5: （７）配列番号:6の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:37ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：合成DNA （xi）配列：配列番号:6: （８）配列番号:7の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:29ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：合成DNA （xi）配列：配列番号:7: （９）配列番号:8の情報：（ｉ）配列の特色：（Ａ）長さ:26ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）分子の型：合成DNA （xi）配列：配列番号:8:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者シェン，トン−ジアンアメリカ合衆国 15213 ペンシルバニア州ピッツバーグ，アトウッドストリート 337，アパートメント２ (56)参考文献特表平２−503509（ＪＰ，Ａ) 米国特許5173426（ＵＳ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，356，258−260（1992) Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，1159（２），223−226（1992) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/12 C07K 14/805 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】α鎖の96位のバリン残基がトリプトファン
残基により置換されている、天然に存在しない突然変異
ヒトヘモグロビン。
【請求項２】健常成人ヘモグロビンに比較して低い酸素
親和性を有する、請求の範囲第１項記載のヘモグロビ
ン。
【請求項３】酸素結合における高い協同性をさらに有す
る、請求の範囲第２項記載のヘモグロビン。
【請求項４】組換え法で産生される、請求の範囲第３項
記載のヘモグロビン。
【請求項５】rHb（α96Val→Trp）。
【請求項６】α鎖の96位のバリン残基がトリプトファン
残基により置換されている人工的突然変異ヘモグロビン
を含む非毒性組成物からなる血液代替物又は血液希釈
剤。
【請求項７】健常成人ヘモグロビンに比較して突然変異
ヘモグロビンは低い酸素親和性を有する、請求の範囲第
６項記載の血液代替物又は血液希釈剤。
【請求項８】突然変異ヘモグロビンはまた、酸素結合に
おいて高い協同性をを有する、請求の範囲第７項記載の
血液代替物又は血液希釈剤。
【請求項９】突然変異ヘモグロビンは組換え法で産生さ
れる、請求の範囲第８項記載の血液代替物又は血液希釈
剤。
【請求項１０】突然変異ヘモグロビンはrHb（α96Val→
Trp）である、請求の範囲第９項記載の血液代替物又は
血液希釈剤。
【請求項１１】発現可能なα−グロビンおよびβ−グロ
ビン遺伝子からなる組換えDNA発現プラスミドであっ
て、α−グロビン遺伝子は突然変異、および別個のtac
プロモーターの支配下でタンデムに配置された大腸菌
（E.coli）のMet−AP遺伝子を含有し、該配列は、ヒト
α−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子およびMet−AP
遺伝子について別々に発現され、かつヘムを導入して、
前記突然変異以外は、未変性のHbAと基本的に同じアミ
ノ酸配列およびヘムコンフォメーションを有する組換え
ヘモグロビンを形成し、α−グロビン遺伝子は、α鎖の
96位のバリン残基が、発現されたタンパク質中でトリプ
トファン残基により置換されているように突然変異され
る、上記プラスミド。
【請求項１２】人工ヘモグロビンの製造方法であって、請求の範囲第11項記載の発現プラスミドを、赤血球以外
の適切な宿主に導入し、形質転換細胞を増殖させる工
程、 DNAを発現させて人工ヘモグロビンを産生させる工程、
およびヘモグロビンを回収し精製する工程、からなる上記方法。
【請求項１３】宿主細胞は大腸菌（E.coli）である、請
求の範囲第12項記載の方法。
【請求項１４】プラスミドはpHE202である、請求の範囲
第13項記載の方法。
【請求項１５】プラスミドはpHE702である、請求の範囲
第13項記載の方法。
【請求項１６】薬剤学的に許容される担体中の天然に存
在しない、α鎖の96位のバリン残基がトリプトファン残
基により置換されている突然変異ヘモグロビンからな
る、非毒性薬剤組成物。
【請求項１７】無細胞環境中のヘモグロビンは、健常成
人ヘモグロビンより低い酸素結合性を有する、請求の範
囲第16項記載の組成物。
【請求項１８】ヘモグロビンはrHb（α96Val→Trp）で
ある、請求の範囲第17項記載の組成物。
【請求項１９】プラスミドpHE202。
【請求項２０】プラスミドpHE702。
【請求項２１】無細胞環境中で、赤血球中の健常成人ヘ
モグロビンに匹敵する酸素結合性を有し、α鎖の96位の
バリン残基の突然変異を含む、人工突然変異ヒトヘモグ
ロビン。
【請求項２２】バリン残基はトリプトファン残基で置換
されている、請求と範囲第21項記載のヘモグロビン。
【請求項２３】組換え法で産生される、請求の範囲第22
項記載のヘモグロビン。
【請求項２４】rHb（α96Val→Trp）である、請求の範
囲第23項記載のヘモグロビン。
【請求項２５】健常成人ヘモグロビンより低い酸素親和
性を有することを特徴とする、分子のα_１β_２サブユニ
ット界面領域中のα鎖の96位のバリン残基に突然変異を
有する、天然に存在しない低酸素親和性突然変異ヘモグ
ロビン。
【請求項２６】アロステリックエフェクター2,3−ジホ
スホグリセレート（2,3−DPG）の存在下で健常成人ヘモ
グロビンに匹敵する酸素結合性を有し、α鎖の96位のバ
リン残基の突然変異を含む、天然に存在しない低酸素親
和性突然変異ヘモグロビン。
【請求項２７】α鎖の96位のバリン残基はトリプトファ
ン残基で置換されている、請求の範囲第26項記載の突然
変異ヘモグロビン。
【請求項２８】α鎖の96位のバリン残基の突然変異を含
む、天然に存在しない突然変異ヘモグロビンであって、
P₅₀により測定された酸素親和性とヒル係数（n_max）に
より測定された協同性の酸素結合性として、アロステリ
ックエフェクター2,3−ジホスホグリセレートの存在下
でHbAの酸素結合性に類似した以下の特性を有する上記
突然変異ヘモグロビン:pH6.5でP₅₀約26.6,n_max約2.4;pH
6.8でP₅₀約22.0,n_max約2.5;pH7.4でP₅₀約11.6,n_max2.6;
pH8.0でP₅₀約5.6,n_max約2.4。
【請求項２９】プラスミドpHE202で形質転換される細胞
から得られたrHb（α96Val→Trp）。
【請求項３０】プラスミドpHE702で形質転換される細胞
から得られたrHb（α96Val→Trp）。