HUT70309A - Production and use of multimeric hemoglobins - Google Patents

Description

A találmány háttere

A találmány területe

A jelen találmány multimer hemoglobin-szerü proteinekre irányul, melyek kettő vagy több genetikai fúzióval vagy kémiai keresztkötéssel egymáshoz kapcsolt pszeudotetramerekből állnak. A tudományos háttér leírása

A. A hemoglobin szerkezete és funkciója

A hemoglobin a vér oxigént szállító alkotórésze. A hemoglo bin a véráramban erithrocitáknak (vörösvértestek) nevezett kicsi ···· ·· ·· • · · · · sejtmag nélküli sejtekben kering. A hemoglobin egy olyan protein, mely négy kapcsolódó polipeptid láncból áll, melyek a haemeknek ismert prosztetikus csoportot hordozzák. Az erithrocita segíti a hemoglobin redukált, funkcionális formájának fenntartását. A haem vas atomja érzékeny az oxidációval szemben, azonban ismét redukált állapotba hozható az erithrocitában levő két enzim rendszer a citokróm b₅ és a glutation redukciós rendszer egyikével.

A hemoglobin szerkezete jól ismert. A hivatkozás révén Bunn és Forget (Bunn and Forget (Eds.) Hemoglobin: Molecular, Genetic and Clinical Aspects (W.B. Saunders Co. Philadelphia, PA:1986)) és Fermi és Perutz (Hemoglobin and Myoglobin, in Phillips and Richards, Atlas of Moleccular Structures in Biology (Claredon Press:1981) teljes szövegét a találmányba építjük.

A normál felnőtt humán hemolizátum körülbelül 92 %-a Hgb A (alfa2 béta2-nek jelölt, mivel két alfa és két béta láncot tartalmaz) . Más ismert hemoglobin típusok a következők: Hgb A₂ (a₂ δ₂), Hgb A_la, Hgb A_lb és a Hgb A_lc, valamint az olyan ritka típusok, mint a Hgb F (a₂ gamma₂), Hgb Gower-1 (Zeta₂, epsilon₂), a Hgb Gower-2 (alfa₂ epsilon₂), Hgb Portland (Zeta₂ gamma₂) és a Hgb H (beta^) , valamint a Hgb Bárt (gamma^J . Ezek a Hgb A-tól a polipeptid láncok eltérő szelekciójával különböztethetők meg.

Egy polipeptid elsődleges szerkezetét aminosav szekvenciája, valamint az egyes aminosavak oldalláncainak bármilyen módosításának azonosítása határozza meg. A normál humán hemoglobin alfa és béta globin polipeptid láncainak aminosav szekvenciáját az 1. Táblázatban adtuk meg. Számos mutáns forma ismert; számos mutánst azonosítottunk a 400. Tábázatban. A vad tipusu alfa lánc 141 aminosavat tartalmaz. A haem (ferroprotoporfirin IX) csoport vas atomja kovalensen kapcsolódik a His 87 (a proximális hisztidin) imidazoljához. A vad tipusu béta lánc 146 maradék hosszú és • · · · «· * · ♦ 4· • · · · · * · · • · · ······ « · ·· ·· · · · ···· a haem a His 92-nél kapcsolódik hozzá. Az apohemoglobin a hemoglobin haem-mentes analógja; túlnyomórészt αβ-globin dimerként létezik.

A polipeptid lánc szegmentjei a két gyakori konformáció, az alfa hélix és a béta lemez egyikévé alakításával stabilizálhatok. Natív állapotában a hemoglobin molekula 75 %-a alfa helikális. Az alfa helikális szegmentek olyan szegmentekkel szeparálódnak el egymástól, melyekben a lánc sokkal kevésbé korlátozott. Hagyományosan az egyes láncok alfa helikális szegmentjeit betűkkel aszonositjuk, pl. az alfa lánc proximális hisztidinje F8 (az F helix 8-as maradéka). A nem-helikális szegmenteket betű párokkal azonosítjuk, jelezve, hogy melyik helikális szegmenteket tartalmazzák. így a nem-helikális BC szegment a B és a C hélixek között található. Egy adott hemoglobin lánc két variánsának összehasonlításában segítséget adhat a helikális szegmentek sorbaállitásának megkisérelése, strukturális homológiák keresésekor. Az aminosav szekvencia és a helikális maradék jelöléshez, a normál humán hemoglobin Aq alfa és béta láncokhoz lásd Bunn és Forget munkáját, és az 1. Táblázatot. A hemoglobin molekula tercier szerkezete azon aminosav maradékok szférikus kapcsolatára utal, melyek a lineáris szekvenciában egymástól távol helyezkednek el, mig a negyedleges szerkezet arra a módra utal, ahogy az alegységek (láncok) egymáshoz kapcsolódnak. A hemoglobin molekula tercier és negyedleges szerkezetét már elkülönítették a hemoglobin kristályok röntgen sugárzásos diffrakciós analízisével, mely lehetővé teszi, hogy meghatározzuk a molekula valóságos atomjainak három-dimenziós pozícióit.

Nem-oxigenált formájában (dezoxi, vagy T a merev-nél) a hemoglobin A alegységek (alfal, alfa2, bétái és béta2) egy olyan tetrahedront képeznek, mely kétszeres axis szimmetriájú. Az • · • · • ·· ······ · · ·· · · · · · ···· ’ - 5 axis egy vízzel töltött központi üregbe fut le. Az alegységek egymással a Van dér Waals erőkön, hidrogén hidakon és ionmos kölcsönhatásokon (vagy sóhidakon) keresztül lépnek kapcsolatba. Az alfalbétal és az alfa2béta2 interfacek viszonylag rögzített állapotban maradnak az oxidálódás alatt. Ezzel szemben jelentős mozgás van az alfalbétal (és az alfa2bétal) interfaceken. Oxigénéit formájában (oxi vagy R a laza forma esetében) az alegységek közötti távolságok megnőttek.

A natív oxihemoglobin és a dezoxihemoglobin tercier és negyedleges szerkezetei megfelelően ismertek, szinte az összes nem hidrogén atom pozíciója 0.5 Angström pontossággal megállapítható vagy még pontosabban. A humán dezoxihemoglobinhoz lásd Fermi et al. munkáját (J. Mól. Bioi. 175:159, 1984) és a humán oxihemoglobinhoz lásd Shaanan-t (J. Mól. Bioi., 171:31, 1983), melyeket a hivatkozás révén a találmányba építettünk.

A normál hemoglobin ciszteineket tartalmaz a béta 93 (F9), a béta 112 (G 14) és az alfa 104 (Gll) helyeknél. Ez utóbbi két pozíció mélyen bent található mind az oxi és a dezoxi állapotokban; közel fekszenek az interfacehez. Az oxi formában a béta azonban reaktív szulfhidril reagensekkel.

A natív humán hemoglobint teljes mértékben újraépítettük szeparált haem-mentes alfa és béta globinból és heminből. Előnyösen, először haemet adunk az alfa-globin alegységhez. Ezután a haemhez kapcsolódó alfa globint vetjük alá a haem-mentes béta alegységgel való komplex képzésnek. Végül haemet adunk a félig töltött globin dimerhez és igy egy tetramer hemoglobint nyerünk. Yip et al·., PNAS (USA) 74:64-68 (1977).

A humán alfa és béta globin gének sorrendben a 16 és 11 kromoszómákon találhatók. Bunn és Forget infra a 172. oldalon.

·« • · · · · « · ·· · · · ·· · • ·· ······ · · • · · · · ·· · ··· ' - 6 Mindkét gént klónozták és szekvenálták, Liebhaber et al., PNAS 77:7054-58 (1980) (alfa-globin genom DNS); Marotta et al., J. Bioi. Chem., 252:5040-53 (1977)(béta globin cDNS); Lawn et al., Cell, 21:647 (1980)(béta globin genom DNS).

A hemoglobin 4 alegysége részvételével egyesített oxigén kötést mutat (a Hgb A esetében két alfa globin és két béta globin) , és ez az együttes oxigénkötés jelentősen elősegíti a hatékony oxigén transzportot. Ez a szövetkezés, melyet az úgynevezett haem-haem kölcsönhatások biztosítanak, lehetővé teszi, hogy a hemoglobin változtassa az oxigénnel szembeni affinitását. A hemoglobin reverzibilisen kötődik 4 mól oxigén/mol Hgb arányban.

Az oxigént hordozó vegyületeket gyakran hasonlítjuk össze az oxigén disszociációs görbének ismert eszközzel. Ezt a görbét akkor kapjuk egy adott oxigén hordozó esetében, ha az oxigén szaturációt vagy az oxigén tartalmat ábrázoljuk az oxigén parciális nyomásával szemben. A Hgb esetében, a szaturáció százaléka egy szigmoid kapcsolatot mutatva nő a parciális nyomással. P₅q az a parciális nyomás érték, melyen az oxigén hordozó oldat félig telítődik oxigénnel. így ez az oxigén kötési affinitás mértéke; minél magasabb a Ρςθ, annál lazábban kötődik az oxigén.

Ha egy oxigén hordozó oldat oxigén disszociációs görbéje olyan, hogy a P₅q a teljes vérénél kisebb, balra eltolódott-nak hívj ák.

A hemoglobin oxigén affinitását csökkenti a 2,3difoszfoglicerát (2,3-DPG), klorid ionok és hidrogén ionok jelenléte. A légzésben részt vevő szövetek széndioxidot szabadítanak fel a vérbe és igy csökkentik annak pH értékét (azaz növelik a hidrogén ion koncentrációt), igy arra kényszerítik az oxigént, hogy disszociáljon a hemoglobinról és lehetővé váljon az egyes sejtekhez való diffúziója.

·· · · · · 4 · · 4 · ·· ······ 4 4

A hemoglobin azon képessége, hogy megváltoztatja oxigénhez való affinitását, a testben való oxigén transzport hatékonyságát fokozva, a 2,3-DPG metabolit jelenlététől függ. A vörösvértesten belül a 2,3-DPG majdnem a hemoglobin koncentrációjával azonos koncentrációban van jelen. A 2,3-DPG hiányában a hagyományos hemoglobin az oxigént nagyon erősen köti és csupán kevés oxigént szabadítana fel a légzésben részt vevő szövetek számára.

Az öregedő vörösvértest a vérplazmába kis mennyiségű szabad hemoglobint szabadit fel, ahol azt a haptoglobin tisztitó protein gyorsan megköti. A hemoglobin-haptoglobin komplex kikerül a vérből és a lépben és a májban lebomlik.

Az izolált alfa globin láncok monomerek; nagy oxigén affinitást mutatnak, de természetesen hiányzik belőlük az alegység kooperativitás. Az izolált béta globin láncok tetramerek létrehozására aggregálódnak (HbH). A tetramer nagy de nem kooperáló oxigén affinitással rendelkezik.

B. Vérpótlószerek, Általában

Nem mindig helyes egy beteget adott vérrel transzfuziónak alávetni. Ezekben az esetekben vörösvértest pótló anyag használata kívánatos. A termék a vörösvértestekhez hasonlóan hatékonyan kell szállítsa az C^-t. (A plazma expanderek, mint pl a dextrán és albumin nem szállítanak oxigént). A kétféle legszéleskörűbben vizsgált pótló anyagok a hemoglobin oldatok és a fluorokarbon emulziók.

A fenti kijelentésekből egyértelmű, hogy a szabad nativ hemoglobin A, közvetlenül a véráramba injektálva nem segítené • ·· «····· · · ·· ·· · · · ···· ’ - 8 hatékonyan az oxigén transzportot a testben. A létfontosságú alloszterikus szabályozó, a 2,3-DPG, nincs elegendő koncentrációban jelen a plazmában ahhoz, hogy sok oxigént szabadítson fel vénás oxigén nyomásnál.

Azonban hagyományos hemoglobin oldatokat használtak RBC pótlékokként. A hemoglobin oldatok előállításának klasszikus módszere lejárt vért használ fel. A vörösvértesteket lizálják és a sejt hulladákot eltávolítják, így remélhetőleg marad a sztroma-mentes hemoglobin (SFH).

Ezzel a módszerrel kapcsolatban azonban számos problébát figyeltek meg. Az oldat mentes kell legyen a vörösvérsejt membrán toxikus alkotórészeitől anélkül, hogy kényelmetlen és fárasztó eljárásokat kellene alkalmazni, mely elriasztana a nagyüzemi termeléstől. DeVenuto, Appraisal of Hemoglobin Solution as a Blood Substitute, Surgery, Gynecology and Obstetrics, 149:417436 (1979).

Másodszor, ahogy az várható, az ilyen oldatok balratolódottak (alacsony a P₅q érték) a teljes vérhez viszonyítva. Gould et al., The Dvelopment of Polymerized Pyridoxilated Hemoglobin Solution as a Red Cell Substitute, Ann. Emerg. Med.

15:1416-1419 (1986, dec. 3.). Ennek eredményeként az oxigén affinitás túl magas ahhoz, hogy elegendő oxigént juttasson a szövetekhez. Benesch and Benesch, Biochem. Biophys. Rés. Comm., 26:162-167 (1967).

Harmadszor, az SFH csupán korlátozott felezési idővel rendelkezik a keringési rendszerben. Ez azért van, mert az oxi Hgb részlegesen egy olyan dimerré (αβ) disszociál, mely gyorsan kitisztul a vérből a glomeruláris szűrés és a keringő haptoglobulinhoz való kötődés révén. Ha a keringésbe nagy mennyiségű oldható hemoglobint juttatunk a dimerek glomeruláris szűrése ···· · · · ·« «· • « · · · · « · • · · *····· · · ·· · · · ·· «··· ’ - 9 protein és vas terhelést jelent a veséknek, vesekárosodást okozva. Bunn, H.F., et al. (1969) The renal handling of hemoglobin I. Glomerular filtration. J.Exp. Med. 129:909-923; Bunn, H.F. and J.H. Jandl (1969) The renal handling of hemoglobin II. Catabolism. J. Exp. Med. 129:925-934; Lee, R.L. et al., (1989) Ultrapure, stroma-free, polymerized bovine hemoglobin solution: Evaluation of renal toxicity (blood substitutes) J. Surgical Rés. 47:407-411; Feola, M. et al., (1990) Nephrotoxicity of hemoglobin solutions. Biomat. Art. Cell. Art. Org., 18 (2) :233-249; Tam, S.C. and J.T.F. Wong (1988) Impairment of renal function by stoma-free hemoglobin in rats J. LAb. Clin. Med. 111:189-193.

Végül, az SFH nagy kolloid ozmotikus nyomással rendelkezik (COD). így az SFH olyan dózisban való adagolása, mely ugyanolyan oxigén hordozó kapacitással rendelkezne mint egy egység becsomagolt vörösvértest nem javasolt, mivel a magas ozmotikus nyomás (60 mm Hg) erős a sejtekből a véráram felé irányuló viz kiáramlást eredményezne igy dehidratálná a beteg szöveteit. Ez a szempont korlátozza az SFH dózisát, igy a végső koncentráció megközelítően 6-8 gm Hgb/dl dózist biztosit.

Egy a kívánt P₅q visszaállítására irányuló kísérletben a kutatók 2,3-DPG-t adtak a hemoglobin oldathoz. Sajnos a 2,3-DPG hamar eltűnt a keringésből. A kutatók ezután más szerves foszfátokhoz, különösen a piridoxin foszfát felé fordultak. A 2,3-DPGhez hasonlóan ezek a vegyületek stabilizálják a Hgb T állapotát a két béta lánc N-terminálisai közötti sóhidak létrehozásán keresztül. Ezen piridoxilált hemoglobin 20-22 torr P₅q értékkel rendelkezik a 10 torr-os SFH-hoz és a 28 torr-os teljes vérhez képest. Mig ez előrelépést jelent az SFH-hoz képest, a piridoxilált Hgb nagy affinitásu marad a teljes vérhez képest.

C. A (nem polimerizáló) hemoglobin természetesen előforduló cisztein helyettesitésü mutánsai

Létezik a humán hemoglobinnak néhány ismert természetesen előforduló mutánsa, melyekben cisztein maradékkal helyettesítjük a normál hemoglobin Ao másik maradékát.

A hemoglobin Nigériában, a mutáció α 81 Ser -> Cis; diszulfid nem keletkezik. Haris et al. , Blood 55 (1):131-137 (1980). A hemoglobin Rainierben egy intraalegység keletkezik a vad tipusu F9 (93) Cisztein és a HC2 (145)β-nál a Tyr helyettesítésével bejuttatott cisztein között. Greer, et al., Natúré [New Biology], 230:261-264 (1971). A hemoglobin Nunobiki (β 141 Drg -> Cys) szintén egy nem polimerizáló cisztein helyettesítést jellemez. A hemoglobin Rainierben és a Hb Nunobikiben az uj cisztein maradékok a tetramer felületén vannak.

D. Természetesen előforduló polimerizáló vagy polimer hemoglobinok

Három másik humán mutánst ismerünk, melyek az intermolekuláris (az első tetramertől a második tetramerig) diszulfid hidak képződése eredményeként polimerizálódnak. A hemoglobin Porto Alegre-ben a Ser-t ( az A6(9)S-nál) cisztein helyettesíti és mivel ez a cisztein maradék externális orientációjú, spontán polimerizáció fordul elő és a három diszulfid kötéssel kapcsolódó

Porto Alegre tetramer dódekamerré való alakulását eredményezi.

• · · · · 4 « ···· ·♦·· » ν ·<

• · · «»«··< · · ·· ·« · «*»14» ⁴ - 11 -

Egy oktamert hoztak létre a Porto Alegre hemoglobin és egy normál hemoglobin 1:1 arányú keverésével. Tondo, Biochem. Biophys. Acta, 342:15-20 (1974); Tondo, An. Acad. Bras. Cr., 59:243-251 (1987).

A hemoglobin Mississippi-t a Ser CD3(44)B helynél egy cisztein helyettesítés jellemzi. Egy beteg hemolizátumait gélszüréses oszlop kromatográfiának vetették alá és 48.8 %-a élűéit az érvénytelen térfogatban. Mivel a molekulasúly exkluzió megközelítően 600 kD, ez azt sugallja, hogy a Hb MS polimerek 10 vagy több hemoglobin tetramerből állnak. Adams et al., Hemoglobin, 11(5):435-452 (1987).

Egy S83(EF7)Gly->Cys mutáció jellemzi a hemoglobin Ta Li-t. Ez a mutáns kis mobilitást mutat keményítő gél elektroforézis esetében, ami azt jelzi, hogy ez egy polimer.

Polimer egér hemoglobinokról is született már beszámoló. A BALB/cJ egerekben van egy reaktív ciszteinil maradék a béta lánc (β-13 az egérben) NH₂~terminálishoz közel. Ezt az egér mutánst hasonlították a Hemoglobin Porto Alegre-hez, mely hasonlóképpen rendelkezik egy ciszteinil maradékkal a béta lánc A-hélixében. Leggyakoribb az okotamer képződés. Azonban az egyes tetramerek két extra ciszteinil maradékkal rendelkeznek, az egyes béta láncon eggyel, mely reakcióba léphet különböző tetramerekkel; ez magyarázatot ad arra, hogy miért fordulnak elő oktamernél nagyobb aggregátumok. Benaventura and Riggs, Science, 149:800-802 (1967); Riggs, Scinece, 147:621-623 (1965).

Macaques szintén bemutat egy polimerizáló hemoglobin variánst. Takenaka, et al., Biochem. Biophys. Acta, 492:433-444 (1977); Ishimoto, et al., J. Anthrop. Soc. Nippon, 83(3):233-243 (1975) . Ezt a mutánst emberekben vetettük össze a Ta Li variánssal .

A kétéltűek és a hüllők is rendelkeznek polimerizáló hemog···· ·« · ··99 • · · · to · ·· • ♦ · · ···« · · · ·· ·* · ·««*4« ' - 12 lobinokkal. Például a kecskebékában a hemoglobin C komponens polimerizálódik tetramerek közötti diszulfid kötés létrehozásán keresztül. Azt állítják, hogy ez elsődlegesen az alfa lánc ciszteinil maradékaitól függ. Tam et al., J. Bioi. Chem., 261:8290-94 (1986) .

A földigiliszta (Lumbricus terrestris) extracelluláris hemoglobinja komplex szerkezetű. Tizenkét alegység van, melyek mindegyike dimer szerkezetű (abcd)2- ahol a, b, c és d a haemet tartalmazó fő láncot jelölik. Az a, b és c láncok egy diszulfid kötésű trimert hoznak létre. A teljes molekula 192 haemet tartalmazó láncból és 12 haemet nam tartalmazó láncból áll és molekulasúlya 3800 KDa. A többi gerinctelen hemoglobin is hatalmas sok alegységből álló protein.

A tengeri rák Artemia három polimer hemoglobint termel kilenc genetikailag fuzionált globin alegységgel. Manning et al., Natúré, 348:653 (1990). Ezeket két eltérő alegység típus , a és b£, különböző kapcsolódásai hozzák létre. A nyolc interalegység kötő közül hat 12 maradék hosszú, egy 11 maradék hosszúságú és egy 14 maradék hosszú.

E. Mesterségesen keresztkötött hemoglobinok (nem polimerizáló)

A hemoglobin tulajdonságait megváltoztatták az alfa láncok alfal Lys99-e és az alfa2 Lys99-e közötti specifikus kémiai keresztkötésével. Walder, U.S. 4,600,531 és 4,598,064; Snyder et al., PNAS (USA) 84:7280-84 (1987); Chaterjee et al., J. Bioi. Chem. 261:9927-37 (1986). A béta láncot is kémiai keresztkötésnek vetették alá. Kavanaugh et al., Biochemistry, 27:1804-8 (1988),

KAvanaugh megjegyezte, hogy a béta N-terminusok 16 Á távolságra vannak a T állapotban és 20 Á távolságra az R állapotban. Nem meglepő, hogy egy DIDS hid bejuttatása a T állapotú hemoglobin N terminusai közé megakadályozza az R állapotba való elmozdulást, igy csökkentve a molekula O₂ affinitását. Mig a Kavanaugh analóg kívánatos oxigén kötéssel és vese tisztítási tulajdonságokkal rendelkezik alacsony hozamban lehet kinyerni.

Hoffman és Nagai USP 5,028,588 azt állítják, hogy a hemoglobin T állapota stabilizálható interalegység (de nem intratetramer) diszulfid keresztkötésekkel, melyek a maradékok cisztein maradékokkal való helyettesítéséből származnak. Egy különösen előnyben részesített keresztkötés volt az, mely a béta Gly Cys-t kötötte össze az alfa G17-tel (Alá ->Cys) vagy a G18cal (Alá ->Cys).

F. Mesterségesen keresztkötött hemoglobin (polimerizáló)

Bonsen, USP 4,001,401, USP 4,001,200 és az USP 4,053,590 szabadalmai mind a vörösvérsejt eredetű hemoglobin kémiai keresztkötéssel való polimerizációjával vannak kapcsolatban. A keresztkötést bifunkcionális vagy polifunkcionális keresztkötő anyagok segítségével érték el, különösen olyanokkal, melyek reaktívak a globin láncok kitett aminocsoportjaival. A keresztkötéses reakció eredménye kovalensen kereszt-kötött aggregátumok polidiszperz készítménye.

Bonhard, USP 4,336,248 leírja a hemoglobin molekulák egymáshoz vagy szérum proteinekhez, mint az albuminhoz való kémiai keresztkötését.

• · · ···· ·« · · · • · · · · * · · · · · · • ·· ······ · ·· ·· · ··

- 14 Bonhard, USP 4,777,244 kidolgozta a dialdehid-kereszt-kötésü hemoglobinok stabilizálását, melyek tendenciát mutattak a tárolás alatti tovább polimerizálódásra, ha egy redukáló anyagot adtak hozzá az azometin kötés stabilizálása céljából.

Bucci, USP, 4,584,130 2. oszlop, azt a megjegyzést tette, hogy a polihemoglobin reakciótermékek különböző molekula típusok heterogén keverékét jelentik, melyek méretben és alakban is eltérőek. Ezek molekulasúlya 64,500 - 600,000 Dalton közötti. Az egyes molekula típusok szeparálása a heterogén keverékből gyakorlatilag lehetetlen. Továbbá, bár hosszabb retenciós időket kapunk in vivő, polihemoglobinokat használva ezek oxigén affinitása magasabb mint a sztróma-mentes hemoglobiné.

Tye szerint, USP 4,529,179, a legtöbben a hemoglobin random intermolekuláris keresztkötésü polimerjeit választják, mert úgy vélik, hogy a 65,000 Dalton méretű tetramert a glomerulusok kiszűrik... Általában a hemoglobin molekula felületén levő lizin amino csoportjai egy bifunkcionális reaktív anyaggal kapcsolódnak, mint pl. glutáraldehiddel vagy szuberimidáttal. 42 lizin vehet részt a reakcióban hemoglobin tetramerenként igy korlátlan számú különböző inter [vagy] intra molekuláris keresztkötés jöhet létre, a hemoglobin különböző polimerjeit hozva létre... A random polimerizációt nehéz szabályozni, és 2-10 tetramert eredményez polimerenként... Eddig senki nem standardizált analitikai sémát a szerkezet és funkció sokféle variabilitásának megállapítására.... [a polimerizált piridoxilált hemoglobin] az alapos kémiai heterogenitás megnehezíti gyógyszerészeti anyagként való vizsgálatát.

G. Fuzionált gének és proteinek, Általában

A gének egymáshoz fuzionáltathatók, az első gén stop kódonjának eltávolításával és annak a második génhez való kapcsolásával. A gének részei szintén fuzionáltathatók és a szakaszt fenntartó spacer DNS-ek toldhatók a fuzionált szekvenciák közé. A fuzionált gén terméke egy egyedüli polipeptid, nem pedig polipeptidek sokasága, mivel egy policisztronos operon expresszálja. lönböző géneket fuzionáltattak számos célból. így Gilbert, U.S. 4,338,397 patkány preproinzulin gént inzertált az E. coli penicillináz gén fragmentje után. Célja az volt, hogy az E. coli transzformánsokat a fuzionált gén expressziós termékének szekretálására irányítsa. Fuzionált géneket hoztak létre azért, hogy a nem antigenikus polipeptid már egy immunogenikus hordozó proteinhez konjugálva expresszálódhasson.

Ismeretes a kötő DNS szekvenciák két eltérő DNS szekvencia összekötésére való használata is. Ezeket a kötőket a DNS hasításhoz való restrikciós helyek biztosítására használják vagy egy egyedi tulajdonsággal rendelkező peptidek kódolására, melyek a kódolt fúziós protein vagy annak egy fragmentje tisztítását segítik elő. Lásd pl. Rutter, U.S. 4,769,326.

Hallewell, et al., J. Bioi. Chem., 264:5260-68 (1989) létrehozta a CuZn szuperoxid diszmutáz egy analógját. Az egyes diszmutáz molekulák két azonos alegységből álló dimerek; egy réz ion és egy cink ion kötődik az alegységhez. A dimer kölcsönhatás olyan erős a CuZn szuperoxid diszmutázban, hogy az alegységeket nem különítették el az enzim inaktiválása nélkül. Az enzim jelentős konformációs hasonlóságot mutat az immunoglobulinokkal; Hallewell, et al., két humán szuperoxid diszmutáz gént kapcsolt össze, közvetlenül, vagy egy 19 maradékból álló humán immunoglo• · · · • · · · • · · • · · · · · bulin IgAl sarok régiót kódoló DNS-sel, majd a fuzionált gént egy transzformált gazdában expresszálta. A közvetlenül kapcsolt gének expresszálásának megkísérlésében a rekombináció úgy következett be, hogy eltávolította a tandem gének egyikét néhány plazmid molekulában. Hallewell, et al., feltételezte, hogy a közvetlen összekapcsolás elfordítja a dimert, igy a hidrofób régiók kitetté vélnak és ez azután toxikus hatást eredményez. Ez szelekciós nyomást eredményezhetett volna, mely kedvez a gén deléciójának. Rekombinációt nem figyeltek meg az IgAl kötő szerkezettel kapcsolatban .

Hoffman, et al., WO88/09179, leírják a hemoglobin és analógjainak baktériumokban és élesztőgombában való termelését. A leirt analógok közé olyan hemoglobin proteinek tartoznak, melyekben az egyik komponens polipeptid lánc két alfa vagy két béta globin aminosav szekvenciát tartalmaz peptid kötéseken keresztül kovalensen kapcsolódva, előnyösen egy vagy több aminosavból álló közvetítő kötőn keresztül, elágazás nélkül. A normál hemoglobinban az alfa és a béta globin alegységek nem kovalensen kapcsolódnak .

A találmány összefoglalása

A találmány olyan multimer hemoglobin-szerű proteinekre vonatkozik, melyekben két vagy több tetramer vagy pszeudotetramer kovalensen kötődik. A kovalensen kapcsolódó tetramer párok bármelyike között a kovalens kötés keresztkötés formáját veheti fel a különböző polipeptid láncok cisztein maradékai között, vagy egy peptid kötőét, mely az egyik tetramer globin-szerü karboxi • · többségű maradékát köti össze egy második tetramer hasonló doménjének amino többségű maradékával

Előnyösen, a multimer hemoglobin-szerű proteint tartalmazó összetétel legalább 50 %-ban monodiszperz, még előnyösebben legalább 95 %-ban monodiszperz.

Bár a természetes forrásokból származó szabad hemoglobin polimerizálható kémiai keresztkötéssel a felezési idő növelése céljából a megnövekedett molekulasúlyon keresztül, valamint az ozmotikus nyomás csökkentése céljából, az összes ilyen készítmény heterogén. A monodiszperzitás csupán fáradtságos tisztítással érhető el.

A jelen találmány eszközöket biztosit a hemoglobin tetramerek polimerizációs foka feletti szigorú ellenőrzés gyakorlásához. A multimerek képződésének szigorú ellenőrzési képessége nagyban elősegíti a végtermék tisztítását és jellemzését, valamint csökkenti a kisebb alkotórészek irányába való káros reakciókat. Úgy véljük, hogy egy fokozottabban monodiszperz összetétel egy következetesebb klinikai hatást mutat.

A hemoglobin előállítható az alfa és a béta globin gének azonos vagy eltérő gazdasejtekben való expressziójával, majd az expresszált alfa és béta globinok ezt követő haemmel való összeállításával a hemoglobin létrehozása céljából. Mig a megfelelő Cys kódon mutációk bejuttatása kedvez a keresztkötésü multimer hemoglobin termelésének, az expressziós termék általában nem lesz alapvetően monodiszperz. A hemoglobin két alfa és két béta globin alegységből áll. Az alfa globin alegységek eredetileg egy egyedüli alfa globin génből expresszálódnak és a béta globin alegységek egy egyedüli béta globin génből. így, ha egy egyedüli Cys kódon szubsztitúciót tartalmazó alfa globin gén expresszálódik, az összeállított tetramer két alfa globin alegységet fog

- 18 tartalmazni mindegyikben egy keresztkötésben részt vehető Cysszel. Egy Cys keresztkötődhet egy második tetramerhez, a másik egy harmadikhoz, igy egy több tagú oligomer képződését eredményezi .

Egy megvalósulásban, a multimer protein egy alapjában véve két kovalensen keresztkötődo tetramerből álló oktamer. A nem kívánatos polimerizáció elkerülése céljából mindegyik tetramer csupán egy egyedül részt vevő ciszteinil maradékot tartalmaz, melynek tiol csoportjai vagy egymással reagálnak (oxidáló körülmények között, diszulfid kötést létrehozva) vagy egy tiolreaktiv keresztkötő anyaggal, a keresztkötés létrehozása célj ából.

A két globin-szerű domént tartalmazó egyedüli polipeptidet kódoló fuzionált gén mutáltatható oly módon, hogy egy külső keresztköthető Cyst biztosítson a kapott pszeudodimer polipeptidek két máskülönben azonos doménjének csupán egyikében. Ez a pszeudodimer állítható össze a komplementer alegységekkel az egyedüli ciszteint tartalmazó tetramer létrehozása céljából. Két ilyen tetramer végül keresztköthető az oktamer nyerése céljából, előnyösen alapjában véve monodiszperz formában.

Ha többtagú multimer mint pl. a dódekamer képződését tervezzük, a pszeudotetramer összetevők - melyek mindegyike rendelkezik egy egyedüli externálisan keresztköthető ciszteinnel kovalensen kapcsolódnak a polifunkcionális keresztkötő egy reaktív helyéhez, igy megfelelő felezési idővel rendelkeznek a véráramban.

Két vagy több pszeudotetramer keresztkötése helyett egy multimer hemoglobin nyerésének egy másik módja pszeudodimer alegységeik egyesítése egy egyedüli pszeudooligomerré, melyben részt vesz a multimer hemoglobin minden pszeudotetramer komponen ·· * ♦· ·· • · · · · » ······· * • ·· ······ * · ·· ·« · ····«« ‘ - 19 se. Például egy peptid kötésekkel kovalensen kapcsolódó (tipikusan egy peptid spacerrel) nyolc alfa globin-szerü domént tartalmazó pszeudooktamer polipeptid összeállítható nyolc egyedüli béta globin-szerü alegységgel egy tetra-tetramer humán hemoglobinszerű protein létrehozása céljából. A többtagú multimerek létrehozhatók a megfelelő pszeudooligomer egyszerű expresszálásával majd a komplementer monomer alegységekkel való összeépítéssel.

A multimer hemoglobinok genetikailag fuzionált pszeudooligomer gerinccel való előállítása elkerüli a kémiai keresztkötés hátrányait. Ez utóbbi eredménytelen és gyakran a hemoglobin oldat oxigénelvonását teszi szükségessé valamint egy másik molekula jelenlétét (pl. inozitol hexafoszfát vagy 2,3-DPG) a verseny reakciók elkerülése céljából.

A fent megvitatott megvalósulásban egy alapjában véve monodiszperz multimer hemoglobint nyerünk ha az externálisan keresztköthető ciszteinek számát egyre korlátozzuk tetramerenként. Azonban lehetőség van arra, hogy egynél több externális keresztköthető cisztein legyen tetramerenként, feltéve hogy helyzetük olyan, hogy miután egy idegen tetramerhez kötődött az egyik, más idegen tetramerek szférikusán gátolva vannak az eredeti tetramer fennmaradó ciszteinjeihez való keresztkötéstől.

A találmány multimer proteinjei, különösen magasabb polimerizációs szinteken, meghosszabbíthatják a rekombináns hemoglobin felezési idejét az érből való kilépés és a disszociált alegységek glomerulásris szűrésének csökkentése révén in vivő a natív humán hemoglobinhoz viszonyítva. A felezési időre, mint a makromolekuláris méret funkciójára vonatkozó tanulmányok azt jelzik, hogy összefüggés van a megnövekedett méter és a megnövekedett keringési felezési idő között a kémiailag keresztkötött Hb valamint más makromolekulák esetében. Előnyösen, emberekben, a felezési idő meghaladja a 9 órát az 1 gm/kgm testsúly dózisok esetében. Ez várhatóan megfelel a kb. 3 órás felezési időnek olyan patkányok esetében, melyek összehasonlítható dózist katak.

Az intravasculáris retenció is fokozható a tetramer keresztkötődő helyek oly módon való manipulálásával, hogy a tetramerek haptoglobin kötő helyeit teljesen vagy részben elzárjuk. Független mutációk is végezhetők a haptoglobin kötés szférikus gátlására, vagy az olyan anyagok közelítésének elektrosztatikus hárítására vagy szférikus akadályozására, melyek bontják a keresztkötést .

A találmány multimer proteinjei növelhetik a daganatos nyomást is, mivel az oxigén kötő haem csoportok száma n tagú politetramerenként n-szerese a tetramenrenkénti számnak. A mérettől függetlenül az daganatos nyomás politetramer Hb oldatban levő haem csoportok egy adott koncentrációja esetében várhatóan (1/n)-szerese a tetramer Hb-ben levő haem ekvimoláris oldatában lavőnek. A daganatos nyomás miatt a véráramba juttatható szabad tetramer Hb maximális koncentrációja kisebb a térfogathoz viszonyított alapon, mint az érintetlen vörösvérsejtben normálisan szállított Hb koncentrációja. A daganatos nyomás csökkentése ezért hasznos a vérpótló készítmény térfogatonkénti oxigén szállító kapacitásának növeklése szempontjából.

Egy előnyben részesített megvalósulásban, egy vagy több globin-szerű dómén tartalmaz olyan mutációkat, melyek csökkentik a hemoglobin analóg oxigén kötő affinitását oldatban, abból a célból, hogy megközelítsük a teljes vér oxigén-kötő tulajdonságait .

A rajzok rövid leírása

1. ábra A pSGEl.lE4 plazmid. Ez a plazmid egy policisztronos operont hordoz, mely a pTAC promótert, valamint egy di-alfa globint és egy béta globint kódoló gént tartalmaz. Hordoz tetraciklin és ampicillin rezisztencia géneket is és a lacl gént.

2. ábra A (des-Val)-alfa-(Gly)-alfa és des-Val béta globin expressziójára szolgáló előnyben részesített szintetikus gén szekvenciáját [1. számú szekvencia] mutatja. Ezt a gént a pSGEl.lE4 hordozza. A a Shine-Delgarno riboszóma kötő helyeket (SD#1 és SD#2) tartalmazó régiót (EcoRI - PstI), az oktapeptidet (Met...Glu) expresszáló, kotranszlációs couplerként szolgáló szekvenciát (25. számú szekvencia), valamint két majdnem azonos alfa globin-szerű peptidet kódoló szekvenciát és a kőzbetoldott Gly-Gly kötőt muutatja. Az első alfa globin szekvencia

Met-Leu-val kezdődik, azaz egy mesterségesen létrehozott változással metionint tartalmaz, kihagyja a valint, mely normálisan az érett alfa globin első maradéka és a második maradékkal a leucinnal folytatódik. A maradékokat 1-141-ig számoztuk (26. számú szekvencia). A második alfa globin szekvencia Val-Leu-val kezdődik, közvetlenül az aláhúzott Gly-Gly kötő után. A maradékokat 1' - 141'-vei jelöltük (27. számú szekvencia). A start és stop kódonokat aláhúztuk. B a des-Val béta globin kódoló szekvenciáját tartalmazó (Pst - Hindin) analóg régiót mutatja. A béta maradékokat 1 -146-ig számoztuk (28. számú szekvencia). Az A és a B a PstI helynél kapcsolódnak egy egyedüli policisztronos operon létrehozása céljából. Ha egy 3 betűből álló aminosav kódot egyszer aláhúzunk, azt jelzi, hogy a ····«· · • · · · ···· · · · ·· ·· · ·* ···· * - 22 maradék, egy potenciális hely a Xaa -> Cys mutációhoz, egy keresztkötődő hely biztosításához. A mutációkat aszimmetrikusan kell elvégezni, azaz a di-alfa vagy di-béta gén csupán egy régiójában, igy csupán egy keresztkötést adunk tetramerenként. Mig, a 2. ábrában a helyeket csupán az alfa gén első kópiáján jelöltük, ezek lehetnek a második kópián is. A kényelem kedvéért a megfelelő béta globin mutációs helyeket is megjelöltük. Azonban, ezeket a mutációkat egy di-béta globin gén csupán egyik béta globinjában szabad elvégezni.

A kettős vonallal aláhúzott aminosav kódok olyan helyeket jelölnek, ahol a két diszulfid kötés (vagy alegységenként) képződése szférikusán gátolható, igy egy di-alaf vagy egy di-béta szerkezet használata nem szükséges.

Azokat a maradékokat, melyek a haptoglobin kötés gátlására szolgáló mutációk feltételes helyei bekereteztük.

3. ábra a pszeudooktamer Hgb egy formájának stilizált képviselője, ahol az oktamer hemoglobin egy aszimmetrikus dialfa Hgb két molekulájának kötődésével vagy keresztkötődésével jön létre.

4. ábra (a) négy vagy (b) hat Hgb tetramer összekapcsolásához megfelelő felcsavart keresztkötőket mutat.

5. ábra Sematikusan mutatja be, hogyan segíthetik a cisztein mutációk az oktamer képződést az alegységek genetikai fúziója nélkül.

«··· ·· · ·9 ·*

9 9 9 φ * · · ···««·· · • · « 9 9999 9 9 9 *· *« < 99 9999

6. ábra A feltételezett alfa^-béta-L globin pszeudodimer.

Az előnyben részesített megvalósulások részletes leírása

Meghatározások

Egy hemoglobin olyan protein, mely haemet (ferroprotoporfirin IX) tartalmaz és ez a respirációs felületen (bor, kopoltyú, trachea, tüdő, stb) oxigént köt és az oxigént a belsőbb szövetekhez szállítja, ahol az felszabadul és az anyagcserében felhasználásra kerül. A természetben az alacsonyabb molekulasulyú hemoglobinok (16-120 kilodalton) találhatók a keringő vörösvér sejtekben, mig a nagyobb polimer hemoglobinok szabadon keringenek a vérnyirok vérében.

A csatolt igénypontok céljaihoz egy hemoglobin-szerű protein egy a következő tulajdonságokkal rendelkező protein:

(a) kellőképpen oldódik vérben ahhoz, hogy klinikailag használható vérpótló anyagként szolgálhasson;

(b) reverzibilisen köti az oxigént fiziológiás körülmények között ;

(c) mindegyik polipeptid lánc tartalmaz legalább egy globin-szerü domént (ahogy azt a későbbiekben meghatároztuk) és, (d) mindegyik globin-szerü dómén hordoz (vagy képes beépíteni) egy haem prosztetikus csoportot;

• ••· ·· · · ’ · · • · ·· · ·· · • · ···· · · • · · ······ · · • · · · · · · ····

A multimer hemoglobin-szerű proteint a továbbiakban a következők jellemzik:

(e) két vagy több polipeptid láncból áll;

(f) két vagy több tetramerből áll, az egyes tetramerek négy globin-szerü domént tartalmaznak és (g) az egyes tetramer alkotók kovalensen kapcsolódnak legalább egy másik tetramer alkotórészhez.

Előnyösen a találmány hemoglobin-szerű proteinjei 2-45 torr P₅q értékűek, még előnyösebben 24-32 torr 37 °C hőmérsékleten vérben. Előnyösen mutatnak valamilyen kooperációs fokot is. Kívánatos, hogy legyen intravasculáris retenciójuk is, legalábbis a normál humán hemoglobinéhoz hasonlítható vérpótló anyagként alkalmazva.

A tetramer hemoglobin-szerű proteinek négy globin-szerü doménnel rendelkeznek, az oktamer hemoglobin-szerű proteinek nyolc globin-szerü doménnel és igy tovább. A multimer fogalom bármely olyan hemoglobin-szerü proteinre vonatkozik, mely (4 x n) globin-szerü domént tartalmaz, ahol n>l.

Egy pszeudomer hemoglobin-szerü protein olyan protein ahol a globin-szerü domének száma nagyobb, mint az alkotórész polipeptid láncok száma, azaz legalább egy lánc tartalmaz legalább két globin-szerü domént. A pszeudoheterotetramer hemoglobin-szerü proteinek például állhatnak (a) egy di-alfa globin-szerü és két béta globin-szerü polipeptidből, (b) két alfa globin-szerü és egy di-béta globin-szerü polipeptidből, (c) egy di-alfa globin-szerü és egy di-béta globin-szerü polipeptidből, (d) egy fuzionált ···· · ♦ · · ······· · • ·· ······ · · * - 25 alfa/béta globin-szerü polipeptidbol és egy különálló alfa és béta globin-szerü polipeptidbol, vagy (e) két fuzionált alfa/béta globin-szerü polipeptidbol. A tetramer fogalma magába foglalja a pszeudotetramereket.

Egy genetikailag fuzionált hemoglobin egy olyan hemoglobin-szerü protein, mely tartalmaz legalább egy genetikailag fuzionált globin-szerü polipeptidet, (globin pszeudooligomer), ez utóbbi tartalmaz két vagy több globin-szerü domént, melyek lehetnak azonosak vagy eltérőek és melyek közvetlenül kapcsolódnak vagy aminosav vagy peptid kötőkön keresztül. Egy di-alfa globin-szerü polipeptid olyan peptid, mely tartalmaz alapjában véve két az első alfa-globin-szerű polipeptid (dómén) normális C-terminusa és egy második alfa-globin-szerü-polipeptid (dómén) N-terminusa között levő peptidkötéssel összekapcsolt alfa-globin-szerü polipeptid szekvenciákat (doméneket). Ez a két szekvencia lehet közvetlenül kapcsolt vagy egy vagy több aminosav peptid kötőjén keresztül kapcsolt; a peptid kötés fogalma mindkét lehetőséget magába foglalja. Az N- és a C-terminusnál a peptid köréstől eltérő (DIDS-szel) módon keresztkötött alfa globin láncok nem di-alfa globinok. A di-alfa globin-szerü polipeptid képes kell legyen a béta globinnal való összehajlásra és a haem beépülésére a funkcionális hemoglobin-szerü protein létrehozásához. A di-béta globin-szerü polipeptid analóg módon határozható meg. A csupán az egyik alkotórész doménben mutációval rendelkező di-alfa vagy di-béta globin-szerü polipeptidet hívjuk aszimmetrikusnak.

Lehetséges egy alfa/béta-globin-szerü pszeudodimer biztosítása is, ahol egy alfa globin-szerü szekvenciát kapcsolunk peptid kötésekkel egy béta globin-szerü szekvenciához. Erre az alfa/béta globin-szerü polipeptid és a di-alfa és di-béta • · a · • a · a a a a • ·· ······ · • · «* a ·a globin-szerü polipeptidekre kollektiven hivatkozhatunk pszeudodimer globin-szerű polipeptidekre vagy diglobinokra. Kibővítve, egy di-alfa, egy di-béta vagy egy alfa/béta globin-szerü polipeptidet tartalmazó hemoglobin-szerű protein egy pszeudotetramer .

Az egyedüli externális keresztköthető ciszteint hordozó pszeudotetramerekre rövidítésként mono-cys molekulákként lehet hivatkozni. Azonban, ezt nem úgy kell értelmezni, hogy a tetramer nem tartalmaz más ciszteineket. Egy mono-cys pszeudotetramer csupán olyan tetramer, mely csak egy egyedüli ciszteinnel rendelkezik, mely viszont jelentős fokig vehet részt a keresztkötéses reakcióban egy második pszeudotetramer cisztein maradékával.

Egy hemoglobin-szerű proteint heteromernek neveznek ha legalább két globin-szerü doménje eltérő. Mivel a hagyományos humán hemoglobin két alfa globinból és két béta globinból áll, egy heterotetramer. Egy multimer humán hemoglobin-szerű protein egy olyan heteromer, melyben mindegyik tetramer vagy pszeudotetramer két humán alfa globin-szerü doménnel és két hűmén béta globin-szerü doménnel rendelkezik.

A globin-szerü dómén.

A globin-szerü domének nem szükségszerűen, de lehetnek azonosak polipeptid lánconként, és nem kell hogy pontosan megfeleljenek szekvenciájukban a normál humán hemoglobin alfa és béta globinjainak. Sőt, mutációkat hajthatunk végre a hemoglobin oxigén affinitásának (vagy kooperativitásának, vagy pH, só, hőmérséklet vagy más környeztet! paraméterektől való függőségének) megváltoztatására vagy stabilitásának (hőre, savra, lúgra vagy más denaturáló anyagra) megváltoztatására, a genetikai fúzió

• · vagy keresztkötés elősegítése céljából, vagy az egyedi láncok expressziójának és összeépítésének megkönnyítése céljából. Az itt biztosított bizonyos tipusu mutációkhoz az útmutatást, pl. Hoffman and Nagai, (U.S. Patent 5,028,588 és 07/443,950 sorozatszám) leírását az irodalmi hivatkozás révén a találmányba építettük. A találmány továbbá magába foglal olyan molekulákat, melyek önkényes mutációkban térnek el az itt bemutatottaktól, melyek nem befolyásolják lényegesen a biológiai aktivitást.

Egy globin-szerü dómén egy polipeptid dómén, mely alapjában véve homológ a természetesen előforduló hemoglobin egy globin alegységével. Egy gerinces, emlős vagy humán globin-szerü dómén olyan dómén, mely alapjában véve homológ sorrendben egy természetesen előforduló gerinces, emlős vagy humán hemoglobin egy globin alegységével.

Egy humán alfa globin-szerü dómén vagy polipeptid egy natív humán alfa globin vagy annak egy olyan mutánsa, mely a natív szekvenciától egy vagy több helyettesítésben, delécióban vagy inzertációban tér el, mig alapjában véve homológ marad (ahogy azt ezekután meghatározzuk) a humán alfa globinnal, valamint továbbra is képes a haem beépítésére és a béta globinnal való összekapcsolódásra. A humán alfa globin-szerü dómén kifejezés célunk szerint magába foglalja az azokra való korlátozás nélkül a természetesen előforduló humán alfa globinokat, ideértve a normál humán alfa globint. Egy béta globin-szerü domént vagy polipeptidet analóg módon határozunk meg. Az állati hemoglobinok vagy ezek mutánsainak olyan alegységeit, melyek kellőképpen homológok a humán alfa vagy béta globinnal beleértjük a humán alfa vagy béta globin-szerü dómén vagy polipeptid fogalmába. Például a szarvasmarha hemoglobin alegységei beletartoznak ezen fogalmak körébe.

• ·

Annak meghatározásában, hogy egy polipeptid alapjában véve homológ-e az alfa (vagy béta) globinnal, a szekvencia homológra egy fontos de nem kizárólagos kritérium. A szekvencia hasonlóság meghatározható hagyományos algoritmusokkal, melyek tipikusan megengednek egy kis számú rést a legjobb megfelelés elérése céljából. Egy humán alfa-globin-szerű dómén tipikusan legalább 75 %-os szekvencia azonosságot mutat a vad tipusu humán alfa globinnal, valamint a humán béta globinnál nagyobb homológiát a humán alfa globinnal. Azonban, egy kisebb szekvencia azonossággal rendelkező polipeptid még mindig tekinthető alapjában véve homológnak az alfa globinnal, ha nagyobb szekvencia azonossággal rendelkezik, mint ami a véletlenből várható, valamint ha rendelekzik az alfa globin jellegzetesen magasabb szerkezetével (pl. a mioglobin haj lássál, a haem beépítésének képességével és oxigén-kötő aktivitással, (megjegyzendő, hogy ahogy már említettük, az oxigén affinitásbeli (P50), intravasculáris retencióban, vagy a kooperativitásban bekövetkezett változás kívánatos lehet és nem teszi a mutánst nem homológgá, ha az még mindig hozzájárulhat a reverzibilis oxigén-kötési aktivitáshoz.) Összehasonlításként, az Artemia haem-kötő doménjeit homológnak tekintjük a mioglobinnai, bár a primer szekvencia hasonlóság 27 %-nál nem nagyobb, ahogy a haem-kötő domének konzervált maradékaik körül és az egyéb hemoglobinokban konzervált maradékok sorbanállnak, (azaz részt vesznek a haem kapcsolatban vagy a helikális szegmentek egymáshoz való viszonyának meghatározásában) azt sugallja, hogy az Artemia domének a klasszikus A -H globin hélixekkel rendelkeznek, megfelelő fordulóikkal, akárcsak a különböző konzervált globin család maradékok. A szerin proteáz inhibitorok között, vannak olyan protein családok, melyekről kitudódott, hogy homológok, melyekben vannak olyan párok, melyek 30%-nál kisebb • 4·4 ·· · · · · · • 4 · · 4··· ·· ···· · · • ·· ······ · · ·· 44 · ·· · · · ·

- 29 szekvencia homológiával rendelkeznek.

Több mint 100 humán hemoglobin mutáns ismert érintve mind az alfa és a béta láncokat; és ezen mutációk oxigén-kötésre és a hemoglobin más tulajsdonságaira kifejtett hatása ismert. A humán alfa és béta globinok 84 pozícióban térnek el egymástól. Azonkívül, a globin szekvenciában levő tipusközi eltéréseket kimerítően tanulmányozták. Dickerson, (Hemoglobin: Structure, Function, Evolution and Pathology eh. 3 (1983) arról számolt be, hogy 1982-ben a 60 ismert gerinces alfa globin 141 pozíciójából 23 azonos maradékkal rendelkezett, mig a figyelembe vett 66 gerinces béta globin 146 aminosavjából 20 volt azonos. A 60 gerinces mioglobin, melyek szintén a globin családba tartoznak, 27 állandó aminosavat tartalmaznak a 153 pozícióból. Ha csupán az emlősöket vesszük figyelembe, az állandó aminosavak száma az alfa globinok esetében 50/141; a béta globinok esetében 51/146 és a mioglobinok esetében 71/153. Az állandó pozíciók a molekula aktivitási központja köré gyűlnek: a haem réshez és az alegységek közötti kapcsolatokhoz. A változó aminosavak közül a konszenzus szekvenciától a figyelembe vett típusok csupán egy kis frakciója tér el.

A teljes eltérések száma a humán alfa globin és más szelektált gerinces alfa globin között a következő: rhesus majom (4), szarvasmarha (17) , kacsacsőrű emlős (39), csirke (35), humán zeta (embrionális) (61), ponty (71) és cápa (88) . A gerinctelen globinok esetében az eltérés tengeri orsóhalnál (124) és a Chironomus (muslica) esetében (131). A béta globin családhoz fordulva a humán béta globin más gerinces béta globinoktól való eltérése rhesus majomnál (8), a humán delta globinnál (10), szarvasmarha béta globinnál (25), szarvasmarha gamma globinnál (33), humán gamma globinnál (39), humán epszilon (embrionális) globinnál (36), kacsacsőrű emlősnél (34), csirkénél (45) cápánál • · ···· · ♦ • ·· ······ ♦ · ·· ·· · ·♦ ···· (96), tengeri orsóhalnál (123), kagylónál (127), Glycera esetében (125) és a Chironomus esetében (128).

Ezek közül az eltérések közül sok félrevezető lehet - a változó aminosavak csak konzervatív helyettesítést mutathatnak az egy aminosav másik, funkcionálisan azonosra való cseréjénél. A konzervatív helyettesítés egy olyan helyettesítés, mely nem szünteti meg a globin-szerü polipeptid (vagy dómén) azon képességét, hogy haemet építsen be és hogy az alfa és béta globin alegységekkel összekapcsolódva egy tetramer (vagy pszeudotetramer hemoglobin-szerü proteint hozzon létre összhangban maradva annak meghatározásával, valamint reverzibilisen kösse az oxigént. A következő források használhatók a konzervatív helyettesítések (és deléciók vagy inzertációk) azonosítására:

(a) a funkcionális hemoglobin mutánsok adatai (több mint 100 ilyen mutáns létezik), (b) a gerincesek, különösen az emlősök alfa és béta globinjai között előforduló szekvencia variációk adatai;

(c) a gerincesek, különösen az emlős mioglobinok szekvencia variációinak adatai;

(d) a gerincesek és a gerinctelenek globinjai, vagy a gerinctelenek globinjai közötti szekvencia variációk adatai;

(e) a humán hemoglobin és más oxigén-kötő proteinek háromdimenziós szerkezetének adatai, valamint molekuláris modellező software-ek a szekvencia változások ilyen szerkezetekre kifejtett hatásának felbecsüléséhez; és (f) a homológ proteinek (nem korlátozódva csupán a globin családra) családjának tagjai közötti aminosav változások gyakoriságának adatai. Lásd Schulz és Schirmer 1-2 Táblázatát (Principles of Protein Structure, Springer-Verlag: 1979) és Creighton 3-9 ábráit (Proteins: Structure and Molecular Properties (W.H. Free« β • · «

• · ·· «

···· mán: 1983) .

Míg az (a) - (d) adatok a leghasználhatóbbak a variációs helyeknél levő tolerálható mutációk meghatározására a rokon proteinekben, hasznos lehet a molekulában más analóg helyeken a tolerálható mutációk azonosításában is. Az (f) kategória adataira alapozva a következő csere csoportok azonosíthatók, melyeken belül az aminosavak helyettesítései gyakran konzervatívak:

I kis alifás, nem poláros vagy enyhén poláros maradékok Alá, Ser, Thr, (Pro, Gly)

II negatív töltésű maradékok és amidjaik - Asn, Asp, Glu, Gin

III pozitív töltésű maradékok - His, Arg, Lys

IV nagy alifás nem poláros maradékok - Met, Leu, Ile, Vas, (Cys) nagy aromás maradékok - Phe, Tyr, Trp.

Három maradékot beszúrunk, a protein építésben való különleges szerepük miatt. A Gly az egyetlen oldallánc nélküli maradék, ezért rugalmasságot biztosit a láncnak. A Pro szokatlan geometriájú, mely erősen korlátozza a láncot. A Cys részt vehet az olyan diszulfid kötésekben, melyek a proteineket egy sajátságos összecsavarodásban tartják. Megjegyzendő, hogy Schulz és Schimer az I és II csoportokat egybeolvasztaná. Az is figyelemreméltó, hogy a Tyr, hidrogénkötő potenciálja miatt valamelyest rokonságban van a Ser-nel, Trh-rel stb.

Általánosságban, a funkcionalitást kevésbé befolyásolják a felszíni maradékokon való mutációk, legalábbis azoknál nem, melyek nem vesznek részt sem a haem résben, sem az alegység kapcsolódásokban. Azonkívül az alfa hélixeket összekötő hurkok, • · « · ·· ···· valamint az amino vagy karboxi terminusok sokkal toleránsabbak a deléciókkal és az inzertációkkal szemben.

A Met FX alfa globin egy N-terminális metionint, az Xa Faktorhoz egy felismerő helyként működő oligopeptidet (pl. IleGlu-Gly-Arg)(2. számú szekvencia), valamint a vad tipusu alfa globinnak vagy ahogy a találmányban leírjuk egy mutánsának megfelelő alfa globin-szeru szekvenciát (pl. Val-HIs-Leu-ThrPro..)(3. számú szekvencia) tartalmazó alfa globin-szeru polipeptid. A Met Fx alfa globint néha FX alfa globin-ként rövidítjük. Az FX béta globin egy analóg módon meghatározott béta globin-szeru polipeptid.

A Met alfa globin egy olyan alfa globin-szeru polipeptid, mely egy extra N-terminális metioninnal rendelkezik. A második aminosav valin, mely az érett vad tipusu alfa globin első aminosava. A Met-béta globint hasonlóan határozzuk meg. A Des-FX alfa globin (vagy a dFX alfa globin) egy olyan Met-alfa globin gén, melyet az FX kódonok Met-FX alfa globin génből való kimetszésével nyertünk. Említésre méltó, hogy a Met-Hgb fogalmát a metionilalfa globinból és a metionil-béta globinból létrehozott metionil Hgb-re való utaláshoz használjuk.

A Des-Val-alfa globin (vagy dVal alfa globin) egy olyan alfa globin-szeru polipeptid, melyben a valint metioninnal helyettesítjük , ami az érett vad tipusu alfa globin szekvenciáját kezdi. A Des-Val-béta globint hasonlóképpen definiáljuk. A DesVal-alf a/alf a globin (di-Des-Val-Alfa globin) egy di-alfa globin, melyben egy Des-Val-alfa szekvenciát kapcsoltunk egy megfelelő peptidil kötőn keresztül egy olyan alfa globin-szeru szekvenciához, mely Val-lal kezdődik.

···· ·· « » · «» ···· ♦ » · * • ·· ······ · · ·· ·« · ·· ·«·♦

- 33 Kis affinitásu mutánsok.

A kis affinitású hemoglobin-szerű protein egy olyan hemoglobin-szerű proteire utal, melynek a P₅q értéke azonos körülmények között legalább 10 %-kal nagyobb, mint a sejtmentes normál hemoglobin Aq P₅q értéke. Előnyösen a protein, ha vérpótlószerként használjuk, alacsony affinitású proteinnek minősül, még előnyösebben P 59 értéke közelebb van a teljes vérsejt P5Q értékéhez, mint a sejtmentes hemoglobinéhoz.

A kis affinitású mutáns hemoglobinok, azaz azok, melyek jobbra tolódott oxigén egyensúlyi kötő görbékkel rendelkeznek a sejtmentes normál hemoglobinhoz viszonyítva, sokféleképpen hasznosíthatók. Leginkább említésre méltók azok a mutáns hemoglobinok, melyek a teljes vörösvérsejtekhez hasonló oxigén affinitással rendelkeznek, ezek oxigén-szállító transzfúziós pótlékokként használhatók az adott vörösvérsejtek helyett, csökkentve a fertőzés veszélyét és az ellátási problémákat enyhítve. A sejtmentes natív humán hemoglobin nem funkcionálhat transzfúziós pótlóként, egyebek között azért, mert az oxigén túl erősen kötődik hozzá. Ezenkívül, azért, mert a sejtmentes hemoglobin oldatok esetében nem szükséges, hogy kereszt illeszkedjenek, valamint elvárás velük szemben, hogy eltarthatóságuk nagyobb legyen, mint a teljes véré, az alacsony affinitásu hemoglobin oldatok széleskörűen használhatók olyan helyzetekben ahol a teljes vér transzfúzió nem valósítható meg, pl. mentőkocsiban vagy a harctereken. A vörösvérsej teknél is alacsonyabb oxigén affinitásu mutáns hemoglobinok valójában még hatékonyabban tudják az oxigént szállítani számos esetben. A teljes vérnél valamivel magasabb (azonban a sejtmentes natív humán hemoglobinnál alacsonyabb affinitású) ···· ί» 4 · · ·«

V 4 4 »·*· • 44 ···«·· · · •· «· · 44 ····

- 34 oxigén affinitású mutáns hemoglobinok még mindig megfelelő transzfúziós pótlóként funkcionálhat és valójában bizonyos esetekben sokkal hatékonyabban szállíthatja az oxigént mint a vörösvérsejtek. Ez azért van igy, mert az oxigén közvetlenül szabadul fel a plazma formájú hemoglobin-alapú oldatokba, anélkül, hogy szükség lenne a vörösvérsejtek membránján való diffúzióra, valamint a sejtmentes hemoglobin olyan régiókba vándorolhat, ami a vörösvérsejtek számára nem hozzáférhetők. Példaként, a kis affinitású mutáns hemoglobintól elvárjuk, hogy koszorusér levegős érplasztikás eljárás alatt hatékonyan szállítsa az oxigént, mikor a vörösvérsejtek keringését az ilyen eljárások alatt gátoljuk. A kis affinitású mutáns hemoglobin hasznos lehet perfúziós komponensként is a szerv tartósításban a transzplantációt megelőzően vagy emlős sejt tenyészet adalékaként.

A lehetséges kis affinitású mutánsokat részletesen megtárgyaljuk a nem korlátozó célú példákon keresztül, valamint Hoffman et al. (US. Patent 5,028,588 számú szabadalom) 1. Táblázatában (természetes kis affinitású hemoglobin mutánsok) és 2. Táblázatában (a nem természetesen előforduló kis affnitású hemoglobin mutánsok lehetséges jelöltjei). Az érdeklődésre különösen számot tartó kis affinitású mutánsok a Presbyterian (béta Lys¹⁰⁸) Béta Phe®⁸, béta Ile®^ és a Kansas (béta Thr^^^) mutánsok.

A hemoglobin oxigén kötő tulajdonságaiban bekövetkező váratlan és meglepő változást figyeltünk meg, ha az N-terminális valint metioninnal helyettesítettük. A vérből tisztított hemoglobin Aq P₅₀ értéke 4.03 N=2.8 25 °C hőmérsékleten mérve. Az E. coli-ban termelt DesFX-Hgb az Αθ-lal azonos hemoglobin, (azzal az eltéréssel, hogy egy metionint adtunk az alfa és a béta láncok N-terminálisához), alapvetően azonos P^q és N értékekkel rendel kezik. így a metionin hozzáadása a szomszédos valin maradék • · · · • · β ······ · * ·· ·· · ·« ····

- 35 megváltoztatása nélkül kis hatással van, vagy nincs is hatással az oxigén kötésre. Másrészt viszont magasabb Ρςθ értéket (6.6) figyeltünk meg az E. coli-ban termelt desVal-hgb, egy olyan hemoglobin esetében, ahol a normális N-terminális valint az egyes láncokon metioninnal helyettesítettük. A kooperativitás, ahogy azt N-nel mértük, gyakorlatilag azonos volt midhárom molekula esetében.

Hasonló összehasonlítást végeztünk két hemoglobin esetében, melyek mindegyike tartalmazott egy Presbyterian mutációt, az egyiket E. coli-ban, a másikat élesztőgombában termeltük. Az E. coli hemoglobint Des-Val alfa lánccal szerkesztettük meg, azaz az N-terminusnál a normál valint metionin helyettesítette. Az oxigén kötést P₅₀=19.8, N=2.5 jellemezte 25 °C hőmérsékleten, valamint P₅q=34.5 és N=2.5 27 °C hőmérsékleten. A megfelelő élesztőgomba kódoló régió egy hozzáadott metionin kódonnal kezdődik a normál valin kódon előtt. Mivel ezt a kezdeti metionint eltávolítjuk a transzláció után in vivő, a tisztított hemoglobin egy normál Nterminális valinnal rendelkezik. Ezen molekula esetében, a P₅q=23 - 25 és N=2.5 37 °C hőmérsékleten mérve. így a fenti esetekben egy N-terminális valin N-terminális metioninra való cseréje megnövelte a P50 értéket. Fiziológiás körülmények között azt várjuk, hogy az E. coli-ban termelt genetikailag fuzionált Presbyterian hemoglobin 20-30 %-kal több oxigént fog szállítani, mint az élesztőgombában termelt hasonló hemoglobin, megváltoztatott N-terminusával.

Nagy affinitású mutánsok • 444 4* ··*>

• « V 4 ♦ · ·· ···*··· · • 4 4 · ··>·· · ·« ·· 4 ······

A nagy affinitásu hemoglobin-szerű protein fogalma egy olyan hemoglobin-szerű proteinre vonatkozik, melynek P^q értéke legalább 10 %-kal kisebb mint a sejtmentes hemoglobin Aq P^q értéke azonos körülmények között.

A nagy affinitású mutáns hemoglobin bizonyos szituációkban felhasználható. Például, periluorokarbon-alapú vérpótló készítmények vannak klinikai vizsgálatok alatt a szilárd tumorok besugárzásos terápiájának és bizonyos kemoterápiás kezelések fokozására (Dowling, S., Fischer, J.J. and Rockwell, S. (1991) Biomat. Art. Cells Immobil. Biotech., 19 277; Hermán, T.S. and Teicher, B.A. (1991) Biomat. Art. Cells and Immobil. Biotech. 19 395; Holdén, S.A., Teicher, B.A. and Hermán, T.S. (1991)Biomat. Art. Cells and Immobil. Biotech., 19 399). Ezen kutatások alapja az a tény, hogy az oxigén egy szükséges alkotórész a besugárzásos sejt toxicitási folyamatban, valamint bizonyos kemoterápiás reagenseknél. A szilárd tuomrok gyakran mutatnak kiemelkedően alacsony parciális oxigén nyomást a tumor belsejében, a terápiát nem elég hatékonynak mutatva. A perfluorokarbon-alapú oxigén hordozó oldatok úgy tűnik drámaian fokoznak bizonyos tumor terápiákat és a hemoglobin-alapú vérpótlóktól azt várjuk, hogy hasonló felhasználásuk lehet. Valószínű, hogy a teljes vörösvérsejttől eltérően a sejtmentes hemoglobin be tud hatolni a tumor belső régióiba hogy oxigént szállítson. A sejtmentes hemoglobin készítmény oxigén felszabadításának aktuális %-a nem egyenes függvénye a P₅q értéknek sokkal inkább a tüdő parciális oxigén nyomását (ahol az oxigén a hemoglobinnal kapcsolódik) és a szövet parciális nyomását (ahol az oxigén leválik a hemoglobinról) képviselő két nyomás közötti oxigén egyensúlyi kötő görbétől függ. Ezért lehetséges, hogy tumor terápiás hatásjavitóként egy nagy affinitásu mutáns hemoglobint részesítenénk előnyben. A nagy • · · ·

affinitású hemoglobin megtartaná kötött oxigénjét a normál keringési rendszerben, ahol a parciális oxigén nyomása viszonylag magas marad, de felszabadítaná az oxigént a nagyon oxigén-hiányos tumor belsőkben. A normál vagy kis affinitású hemoglobin esetleg kevesebb felszabadítandó, elérhető hemoglobinnal rendelkezik mire eléri a tumor belsejét.

Ismertek a természetesen előforduló nagy affinitású hemoglobin mutánsok is, lásd Bunn és Forget munkáját, a 14-1 Táblázatot és a nem természetesen előforduló nagy affinitású hemoglobin mutánsok jelöltjei az ismert mutánsok és hemoglobin szerkezetek fényében tervezhetők. A különösen előnyben részesített nagy affinitású mutánsokat a 400. Táblázatban mutatjuk be.

Meg kell jegyezni, hogy a genetikai fúzió és a keresztkötés befolyásolhatják az oxigén kötő affinitást.

Cisztein mutációk és diszulfid hid képzés

A cisztein mutációk értéke abban van, hogy fokozzák a tetramer stabilitását (lásd USP 5.028,588 és 07/443,950 sorozatszám). Elősegítik a poli(teramer) (n>=2) hemoglobinok megszerkesztését.

Ez azért van, mert a szomszédos tetramereken levő ciszteinek (ideértve a pszeudotetramereket is) oxidálhatok a diszulfid hidak létrehozása céljából, kovalensen kötve a tetramereket. Továbbá a ciszteinek tiol csoportjai számos keresztkötődő anyaggal reagáltathatók.

Számos hely jöhet szóba a ciszteinek hemoglobin-szerű proteinbe való bejuttatásához.

A hely megválasztását megszabó kritériumok a következők: (1) • · · • · · · · · • ·· ······ • · * · ·

- 38 a mutáció ne befolyásolja a működést; (2) az oldallánc hozzáférhető legyen viz számára oxi vagy dezoxi szerkezetben; (3) a hely az összehajtogatott protein felszínén legyen; (4) az oldallánc szulfhidrilje nyúljon ki a felszínből, és ne a molekula belseje felé orientálódjon; (5) a hely a molekula egy olyan részében legyen, mely közvetlenül nem vesz részt az R->T átvitelben; (6) a változás olyan részben következzen be, melynek nincs erősen rögzített helyzete (az ilyen régiók általában homályos röntgendiffrakciós mintázatot mutatnak); (7) a mutáció ne tegye tönkre a helyi másodlagos szerkezetet, azaz el kell kerülni a pro -> cys mutációkat, melyek a kihajtódási problémákat okozhatják; és (8) ha lehetséges konzervatív változást kell alkalmazni mint amilyen a ser -> cys vagy az ala -> cys. A mutáció nem szükséges hogy kielégítse a fenti kikötések mindegyikét. Például, felidézhetünk egy olyan helyet, mely részt vesz az R -> T átvitelben (lásd az (5) fent), de előnyös változást ad a P^q esetében (lásd (1) fent) az abban való részvétel miatt. A legfontosabb szempont az, hogy a mutáció ne szüntesse meg az C>2 kötést a keresztkötés létrejötte előtt vagy után, és a cisztein elérhető legyen a kívánt keresztkötéses reakcióban való részvételhez.

Az alfa felszínen a lehetséges helyek közé a következők tartoznak: his72, asn78, asn68, ala71, thr67, lys7, thr8, alal2, thrll8, lysl6, ala45, glull6, glyl5, hisll2, thr24, glu23, lys60, lys56, his50, gly51, glu53, ser49, asp47,gln54, his45, lys90, ala82, lys61, alal9, his20, asp85,ser81, asp75, asp74, lysl39, asp64 és glyl8 (összesen 40 aminosav).

A béta felszínen a lehetséges helyek közé a következők tartoznak: asp79, his2, leu3, thr4, glu6, ser9,thrl2, alal3, glyl6, lysl7, valll8, asnl9,val20, asp22, lys65, ser72, ala76, his77, asp79, asn80, gly83, ala86, thr87, glu90, lys95, lys59, • · · · · · • · · · · · · • · · ······ · ·· ·· · ·· • · · · glu43, ser44, asp47, ser49, thr50, ala53, asp52, lys61, glul21, lysl20, thrl23, lys66, asp73, ala62, hisll6, hisll7 (összesen 45 aminosav).

Számos természetesen előforduló mutáns van, melyek, már mutációkat mutatnak ezeken a helyeken. Ezek a következő felsorolásban láthatók:

Maradék	Régió	Mutáció
19	AB1	ALA- >	GLU
		ALA- >	ASP
54	E3	GLN- >	ARG
		GLN- >	GLU
71	E20	ALA->	GLU
75	EF4	ASP->	GLY
		ASP->	HIS
		ASP- >	TYR
		ASP->	ASN
81	F2	SER->	CYS
47	CE5	ASP->	GLY
		ASP->	HIS
		ASP- >	ASN

Ha a pszeudo-oktamert hozzuk létre n=2) közvetlenül kapcsolva a két pszeudo tetramert egy diszulfid kötésen keresztül a szérumban a felezési idő befolyásolható azzal az aránnyal, melynél az endogén szérum kis molekula tiolok (mint pl. a glutation) csökkentik a diszulfid kötéseket. Ezen reakciók mechanizmusa magába foglalja a tiolát anionokat, mint az aktuálisan redukáló típusokat (Creighton, T.E. (1978) Proq. Biophys. Molec. Bioi., 33:259-260; Creighton, T.E. (1975) J. Mól. Bioi. 96:767;

Creighton, T.E. (1977) J. Mól. Bioi. 113:313). így a redukció mértéke a molekuláris elektrosztatikus környezet függvénye a diszulfid kötés közelségében. Kisebb arányú redukciót jósolunk ha a diszulfid egy elektrosztatikusán negatív környezetben helyezkedik el, a tiolát anion taszításának köszönhetően. A glutation esetében még a nem reaktív tranziens protonált típus is nettó negatív töltéssel rendelkezik és taszító hatás érné, igy tovább csökkentve a diszulfid redukció arányát.

A negatív töltésű felületi maradékhoz nagyon közel elhelyezkedő di-alfa vagy di-béta hemoglobin felszíni vagy felszinközeli aminosav maradéka ezért jó választás lehet egy egyedüli cisztein mutáció di-alfa vagy di-béta polipeptidben való lokalizálására. Bár két ilyen cisztein közötti kezdeti diszulfid kötés létrehozása lasabb lehet a két hemoglobin molekulán levő ciszteinekhez közeli negatív töltések közötti taszítás miatt, a reakció elősegíthető erős sók vagy magas pH értékek használatával az in vitro kötés megvalósulásának reakciója során. Ha dezoxi körülmények között hajtjuk végre redox pufferben a reakció elősegíthető a hőmérséklet emelésével.

A negatív töltésű maradékokhoz közeli előnyben részesített helyek a cys mutációkhoz alfa ser49 közeli asp47; természetesen előforduló ser49 arg normális O₂ affinitással gin, arg, nincs ismert nem kívánatos tulajdonsága alfa lysl6 közeli glullő; természetesen előforduló lys glu normális O₂ affinitással rendelkezik alfa his20 közeli glu23; természetesen előforduló his20 tyr, alfa his50

közeli glu30; természetesen előforduló his50 asp nincs ismert nem kívánatos tulajdonsága béta thr50 közeli asp52; természetesen előforduló thr50 lys nincs ismert nem kívánatos tulajdonsága béta lys65 közeli asp21 béta asnl9 közeli asp21

A felszíni vagy a felszínhez közeli cisztein mutációktól általában nem várjuk el, hogy nagyobb hatásuk legyen a hemoglobin pszeudotetramer funkcionalitására. A cisztein mutációktól nem várjuk el, hogy jelentősen destabilizálják az alfa hélixeket és a felületi maradékok nem tartoznak bele a hemoglobin oxigén kötő tulajdonságaiba. A legtöbb felszíni maradék átesik jelentős mutáción és nem túl erőltetettek. Meg kell jegyeznünk azt is, hogy a protein légzési mozgás miatt a cisztein oldallánc nem kell hogy szükségszerűen közvetlenül a diszulfid kötés képződéséhez elérhető oldat irányába mutasson.

A pszeudo-oktamer szerkezetben való alkalmazáson túl a felszíni cisztein mutációknak egyéb alkalmazásuk is lehet. Ezek közé a következők tartoznak: (1) multimer hemoglobinok n>2) megszerkesztése olyan szintetikus szulfhidril reaktív peptidek használatával, melyek kettőnél több reaktív hellyel rendelkeznek; (2) a felszíni cisztein maradékok felhasználhatók a radioizotópokat kötő kelátokhoz kapcsolhatók a feltérképezéshez; és (3) a felszíni ciszteinek felhasználhatók a bio-aktiv peptidek vagy más terápiás anyagok kötéséhez keringési felezési idejük növelése céljából vagy szállításuk megcélzásához. Ha a gyógyszer kötődése egy diszulfidon keresztül valósul meg a poeptid hordozójától való felszabadulásának sebessége szabályozható a szomszédos • · · ·

- 42 maradékokkal. A (2) és a (3) alkalmazásához, az egy cisztein/dialfa vagy di-béta korlátozás szükségtelen.

Kívánatos lehet a normál humán hemoglobin báta 93 helyénél levő cisztein eltávolítása, igy az nem vehet részt a polimerizációs reakcióban. Ez a cisztein szerinnel, alaninnal vagy threoninnal helyettesíthető például. Más vad tipusu ciszteinek szintén helyettesíthetők, ha erre szükség van, de nem valószínű, hogy ezek részt vesznek a tetramer létrejötte után a keresztkötéses reakcióban.

A haptoglobin kötés csökkentésére irányuló mutációk

Jelenleg úgy vélik, hogy a haptoglobin kötés szerepet játszik a hemoglobin katabolizmusában. Ha ez igy van, a hemoglobin intravasculáris retenciója fokozható olyan mutációkkal, melyek gátolják a haptoglobin kötődést. Az oxihemoglobin alfabéta dimerekre disszociál, melyeket azután a haptoglobin köt meg. Míg a kötési energia többsége a tetramerben eltemetett de a dimerben kitett maradékokhoz való kötődéséssel kapcsolatos, úgy tűnik, hogy a tetramer felszínén vannak másodlagos kötési helyek is. Bár a mechanizmus nem világos, a haptoglobin-kötött dimerek a májban levő Kupffer sejtekbe szállítódnak, ahol lebomlanak.

A legkívánatosabb az olyan helyek mutációja lenne, melyek részt vesznek a haptoglobin kötésben és, melyek egy másik tetramer kapcsolódásához is megfelelőek. Az ilyen mutációs helyek a normál humán alfa globin alfa láncában az 1, 6, 74, 82, 85, 89, 90, 93, 118, 120-127 és a 131-146 maradékoknál találhatók. Nem valószínű, hogy a haptoglobin kötés gátolható egy genetikailag • ·

kódolt aminosav csupán egy másik aminosavval való egyedüli helyetteseitéses mutációjával. Azonban ha a fenti maradékokat ciszteinnel helyettesítjük, majd a ciszteint keresztkötjük egy másik molekulával, mely jelentősen nagyobb, mint a hagyományos aminosav oldallánc, a szférikus hatás jelentősen fokozódik és a haptoglobin kötés gátolható. Természetesen a polimerizációs szabályozás megőrzéséhez ezeket a mutációkat aszimmetrikusan kell elvégezni a pszeudooligomer polipeptidben, úgy, hogy csak egy keresztkötés legyen tetramerenként.

Ismeretes, hogy még a kovalensen keresztkötődő hemoglobinokat is feldolgozhatják a haptoglobinok; erről úgy vélik, hogy a tetramer oxi formájának légzési eredménye, acélból, hogy a haptoglobin kellőképpen hozzáférjen a kérdéses alegység interface normálisan eltemetett maradékaihoz. Ez kivédhető a globin egységek szoros keresztkötésével, igy a disszociáció nem fog bekövetkezni a kérdéses időszakon belül. A fent megtárgyalt mutációktól eltérően ezeket a mutációkat az összes jelzett alegységnél el kell végezni a maximális hatás eléréséhez.

béta37 ->Cys és alfa92->Cys béta40 ->Cys és alfa92->Cys béta97 ->Cys és alfa41->Cys

A fenti mutációk mind az alfa₁béta₂ és a béta₁alfa₂ interface-ekben találhatók és úgy zárják be ezeket az interfaceeket hogy nem teszik lehetővé a haptoglobin hozzáférését.

A légzés alacsony oxigén affinitási mutációkkal is gátolható; a tetramer ekkor több időt tölt a dezoxi állapotban, mely nem érzékeny a haptoglobin támadásával szemben.

···· «· « ., • · ·· · · · · .·♦····· · • · · · ···· · · · ·· ·· · ·· ·«··

A multimer hemoglobin-szerű proteinek előállításában közvetítőkként hasznos pszeudomer globin-szerű polipeptidek és pszeudotetramer hemoglobin-szerű proteinek

Kötött formában a hemoglobin könnyen disszociál αβ dimerekké, melyek kellőképpen kicsik a vese glomerulokon való keresztülhaladáshoz és a Hb ezért gyorsan eltávozik a keringési rendszerből. A hemoglobin oxigén transzport elősegítéséhez szükséges mennyiségénél jóval kisebb mennyiségekben való intravénás adagolása hosszútávú vese károsodást és hiányos működést okozhat. Ackers, G.K. and Halvorson, H.R., proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 71:4312-16 (1974); Bunn, H.F. Jandl, J., J. Exp. Med. 129:925-34 (1969). Ha a dimerekké való disszociációt kivédjük, nő az intravasculáris felezési idő és jelentősen csökken a vese toxicitás. Lásd R., Atsumi N., Jackbs, E., Austen W. , Vlahakes, G., J. Surg. Rés. 47:407-11 (1989). A találmány hemoglobin-szerű proteinjei nem képesek αβ-dimerekké disszociálni a peptidkötés széttörése nélkül és a hosszabb intravasculáris felezési idő és a csökkent vese toxicitás előnyeivel kell rendelkezzenek.

A dezoxihemoglobin és az oxihemoglobin kristályszerkezetében az egyik a alegység N-terminális Val maradéka és a másik a alegység C-terminális Arg maradéka 2 és 6 Á távolságra vannak és a dezoxihemoglobinban egy sóhidon keresztül kapcsolódnak egymáshoz. Fermi, G., Perutz, M., Shaanan, B., Fourme, R., J. Mól. Bioi., 175:159-74 (1984); Shaanan, B., J. Mól. Bioi. 171:31-59 (19 83) . Ez a távolság egy vagy két aminosavval növelhető. Egy extra aminosav adható az a alegység C-terminális Arg maradékához tripszin-katalizált reverz hidrolízissel, az oxigén kötő tulajdonságok szignifikáns megváltoztatása nélkül. Nagai, K., Enoki, Y., Tomita, S. and Teshima, T., J. Bioi. Chem., 257:1622-25 (1982). Előnyösen a di-alfa kötő (ha használunk ilyet) 1-3 aminosavból áll, melyek lehetnek azonosak vagy eltérőek. Egy Mono-Gly kötő különösen előnyben részesül. Egy ilyen kötő megtervezésekor fontos felismerni azt, hogy kívánatos egy vagy több olyan aminosavat használni, melyek rugalmasan kapcsolják a két alegységet, egy egyedüli di-alfa globin polipeptid doménné transzformálva ezeket.

A di-béta mutánsok előállítását is fontolóra vettük. Az egyik béta alegység N-terminusa és a másik közötti távolság 18.4 Á a dezoxi konfigurációban és 5.2 Á az oxi formában. Előnyösen a di-béta kötő 2-9 aminosavat tartalmaz, melyek lehetnek azonosak vagy eltérőek. A glicin aminosavakat különösen előnyben részesítjük.

Az egyik béta lánc N-terminusa (a béta^ 1 Val-nál) és a második béta lánc C terminusa (béta₂ 146 His) közötti (-gly-) genetikailag fuzionált kötés hossza a di-béta hemoglobinban 1 és megközelítően 9 glicin körüli tartományba eshet. A humán hemoglobin A_o oxi és a dezoxi kristály szerkezeteiben az ezen terminusok közötti távolság sorrendben 5.22 Á és 17.93 Á (a karboxilát Nterminális nitrogénjétől a C-terminális szénig). Egy egyedüli glicin kötő, mely 4 Á hosszúságnál valamivel kisebb, közel kerülhet az oxi szerkezetben levő két terminus összekapcsolásához, azonban azt várjuk, hogy ez a kötő 14 Á-gel lemarad a dezoxi szerkezetben. Jelentősen több zavar okozható a dezoxi szerkezet vs oxi szerkezetben ezzel a kötővel. Az oxigén kötő tulajdonságokban néhány változás idézhető elő a két terminusban levő pozitív és a negatív töltések deléciójával és ezek amid kötésbe való beépítésével. Továbbá maga a kötő molekula kevésbé destabilizálja az oxi szerkezetet mint a dezoxi szerkezetet, és ez az oxigén affinitásban bekövetkező viszonylag erős növekedéshez vezet.

···· ·· · _Λ9 ..

_···· » · · .······· * • · · · ···« · · · ·· ·· * ·· ····

- 46 Hasonlóképpen, a kötőként inzertált két glicin eltérően stabilizálhatja az oxi szerkezetet és ezért a fent leirt mechanizmushoz hasonlóan megnövelheti az oxigén affinitást.

Ha a kötő glicinek számát 5-re növeljük a kötő csupán a béta lánc terminusok közötti távolságot kell, hogy áthidalja, és, továbbá inzertálja a hozzáadott szférikus térfogatot a terminusok közé az oxi szerkezetben, igy a dezoxi szerkezet viszonylagos stabilizálásához vezet (vagy az oxi destabilizálásához) valamint az ezzel járó oxigén affinitásban bekövetkező csökkenéshez vezethet. A dezoxi szerkezetben a béta terminusok közötti nagy távolságok következtében (az oxi szerkezetben azonban nem) a 6-9 tartományba eső glicin kötők hozzáadása tovább stabilizálhatja az oxi szerkezetet és hasonlóképpen tovább csökkenti az oxigén affinitást.

A globin pszeudodimer harmadik formája alfa és béta globin doméneket is tartalmaz. Az alfal béta 2-höz való fúziójának egy lehetséges útja, melynek során a hemoglobint az α₁β₁/α₂β₂ dimer képződéssel szemben stabilizáljuk, az alfal C-terminális maradék béta2 C hélix N-terminális maradékához való fúziója, egy új Cterminust hozva létre a béta2 B hélix végén. Az eredeti béta Nterminus, a Vall, az eredeti béta alegység C-terminális maradékhoz fuzionáltatható, a Hisl46-hoz, a protein egy közbeeső új szekciója révén, igy létrehoznánk egy olyan folyamatos polipeptid láncot, mely eltérő dimerek alfa és béta alegységeit tartalmazzák. Ezt a láncot a következőkkel lehet jellemezni: a(l-14)Gly₃-β ( 35 -146)-Gly ]_ _3-Ala-|_3-Gly-|_ _ 3-β (1-34) ; lásd a 6. Ábrát.

A humán dezoxihemoglobin szerkezetének molekuláris grafikai számítógéppel való vizsgálata jelzi a lényeges távolságokat.Az Alfal Argl41 karboxil szén és a Béta2 Tyr35 N atomok közötti távolság megközelítően 8.6 Angström. Egy teljesen kinyújtott lineáris triglicin peptidet megközelítően 10.1 Angström hosszúságúnak mértünk a N terminális maradéktól a C terminális maradékig. Ez azt sugallja, hogy három glicin maradék használható az Argl41 és Tyr35 maradékok közötti távolság áthidalására minimálisan kedvezőtlen szférikus kölcsönhatásokkal és maximális konformációs szabadsággal. A távolságbeli elvárások eltérőek lehetnek az oxihemoglobin esetében, és ha ez igy van a fúziós peptid szekvenciája megváltoztatható a két szerkezet igényeinek legjobb kielégítése céljából.

A humán dezoxihemoglobinban a Béta2 Hisl46 karboxil szén és a béta2 Vall nitrogén atomok közötti távolság megközelítően 25 Angström. A 13 Alanin maradék lineáris szekvenciájából megszerkesztett jobbra csavarodó 3.6 Alfa hélix esetében azt találtuk, hogy az N és a C terminális közötti távolság 22 Angström. Az ezen hélix mindegyik végéhez való egy - három glicin maradék hozzáadásával (a Gly_n (Alá)-L3Gly_n, ahol n=l - 3) az igényelt távolság áthidalható és elegendő konformációs rugalmasság biztosítható a komoly tercier tömörülési problémák elkerülése céljából. Továbbá a hélix aminosav szekvenciája megváltoztatható a kedvező hidrogén kötések és sókötések létrehozása céljából az új hélix és a Béta2 hélix között, mely ellen ez az összehajtott proteinbe tömörülne. Az ilyen interakciók segíthetik a manipulált protein stabilizálását .

A kötők között a Glicin az előnyben részesített aminosav, mivel erről ismert, hogy meglehetősen rugalmas, Cantor és Schimmel, Biophysical Chemistry part 1, pp.266-9 (1980), és lehetővé teszi annak a láncnak a sokkal tömöttebb szerkezetet, melybe beépült. Azonban a kötőt tartalmazó maradékok nem korlátozódnak a glicinekre; más maradékok is idetartozhatnak a glicin helyett vagy azon túl, mint pl. az alanin vagy a threonin. Mivel ezeknek

Λ 9 f

az aminosavaknak sokkal korlátozottabb konformációs helyük van a proteinben, ezek valószínűleg sokkal merevebb kötő láncokat eredményeznek és sokkal hagsulyosabb hatásuk van az oxi/dezoxi szerkezetek relatív stabilizációjára/destabilizációjára.

Meg kell érteni, hogy az aminosavak minimális és maximális száma a kötőben az áthidalandó távolság függvénye az oxi és a dezoxi formákban is, függ a választott aminosavtól és az adott aminosav szekvencia másodlagos szerkezetet képező hajlandóságától. Ugyan a random orsót részesítjük gyakran előnyben, nem szükséges, és a másodlagos szerkezetben levő nagy számú aminosavat tartalmazó kötő azonos áthidalóval rendelkezhet mint a kevesebb aminosavból álló random orsós kötő. Egy kötő tartalmazhat pl. 1-3 glicint, melyet egy másodlagos szerkezetű szekvencia követ, melyet 1-3 több glicin követ ismét. A maradékonkénti transzláció a poliprolin I esetében 1.9 Á, a poliprolin II esetében 3.12, a poliglicin II esetében 3.1, az antiparalell βlemez esetében 3.4, a paralell β-lemez esetében 3.2, 1.5 a jobbra csavarodó a-hélix esetében, 2.0 a 310 hélix esetében és a π hélix esetében 1.15. A teljesen kinyújtott láncban a maradékonkénti maximális transzláció 3.63 Á ha az ismétlődő egységek lépcsősen oszlanak el és 3.8 Á ha a peptid kötés transz.

A kötőben levő aminosavak száma olyan lehet, hogy a másodlagos szerkezet létrejötte, mint az alfa-hélix vagy a béta-lemez, nem kívánatos, mivel a rés csökkentett. Bizonyos aminosavak nagyobb tendenciát mutatnak az ilyen szerkezetekben való részvételre. Lásd Chou és Fasman Biochemistry, 13:222-245 (1974), mely a hivatkozás révén része a találmánynak. Az alábbiakban az aminosavakat a csökkenő részvétel sorrendjében adtuk meg. Az előnyben részesített kötő aminosavat nagybetűvel szedtük. Erre a célra a legalkalmasabb aminosav a glicin. A leginkább előnyben

részesített di-alfa kötők a Gly vagy a Gly-Gly.

Alfa Hélix képzők

Béta-Lemez képzők

Glu	(1.53)		Met	(1.67)
Alá	(1.45)		Val	(1.65)
Leu	(1.34)	Ha	Ile	(1.60)	HB
His	(1.24)		Cys	(1.30)
Met	(1.20)		Tyr	(1.29)
Gin	(1.17)		Phe	(1.28)
Val	(1.14)		Gin	(1.23)
Trp	(1.14)		Leu	(1.22)
Phe	(1.12)	ha	Thr	(1.20)
LYS	(1.07)		Trp	(1.19)	hB
Ile	(1.00)		Alá	(0.97)	Ifi
ASP	(0.98)		ARG	(0.90)
Thr	(0.82)		GLY	(0.81)
ARG	(0.79)		ASP	(0.80)	ifi
SER	(0.79)		LYS	(0.74)
Cys	(0.77)	ia	SER	(0.72)
ASN	(0.73)		His	(0.71)
Tyr	(0.61)	ba	ASN	(0.65)
PRO	(0.59)		PRO	(0.62)	bB
GLY	(0.53)	Ba	G1U	(0.26)	BB

(A betüszimbólumok: Ha erős a képzők; ha a képzők; la gyenge a képzők; ia a indifferens; ba a törő; és Ba erős a törő. A fi szimbólumok analógok. Trp bB ha a B-lemez régió C-terminálisához közel van.)

A polipeptid lánc alfa hélixe átlagosan 3.6 maradékot tartalmaz fordulóként. A globurális proteinekben az átlagos hosszúság kb. 17 Á, ami 11 maradéknak vagy 3 hélix fordulónak felel • « • · · ·····« · · ·· ·· · ·· ····

- 50 meg. Az alfa és a béta globinban a hélixek hosszúsága 7-21 aminosav közé esik (A.A.). A béta elrendezésű lemez 2.3 maradékot tartalmaz fordulóként; az átlagos hossz kb. 20 Á vagy 6 maradék.

Chou és Fasman egy alfa hélix magot a következőképpen határoznak meg: négy hélix képző maradékot és egynél nem több hélix törőt tartalmazó hexapeptid és a béta lemez nukleuszt: három béta lemez képző maradékot és egynél nem több béta lemez törőt tartalmazó pentapeptid.

A di-alfa kötő közelében levő aminosav szekvencia a követke-

maradék #	138	139	140	141	12 3	4
AA	Ser	Lys	Tyr	Arg - (XXX)n	Val Leu Ser	Pro
(4. s z ámu	szekvencia)			(5. számú szekvencia)
Helix Nőt	H21	HC1	HC2	HC3	ΝΑΙ NA2 A1	A2
Helix Pót	079	107	061	079	114 134 079	059
Lemez Pót	072	074	129	090	165 122 072	062

(Megjegyzés: A hélix és lemez képző potenciálokat 100-zal szoroztuk tipográfiai okokból.)

A di-alfa kötő előnyösen csupán 1-3 aminosav. így az alfahélixet csupán a kötő terminusokkal együtt képesek létrehozni. Az egy vagy két maradékos kötő, még ha erős másodlagos szerkezet hajlammal rendelkező aminosavakat is tartalmaz nem valószínű, hogy felveszi az alfa hélix vagy a béta lemez konfigurációt az Arg 141 vagy a Ser 3 törő hatását figyelembe véve. Ha a kötő 3 maradék hosszú, kívánatos lenne, ha egynél nem több maradék lenne erős alfa hélix képző, hacsak a kötő nem tartalmaz egy erős alfa

hélix törőt is.

A di-béta kötő közelében levő aminosav szekvencia még szigorúbb kényszert mutat:

143	144	145	146	1	2	3	4
His	Lys	Tyr	His - (XXX)n -	Val	His	Leu	Thr
(6.	számú	szekvencia)	(7.	számú	szekvencia)
H21	HC1	HC2	HC3	NA1	NA2	NA3	A1
124	107	061	124	114	124	134	082
071	074	129	071	165	071	122	120

A di-béta kötő valószínűleg hosszabb (előnyösen 1-9 A.A.) és ezért sokkal érzékenyebb a másodlagos szerkezet képződéssel szemben. Ha a másodlagos szerkezet létrejötte nem kívánatos, kívánatos, hogy a Val-1-gyei szomszédos aminosav egy alfa hélix törő legyen (pl. Glicin) a Val-His-Leu Alfa hélix hajlamát figyelembe véve. Még általánosabban, kívánatos, hogy a kötő ne tartalmazzon (vagy kooperáljon a legközelebb kötött aminosavvakkal hogy létrehozzon) egy alfa hélix nukleuszt vagy béta lemez nukleuszt.

Ha a másodlagos szerkezet nem kívánatos, az alfa hélix képződésre nagy hajlandóságot mutató aminosavakat lehet felhasználni a kötőben, ha hélix törő aminosavak követik ezeket. Hasonlóképpen a béta lemez képződés kivédhető a lemez törő aminosavakkal.

Természetesen, egy másodlagos szerkezet Chou és Fasman-féle megközelítést felhasználó megjósolásának megvannak a maga korlátái és egy kötő elfogadhatóságának végső tesztelése az, hogy a di-alfa vagy a di-béta hemoglobinnak egyaránt megvan a kívánt oxigénnel szembeni affinitása. Közelebbről, egy poli-alanin kötő, feltételezett alfa hélix képződésre való hajlandósága ellenére, hasznos lehet, mivel az alanin csoport szilárd, ezért a kötő meglehetősen rugalmas ha a másodlagos szerkezet nem jön létre.

Egy különösen előnyben részesített megvalósulásban a di-alfa és béta globin géneket egy egyedüli policisztronos operonban egyesítjük. A policisztronos operon alkalmazása azonban nem szükséges a találmány alkalmazásához és az alfa (vagy di-alfa) és béta (vagy di-béta) globin gének különálló promóterekből is expresszálhatók, melyek lehetnek azonosak vagy eltérőek.

Mig a találmány előnyben részesített genetikailag fuzionált hemoglobinja egy di-alfa és/vagy di-béta globint tartalmaz, más globin láncok genetikailag fúzionáltathatók és felhasználhatók a Hgb Al (a₂S2) típusú hemoglobintól eltérő hemoglobin multimerek termelésére.

Diszulfid hidakkal rendelkező pszeudo oktamer (ditetramer) hemoglobin-szerű proteinek

Egy egyedüli diaifa polipeptidet és két béta láncot (vagy egy dibéta polipeptidet és két alfa láncot) tartalmazó pszeudotetramer rekombináns hemoglobinok létrehozásának képessége egyedülálló lehetőséget biztosit egy normálisan szimmetrikus pszeudotetramerből való aszimmetrikus pszeudotetramer létrehozására. Mivel a két alfa globin dómén egyedüli polipeptidként expresszálódik lehetséges az egyik alfa globin dómén megváltoztatása a másik megváltoztatása nélkül. Az eredmény egy olyan protein, mely a végső hajtogatott állapotában két eltérő alfa ·· ·· · ·· ,.

···· « · · · * · ·····« · · • ♦· · ·· ···· globin domént tartalmaz szigorú 1:1 arányban. Ezzel az egyedülálló kémiai tulajdonsággal rendelkező aszimmetrikus hemoglobin molekula nem állítható elő könnyen más módszerekkel. A találmány egy előnyben részesített megvalósulása magába foglalná egy di-alfa hemoglobin, mint pl. az SGE1.1 (egy béta lánc Presbyterian mutációval rendelkező di-alfa hemoglobin) két alfa globin doménjének egyikében egy cisztein maradék helyettesítését célzó hely-irányitotta mutagenezis alkalmazását oly módon, hogy a cisztein a hajtott rekombináns hemoglobin molekula felszínén lenne. Ezután a pszeudooktamer hemoglobin egy homogén készítményét hozhatnánk létre két pszeudotetramer interhemoglobin kötésén keresztül vagy a tisztított pszeudotetramerek egyszerű oxidációjával közvetlenül, vagy egy hidat létrehozó molekulával való reakcióval (3. Ábra).

Bár a kémiai keresztkötés szükségességének elkerüléséhez kívánatos a két mono cys tertamer közötti diszulfid kötés közvetlen létrejötte, természetesen előforduló redukáló anyagok jelentős mértékben redukálhatják a diszulfid kötést in vivő. ELőzetes vizsgákatok azt jelzik, hogy a kötés redukciójának sebességét a hemoglobin felszínén levő cisztein mutációjának elhelyezkedése is befolyásolhatja.

A felületi cisztein mutánsok (MW = 64 kDa) a diszulfid kötő dimerhez oxidálhatok oxidativ körülmények között. Ez úgy valósítható meg, hogy az expresszált protein koncentrált oldatát keverjük pH 8 értéken tiszta oxigén alatt 4 °C hőmérsékleten vagy szobahőmérsékleten sötétben. Átmeneti fémionok mint pl Cu²⁺ nyomnyi mennyiségei adhatók 1 μ,Μ szint alatt az oxidáció katalizálása céljából (1). A 128 kDa hosszúságú oktamer képződését gélszüréssel észlelhetjük. Az oldat oxigénnek való telítése emelt pH értéken minimalizálja a rekombináns hemoglobin autooxidációj át.

Egy alternatív eljárás, mely ezen reakció katalizálásának előnyben részesített módszere, magába foglalja redox pufferek, mint pl a redukált vagy oxidált glutation vagy redukált vagy oxidált ditiotreitol használatát (2) . A diszulfid átalakuláson keresztüli reakció katalízise szükséges lehet a nyom átmeneti fém katalízis szabályozásához (3). És másodszor, hasonló megközelítés magába foglalja a 65 kDaa típusban a felszíni ciszteinek szulfonátokká való átalakítását a tisztítás előtt (a 128 kDa típusok tisztítás alatti képződésének elkerülése céljából), melyet a redukált glutationnal való diszulfid-kötött 128 kDa típussá való konverzió követ (2).

(1) Freedman, R.B. and Hillson, D.A. (1980) Formation of

Disulfide Bonds In: Thr Enzymology of Post Translational Modification of Proteins, Vol. 1,

p. 157 ff (Academic Press).

(2) DiMarchi, R. et (1988) Chemical synthesis of humán epidermal growth factor and humán type a transforming growth factor (TGFa) In:

Peptides: Chemistry and Biology (G.R.

Marshall, ed.) pp. 202-203 (Leiden:ESCOM).

(3) Creighton, T.E. (1978) Expreimental folding and unfolding. Prog. Biophys. Molec.

studies of protein

Bioi. 33:231-297.

Más intercisztein kötésekkel rendelkező multimer hemoglobin-szerű proteinek

Természetesen lehetséges két mono cys molekula homobifunkcionális keresztkötő reagensekkel való párosítása is, mely a nem redukálható kötéseken keresztül valósul meg. A polimerizáció foka

- 55 most is szabályozható a mono cys di-alfa vagy di-béta Hgb kiindulási anyag használatával.

A bi-, tri-, tetra-, hexa-, vagy okta-funkcionális keresztkötők használatával a multimer hemoglobin számos tulajdonsága, mely hozzájárulhat a hosszabb szérum felezési időhöz, szabályozható. A keresztkötők tervezhetők úgy, hogy nemredukálható kötést adjanak két teramer között, n>2 pszeudo-tetramerek (pl. dodekamerek, stb.) nagy molekulasulyú multimerjeinek létrehozása céljából és/vagy a hemoglobin oktamer teljes izoelektromos pontjának csökkentése céljából felezési idejének további növelése végett.

A molekula súly szérum felezési idő korrelációja az olyan proteinek eseetében mint az IL-2, azt mutatja, hogy egy jelentősen hosszabb felezési idő várható ha egy protein molekulasúlya megnő, különösen az 50-70 kDa-os vese-szürési határon felül. Azonban a tetramerek között egy diszulfid kötéssel létrejött multimer hemoglobin felezési idejét potenciálisan korlátozó faktor a szérumban talált endogén tiol-redukáló anyagok által előidézett cys-cys diszulfid kötés redukciója. A plazmában levő kis molekulájú tiol szintek becsült értékei 17 μΜ - 5 μΜ között változnak. A fő típus a redukált glutation. A plazmában levő más tiol vegyületek a következőket foglalják magukba: cisztein, homocisztein és gamma-glutamil cisztein. így a kis molekulás plazma tiolok érhetők el a diszulfid kötések redukálásához. Ezt tükrözik a hagyományos diszulfidokkal kötött antitest - ricin A lánc konjugátumok esetében megfigyelt csökkent felezési idők (6.7 óra) a szférikusán megakadályozott és igy kevésbé redukálható alfa-metil diszulfidokkal kötött konjugátumokéhoz viszonyítva (42.5 óra).

így, egy megvalósulásban, az oktamer hemoglobin egy nem « · • · • « «··« • · ·· «

• « ·· redukálható kén-tartalmú keresztkötést mutat, mint pl. egy tioéter kötést vagy egy tiol-maleimid terméket. Ezek jelentősen megnövelhetik a multimer felezési időt. Egyszerű homobifunkcionális keresztkötők vagy polietilén glikol (peg) származékok hasonlóképpen hasznosak lehetnek ebből a célból (lásd lent). Egy bifunkcionális cisztein-specifikus keresztkötő mono-cys di-alfa vagy di-béta Hgb-vel való reakciója egy súlyzó alakú oktamer hemoglobinra és nem reagált hemoglobinra korlátozná a reakció termékeit. A reakció stoichiometrikus kell legyen, ha a Hgb és a keresztkötő nagy koncentrációban van jelen és ha a Hgb egy kis többletben van a keresztkötő maleimidekhez képest 6.5-7.0 pH értéken. Továbbá, nem szabad, hogy jelentős kölcsönhatás legyen a globin lizinekkel való reakciója révén. A tiolok lizinnel szembeni kedvező reaktivitása durván kiszámítható, moláris arányuk és a maleimid - tiolok vs aminok valódi reaktivitása arányának szorzataként. Ez a szorzat kb [1 cys/40 lys]x[1000]=25 ph7 értéken. A melléktermékek még mindig oktamerek lesznek, és mivel az egyik kapcsolódási hely egy másodlagos amin igy funkcionálisan megfelelnek az S-keresztkötött oktamereknek. A maleiimid melléktermék hidrolízise ph7 esetében lassú és a gyűrű felnyilás a keresztkötést érintetlenül hagyja.

A tioéter RC(=O)CH₂I szulfhidril-hordozó proteinnel (R'SH) való reakciója a következő keresztkötést eredményezi: RC(=0)CH₂-S-R'. A maleiimid proteinnel való reakciója az öttagú maleiimid gyűrű kettős kötésén keresztüli R'SH hozzáadását eredményezi, igy egy tiomalaiimid melléktermék jön létre.

A következőkben az olyan homobifunkcionális keresztkötőkre adunk példákat, melyek metabolikusan stabil keresztkötéseket hoznak létre a monocisztein pszeudo tetramerek között:

1) 1,2-bis-(2-jódetoxi)etán

2) 4,4'-dimaleiimidilbenzén vagy N,N'-p-feniléndimaleiimid

3) N,N'-bis-(3-maleiimido-propipnil)-2-hidroxi-l,3-propán diamin.

Hosszabb felezési idők érhetők el, ha a jelen oldat molekulasúlyát megnöveljük, egyszerűen a két kötött tetramer közötti távolság megnövelésével egy hosszú keresztkötő anyagot használva. Néhány potenciálisan új polietilén glikol származék - SGE1.1 monocys-szel reagáló - homobifunkcionális keresztkötőként való használata egy az oktamer hemoglobin molekulasúlyának jelentős növelésére szolgáló mechanizmust biztosit csupán a keresztkötő hosszán keresztül.

Erre a célra alkalmas keresztkötő a maleiimido-CH₂CH2(=0)(OCH₂CH2)_n0C(=0)CH2CH2-maleiimido. A hosszúság az n variálásával igazítható. Az alábbiakban néhány példát mutatunk be.

Szerkezet	Maximális hossz	Forrás
n = 22	- 49 Á	peg -1000
n = 76	- 166 Á	peg -3350
n = 227	- 499 Á	peg -10000

Homobifunkcionális N-hidroxiszukcinimid-aktivált peg-et használtunk korábban a hemoglobin származtatására. Yabuki et al., Transfusion, 30:516 (1990). Ez a reakció monomer, dimer és trimer típusok polidiszperz keverékét eredményezi, a peg/hemoglobin átlagos stiochiomertiája 6.2. Azonban a peg-gel származtatott hemoglobin 83 %-a nem keresztkötődött más hemoglobin molekulával. A vad típusú hemoglobin peg-gel való származtatása nem szabályozható, mivel a hemoglobin kiindulási anyag esetében nincs hely-irányitóttá jelölés.

• · · · «··· ······· · * · · · ···· · · · ·· ·· · ·«··«·

- 58 Ezzel szemben, az SGE 1.1 mono-cys kiindulási anyagának és egy peg keresztkötőnek a vegyítése alapjában véve egy monodiszperz súlyzó alakú (pszeudo-oktamer) terméket eredményez. A keresztkötő kapcsolódási helyének hely-irányitása az adott molekulasúly pontos szabályozását eredményezi, mely a keresztkötő méretétől függ. Továbbá, a rekombináns hemoglobin felszínén levő cys-mutáció helyének gondos szabályozása biztosítja, hogy a származtatott hemoglobin funkcionalitása megmaradjon.

Magasabb multimer hemoglobinok

A fenti keresztkötések mind magukba foglalják egy tetramer a keresztkötő mindegyik végéhez való kapcsolását. Előnyös lehet kettőnél több tetramer kapcsolása egy egyedüli keresztkötőhöz a nagyobb oxigén-hordozó kapacitás elérése céljából, valamint a molekulasúly további növelése céljából.

Egy multimer hemoglobin összeállítható egy vagy több kötő peptid segítségével, melyek mindegyike szabályozott számú reaktív hellyel rendelkezik, melyekhez a hemoglobin tetramer vagy a pszeudotetramer cisztein maradéka közvetlenül vagy közvetve kapcsolható.

Egy megfelelő hosszúságú peptid kötővel kapcsolatban az az aggodalom, hogy a szérum proteáz le fogja bontani, igy a multimer hemoglobint lebontja alkotó tetramerjeire. Ez a probléma, ha jelentős, egy olyen peptid kötő használatával orvosolható, mely kevésbé érzékeny a proteolizissel szemben. Az ilyen kötőket tartalmazó nem kimerítő lista D-aminosavakból álló peptideket

- 59 foglal magába, olyan peptideket, melyek stabil, nyújtott másodlagos szerkezetűek és elágazó peptidek.

A D-aminosavakból álló peptidek esetében D-Glu vagy D-Asp használata különösen előnyben részesített.

Számos stabil, kinyújtott, másodlagos szerkezet ismert. A legegyszerűbb feltételezhetően a poliprolin. Másik példa a kétszálú csavart orsó, melyben két peptid lánc fonódik egybe. Egy

4-helikális vagy egy 4-szálú csavart orsó szintén lehetséges.

Elágazó szerkezetek, mint amilyeneket a lizin másodlagos amino csoportjának származtatásával nyerünk tipikusan ellenállnak a proteázzal szemben.

Ha kívánatos, ezen megközelítések vegyithetők. Például, számos csavart orsó kezdhet egy elágazó szerkezetet, vagy Daminosavak építhetők be egy csavart orsóba.

Egy hipotetikus 4-tetramer csavart orsós kötő komplexet mutat be a 4(a) ábra. Ezen csavart orsójú peptidek tervezését és szintézisét már megvizsgálták (példának lásd Cohen and Perry, Proteins, 7:1-15 (1990)). A csavart orsó magyarázata az, hogy két egymásba fonódó alfa hélix kevésbé lesz érzékeny a proteolitikus hasítással szemben mint egy egyedüli csupasz másodlagos szerkezet, mint egy kinyújtott peptid (a proteázok gyorsan hasítják), egy alfa hélix vagy egy béta lemez.

Molekuláris modellezést használva, egy belső diszulfid tervezhető a bi-funkcionális csavart orsó kötő centrumába oly módon, hogy a szálak kovalensen kapcsolódnak. Ez stabilizálná a helyes csavart orsójú keresztkötő képződését mielőtt mono-cys di-alfa vagy di-béta Hgb (pl. sgel.l cys) kapcsolódna. Továbbá, egy tri-funkcionális keresztkötő sokkal inkább stabilizálható egy ortogonálisán védett lizin (lys-FMOC) használatával mint egy proteolitikusan inért másodlagos szerkezet központjában levő ···♦ ·· . ·· ···· ···· . ·. · ···· · · * · · ·*···· · · ·· ·· · ·· ····

- 60 diszulfid. Egy poliprolin hélix használható kötőként és stabilizálható a szintézis lys-FMOC-nál való elágaztatásával az oldalláncok eltávolítása után. Az elágazó pepiidben a megmaradó három lizin ezután jódacetilálható, hogy hely-specifikusán kapcsoljon egy tiol-reaktiv csoportot jódecet anhidridet vagy Nszukcinimidiljód-acetátot használva, majd sgel.1-cys-szel reagáltatva. Egy analóg tetra-funkcionális keresztkötő szintetizálható két belső elágazó lizin közé való 1-2 prolin inzertálásával ezek oly módon való rotáltatása céljából, hogy az ortogonálisán védett lizinekből kinövő két belső elágazó lánc (majdnem) ellenkező irányban álljon. Analóg szerkezetek hozhatók létre D-glutamát (E) vagy D-aszpartát (D) használatával a proteázzal szembeni rezisztencia biztosításához és ezek egy kinyújtott polianionos láncot hoznának létre pH=7 értéken.

Az alfa-helikális csavart orsó hipotetikus szekvenciáját a Semchuck et al által megadott szekvenciából (Peptides: Chemistry, Structure and Biology; 566 (Rivier and Marschall eds:1990)) módosítottuk abból a célból, hogy csupán két lizint hagyjunk (K) az egyes végeken: AcKCAELEGRLEALEGRLEALEGRLEALEGRLEALEGKL-amid (8. számú szekvencia)

Ez a csavart orsó egy hélix kb. 10 fordulójával rendelkezik és igy kb. 54 Á hosszú, lehetővé teszi, hogy két tetramer kapcsolódjon az egyes oldalakon szférikus kölcsönhatások nélkül. A négy tetramer megfelelő elhelyezkedését lehetővé tevő pontos szekvencia és hosszúság a molekuláris modellezés eredményeitől függ.

Az alábbiakban ajánlott trifunkcionális és tetrafunkcionális keresztkötőket mutatunk be.

TRIFUNKCIONÁLIS ···· ·· · ,♦ ·*·· *··« .· · ···· · · • ·· ······ 4 · ·· ·· · ·♦ ·»«· ch₂ k---coch₂i**

II

CO (P)n COOCH₂I**

I II

Ac-K-(P) n-K-(P)n-K n > 6-8 ch₂ k----coch₂i**

II

CO(D)

II

Ac-K-(D-)_m-K-(D-)_m-K-COCH₂I* *

m. > 5-6

TETRAFUNKCIÓNÁLIS coch₂i** coch₂i**

Ac-K- (P)n-K(P)m-K(P)n-K coch₂i** coch₂i** m - 1 vagy 2 k-coch₂i**

COCH₂I**(D)m coch₂i**

Ac-K- (D)m-K- (D)n-K- (D)m-K

I (D)m COCH₂I** m > 5 - 6 , η = 1 vagy 2 (D egy D-aminosav lehet a nagyobb proteáz rezisztenciához) (** θ9Υ reaktív helyet jelöl; K egy lizin; P Prolin, Ac acetil; I jód; D D vagy L-aszpartát; a K-k az ellenkező oldalon vannak igy a pszeudotetramerek a csavart orsó ellentétes oldalán kapcsolódnak)

Lásd a 4(a) ábrát is.

Másik lehetőség egy 8-hemoglobinú komplex (4(b) ábra). Az ilyen típusú komplex figyelembe vételének ésszerű magyarázata az, hogy ez a nagyon hosszú felezési idő elérésének egy útja lehet, a keresztkötő különösen erős stabilitásának, valamint a komplex jelentősen nagyobb molekulasúlyának köszönhetően. A keresztkötő felveheti egy kettős elágazású csavart orsó alakját, a lánc közepén levő Arg elágazást lehetővé tevő Lys(FMOC)-kai való helyettesítésével, és egy poliprolin hélixszel vagy más az elágazó egységet tartalmazó proteáz rezisztens másodlagos szerkezettel. Ez a szerkezet lehetővé teheti 6 SGE1.1 kapcsolódását keresztkötőként. Másik lehetőségként a kötő megfelelő magjaként egy 4-helikális csomóval rendelkező protein (lásd a 4(c) ábrát) vagy egy 4-szálú csavart orsó, mint amilyet DeGrado (Science, 243:622 (1989)) szintetizált használható, az egyes hélixek a 4 helikális csomóban a GELEELLKKLKELLKG (9. számú szekvencia) konszenzus szekvenciát tartalmazzák, a hélixek három PRR vagy ···♦ ·« · ·· ·· ·*·♦ **·· * · · · r ♦ · · * >_c ·· ·· * ·· ♦·*«

- 63 PRP hurkokon keresztül kötődnek. Ez egyike a legstabilabb ismert proteineknek, a hajtogatott formát a nem hajtogatott formától G= -22 kcal/mol-lal szeparálja. Az egyes hélixek 4+ fordulóval rendelkeznek vagy kb. 22 Á hosszúak. Mivel ez nem jelent elegendő helyet két hemoglobin a hélix egyes végeihez való rögzítéséhez, ezek ugyanezen hélix eltérő felületére kell hogy kapcsolódjanak, lizinekhez, melyek az egyes hélixek poláros felszínének végeinél helyezkednek el. Az egyes hélixek amphipatikusak; ez viszonylag nagy szabadságot ad ahhoz, hogy összesen 8 lizin legyen jelen (és nem több), valamint hogy a fennmaradó lizineket argininekre cseréljük. A hélixenkénti i, i+4 sóhidak közül legalább kettőt meg kell tartani a protein stabilitásához. Egy külső keresztköthető cisztein-hordozó tetramer kapcsolása a lizin epszilon amino csoportok jódacetilálásán keresztül valósítható meg, majd a cisztein tiol csoportjával való reakcióval.

Egy módosítást bemutató példa, mely több helyet enged a tetramerek között a hélix egy fordulójának hozzáadása az A és a C hélixek N-terminusához és a B és D hélixek C-terminusához. Ez és hasonló módosítások a modellezés és kísérleti kényszer tárgyát képezik.

Analóg mag proteinek hozhatók létre az ismert 4-helikális csomóval rendelkező proteinek mutánsaiként, mint pl. a miohemeritrin vagy az apoferritin, a felületi maradékokat úgy változtattuk meg, hogy 8 (vagy ha topológiailag lehetséges több) lizin (hélixenként kettő) van jelen a felületen az egymást követő módosításhoz és a tetramer kapcsolásához.

Csökkentett izoelektromos pontokkal rendelkező poli(tetramer) hemoglobinok » · ···· *· f • · * ·

Ha a teljes keresztkötött konjugátum izoelektromos pontja befolyással van a szérum, felezési idejére a vese szűrő pórusok-tói való elektrosztatikus exklúzión keresztül további negatív töltések vonhatók be a keresztkötésbe (a hemoglobin helyett, mely a molekula funkcióját változtatná meg) a teljes keresztkötött részecske izoelektromos pontjának csökkentése céljából. Ennek egy további előnye a retikuloendoteliális rendszer általi csökkentett felvétel, ez a felvétel a kationozált albuminhoz a pl funkciója.

Az SGE1.1 szukcinilációjából előzetes bizonyítékunk van, mely szerint összefüggés van a módosított lizinek száma és az izoelektromos pont között. Ez durva becslést ad a lys glu-vá és/vagy a lys asp-pá való mutációinak számáról, mely ahhoz szükséges, hogy a pl 5 vagy kevesebb legyen. Ez az a pl tartomány, mely véleményünk szerint a felezési idő jelentős megnöveléséhez szükséges. Úgy véljük, hogy mintegy 8 lizin módosítására lehet szükség (16 egység töltésében a teljes változtatás) a kb. 2 egységnyi pl csökkentéshez. A hemoglobin funkcionális tulajdonságait tekintve kevésbé romboló ha ezt az alfa vagy a béta globin alegységek mutációja helyett inkább a peptid keresztkötőkön keresztül valósítjuk meg. Azonban néhány mutáció elvégezhető a keresztkötőben is és a fennmaradó alegységekben is. Ahogy korábban, az SGE1.1 a jódacetilált lizin epszilon amino csoportokhoz kapcsolható a pH 6.5-7.0 értéken való reakcióval.

A patkányokban levő humán szérum albumin esetében a felezési idő durván lineárisan változott a protein pl-jével, kb 4.6 órától a natív albumin esetében (pl=4) 0.8 óráig a 9.5 feletti pl-nél. A feltisztulás feltételezhetően egy összetett mechanizmus eredménye, mely magába foglalja a megnövekedett pl-vel való retikuloendoteliális rendszerbe való feltételezett megnövekedett felvételt is. A patkány tripszinogéneknél a verziók közötti szérum felezési idők közötti eltérések pl 5.-0 (t-^/2 4 P^erc) esetében még nagyobbak voltak. így a pl egyértelműen fontos változónak tűnik ezen proteinek szérum felezési idejében.

A következő táblázat példákat mutat a mono-cys tetramerek közötti keresztkötőkre, mely keresztkötők a teljes komplex izoelektromos pontját csökkentik.

Forrás Szekvencia

poliasp vagy poliglu	coch2i coch2i 1 1 Ac-K- (X)n-K	n feltehetően >= 10-12
X = D	vagy E-
II	II	coch2i 1 Ac-K- (G)n- (X)m-	ih2coc 1 (G)n-K	n > 2, hogy rugalmasságot biztosítson az egyes végeken, m>=10-12, X=D“ vagy E_
II	II	coch2i coch2i 1 1 Ac-K- (GX)n-K		n>= 5-6, m>= 10-12 X = D_ vagy E_

A javasolt keresztkötők közül sok egyesíthet legalább két, félté66

•. * · ···* · · * ·· ·· · ·· «·«« telezhetően három tulajdonságot a potenciális további hatáshoz.

Lehetséges, hogy a peptid keresztkötőkben levő egyedi amino csoport közvetlenül jódacetilálható a peptid szintézise során jódecetsavval mint az utolsó hozzáadandó aminsavval való kezeléssel, a gyantán levő lizin aminocsöpörtök védelmének megszüntetése után. Ebben az esetben a lizinek ortogonálisán védhetők NFMOC-kal vagy N-nitropiridinszulfenil csoportokkal vagy BNPEOCkal. Ez jelentősen egyszerűsítheti szintézisüket.

A szintézis részeként szereplő jódacetiláció eltérő módszere magába foglalja az sgel.l-SH vagy a peptid keresztkötő szulfhidrilekre és aminokra specifikus heterobifunkcionális keresztkötővel, mint pl a szulfo-SMCC vagy hasonló a Pierce Chemical Co.től beszerezhető (Rockford, IL)való reagensekkel való reakcióját.

Genetikailag fúzionált poli(tetramer) hemoglobinok

A multimer (pl politetramer) hemoglobin előállításának egy másik megközelítése magába foglalja az egyéb kötőket felhasználó egyéni tetramerek genetikai fúzióját. Két vagy több tetramer köthető, a kívánt molekulasúlytól és a végső molekula hajtodásának eredményességétől függően. A di-alfa vagy di-béta Hgb eltérő tetramerjeiből származó diaifa (vagy dibéta) alegységek genetikailag fúzionáltathatók egymáshoz egy kinyújtott polipeptid létrehozásához, mely köti az egyedi pszeudotetramer doméneket.

A proteolitikusan stabil nyújtott polipeptid kötések előre láthatóak, A kívánatos kötő tulajdonságok közé a következők tartoznak: 1) az egyes végeken levő glicinek, biztosítsanak rugalmasságot a diaifa (vagy béta) terminális doménekbe belépve, «··· ·· ·· ·· W V ♦ 4♦ • ·· ·· ···· és szüntessék meg a diaifa (vagy béta) terminális domének kötő másodlagos szerkezethez való kapcsolódását: 2) merevség a tetramerek szeparálásához, kinyerhető egy nyújtott szerkezettel mint amilyen a poliprolin hélix vagy poliglutamáttal vagy poliaszpartáttal; és 3) a proteázokkal szembeni semlegesség (vide supra vagy mint a kollagén szekvenciában). Az alábbiakban számos ilyen szekvenciát soroltunk fel. Nyilvánvalóan bármely más ebben a specifikációban említett peptid kötő kipróbálható miután szférikusán modelleztük a fúzionált diaifa (vagy dibéta) terminusok környezetét. A kötők egy diaifa C-terminusától a következő Nterminusa felé kell haladjanak és egy egyedüli génként szintetizálandók. A proteáz rezisztens vagy negatív töltésű másodlagos szerkezet szegmentek modellezésén túl egy vagy több Artemia kötőt kell modellezni a tetramerek között. A béta láncok szintén kapcsolhatók ezen a módon, bár a protein funkciójára kifejtett hatása ismeretlen. Lehetőség van egy további láncközötti keresztkötőkkel rendelkező vagy nem rendelkező intermolkeuláris di-béta (sgel.l) létrehozása is.

Forrás______________________________Szekvencia

poliprolin hélix	di a vagy β C term-(G)η-(P)n-(G)n-di a vagy β N-terminus n feltételezhetően >=3, m feltételezhetően >=10-12
poliaszpartát vagy	-(G)n-(D)n-(G)n- (a komplex pl-jét csökken-
glutamát	ti)
Artemia kötő	-(G)n-LRRQIDLEVTGL-(G)η-; n >=0
(példa)	(2. számú szekvencia)
egy helikális	-(G)n-KCAELEG(KLEALEG)4
csavart orsó	<- - nem fúzionált a terminushoz (oktamert

·..· ·. · ···· · · · kell képezzen a csavart orsó keresztkötéssel (3. számúő szekvencia)

A következők szerint határoztuk meg az intertetramer kötő minimumát. A humán hemoglobin A_o két szerkezetét (vagy mind a kettő az oxi vagy mindkettő a dezoxi formában) - melyeket a Brookhaven Protein Data Bank-tói szereztük vagy állítottuk össze - a lehető legközelebb helyeztük egymáshoz bármely maradék közötti van dér Waals átfedések nélkül az Insight (Biosym. Inc., San Diego, CA) programot használva. Az alfa lánc C terminális arg 141 maradékától az alfa lánc N terminális val 1 amino terminális nitrogénjéig terjedő távolság (az egyik szerkezetben) ezután mérhető. A távolság kb. 22 Á volt ha mind a két molekula az oxi szerkezetben volt és kb. 18 Á ha mind a két molekula a dezoxi szerkezetben. Az oxi és a dezoxi szerkezetekben az alfa lánc N terminusánál levő valin kitett állapotban van a szerkezetben levő hasadék oldalán, mig az arg karboxitát a hasadék alján található. így lehetőség nyílik ezen két terminus genetikai fúziójára a terminális aminosavak körüli maradékok nagy szerkezeti elmozdítása nélkül. Egy megfelelő intertetramer kötő legalább 18-22 Á hosszú, előnyösen hosszabb a szerkezetnek adandó nagyobb rugalmasság biztosítása céljából. Nincs rögzített felső határ a kötő hosszúságát illetően, azonban minél hosszabb a kötő, annál érzékenyebb a proteázzal szemben és ha a molekula elég nagynak tűnik a retikuloendoteliális rendszer makrofágja általi fagocitózisnak eshet áldozatul. Az alábbiakban néhány alkalmas kötőt soroltunk fel.

Egy alternatív fúzió előre látható az egyik hemoglobin csonkított alfa lánca és a második hemoglobinban levő N terminális alfa val 1 között. Az első molekula csonkított lehet a ser • ·

- 69 138-nál, mely esetben az intermolekuláris N terminális és a C terminális közötti távolság kb. 17 Á (dezoxi) és 22 Á (oxi) és az ezen távolságot áthidaló genetikailag inzertált kötőket az alábbiakban soroltuk fel.

így két hemoglobin molekula köthető (két intermolekuláris alfa dómén fúziója révén) egy fúziós protein létrehozása céljából, melynek mérete megközelítően kétszerese a normál humán hemoglobinénak. Egy további intramolekuláris keresztkötő, ahogy azt az rHbl.l-be bejuttattuk a hemoglobin dimerekké való disszociációjának kivédésére, is beleérthető, négy alfa dómén fúzióját eredményezve.

Azt várjuk, hogy a genetikailag inzertált kötések satbilak lesznek a proteázok jelenlétében is, a kötést körülvevő két hemoglobin révén biztosított szférikus elzárásnak köszönhetően. Ez a rezisztencia talán tovább fokozható glicinek használatával, melyek között a kötés kevésbé érzékeny a proteázokkal szemben, mivel a proteázok a glicintől eltérő maradékokra irányuló oldalánc specifitással rendelkeznek és igy gyenge a Km érték ezen szubsztrát esetében a proteázoknál. Egy poliprolin hélix is alkalmazható kötőként a proteázokkal szembeni stabilitás fokozásához. Egy poliglutamát vagy poliaszpartát kötőként való fúziója egy sokkal alacsonyabb izoelektromos pontot tesz lehetővé a komplex esetében és igy egy sokkal hosszabb szérum felezési időt.

A pszeudooligomer polipeptidekbe való beépítéshez való intertetramer kötők

köKötő vég-vég távolság

- 70 konformáció

Megjegyzés

-(gly)725 nyúj tott minimális hossz a gly tő esetében az oxi és dezoxi szerkezetekben levő terminusok áthidalásához. Hosszabb kötők (2050 maradékig) szintén jók lehetnek.

-(gly)1-3(ala)	20	Á-	Ala a	j obb-
12_(giy)1-3”	40	Á	kezes	alf a
helix			hélixben

A Gly-t a rugalmassághoz biztosítjuk és az N és C terminusokkal való fúziójuk körüli Hb szerkezet minimális zavarásának biztosításához. A hossz a glicinek számától és a nyújtás mértékétől függ.

-(gly)1-3(pro)	21 Á-	pro a bal-	12, 14, 16 prolin. A
12-16”(91^)1-3	48 Á	kezes poli-	hosszúság a prolinok és
-prolin helix		prolin hé-	glicinek számától függ.
		lixben
(giy)1-3-	26 Á-		Az asp maradékok negatív
(asp)1-3Q-	49 Á		töltéseket adnak

Más maradékok helyettesíthetők be ezekbe a kötőkbe mig hosszúságukat alapjában véve meghagyjuk. Ezek közé tartoznak • · olyan kötők., melyeket egészében véve más ismert humán proteinekből, mint pl a hemoglobin szekvenciájából vettünk, hogy kivédjük a multimer idegen proteinként való bármilyen felismerését.

A 18 Á maximális hossznál nagyobb és 22 Á-nél rövidebb kötők használata eltérően stabilizálhatja a dezoxi szerkezetet és alacsonyabb oxigén affinitást eredményezhet a multimer esetében.

Pszeudooligomer globin használata nélkül létrehozott oktamer hemoglobinok

Lehtőség van egy oktamer hemoglobin magasabb multimerek alapvető termelése nélküli létrehozására is az alfa vagy a béta lánc megfelelő cisztein mutációival (lásd az 5. ábrát).

A béta lánc génben (tetramerenként kettőt adva) vagy az alfa lánc génben (tetramerenként szintén kettőt adva) egy X-cys mutációt tartalmazó hemoglobin mutánsok - melyben a ciszteinné mutáltatott maradékok vagy rajta vannak az alegység felszínén vagy nagyon közel vannak ahhoz vagy nagyon közel vannak az alegységeket elválasztó diád axishoz - két diszulfiddal kötött oktamert (két hemoglobin) hozhatnak létre. Az ilyen mutánsok polimerizációját késleltetni kell a két diszulfid egymáshoz való közelségével oly módon, hogy miután az egyik diszulfid létrejött egy harmadik bejövő hemoglobin szférikusán gátolva legyen a két eredeti hemoglobinon levő szabad ciszteinnel való reakcióban.

Mivel lehetséges, hogy ez a mutáns nagyobb polimerizációs fokot ér el ( az egyszerű oktamernél nagyobbat) egy higitott oldat használható in vitro a diszulfid kötések létrehozásához. A hemoglobin polimerizációjának kinetikája legalább két nagyságren• · · ·

- 72 dü kell legyen (vagy nagyobb) a hemoglobin koncentrációban, mig miután az egyik diszulfid létrejött a második diszulfid két tetramer közötti megvalósulása 0 rendű legyen a hemoglobinban, így a polimerizált termék : oktamer arányának csökkennie kell a hemoglobin koncentráció csökkenésével. Ha az oktamerek képződését oxigénéit közülmények között hajtjuk végre az oktamer vs polimerek hozama tovább fokozható, mivel a két cisz mutáció közötti távolság a dezoxi szerkezetnél kisebb minden egyes esetben az oxi hemoglobin szerkezetben.

Az alábbiakban a béta lánc és az alfa lánc előnyben részesített mutációs helyeinek listáját mutatjuk be:

Béta és alfa lánc mutációs helyek az X -cys mutációkhoz a diszulfid híddal kötött oktamer hemoglobin létrehozásához.

Lánc/	Régi	Uj
Mutáció	távolság	távolság
	(Á)	(Á)
béta Asn	22	18
80 - cys
béta Asp	24	22
70 -cys
alfa Asn	24	20

Megjegyzés nincs felsorolt kóros mutáció, az asn 80 a felszínen van a Hb Tampa^a (asp - tyr) nem rendelkezik fő abnormális tulajdonsággal; Hb G-His-Tsou (asp - gly) megnövekedett O₂ affinitású, a fel színen van.

a felszínen van, nincs fő^a abnor• ·· ··*··· ·· ·· ·

78 -	cys			malis tulajdonsága az asn78 ismert
				mutációinak
alfa	Asp	22	18	a felszínen van, nincs fő abnormá-
75 -	cys			lis tulajdonsága az asp75 ismert
				mutációinak
alfa	Asp	26	20	a felszínen van, nincs főa abnormá-
74 -	cys			lis tulajdonsága az asp74 ismert

mutációinak ^a R.N. Wrightstone. Polices of International Hemoglobin Information Center (IHIC) , Comprehensive Sickle Cell Center, Medical

College of Georgia. 1988.

Gén szerkesztés és expresszió

Az egyedi polipeptid láncokat kódoló DNS szekvenciák lehetnek genom, cDNS és szintetikus eredetűek vagy ezek kombinációi. Mivel a genom globin gének intronokat tartalmaznak a genom DNS-t vagy a premessenger RNS-t megfelelően összeilleszteni képes gazdában kell expresszálni, vagy az intron kimetszésével módosítani kell. Egy legalább részben szintetikus gén használatát számos okból előnyben részesítjük. Először, a kivánt aminosavakat kódoló kódonok úgy szelektálhatok, hogy egy egyedüli vagy közel egyedüli restrikciós helyet biztosítunk a megfelelő pontoknál a szekvenciában, igy elősegítjük a a szekvencia gyors kazettás mutagenezissel való változtatását. Másodszor, a kódon szelekciót egy szelektált gazdában való expresszió optimalizálásához végezzük. Az E. coli-ban való kódon preferenciákhoz lásd • · · ·

- 74 Konigsberg, et al., PNAS, 80:687-91 (1983). Végül, a messenger RNS transzkript által létrehozott másodlagos szerkezetek beleavatkozhatnak a transzkripcióba vagy a transzlációba. Ha ez igy van, ezeket a másodlagos szerkezeteket kiküszöbölhetjük a kódon szelekció megváltoztatásával.

Természetesen ha egy kötőt használunk az alegységek genetikai keresztkötéséhez a kötő normálisan egy szintetikus DNS által kódolt.

A találmány nem korlátozódik semmilyen különös gazdasejt, vektor vagy promoter használatára. A gazdasejt lehet prokarióta vagy eukarióta, ez utóbbi esetben lehet egy növény, rovar vagy emlős (ideértve az embert is) sejt is. A sejt lehet bármilyen megfeklelő szövet típusból való ideértve inter alia egy erithrocita. Azonban az előnyben részesített gazdasejtek bakteriális (különösen E. coli.) és élesztőgomba (különösen S. cerevisiae) sejtek. A választott promoter működőképes kell legyen a kívánt gazda sejtben. Ez előnyösen egy indukálható promoter, mely az indukció révén nagyobb arányú transzkripciót biztosit. Az előnyben részesített bakteriális promoter a Tac promoter, egy DeBoer által teljesen leirt (U.S. 4,551,433, és a Pharmacia LKB-től megvásárolható) trp/lac hibrid. Más felhasználható promóterek közé tartoznak a hőérzékeny lambda P_L és a P_R promóterek, valamint a lac, trp, trc, pIN (lipoprtoein promoter és lac operátor hibrid), gal és hősokk promóterek. A használt promoter nem kell hogy megegyezzen bármilyen természetesen előforduló promóterrel. A promóterek tervezéséhez útmutatást az olyan promoter szerkezetekkel végzett kutatások biztosítják, mint Harley és Reynolds vizsgálatai (Nucleic Acids Rés. 15:2343-61, 1987) és az itt idézett közlemények. A promoter első struktúr génhez viszonyított elhelyezkedése optimalizálható. Lásd Roberts et al., PNAS (USA), « ·

76:760-4, (1979). Egy egyedüli promoter használata előnyben részesül. A megfelelő élesztőgomba expressziós rendszereket részletesen a találmány más részében irtuk le.

A használt vektor olyan vektor kell legyen, mely rendelkezik egy a gazdasejtben működőképes replikációs origóval. Kívánatos hogy rendelkezzen a globin gének inzertációjához való egyedi restrikciós helyekkel is, valamint szabályozó elemekkel és megfelelő szelektálható markerrel. Egy vektor módosítható a restrikciós helyek bejuttatásához vagy eliminálásához, hogy a további manipulációkhoz alkalmasabbá tegyék a vektort.

A multimer hemoglobin alkotórészekből álló polipeptid láncai vagy közvetlenül expresszálhatók vagy a fúziós proteinek részeként. Ha fúziós proteinként expresszálódnak ez utóbbi magába foglalhat egy olyan helyet, ahol hasíthatok a globin-nal kapcsolatos egység idegen polipeptidtől való elszabaditása céljából. Ha ez igy van, a Faktor Xa enzimmel szemben érzékeny hely biztosítható, ahogy azt Nagai és Thorgenson állítják (EP Appl. 161,937), melyet a hivatkozás révén a találmányba építettünk. Másik lehetőségként a fúziós proteinek szintetizálhatok, hajthatók és haem építhető be egy hemoglobin analóg létrehozása céljából. Az alkotórészekből álló polipeptid közvetlen expressziója kívánatos.

A bakteriális mRNS-ben a messengerhez kötődő riboszóma kötődési helye egy polipurin szakasz, mely a start (AUG) kódontól

4-7 bázisra található upstream irányban. Ezen szakasz konszenzus szekvenciája az 5'...AGGAGG...3', és gyakran a Shine-Dalgarno szekvenciaként utalnak rá. (Shine and Dalgarno, Natúré, 254:34, 1975) Az SD szekvencia és a transzlációs start kódon közötti pontos távolság és ezen spacer régió alap szekvenciája befolyásolja a transzláció hatékonyságát és empirikusan optimalizálható. (Shepard, et al., DNA 1:125, 1985; DeBoer, et al., DNA 2:231, • · · · • · · • · · * ·· ······ · ·· ♦· · ·«

- 76 1983; Hűi, et al., EMBO J., 3:623, 1984)

Továbbá, maga az SD szekvencia módosítható az expresszió megváltoztatásához. (Hűi and DeBoer, PNAS (USA), 84:4762-66, 1987) A riboszóma kötő helyek összehasonlító vizsgálata (mint amilyen Scherer, et al., vizsgálata, Nucleic Acids Rés.,8:38953907, 1907) Útmutatóul szolgálhatnak a megfelelő bázis cserékhez. Ha a hemoglobint az E. coli-tói eltérő gazdában akarjuk expresszálni azon gazda által előnyben részesített riboszóma kötő helyet kell biztositnai. (Zaghbil and Dói, J. Bacteriol., 168:1033-35 , 1986) .

Bármely gazda felhasználható, mely felismeri a szelektált promótert és a riboszóma kötő helyet és mely képes a haemet szintetizálni és beépíteni. Bakteriális és élesztőgomba gazdákat részesítünk előnyben.

Az intracellulárisan összeépített hemoglobin a termelt sejtekből nyerhető ki és tisztítható a tudomány által ismert technikákkal.

Policisztronos expresszió baktériumokban

Bár nem szükséges, kívánatos lehet, hogy az alegység, ha baktériumban expresszáljuk, ugyanabban a sejtben koexpresszálódjon, mégkivánatosabb, hogy policisztronosan koexpresszálódjon. A policisztronos operon egy egyedüli messenger RNS transzkriptet kódol, mely 1 promoter szekvenciával de kettő vagy több start és stop kódon párral rendelkezik, mely párok pontosan meghatározzák a transzlálható szekvenciákat. Az összes ilyen szekvencia cisztronként ismert és a cisztronoknak megfe77 ···· ···· ·· ···· · · • · · ·····« · · ·· *· ♦ ·· ·«·· lelő polipeptidek igy az egyedüli promóter szabályozása alatt ko-expresszálódnak.

A bakteriális operonok döntő többsége policisztronos, azaz számos eltérő gén transzkripciója megy végbe operonjuk egyedüli üzeneteként. A példák közé tartozik a laktóz operon három kötött génnel (lacZ, lacY és lacA) és a triptofán operon 5 kapcsolódó génnel (trpE, trpD, trpC, trpB. trpA). Ezekben az operonokban a messenger RNS szintézise a promóternél kezdődik, és a transzkripten belül, a kódoló régiókat különböző hosszúságú intercisztronos régiók választják el. (egy operon olyan gének egy csoportja, melyek egy egyedüli transzkripciós genetikai egységként állnak szabályozás alatt). A transzlációs hatékonyság cisztronról cisztronra változik. (Kastelein, et al., Gene 23:245-54, 1983)

Ha az intercisztronos régiók hosszabbak, mint a riboszóma rése (kb 35 bázispár), egy cisztron stop kodonnál való disszociációját egy független iniciáció követi a következő cisztronnál. Rövidebb intercisztronos szakaszok esetében vagy átfedő cisztronoknál a termináló riboszóma 30S alegysége nem disszociál a policisztronos mRNS-ről, mivel állandóan vonzódik a következő transzlációs iniciációs helyhez. (Lewin, Gene Expression, 143148, (John Wiley & Sons: 1977).

A bakteriális mRNS-ektől eltérően az eukarióta mRNS-ek általában monocisztronos természetűek. (Lewin, Gene Expression, 157) .

Egy megvalósulásban a két vagy több alkotórészt tartalmazó polipeptidet kódoló gének expresszióját egy egyedüli promóter irányítja és a gének oly módon rendeződnek, hogy a policisztronos messenger RNS transzkript átiródik, melyből az elkülönült globinszeru polipeptidek ezt követően transzlálódnak. Azonban, a találmány magába foglalja a szeparált promóterekből való eltérő ···· ·· · 9· ·· ·· ·· · · · « • «· ······ · « ·· ·· · ·····«

- 78 polipeptidek ko-expresszióját, azaz a gazda szeparált alfa és béta globin mRNS-eket ir át.

Ideális esetben, az alfa és béta globin-szeru domének stoichiometriásan azonos mennyiségben expresszálódnak. Mig egy egyedüli promóter nem garantálja az azonos mennyiséget, megszüntet egy egyensúlytalanságot okozó hatást -- a transzkripcióban levő eltéréseket, melyek a promóter erősség és elérhetőségben meglevő különbségeknek tudhatok. Ha a promóter erősségben levő eltéréseket minimalizáljuk ugyanazon plazmádon levő két azonos promóter használatával, a plazmid stabilitás csökkenne, mivel hajlama lenne a homológ régiók rekombinációjára.

Előnyösen az alfa és béta globin-szeru doméneket úgy rendezzük el, hogy a riboszóma az alfa globin cisztronokat transzlálja először. Ennek magyarázata az, hogy van alapja annak a véleménynek, hogy az alfa globin hatással van a béta globin hajtodására. Azonban a gének pozíciója úgy állítható, hogy a béta globin-szeru dómén szintetizálódjon először.

A policisztronos mRNS transzkript stabilitása, alfa és béta globin-szeru polipeptidekké való transzlációjának hatékonysága és a globin láncok tetramer hemoglobinná való hajtodása módosítható az intercisztronos régiók hosszának és bázis szekvenciájának (ez a régió az egyik cisztron stop kódonja és a következő cisztron start kódonja között fekszik), és egy első cisztronra vonatkozóan egy második cisztron egymásutániságának, és a megelőző cisztronra vonatkozó egy cisztron riboszómális kötő hely pozíciójának és szekvenciájának megváltoztatásával.

Egy előnyben részesített megvalósulásban az alfa és a béta globin-szeru polipeptid gének mindegyikét egy rövid bevezető cisztron vagy riboszómális terhelő előzi meg, mely elősegíti a globin cisztron ezt követő transzlációját. A 2. Ábrán az A régió • · · · • · két cisztront tartalmaz és az egyes cisztronokat megelőző ShineDalgarno szekvenciákat. Az első Shine -Dalgarno szekvenciát (SD#1) a riboszóma köti, mely azután az első cisztront transzlálja, mely egy oktapeptidet kódoló rövid cisztron. (Erre a cisztronra bevezető cisztronként vagy riboszómaális terhelőként utalnak.) A második cisztron egy globin gén, ebben az esetben egy FX alfa-globin gén. A második cisztron transzlációját elősegítő Shine-Dalgarno szekvencia (SD#2) az első cisztronon belül helyezkedik el. Ebből kifolyólag a kettőt transzlációs szempontból kapcsolónak nevezik. A B régió szerkezetileg azonos, azzal az eltéréssel, hogy a második cisztron FX-béta globint kódol. Az A és a B régiók között egy 43-bázisú intercisztronos régió található. Az A és a B régió bevezető cisztronjai megfelelnek a Schoner et al. (Meth. Enzymol., 153:401-16, 1987) által pCZ144-nek jelzett két-cisztronos expressziós rendszer első cisztronjának. A jelen találmány azonban nem korlátozódik a Schoner et al., által ismertetett adott starter cisztronra; más bevezető cisztronok, melyek lehetővé teszik a következő cisztron magas szintű transzlációjának újrakezdését szintén alkalmazhatók.

Az intercisztronos szekvenciák megtervezéséhez és az SD szekvenciák elhelyezkedéséhez az útmutatás az azonos policisztronos operon spontán és szabályozott mutánsainak transzlációs hatékonysága összehasonlításával nyerhető, ahogy azt Schoner et al (PNAS, 83:8506-10, 1980) példázzák. Lehetséges az eltérő operonok intercisztronos régióiban való konszenzus tulajdonságok keresése is. McCarthy, et al., (EMBO J. 4:519-26, 1985) egy transzlációt fokozó intercisztronos szekvenciát azonosított az E. coli atp operonban.

A jelen találmány célja a hemoglobin vagy annak alkotó polipeptidjeinek inkluziós testekbe való lokalizációjának csők• · • · « · • · · · · * • · · ♦ · « ·· ·♦···· · ·· · ··

- 80 kerítése vagy elkerülése. Következésképpen a találmány egy további jellemzője az, hogy a funkcionális hemoglobin alapjában véve (előnyösen több mint 80 %-a) a sejt oldható frakciójában található. Úgy tűnik, hogy ezzel a találmánnyal a funkcionális hemoglobin több mint 90 %-a igy irányítható ha alfa₂ béta₂ hemoglobint állítunk össze az itt leirt tetracisztronos operonból ko-expresszált alfa és béta globin láncokból. A di-alfa béta₂ hemoglobinnal majdnem 100 %-os az oldhatóság ha az expressziót 25 °C hőmérsékleten indukáljuk és kisebb, ha magasabb indukciós hőmérsékleten. Ezek a százalékok a sejt oldható frakciójában talált összes di-alfa és béta lánc százalékát tükrözik, és nem a sejtből való protein aktuális kinyerését.

Élesztőgombában való expresszió

Egy másik megvalósulásban a találmány hemoglobin-szerű molekulák élesztőgombában való termelésére vonatkozik. Az expresszióhoz az előnyben részesített gazda a Saccharomyces cerevisiae. Azonban fonalasgombák vagy más élesztőgombák is használhatók, erre a célra, mint pl. az Aspergillus vagy a Plchia törzsei. Ahhoz, hogy egy élesztőgomba megfelelő gazda legyen képes kell legyen replikálódó vagy integrálódó típusú rekombináns vektorokkal való transzformálódásra. Ez lehetővé teszi a kívánt DNS szekvencia kérdéses génbe való inzertálását. Képes kell legyen a nagy sűrűségű sejt szaporodásra megfelelő mennyiségben, hogy elegendő sejttömeget biztosítson, hogy a kívánt reakció tartályból a kívánt géntermék izolálható legyen, ahol ideálisan a szaporodás könnyen szabályozható számos paraméterrel, melyek közé a követke• · · · · » «*·««* · · *· · ·· · 4 4 4

- 81 zők tartoznak: tápközeg formulázás, rázatás és oxigén transzfer és hőmérséklet. Kívánatos lehet, hogy a protein szintézis expressziója indukálható legyen a tápközeg, a hőmérséklet manipulálásával, vagy bizonyos vegyszerek hozzáadásával vagy elvonásával. Végül, ahhoz, hogy megfelelő gazda legyen, az élesztőgomba képes kell legyen rekombináns proteinek termelésére, előnyösen a teljes sejt protein 1 %-os fölöslegében. Ez lehetővé teszi a kívánt rekombináns protein sokkal könnyebb izolálását.

A S. cerevisiae haploid vagy diploid törzse használható.

Például a következő diploid törzseket részesítjük előnyben:

BJY3505 X RSY330

BJY3505 x BJY1991

Más párosodások is felhasználhatók a találmány alkalmazásához .

Proteáz-hiányos törzsek felhasználása is előnyös lehet. Az élesztőgomba expressziós rendszerek két fő kategóriába sorolhatók: (1) protein szekretálására tervezett rendszerek és (2) a proteinek citoplazmás expresszálására tervezett rendszerek. Jelen esetben a citoplazmás expressziót részesítjük előnyben, mivel az élesztőgomba sejtek összehajtják a globin láncokat és beépítik a haemet a hemoglobin in vivő létrehozása céljából. Azonban lehetőség van az alfa és a béta globin láncok szeparált expressziójára és szekretálására is és a hemoglobin in vitro összeépítésére.

A globin gének egy megfelelő promóter szabályozása alatt kell legyenek. Az általánosan használt élesztőgomba promóterek általában két széles kategóriába sorolhatók: szabályozott és konstitutív. A széleskörűen használt konstitutív promóterek közé tartoznak a GAP, PGK (foszfoglicerát kináz) és az a-faktor promóter. Szabályozott promóterek szintén felhasználásra kerül-

nek, ezek közé a következők tartoznak: az élesztőgomba metallotionein promoter (a réz szabályozza), a Gall-10 promoter, a GAL7 promoter (galaktóz és glükóz szabályozza) az ADHII promoter (etanol és glükóz szabályozza), a PHO5 promoter (foszfát szabályozza) és számos hibrid promoter, mint pl. a PHO5-GAP, GAL-PGK, ADHII-GAP és a GAL-CYC1.

A GAL-GAP hibrid promoter használatát előnyben részesítjük. Mindkét elem (a GAL_UAS és a GAP transzkripciós iniciációs hely) is jól ismert. A GÁL regulon transzkripciós szabályozásának mechanizmusára irányuló kutatások meglehetősen széleskörűek voltak. A galaktóz regulon 5 a galaktóz hasznosításához szükséges enzimet kódoló gént foglal magába. Ezen gének közül négy (a GÁLI, a GAL7, a GAL10 és a GAL2) csak a galaktóz jelenlétében expresszálódik. A galaktóz indukció nem fordul elő glükóz jelenlétében, hacsak az élesztőgomba törzs nem hordoz egy mutációt a REGI génben. A GÁLI, 7, 10 és 2 géneket legalább két másik gén szabályozza a GAL80 és a GAL4. A GAL4 egy transzkripciós aktivátor protein, mely a GALl-től, 7-től, 10-től és 2-től upstream irányban elhelyezkedő aktivátor szekvenciákból (UAS_GAL) való mRNS szintézist aktiválja. Bár a GAL4 konstitutív módon expresszálódik funkcionálisan néma galaktóz hiányában. A GAL4 aktivitás repressziója galaktóz hiányában fennmarad a GAL80 gén terméke révén. A GAL80 gén nyilvánvalóan fizikai kölcsönhatásban van a GAL4-gyel a transzkripciós aktiválás kivédése céljából. Feltehetően a galaktóz vagy egy galaktóz származék kivédi ezt a kölcsönhatást hogy lehetővé tegye a GAL4 által közvetített indukciót.

A S. cerevisiae haploid törzsei három eltérő gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAP) enzimet kódoló génnel rendelkeznek. Ezeket a géneket TDHl-nek, TDH2-nek és TDH3-nak jelöltük és mindegyik egy egyedüli kópiában van jelen haploid genomonként. A TDH3 gén a sejt GAP enzimjének megközelítően 60% át termeli és a TDH1 és 2 sorrendben kb.

és 28 %-át (McAllister, L. and M.J. Holland,

1985, J.

Bioi.

Chem, 260:15019-15027).

Holland csoportja (Holland et al. ,

1981,

J. Bioi. Chem.

256:1385-1395; és

Holland et al.,

1983 ,

J. Bioi. Chem. 258:52915299) klónozta és jellemzete a S.

cerevisiae három GAP génjét. A kiónokat pGAPll-nek pGAP63-nak és pGAP491-nek jelölték. A pGAP491 megfelel a TDH3 génnek és ezért ez expresszálódik legerősebben.

Ez a promoter általánosan használt egy 600-850 bázispár hosszúságú fragmentként és alapjában véve nem szabályozott. Hosszú formájában ez egy nagyon erőteljes promoter. Az általunk használt forma csupán “200 bp hosszúságú 5' irányban a transzlációs iniciációs helytől. Ez a forma erősitő szekvenciák hozzáadása nélkül alapjában véve a promoter hosszabb formájánál kevésbé aktiv (Edens, L. et al. , Cell 37.:629 (1984)). A GÁL erősitő régió hozzáadása magasszintü expressziót és szabályozást biztosit. Csak a GAP491 promóterrel az alfa és béta globin a teljes sejt protein 0.2 %-ánál kisebb szinten termelődött; a GAL-GAP491 hibrid promóterrel az expresszió a teljes sejt protein

7-10 %-ára emelkedett.

Más hibrid promóterek is érdeklődésre tarthatnak számot: a

GAL-SIGMA; a SIGMA-GAP; a GAL-EF III; a SIGMA-EF III.

Kigondolhatok más működőképes promoter rendszerek is. Ezek közé tartozik az ezekre való korlátozás nélkül számos konstitutív promoter. Például az élesztőgomba párosodási faktora (MFa) promóter vagy a párosodási faktor a promoter , az MF(a), a foszfoglicerát kináz promoter (PGK), a hexokinázl, a hexokináz2 a glükokináz, a piruvát kináz, a trióz foszfát izomeráz, a foszfoglicerát izomeráz, a foszfoglicerát mutáz, a foszfofruktóz kináz vagy az aldoláz promóterek is alkalmazhatók. Röviden, bármely jól • · · ·

- 84 expresszált élesztőgomba promoter megfelelhet az élesztőgombában való hemoglobin expresszióhoz. A természetesen előforduló szabályozott promoterek széles köre is felhasználható, pl. GÁLI-10, GAL7, PHO5, ADHII használtak az élesztőgombában való heterológ proteinek termeléséhez. Szintetikus vagy félszintetikus élesztőgomba promoterek is felhasználhatók, mint pl. a GAL-PGK, GAL-MFa-1, GAL-MFal, GAL-SIGMA. Az ADHII szabályozó szekvenciák számos promóterből származó erős transzkripciós iniciációs helyhez párosíthatok. A PHO5 szabályozó szekvenciák vagy a sigma elem szabályozó szekvenciák szintén felhasználhatók erőteljes hibrid promoterek megszerkesztéséhez. Az élesztőgomba promótereken túl elképzelhető egy olyan erőteljes prokarióta promoter használata, mint a T7 promoter. Ebben az esetben, a T7 polimeráz egy szigorúan szabályozott élesztőgomba promoter szabályozása alá helyezhető. A T7 promoter szabályozása alatt álló hemoglobin géneket hordozó élesztőgomba sejtekben való fág polimeráz indukciója lehetővé teszi a gének ezen nagyon hatékony fág polimeráz általi transzkripciój át.

Mivel a fent leirt élesztőgomba szabályozó szekvenciák többsége a transzkripció pozitív szabályozóiként szereplő proteinek céljaiként szolgálnak, elképzelhető, hogy korlátozzák a transzkripciót olyan szituációkban, ahol a cél szekvencia több kópiában van jelen. Ilyen szituáció olyan vektorokkal állhat fenn, mint a pClB, pCIT,pClU vagy a pCIN, melyek sejtenként 200 kópiánál nagyobb számban lehetnek jelen. A pozitiv szabályozó (pl. a GAL4) túlexpresszálása fokozott expressziót eredményezhet. Lehetséges egy olyan törzs megszerkesztése, melyben a GAL4 gént úgy változtattuk meg, hogy eltávolítjuk promóterét és a promótert a GAL7 vagy a GAL1-10 promóterekkel helyettesítjük, melyek mindegyike sokkal hatékonyabban íródik át mint a GAL4 promoter.

- 85 Ebben az esetben a pozitív transzkripciós aktivátor protein GAL4 emelt szinten expresszálódna akkor, amikor a hemoglobin expresszióját indukáljuk.

A magasabbrendü eukarióta riboszóma kötő helyek konszenzus szekvenciáját Kozack határozta meg (Cell, £4:283-292, 1986) a következőnek: G^gCCAUGG (10. számú szekvencia). Ettől a szekvenciától való eltérés, különösen a -3 pozícióban (A vagy G) nagy hatással van egy adott mRNS transzlációjára. Gyakorlatilag az összes erősen expresszált emlős gén ezt a szekvenciát használja. Az erősen expresszált élesztőgomba mRNS-ek másrészt különböznek ettől a szekvenciától és ehelyett az AAAAAUGU szekvenciát (Cigan and Donahue, GEne, £9:1-18, 1987) használják. Az α és β-globinok expressziójához általunk használt riboszóma kötő hely megfelel a magasabbrendü eukarióta riboszóma kötő helynek. A találmány szándékán belül van az, hogy szisztematikusan megváltoztatjuk ezt az RBS-t az olyan változtatások hatásának tesztelése céljából, mely változtatások még inkább az élesztőgomba RBS-re emlékeztetővé teszik azt. Le kell szögezni, hogy a -2, -1 és +3 pozíciókban való változásokat úgy találtuk, hogy általában csak gyengén befolyásolják a transzlációs hatékonyságot élesztőgombában és emlősökben.

A gének S. cerevisiae-ben való intracelluláris expresszióját elsősorban a génnel kapcsolatos promoter erőssége, a plazmid kópia száma (plazmid eredetű géneknél), a transzkripciós terminátor, a gazda törzs és a gén kódon preferencia mintája befolyásolják. Ha a géntermék szekréciója kívánatos, a szekréciós vezető szekvencia jelentőssé válik. Meg kell jegyezni, hogy sokkópiás plazmidok esetében az erős promoter szerkezetek csökkenthetik a szekréciós hatékonyságot. Ernst, DNA 5:483-491 (1986).

·· · · . * ·· ·· · · > - · · · • ·· . * · · ·

.. ..........

• · · · · · ·

- 86 Számos extrakromoszómálisan replikálódó vektor (plazmid) áll rendelkezésre az élesztőgomba sejtek transzformálásához. A leghasznosabb sokkópiás extrakromoszómális élesztőgomba vektorok a hordozó vektorok, melyek egy teljes hosszúságú 2μ-^^ használnak egy E. coli plazmiddal kombinációban. Ezek a vektorok olyan géneket hordoznak, melyek lehetővé teszik a plazmid megfelelő élesztőgomba mutánsban való fenntartását és antibiotikus rezisztencia markerek fenntartását, melyek lehetővé teszik az E. coliban való szelkeciót. A teljes hosszúságú 2μ^ότ használata a részleges 2μ-szekvenciát tartalmazó vektorokkal szemben általában sokkal nagyobb plazmid stabilitást eredményez, különösen az olyan élesztőgomba törzsekben, melyekből korábban a 2μ plazmidot eltávolították. Az itt leirt vektorok pC sorozata ilyen tipusu vektorokat jelent.

A törzsek megszerkeszthetők oly módon is, hogy a GALGAP hemoglobin expressziós kazettát integráltuk a kromoszómákba élesztőgomba integráló vektorokat használva. Bár a hemoglobin gének kópia száma kisebb kell legyen, mint a plazmid vektoroké, ezek meglehetősen stabilak és talán nem igényelnek szelekciót a gazdasejtben való fenntartáshoz. Az élesztőgomba integráló vektorok közé tartoznak a Yip5 (Steuhl, et al., PNAS, 76:1035-39, 1989), Yipl (Id.), és a pGT6 (Tchumper and Carbon, Gene, 10:157166, 1980). Az ezen és más élesztőgomba vektorokkal kapcsolatos információkért lásd Pouwels, et al., Cloning Vector VI-I, et seq. (Elsevier, 1985).

A kívánt globin-szeru doméneket kódoló gének szeparált plazmidokkal, vagy ugyanazon a plazmidon is bejuttathatok.

Az erősen expresszált élesztőgomba gének nagyon magas kódon egyoldalúságot mutatnak. A gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenázt és ADH-I-et kódoló gének például 90 %-os egyoldalúságot mutat egy élesztőgomba kódon egyol- 87 25 tagú kódonsorral szentben. Az erősen expresszált gének (a teljes mRNS 1 %-nál nagyobb) élesztőgomba dalúsági indexe .090-nál nagyobb. A mérsékelten expresszált gének (a teljes mRNS 0.1-0.05 %-a) egyoldalúsági indexe 0.6-0.8, és az alacsony szinten expresszált gének (a teljes sejt protein 0.05 %-ánál nagyobb) kódon egyoldalúsága 0.10-0.50 (Bennetzen and Hall, J. Bioi. Chem., 257:3026-3031, 1982). A humán a-globin cDNS-ének kodonjához számított érték 0.23. Hasonló érték számítható a β-globin cDNS esetében. Mivel nagyon erős korreláció van a leggyakrabban használt kódonok között, lehetséges, hogy a humán cDNS-ből való hemoglobin expresszió élesztőgombában korlátozható a megfelelő tRNS molekulák elérhetőségével. Ha ez igy van, a leginkább előnyben részesített élesztőgomba kódonokat használó gének teljes szintézise fokozhatja az expressziós szinteket. Egészen valószínű, hogy az ártalmas kódon használat legnagyobb negatív hatása akkor lenne, ha a cDNS-ben használt olyan kódonok lennének bőségben, melyeket kis többségben levő tRNS-ek képviselnék. Egy ilyen esetben a magasszintő hemoglobin expresszió teljesen elszívná a tRNS molekulákat, ezzel csökkentve nem csupán a hemoglobin transzlációját, hanem olyan élesztőgomba proteinek transzlációját is, melyek szintén azt a kódont használják. Az aglobin humán cDNS esetében a legáltalánosabban használt leucin kódon a CTG (21-bol 14), ezt a kódont soha nem használják magasan expresszált élesztőgomba génekben (Guthrie and Abelson, The Molecular Biology of thr Yeast Saccharomyces, Eds. Stratern, Jones and Broach, 1982. Cold Spring Harbor, NY). Az alacsony kódon egyoldalúsági index és a ritka élesztőgomba kódonok jelenléte a globin cDNS-ekben kellőképpen ösztönzött minket az alfa- és béta-globin gének módosított formájának szintetizá lására, az előnyben részesített élesztőgomba kódonokat alkalmaz- 88 va.

Vegyes adatok

A csatolt igénypontok beépítésre kerültek a találmányba a hivatkozás révén az előnyben részesített megvalósulások további felsorolásaként. Az összes idézett irodalmi hivatkozást olyan mértékben építettük be a találmányba a hivatkozás révén, amilyen mértékben szükség van arra a találmány kivitelezéséhez ahogy itt és később leirtuk.

A leirt multimer hemoglobinok termelésében használt expressziós vektor készítmények előnyben részesíthetők a Budapesti Szerződés értelmében deponált következő vektorokkal, melyeket az American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA) törzsgyüjteménynél helyeztünk letétbe 1990 másjus 10-én:

ATCC 68323 pDL III-14C

Ez a pKK223-3 (Pharmacia LKB, Piscataway, New Jersey, UDA) és a pGEMl (PromeguCorp., Madison, Wisconsin, USA) származéka, mely az egyedüli Tac promóter által irányított policisztronos operon egy részeként szereplő des-Val alfa globin és des-Val béta globin részére hordoz szintetikus géneket.

ATCC 68324 pDL IV-8a

Ez a PDL III-14c egy származéka, mely egy alfa globin egységet kódoló fúzionált gént, egy glicint és egy második alfa globin

·. ·' · ·* · : : ·’’·

·. ·..···:·· :

·♦ ··· · egységet, valamint második génként des-Val béta globint kódoló gént tartalmaz.

ATCC 20992 pGS 389

Ez egy olyan élesztőgomba vektor, mely a GALGAP promóterek szabályozása alatt expresszálja az alfa és a béta globint.

Ezen vektorok depozitja nem jogosít fel ezek előállítására vagy eladására.

1. példa

A di-a globin mono-cisztein (A71C, D75C, vagy S81C) mutáns expressziós vektor megszerkesztése

A következő plazmidokat, melyek előállítását részletesen

Hoffman et al., írták le (WO88/09179) manipuláltuk ebben a példában.

pDL ll-83a plazmid

Egy Met iniciációs kódont, egy Faktor X helyet (Ile-Glu-Gly-Arg)(11. számú szekvencia) és egy humán alfa globint kódoló gént, melyre kollektiven FX-Aként utakunk, szintetizáltunk és az M13mpl9 Xmal/PstI helyére klónoztuk. Az FX-A gént hordozó EcoRI-PstI fragmentet kimetszettük és a pKK 223-3-ba újra klónoz-

tűk, a Tac promóter szabályozása alá helyezve ezzel. Ezt a származékot pDLII-62m-nek neveztük. A pDLII-62m-ből az FX-A gént eltávolitottuk és az EcoRI-Pstl-gyel linearizált pGEMl-gyel ligáltuk a pGEM-FX-A-t létrehozva. Ezt Ndel-gyel és Eaql-gyel emésztettük, eltávolitva ezzel a Faktor Xa-t kódoló szekvenciát (és az a globint kódoló szekvencia egy részét). A kimetszett fragmentet egy szintetikus oligonukleotiddal helyettesítettük, mely visszahelyezte a hiányzó a globin kódonokat; a kapott plazmidot pDLII-83a-nak neveztük, az expresszált protein a Met-ValLeu-... .

A pDLII-91f plazmidot, melyben a gén Met-Leu...-t kódol Met-VAl-Leu helyett hasonlóképpen szerkesztettük meg a pGEM-FX-A-ból, de egy eltérő szintetikus helyettesítő oligonukleotiddal, melyből hiányzott a Val kódon.

pSGE 1.1 E4 plazmid

Ezt a plazmidot (mely SGEl.l-ként is ismert) az 1. Ábrában irtuk le. A pDLIV-8A plazmid SGE1.1E4 plazmiddá alakítható a következő eljárással.

A pDLIV-8a expressziós plazmid tartalmazza a diaifa kódoló szekvenciát, melyben az alfa globinokat egy egyedüli glicin kódon kapcsolja, valamint egy egyedüli Ptac promóter szabályozása alatt álló des-val béta globin géneket. A plazmid ampicillin rezisztenciát kódol, nincs funkcionális tetraciklin rezisztencia génje és Rop+ és Lac. Egy kereskedelemben beszerezhető kitet mint a DuobleTake™ (Stratagene, Inc.) felhasználó oligonukleotid által iráényitott hely specifikus mutagenezis alkalmazható a Presbyterian mutáció béta globin szekvenciába való inzertálására.

AAC

AAA

TTG

TTT asn

108 lys

Ezután a végső expressziós plazmidot az SGE l.lE4-et (amp R, tét R, Rop-, Lac+) szerkesztjük meg egy funkcionális tetraciklin rezisztencia gén és a lacl gén inzertációjával, mely egy indukáló anyaggal való indukcióig a Ptac promótert gátló lac represszor proteint kódolja. Ezt a módosítást az alábbiakban írjuk le.

A plazmid első módosítása a lacl gén inzertálása. Ez a gén polimeráz lánc reakciós (PRC) amplifikációval szintetizálható a gyártók eljárásának megfelelően (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) az E. coli JM109 törzsének F episzómáját (FtraD36, proAB, lacIndeltaM15) használva szubsztrátként. A következő oligonukleotidok használhatók primerként:

előre irányuló:

5'-GCGGCCGCGGAAGAGTCAATTCAGGAGGGTG-3' (12. számú szekvencia) fordított:

5'-GCGGCCGTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAA-3' (13. számú szekvencia)

A primerek 5' végeiken a NotI restrikciós enzim helyeket kódoló szekvenciákat tartalmaznak. A PRC amplifikáclós reakció terméke tompa végű lehet és az expressziós plazmid PvuII helyére klónozható. A PvuII helyet nem szerkesztjük újra ezen klónozó lépés alatt igy a ligálást követő PuvII-vel való emésztés linea····

- 92 rizálja a lacl szekvenciát magábafoglaló plazmidokat. A linearizált plazmidok nem transzformálják az E. colit. Mivel a primerek csupán a lacl gén transziáit részével komplementerek, ez a fragment nam tartalmazza saját promóterét. Megjegyzendő, hogy a hemoglobin indukálhatósága vagy expressziója a lacl gén orientációjától függ, igy a lacl gén inzertálása után az orientációt ellenőrizni kell. A helyes orientáció kisebb EcoRI fragmenttel rendelkezik, mint a nem helyes. Továbbá, a lacl represszor gén PuvII restrikciós helyre való inzertálása inaktiválja a rop génterméket és megnövekedett plazmid kópiaszámot eredményez.

A plazmid végső módosítása a funkcionális tetraciklin rezisztencia gén visszahelyezése. Ez a kereskedelemben beszerezhető pBR322 EcoRI-gyel való emésztésével végezhető el, amit az EcoRI átfedésekkel és egy belső BamHI hellyel komplementer 5' és 3' végeket tartalmazó szintetikus DNS kötő ligációján keresztüli inzertációja követ. Ebből a tetraciklin rezisztencia 5' kódoló szekvenciáját tartalmazó módosított pBR322 vektorból származó BamHI fragmentet tisztítottuk agaróz gélelektroforézissel, majd a módosított pDL IV-8a plazmid BamHI helyére inzertáltuk. A tet^R fragment csupán egy orientációja eredményez tetraciklin rezisztencciát; a törzsek a helyes orientációra a megfelelő tápközegen való szaporítással szkrinelhetők. A ter^R fragment módosított vektorba való inzertálása visszaállítja a tetraciklin rezisztenciát és SGEl.lE4-et termel.

pGEM di-alfa plazmid

Az SGE1.1 E4 di-alfa gén hordozó Smal/PstI fragmentjét

Smal/PstI hasitásu pGEM 1-gyel ligáltuk a pGEM di-alfa létrehozása céljából.

1.1 Az α gén fágszkriptbe való szubklónozása

A desfxa pGEM (pDLII-83a) vektort EcoRI és PstI endonukleá zokkal hasítottuk és az EcoRI/Pstl-gyel emésztett fágszkriptbe ligáltuk (melyet a Stratagene-tői szereztünk). A DH5a E. coli törzset a ligációs eleggyel transzformáltuk és a sejteket 2xYT lemezekre szélesztettük, melyeket 10 μΐ 100 mM IPTG-t, 25 μΐ 2 %-os X-Gal-t (DMSO-ban) és 150 μΐ XL-1 sejteket (Stratagene) tartalmazó 3 ml fedőagarral befedtünk. A tiszta plakkokat izoláltuk és 37 °C hőmérsékleten XL-1 sejteket tartalmazó 2xYT tápközegben szaporítottuk. A tenyészetből kétszálu DNS-t izolál tünk és restrikciós analízissel és agaróz gélelektroforézissel ellenőritük az 500 bázispár hosszúságú α gén jelenlétére. Egyszálú DNS-t izoláltunk a desfxa fágszkript transzformánsok (fl91 elnevezésű) egyikéből. Az egyszálú DNS-t szekvenáltuk a desfxa gén fágszkriptben való jelenlétének megerősítésére.

1.2 Mutagenikus oligonukleotidok

Három mutagenikus oligonukleotidot használtunk három független mutagenikus reakcióban. Az oligonukleotidok szekvenciája a következő volt (a mutáns kódont aláhúztuk):

Nigéria mutáció: aS81C

5' CCG AAC GCG TTG TGC GCT CTG TCT GAT 3' (14. számú szekvencia) aD75C

5' GGT GCT CAC GTT GAT TGC ATG CCG AAC GCG 3' • · ······ β • ·· · . ·. ·· · .

·· · · ·· (15. számú szekvencia) oiA71C

5' CTG ACC AAC GCT GTT TGC CAC GTT GAT GAT 3' (16. számú szekvencia)

1.3 Az A71C, D75C és az S81C mutagenikus oligonükleotidok kináz reakciójának körülményei:

μΐ oligonukleotid (kb. 300 pmol) μΐ 10 mM ATP-t tartalmazó lOx kináz puffer

0.5 μΐ T4 polinukleotid kináz (10 U/μΙ, New England Biolabs)

15.5 μΐ H₂O μΐ 10 mM spermidin

A reakciót 1 órán keresztül inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten, majd μΐ vizet adtunk hozzá és a reakciót 10 percig tartó hővel való inaktiválással állítottuk le.

1.4 Mutagenezises reakció μΐ fw 191 ss DNS (0.5 pmol) μΐ kináz oligonukleotid (vagy A71C, D75C vagy S81C kb. 45 pmol mennyiségben) μΐ lOx anneáló puffer (Promega) μΐ H₂O a primer nélküli kontrol a következő:

1	μΐ	fw	191 ss DNS
2	μΐ	10x	anneáló puffer
17	μΐ	h2o

A reakciót 65 °C hőmérsékleten végeztük, majd lassan lehütöttük

- 95 35 °C hőmérsékletre (kb 70 perc alatt) és 5 percre jégre helyeztük. A következő reagenseket adtuk hozzá és a reakciót 37 °C hőmérsékleten 90 percig inkubáltuk:

μΐ x szintézises puffer (Promega) μΐ T4 gén 32 protein (0.5 μg/μl, Biorad) μΐ T! DNS polimeráz (3 U/μΙ, NEB)

0.5 μΐ T4 DNS ligáz (lOU/μΙ, NEB) μΐ H₂0

200 μΐ 71-18 műt S kompetens sejteket (a Promega Megváltoztatott Hely eljárása szerint készítettük) transzformáltuk az egyes mutagenezises reakciók 10 μΐ mennyiségeivel, 30 percig jégre helyeztük majd két percig 42 °C hőmérséklettel hősokkoltuk. A transzformációs elegyet hozzáadtuk 3 ml 2xYT tápközeghez és 37 °C hőmérsékleten (rázatás mellett) szaporítottuk 5.5 órán keresztül. Inkubálás után a három tenyészetből 1-1 ml-t eltávolítottunk, centrifugáltuk és 800 μΐ mennyiséget friss kémcsőben tároltuk 4 °C hőmérsékleten a mutáns fág törzsoldataként.

1.5. A D75C mutánsokra való szkrinelés

A D75C mutáns fág törzsoldat 10^-5 hígításának 100 μΐ mennyiségét szélesztettük 153 mm 2xYT lemezeken 0.5 ml XL-1 sejteket tartalmazó fedoagarral bevonva. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk kb. 5 órán keresztül. Nitrocellullóz szűrők duplikátumait leemeltük az egyes lemezekről és a plakkokat 6 ml 0.5 M NaOH/1.5 M NaCl-ben lizáltuk 10 ml 1 M Tris-HCl pH8.0/1.5 M NaCl elegyében semlegesítettük és 500 ml 6xSSC-ben mostuk. A szűrőket levegőn megszáritottuk és 75 °C hőmérsékleten 45 percig hevitettük. Ezután a szűrőket rövid ideig főztük 1 %-os SDS-ben

a prehibridizációt megelőzően. A szűrőket 20 ml oldatban prehibridizáltattuk 4 órán keresztül 68 °C hőmérsékleten. A prehibridizációs oldat a következőket tartalmazta:

5xSSC (20x SSC Maniatis receptje alapján elkészítve)

0.1 % (w/v) N-lauroilszarkozin

0.02 % (w/v) SDS

0.5 % blokkoló reagens (Genius Kit, Boehringer Mannheim)

A D75C oligonukleotidot n^⁸²^ ATP-vel jelöltük a következők szerint:

μΐ oligonukleotid (80 pmol) μΐ lOx kináz puffer μΐ n(⁸²> ATP (10 pC/pl, a specifikus aktivitása > 3000

Ci/mmolnál) μΐ H₂O μΐ kináz (10 U/μΙ, NEB).

A reakciót 5 órán keresztül inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten. A be nem épült ATP-t egy Biospin 30 oszlopon (Biorad) keresztül történő centrifugálással eltávolitottuk. A teljes próbát (17000 cpm/μΐ) hozzáadtuk a prehibridizációs keverékhez és a szűrőket egy éjszakán keresztül hibridizáltattuk 46 °C hőmérsékleten primer nélküli kontroll szűrőt is használva. A következő napon a szűrőket 10 percig mostuk szobahőmérsékleten (RT) 6xSSC-ben és egy éjszakára -70 °C hőmérsékleten Kodak X-Omat filmre helyeztük.

A szűrőket 10 percig 57 °C hőmérsékleten 6xSSC-ben mostuk, megszáritottuk és egy éjszakán át exponáltuk, majd 10 percig 67 °C hőmérsékleten 6xSSC/0.1% SDS-ben mostuk, megszáritottuk és egy éjszakán át újra exponáltuk. Az utolsó mosás 10 percig tartott 70 °C hőmérsékleten 6xSSC/0.1 % SDS-ben, majd a szűrőket ismét megszorítottuk és egy éjszakán át exponáltuk.

Tíz a mutáns oligonukleotidhoz eltérően hibridizálódott plakkot izoláltunk (a primer nélküli kontrolihoz viszonyítva). A plakkokat 5 ml 0.25 ml XL-1 sejteket tartalmazó 2xYT tápközegbe helyeztük. A tenyészeteket rázatva inkubáltuk 37 °C hőmérsékleten

7.5 órán keresztül. Az egyes tenyészetek 1 ml mennyiségeit eltávolitottuk, 5 percig centrifugáltuk friss csövekbe helyeztük és 4 °C hőmérsékleten tároltuk az ezt követő szekvenáláshoz és plakk tisztításhoz.

1.6 Az A71C és S81C mutánsaira való szkrinelés

Az A71C törzs fág mutagenezises reakció 10~³ hígításának 1 μΐ mennyiségét és az S81C mutagenezises reakció 10^-3 hígításának 20 μΐ mennyiségét négy különálló 82 mm-es 2xYT/tet(lOmg/ml) lemezekre szélesztettük, 3 ml fedőagart és 100 μΐ XL-1 sejtet használva a fedőrétegezéshez. A fentiek szerint szélesztettünk egy primer nélküli kontrollt is. A lemezeket 37 °C hőmérsékleten 5 órán keresztül inkubáltuk; a plakkokat az egyes lemezekről nitrocellulóz szűrőkre helyeztük és a szűrőket egy éjszakán át szárítottuk szobahőmérsékleten. A következő napon a plakkokat 0.5 M NaOH/1.5 NaCl elegyével 3 percig lizáltattuk, 3 percig 1 M Tris-Hci ph 7.0/1.5 M NaCl elegyével semlegesítettük és 6xSSCben mostuk 5 percig. A szűrőket levegőn megszáritottuk, majd 75 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül hőkezeltük. Ezután a szűrőket rövid ideig 1.5 %-os SDS-ben főztük a 6 órán keresztül 60 °C hőmérsékleten tartó prehibridizáció előtt, melyhez a fent leirt prehibridizációs oldatot használtuk.

1.7 Az A71C és az S81C oligonukleotidok digoxigenin felhasználásával történő jelölése (Az összes reagenst a Boehringer Mannheim-től szereztük be.) μΐ A71C (100 pmol) vagy 1 μΐ S81C (100 pmol) μΐ terminális transzferáz puffer pl 25 mM CoCl₂ pl 1 mM dUTP-digoxigenin pl 04 31 pl H₂O (sorrendben A71C és S81C reakciók) pl terminális transzferáz (25 U/μΙ)

A reakciókat 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk 3 órán keresztül, melyet egy 6 órás RT követett. Digoxigenin-jelölésü A71C és S81C próbákat (20 pl) adtunk hozzá a megfelelő szűrőkhöz 10 ml prehibridizációs oldatban, a prímért nem tartalmazó kontroll szűrővel együtt. A szűrőket egy éjszakán keresztül 47 °C hőmérsékleten hibridizáltattuk.

1.8 Szűrő mosás és előhívás

Az összes szűrőt először 6xSSC/0.1% SDS-ben mostuk 15 percig 30 °C hőmérsékleten majd 15 percig 42 °C hőmérsékleten.

A jelölt A71C vagy S81C oligonukleotidokkal próbáltatott négy szűrő mindegyikét elkülönítettük, majd fokozatosan emelkedő hőmérséklet mellett mostuk őket a prímért nem tartalmazó kontroll szűrővel együtt. Az A71C és S81C szűrők mindegyikéből egyet lOml 6xSSC/0.1 % SDS-t tartalmazó műanyag zsákba helyeztük és 10 percig mostuk a négy hőmérséklet valamelyikén azaz 50 °C, 60 °C, vagy 65 °C hőmérsékleten. A nagy hőmérsékleten való mosás után az egyes szűrő sorozatokat a Genius Kit eljárásának megfelelően előhívtuk.

Először a szűrőket tartalmazó zsákokat megtöltöttük 10 ml 100 mM Tris-HCl, pH 7.5/150 mM NaCl (A puffer) elegyével és 15 percig inkubáltuk. Ezután a puffért eltávolitottuk és 70.5 % blokkoló reagenst tartalmazó A pufferrel helyettesitettük, majd további 15 percig inkubáltuk RT-n rázatás nélkül. Anti-digoxigenin antitestet (2 μΐ) adtunk közvetlenül az egyes zsákokhoz és 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A szűrőket ezután eltávolitottuk megfelelő zsákjaikból és együtt mostuk 15 percig 100 ml A puffer/0.05 % blokkoló reagens elegyében szobahőmérsékleten, melyet egy 15 perces A pufferben való mosás követett. Az utolsó mosás 100 ml 100 mM Tris-HCl, pH 9.5/100 mM NaCl/50 mM MgCl₂ (B puffer) elegyében történt 5 percig szobahőmérsékleten. Az adott hőmérsékletről származó szűrők egyes sorozatait külön zsákokba helyeztük 5 ml szin előhivó oldatba (5 ml 22.5 μΐ 75 mg/ml NBT/15 μΐ mg/ml X-foszfátot tartalmazó B pufferbe). A szűrőket 30 percig sötétben inkubáltuk szobahőmérsékleten. 30 perc után a szűrőket eltávolitottuk az előhivó oldatból, 5 percig mostuk 100 ml ΙΟχΤΕ-ben és 5 percig 100 ml lxTE-ben, mindkét esetben szobahőmérsékleten. A szűrőket szobahőmérsékleten megszáritottuk.

A Genius Kit szkrinelési eljárás eredményeit felhasználva 10 az A71C vagy S81C jelölt oligonukleotidhoz eltérően hibridizálódott plakkot izoláltunk, majd 3 ml 0.25 ml XL-1 sejtet tartalmazó 2xYT tápközegbe helyeztük és 7.5 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk rázatás mellett. Az egyes tenyészetek 1 ml mennyiségeit eltávolitottuk, 5 percig centrifugáltuk, friss kémcsövekbe helyeztük és 4 °C hőmérsékleten tároltuk az ezt követő szekvenáláshoz és plakk tisztításhoz.

1.9 A mutációk megerősítése szekvenálással

- 100 Egyszálu DNS-t izoláltunk 800 pl mutáns fág törzs felüluszóból és szekvenálásnak vetettük alá a Sequenase kitet (USB), és primerként az a 179 oligonukleotidot használva. Az a 179 oligonukleotid egy 18-tagu homológ cys egy a mutációs helytől kb. 100 bázispárnyira upstream irányban levő régióig. A szekvenálás megerősítette az oiA71C, aD75C és az aS81C mutációk jelenlétét

A fág törzsoldatot plakk tisztítottuk a 10^-8 és 10^_1° hígítások 10 pl mennyiségeinek 2xYT/tet (10 mg/ml) lemezekre való szélesztésével, melyeket 200 pl XL-1 sejteket tartalmazó 3 ml fedőagarral vontunk be. Hét órás 37 °C hőmérsékleten való inkubálás után egy egyedüli plakkot izoláltunk az egyes mutáns lemezekről és 90 ml 10 ml XL-1 sejteket tartalmazó 2xYT/tet (10 mg/ml) tápközeg inokulálására használtuk. A tenyészeteket egy éjszekán keresztül szaporítottuk 37 °C hőmérsékleten rázatás mellett. Az egyes mutáns fág törzsoldatból 1 ml mennyiséget eltávolítottunk, centrifugáltuk és a felüluszót -80 °C hőmérsékletre fagyasztottuk a megfelelően tisztított mutáns fág törzsoldataként. Kétszálu DNS-t preparáltunk a fennmaradó tenyészetből az ezt követő 1.1E4 expressziós vektorba való szubklónozási lépésekben való alkalmazáshoz.

1.10 Az acys mutánsok l.lE4-be való szubklónozása

A di-α gén di-a protein N-terminális vagy C-terminális doménjeiben levő három cisztein mutációval való megszerkesztéséhez három szubklónozási lépésre van szükség:

1) A cys mutáns a gén Eagl-Pst fragmentként fágszkriptből az

Eagl-Pstl-gyel emésztett desval a pGem vektorba (pDL Il-91f) való transzferálása. Ez a lépés biztosítja a mutáns a génnek a helyes

5' terminust.

101

2) A mutáns di-α gént, mely az egyes cys mutációkat a 3' a génben tartalmazza, úgy szerkesztjük meg, hogy az Eagl DNS fragmentet a di-α pGem-ből (pGem di-alfa) a megfelelő cys mutáns desval a pGem plazmid Eagl helyére inzertáljuk. Az 5' a génben a cys mutációt tartalmazó mutáns dia gént úgy szerkesztettük meg, hogy a BstBl DNS fragmentet a dia pGem-ből a cys mutáns desval a pGem plazmid BstBl helyére inzertáltuk.

3) Végül, az egyes mutáns dia géneket az 1.1E4 expressziós vektorba klónoztuk Smal-Pstl fragmentként.

A szubkónozási eljárásban az egyes lépéseknél a DH5a-ba való transzformációkat úgy végeztük el, ahogy azt a β G83C mutáció l.lE4-be való szubklónozásának módszerében leírtuk (lásd lent). A helyes a génben levő fontos cys mutáció jelenlétét szekvenálással megerősítettük a szubklónozási eljárás egyes állomásainál. Az l.lE4-ben levő dia cys mutációk mindegyikét a 127-es E. coli törzsbe transzformáltuk, melyet TB komplett tápközegen szaporítottunk és IPTG-vel indukáltuk. A dia és β proteinek expresszióját SDS-PAGE és Western-lenyomat technikával erősítettük meg.

2. példa Két SGE1.1 monocys pszeudooktamer létrehozására irányuló oxidációjának eljárása

A kérdéses hemoglobin mutánsokat standard fermentációs táplevesben szaporított E. coli-ban expresszáltuk az IPTG-vel való indukció után. A sejteket pelletáltuk, 40 mM Tris-bázis, 2 mM benzamidin/gm sejt pép 3 mól mennyiségében reszuszpendáltuk, és egy Microf luidizer™-en (Microfluidics, Inc.) keresztül két lépésben lizáltuk. A lizátumot a sejt hulladék eltávolítása céljából centrifugáltuk és a felüluszót összegyűjtöttük. A • ·

- 102 tetramer hemoglobint Mathews et al., módszertanában leirt módon (Methods in Enzymology, sajtó alatt) tisztítottuk a felüluszóból. Röviden, a felüluszót 5 mM Trissel (pH7.0 ) hígítottuk míg a konduktivitás elérte a 200 ^mhos értéket. Ezután az oldatot 20 mM Trissel (pH7.0) ekvilibrált Q Sepharose átfolyási ágyon vezettük át. Az átfolyást összegyűjtöttük az oldat pH értékét 8.0 értékre igazítottuk koncentrált NaOH-t használva majd egy második 20 mM Trissel (pH8.0) Q Sepharose oszlopra vittük fel. Az oszlopon befogott hemoglobint 20 mM Tris (pH8.0) 2 oszlop térfogatnyi mennyiségével mostuk és 20 mM Trissel (pH7.0) eluáltuk. A frakciókat összegyűjtöttük és az abszorbancia arányok alapján csoportosítottuk (A₅₇₅/A₅₄q>1.03). Az oldatot ezután puffer cseréltük MinitanTM-et (Millipore Corp.) használva 14 mM nátrium foszfátottá (pH 8-8.5/150 mM kb. 100 mg/ml). Megjegyzendő, hogy a tisztítási eljárás ezen pontjánál a mutáns hemoglobin tetramerek már jelentős mennyiségű oktamert képeznek (> 20 %) a molekulába bejuttatott ciszteinek levegőn való oxidálódása következtében. Azonban a fennmaradó cisztein tiolok diszulfidekké való oxidációjának elvégzéséhez az oldatot levegő vagy oxigén alatt inkubáljuk megközelítően 48 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten.

Inkubálás után az oktamereket szeparáljuk a nem reagált monomerektől és a magasabbrendü polimerektől 14 mM nátrium foszfáttal ekvilibrált Sepharcril S-200-at használva, pH 88.5/150 mM NaCl a lineáris átfolyási sebesség 60 cm/óra. A frakciókat összegyűjtjük és a poolokat analitikai tisztaságú Superose 12 oszlopot használva vizsgáljuk.

Azon hemoglobin mutánsok esetében, ahol a cisztein helyettesítés a negatív töltés szoros közelségében található, vagy ahol a diszulfid képződés egyébként nem teljes, a fent leirt eljárást előnyösen módosítjuk a diszulfid képződés fokozása céljából. A

103 ···· ·« * _t, ₉₉ • · ·· · ·· · ♦ · ·♦·· · · * ·· ······ · · ·· ·· · ·· ···· fent leirt eljárást használva az 50 mg/ml-re való koncentrálás után a hemoglobin oldatot karbon monoxi hemoglobinná változtatjuk CO-val való óvatos buborékoltatással. Haemenként 5 Cu++-t adunk az oldathoz 100 mM CuC12^_őt használva és a hemoglobint CO alatt jégen inkubáljuk 5 percig. A reakciót ezután Na-EDTA ötszörös moláris feleslegben ( a rézhez viszonyítva) való hozzáadásával állítjuk le. A kapott oktamereket ezután a fentiek szerint tisztítjuk.

3. példa Hipotetikus eljárás az alfa 1-béta 2 vagy alfa 2-béta 1 dimer interface régión keresztüli fúzióval a dimer képződés ellen stabilizált hemoglobin molekulák megszerkesztése

Az egyik alfa alegység C terminusa és a szomszédos alfa alegység N terminusa között jelenleg alkalmazott inter-*dimer di-alfa fúzió egy sikeres protein manipulálás! megközelítést képvisel a hemoglobin dimer képzése elleni stabilizálásban. Ebben az esetben az eltérő dimerekből származó két terminus szerencsés juxtapoziciójából hasznot húztunk. Egy di-béta polipeptid is előállítható ahogy leírtuk, vagy egy di-alfa és di-béta polipeptiddel rendelkező hemoglobin, ahogy leírtuk, vagy di-alfa és dibéta kapcsolt alegységekkel rendelkező hemoglobin is előállítható. Alternatív megoldásként más fúziós típusok is előre láthatók, melyekben az egyik alfa/béta dimer alfa alegysége fúziónál a másik dimer béta alegységéhez (6. Ábra). Ebben, két egyéni, kapcsolt polipeptid dimerizálódna egy pszeudo-tetramer hemoglobin létrehozása céljából. Ez a megközelítés azon a tényen alapul, hogy a dimerizáció specifikus azonos alegység párokat

104 ·· ·· * «· ·· • · · ♦ · » · · • •••••· · • · ······ · · • ·· · ·· ···· foglal magába, melyekre mint αϊβΐ és a2B2-re utalunk.

Ezen alternatív fúziós megközelítésre példa az 1-es dimer alfa alegység C terminális maradéka (Arg 141) fuzionáltatható közvetlenül vagy egy közbeeső fúziós szekvenciával a 2-es dimer béta alegységének C hélix N-terminális aminosavához (Tyr 35). Ez egy uj C terminális maradékot hozna létre a béta B hélix végén (Val 34) és a béta A és B hélixeket tartalmazó polipeptid egy részét szabadon hagyná (1-34 maradékok, eeket is beleértve). Ezek a változtatások olyan proteint eredményeznének, mely az A-H alfa alegység hélixeket a C-H béta alegység hélixekhez fuzionálva tartalmazná. A béta alegység A és B hélixekből álló polipeptid kovalensen kapcsolódna a proteinhez a molekulába való uj hélix beépítésével. A hélixet úgy kell megtervezni, hogy áthidalja a béta C terminus (His 146) és az A hélix eredeti béta N terminusa (Val 1) közötti távolságot. Ezen változtatások után a hélixek szekvenciája az uj protein N terminusától a C terminusig a következő lenne: (alfa) A-B-C-E-F'-F-G-H-(béta)-C-D-E-F'-F-G-Huj-A-B. A fúziós régió aktuális elhelyezése nagy gondosságot igényel, hogy a szerkezet uj régiói ne nyúljanak be a dimer-dimer interface régióba, ami a kooperativitáshoz kritikus fontosságú. Bázikus vagy savas maradékokat tartalmazó aminosavak a molekulába bizonyos pontokon történő bejuttatása lehetővé teszi a funkcionálisan fontos sóhidak és hidrogén kötések visszaállítását, melyek a normál N és C terminusok manipulálásának eredményeként elveszhettek. A fenti megközelítés kiterjedhet a teljes hemoglobin molekula létrehozására vagy az egyéni dimerek egyedüli polipeptid láncokként! termelésére, bár ez utóbbi esetben nem várjuk, hogy a dimer képződés ellen stabilizációt biztosit.

A diszulfid kötés képződésre való lehetőség biztosítása céljából egy ciszteint juttathatunk az αϊβΐ pszeudodimer α vagy ·· ·· · · · · • · · · ν · · · • · · ······ · · ·· ♦< · ·· ··«· • - 105 β globin dóménj ébe.

A referencia Példa: A rekombináns alfa globin és rekombináns béta globin haemmel való újraépítése és kémiai redukciója mesterséges hemoglobin létrehozásához

A következő példában a mesterségesen létrehozott hemoglobin előállításának hagyományos módszerére adunk példát.

A liofilezett rekombináns alfa és béta globinokat (100 mg mindegyikből) egyenként feloldjuk 8M urea/50 mM Tris-Cl (pH 8.01/1 mM EDTA/ 1 mM DTT elegyében 5 mg/ml koncentrációjúra hígítjuk és szobahőmérsékleten 3-4 órán keresztül inkubáljuk. Az alfa globint ezután 0.3 mg/ml koncentrációjúra hígítjuk hütött 20 mM K2HPO4, pH 5.7/1 mM EDTA/lmM DTT elegyével. A hemint (25 mg) feloldjuk 2.4 mg 0.1 M KOH-ban, 1 M KCN azonos térfogatnyi mennyiségével hígítjuk; ezt az oldatot tesszük ezután 0.1 mg/ml koncentrációjúvá heminben és 20 mM Κ₂ΗΡΟ₄ (pH6.7) elegyében törzs foszfát pufferben. Az ebből az oldatból származó hemint 2.8 moláris feleslegben adjuk a hütött alfa-globinhoz; a bélta globin azonos moláris mennyiségét adjuk hozzá, és az oldatot 4 °C hőmérsékleten dializáltuk 0.1 Μ K2HPO4, pH 7.6/1 mM EDTA/ 1 mM KCN elegyével szemben. A mesterséges Hb oldatot ultraszüréssel koncentráltuk PM-10 membránt (Amicon) használva és egy 200 ml-es csavaros tetejű gumi szeptumos teszt csőbe helyeztük. A hemoglobin oldatot eltávolítással és N₂ elárasztással dezoxigenáltuk, majd az oldatot CO-val telítettük. 100 mM nátrium ditionit oldatot készítettünk anaerob módon egy 20 ml-es csavaros tetejű gumi szeptumos teszt csőben. A ditionit 4.5 ekvivalenseit adtuk a Hb

105 oldathoz injekcióstüvel és az elegyet jégen 15 percig inkubáltuk.

A Hb oldatot gélszürtük 10 mM Na foszfát pufferrel (pH 6.0) szemben egy 4x 40 cm-es Sephadex G-25 (finom) oszlopon. A színes oldatot ezután egy ugyanilyen pufferrel ekvilibrált 2x10 cm-52 (Whatman) oszlopra helyeztük és a kromatográfiát 500 ml 10 mM Na foszfát puffer (pH6.0) és 500 ml 70 mMnátrium foszfát puffer (pH6.9) elegyének lineáris grádiensével futtattuk. A Hb-ből a CO-t fotolizissel távolitottuk el oxigén áram alatt. Az ily módon előállított mesterséges Hgb-t csupán 25 %-os hozamban izoláltuk a fúziós peptidekből, de natív oxigén kötő tulajdonságokat mutat.

B Referencia Példa: P^q Meghatározás

A tisztított hemoglobin oldatok általunk előnyben részesített P50 meghatározása a csatolt igénypontok céljára a következők szerint történik:

A hemoglobin-oxigén egyensúlyi görbéket Hemox Analyzer^^-et (TCS Medical Products, Southampton, PA) használva mértük 25 vagy 37 +0.1 °C hőmérsékleten 50 mM HEPES puffer/0.1 M NaCl elegyében (pH 7.4). Az oxigén egyensúlyi görbéket az oxihemoglobin oldat N2-vel való dezoxigenációjával mértük, mely oldatot korábban vizzelt telitett 0₂-nel (a példához egy P50>10torr) vagy vízzel telített sűrített levegővel ekvilibráltunk. Az abszorbancia leolvasásokat 568 és 558 nm hullámhosszokon a teljes futtatás alatt mértük a mintában levő oxihemoglobin százalékának meghatározásához. Az oxihemoglobin százaléka egyenesen arányos a lóg A-|-558/log A-|-568-cal és független az uthossztól.. Az abszorbanciá107 kát és az oxigén nyomásokat is mintáztuk programozható-gyüjtő-12-bites analóg-digitási konverterrel (Labmaster PGH, Scientific Solutions, Solon, OH) számitógépes vezérlés alatt. Az oxigén egyensúlyi görbét egy alacsony-apss digitális szűrőnek vetettük alá. A Ρςθ értékeket (az 50%-os oxigén kötési hely telítéshez szükséges parciális O₂ nyomás) és a Hill koefficienseket (ⁿmax) a digitálisan szűrt adatokból számítottuk a laboratóriumunkban kifejlesztett szoftware-t használva. A Hill koefficienseket a dlog[y/l-y]/dlog p függvény maximális meredekségeként határoztuk meg, ahol y a %-os O₂ telítés és p az O₂ parciális nyomása.

A P50 ^má^s körülmények között is mérhető, de meg kell jegyeznünk, hogy számos környezeti tényező befolyásolja a hemoglobin oxigén affinitását. A pH, CO₂ szervetlen egybeolvadások, szerves foszfátok és a hőmérséklet P₅Q-re kifejtett hatását Bunn és Forget tárgyalják meg, HEMOGLOBIN: MOLECULAR, GENETIC AND CLINICAL ASPECTS 37-47, 95-98 (W.B. Saunders Co., 1986).

Mivel a teljes vér oxigén kötési görbéinek számos meghatározását végezték már el standard fiziológiás körülmények között (37 °C hőmérséklet, pH 7.4, PCO₂ 40 mm Hg) szükség lehet az irodalomban található adatok egybevetésre. Ilyen összefüggésben meg kell jegyeznünk, hogy egy 10 °C hőmérséklet emelés majdnem kétszeres növekedést eredményez a P^q értékben, míg a P^q pH függősége kb a következőként adható meg: delta lóg P 5q/delta pH= -0.5.

A tisztított Hb készítmények P₅₀ értékeinek a teljes vér Ρ₅θ értékeivel való összehasonlítása problémás lehet. A teljes vér vagy az izolált RBCk számos olyan alkotórészt tartalmaznak melyek természetesen módosítják a hemoglobin-oxigén kötési görbét. Az RBC bezárja a Hgb-t a 2.3-DPG effektor molekula magas koncentrá108 dójának jelenlétében; ez egy olyan molekula, mely a Hgb-t jelentősen alacsonyabb O₂ affinitásra készteti. Más intra-erithrocita alkotók szintén hatással vannak a kötési görbe alakjára: ATP, Cl-, CO₂, H+, ortofoszfát, methemoglobin és karboxihemoglobin. Ezen anyagok szintjei a kortól a nemtől és az egészségi állapottól is függhetnek. Ezek az anyagok normálisan nincsenek jelen a tisztított Hgb oldaytokban és ezért a tisztított Hgb P^q értéke alacsonyabb mint a teljes vér esetében talált érték. A Hgb-oxigén affinitás egy nagyon fontos módosítója a Cl- ion. A Cl ion az erithrocitán kívül, a vér szérumban található megközelítően 0.15 M fiziológiás koncentrációban. Mivel a Cl- alacsony O₂ affinitást okoz, egy in vitro mért P₅q értékkel rendelkező Hgb oldat sokkal alacsonyabb 0₂ affinitással rendelkezhet ha a véráramba juttatjuk. A teljes vér oxigén kötésének mérésekor felmerülő másik probléma az, hogy az RBC-k meglehetősen törékenyek és az erithrocita az oxigén kötés mérésére használt műszerbe való bejuttatása során elkerülhetetlen, hogy az RBC-k egy kis százaléka lizáljon. A lizált RBC-k Hgbt juttatnak a környező tápközegbe a 2,3DPG-től távol, igy mivel a szabad Hgb magasabb affinitással rendelkezik mint az intraerithrocita Hgb, a lizált RBC-k magasabb O₂ affinitást mutatnak és igy hamisan alcsony P^g értéket mutatnak a teljes vér Ρ₅θ meghatározásakor. Széleskörűen elfogadott, hogy fiziológiás körülmények között a teljes vér P^g értéke 26-28 mm Hg. Ha a Hgb-t azonban a teljes vérből izoláltuk a mért Ρςθ érték az 1-10 mmHg nagyságrendbe esik a vizsgálatot végzők kísérleti körülményeitől függően. Ezen okok miatt a legfontosabb a Hgb-oxigén egyensúly mérését tisztított Hgb molekulákkal végezni szigorú puffer, pH és só koncentrációk körülményei között.

Sajnos, nincs az összes kutató által elfogadott standard a Hgb oxigén kötés in vitro rendszerekben való méréséhez.

···· ·* · »« • · · ♦ 4 · * « ·»»·«·» « * · * · ♦··· » t * ·· ·· * ·· *··· ‘ - 109 Mégis, mivel sok mutáns hemoglobint először betegek teljes véréből azonosították, igény lenne a natív és a mutáns Hgb 02 iránti relatív affinitásának összehasonlítására, a teljes vér és a tisztított Hgb készítmény között. Erre példa a Hgb Chico (béta lys⁶⁶-thr). Ha valaki a tisztított mutáns Hgb csupán P^q értékét vizsgálja (10.1 mmHg) meg kell említeni, hogy a Hgb alacsonyabb P^q értékkel rendelkezik, mint a normál teljes vér (27.2 mmHg). Ha azt a hemoglobint RBC-kben mérjük fiziológiás körülmények között nyilvánvaló, hogy magasabb P^q értékkel rendelkezik mint a normál teljes vér (38 mmHg). Nem lehet megjósolni, hogy milyen mértékben fog megváltozni a P₅q érték a teljes vér Chicoból tisztított Hgb Chicoba való változástól ha vérpótlóként a véráramba juttatjuk. Azonban levonhatjuk azt a következtetést, hogy a P₅q érték magasabb lesz mint tiszta formájában, valamint azt, hogy a mutáns Hgb szerves foszfátokkal való reagáltatása még magasabb P₅q értéket eredményez.

SZEKVENCIA LISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:

(i) FELTALÁLÓ: ANDERSON, DÁVID C.

MATHEWS, ANTONY JAMES STETLER, GARY L.

(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: MULTIMER HEMOGLOBINOK TERMELÉSE ÉS

ALKALMAZÁSA (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 28 (iv) LEVELEZÉSI CÍM:

(A) CÍMZETT: Browdy and Neimark • · · · · · ······ · · • · · · · · · ····

- 110 - (B) UTCA: 419 Seventh Street, N.W. Suite 300 (C) VÁROS: Washington (D) ÁLLAM: D.C.

(E) ORSZÁG: USA (F) IRÁNYITÓSZÁM: 20004 (v) SZÁMÍTÓGÉPES OLVASÁSI FORMA:

(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: Floppy lemez (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, #1.25 verzió (vi) A JELEN TALÁLMÁNY ADATAI:

(A) A TALÁLMÁNY SZÁMA: EP PCT/US92/09752 (B) AZ IKTATÁS DÁTUMA: 1992 november 6.

(C) MINŐSÍTÉS:

(viii) AZ ÜGYVÉD/IRODA ADATAI:

(A) NÉV: COOPER, IVER P (B) REGISZTRÁCIÓS SZÁM: 28,005 (C) REFERENCIA/DOKUNABTUM SZÁMA: ANDERSON-6-PCT (ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS ADATOK:

(A) TELEFON: 202-628-5197 (B) TELEFAX: 202-737-3528 (C) TELEX: 248633

AZ 1. SZÁMÚ	SZEKVENCIA	ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A)	HOSSZÚSÁG:	1464 bázispár
(B)	TÍPUS: nukleinsav
(C)	SZÁLTIPUS:	egyszálú
(D)	TOPOLÓGIA:	lineáris

- 111

GAATTCGAGC	TCGGTACCCG	GGCTACATGG	AGATTAACTC	AATCTAGAGG	GTATTAATAA 60
TGTATCGCTT	AAATAAGGAG	GAATAACATA	TGCTGTCTCC	GGCCGATAAA	ACCAACGTTA 120 AAGCTG
GGGTAAAGTT	GGCGCGCACG	CTGGTGAATA	CGGTGCTGAA	GCTCTCGAGC	180
GTATGTTCCT	GTCTTTCCCG	ACCACCAAAA	CCTACTTCCC	GCACTTCGAC	CTGTCTCACG 240
GTTCTGCGCA	GGTTAAAGGT	CACGGTAAAA	AAGTTGCTGA	TGCTCTGACC	AACGCTGTTG 300
CTCACGTTGA	TGATATGCCG	AACGCGTTGT	CTGCTCTGTC	TGATCTGCAC	GCTCACAAAC 360
TGCGTGTTGA	TCCGGTTAAC	TTCAAACTGC	TGTCTCACTG	CCTGCTGGTT	ACTCTGGCTG 420
CTCATCTGCC	GGCTGAATTT	ACCCCGGCTG	TTCATGCGTC	TCTGGATAAA	TTCCTGGCTT 480
CTGTTTCTAC	CGTTCTGACT	TCGAAATACC	GTGGTGTTCT	GTCTCCGGCC	GATAAAACCA 540
ACGTTAAAGC	TGCTTGGGGT	AAAGTTGGCG	CGCACGCTGG	TGAATACGGT	GCTGAAGCTC 600
TCGAGCGTAT	GTTCCTGTCT	TTCCCGACCA	CCAAAACCTA	CTTCCCGCAC	TTCGACCTGT 660
CTCACGGTTC	TGCGCAGGTT	AAAGGTCACG	GTAAAAAAGT	TGCTGATGCT	CTGACCAACG 720
CTGTTGCTCA	CGTTGATGAT	ATGCCGAACG	CGTTGTCTGC	TCTGTCTGAT	CTGCACGCTC 780
ACAAACTGCG	TGTTGATCCG	GTTAACTTCA	AACTGCTGTC	TCACTGCCTG	CTGGTTACTC

840

112

TGGCTGCTCA	TCTGCCGGCT	GAATTTACCC	CGGCTGTTCA	TGCGTCTCTG	GATAAATTCC 900
TGGCTTCTGT	TTCTACCGTT	CTGACTTCGA	AATACCGTTA	ATGACTGCAG	CTACATGGAG

ATTAACTCAA	TCTAGAGGGT	ATTAATAATG
CACCTGACTC	CGGAAGAAAA	ATCCGCGGTT
GAAGTTGGTG	GTGAAGCTCT	GGGACGTCTG
TTTGAATCTT	TCGGAGATCT	GTCTACCCCG
GCCCATGGTA	AAAAAGTTCT	GGGTGCTTTC
AAAGGTACCT	TCGCTACTCT	GTCTGAGCTC
AACTTCCGTC	TGCTGGGTAA	AGTACTAGTT
TTCACTCCGC	CGGTTCAGGC	TGCTTACCAG

	960
TATCGCTTAA	ATAAGGAGGA	ATAACATATG 1020
ACTGCTCTGT	GGGGTAAAGT	GAACGTTGAC 1080
CTGGTTGTTT	ACCCGTGGAC	TCAGCGTTTC 1140
GACGCTGTTA	TGGGTAACCC	GAAAGTTAAA 1200
TCTGACGGTC	TGGCTCACCT	GGACAACCTG 1260
CACTGCGACA	AACTGCACGT	TGACCCGGAA 1320
TGCGTTCTGG	CTCACCACTT	CGGTAAAGAA 1380
AAAGTTGTTG	CTGGTGTTGC	TAACGCGCTA

1440

GCTCACAAAT ACCACTAATG AAGC

1464 (2) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A)	HOSSZÚSÁG:	4 aminosav
(B)	TÍPUS: aminosav
(C)	SZÁLTIPUS:	egyszálú
(D)	TOPOLÓGIA:	lineáris

(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

• · · * ·

Ile Glu Gly Arg (2) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 5 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val His Leu Thr Pro

5 (2) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 4 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ser Lys Tyr Arg (2) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

- 114 -

(A)	HOSSZÚSÁG:	4 aminosav
(B)	TÍPUS: aminosav
(C)	SZÁLTIPUS:	egyszálú
(D)	TOPOLÓGIA:	lineáris

(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val Leu Ser Pro (2) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 4 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

His Lys Tyr His (2) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A)	HOSSZÚSÁG:	4 aminosav
(B)	TÍPUS: aminosav
(C)	SZÁLTIPUS:	egyszálú
(D)	TOPOLÓGIA:	lineáris

(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid

- 115 • ·· · ·· · ·> ·· • · · ♦ *··· ·· ···« · · • *· ······ · · ·· *· · ·· ···· (xi) A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val His Leu Thr (2) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 37 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Lys

Cys

Alá

Glu

Leu

Glu

Gly

Arg

Leu

Glu

Alá

Leu

Glu

Gly

Arg

Leu

1

5

10

15

Glu

Alá

Leu

Glu

Gly

Arg

Leu

Glu

Alá

Leu

Glu

Gly

Arg

Leu

Glu

Alá

20

25

30

Leu Glu Gly Lys Leu

A 9 .	SZÁMÚ	SZEKVENCIA ADATAI:
(i)	A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
	(A)	HOSSZÚSÁG: 16 aminosav
	(B)	TÍPUS: aminosav
	(C)	SZÁLTIPUS: egyszálú
	(D)	TOPOLÓGIA: lineáris

(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

t · · • · • · ·

··

116

Gly Glu Leu Glu Glu Leu Leu Lys Lys Leu Lys Glu Leu Leu Lys Gly (2) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(í) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 10 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (Xi) A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GAAGCCAUGG 10 (2) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 4 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (Xi) A 11. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Ile Glu Gly Arg (2) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

• ·· · ·« • ·

- 117

(A) HOSSZÚSÁG: 31 bázispár
(B)	TÍPUS: nukleinsav
(C)	SZÁLTIPUS: egyszálú
(D)	TOPOLÓGIA: lineáris

(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) A 12. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCGGCCGCGG AAGAGTCAAT TCAGGAGGGT G

A 13. SZÁMÚ	SZEKVENCIA	ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A)	HOSSZÚSÁG:	33 bázispár
(B)	TÍPUS: nukleinsav
(C)	SZÁLTIPUS:	egyszálú
(D)	TOPOLÓGIA:	lineáris

(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) A 13. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GCCGGCCGTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAA (2) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 27 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) A 14. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CCGAACGCGT TGTGCGCTCT GTCTGAT

- 118 (2) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A)	HOSSZÚSÁG:	30 bázispár
(B)	TÍPUS: nukleinsav
(C)	SZÁLTIPUS:	egyszálú
(D)	TOPOLÓGIA:	lineáris

(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) A 15. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

GGTGCTCACG TTGATTGCAT GCCGAACGCG (2) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 30 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) A 16. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

CTGACCAACG CTGTTTGCCA CGTTGATGAT (2) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 141 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid ·»

- 119 (xi) A 17. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val

Leu

Ser

Pro

Alá Asp

Lys

Thr

Asn

Val

Lys

Alá

Alá

Trp

Gly

Lys

1

5

10

15

Val

Gly

Alá

His

Alá

Gly

Glu

Tyr

Gly

Alá

Glu

Alá

Leu

Glu

Arg

Met

20

25

30

Phe

Leu

Ser

Phe

Pro

Thr

Thr

Lys

Thr

Tyr

Phe

Pro

His

Phe

Asp

Leu

35

40

45

Ser

His

Gly

Ser

Alá

Gin

val

Lys

Gly

His

Gly

Lys

Lys

Val

Alá

Asp

50

55

60

Alá

Leu

Thr

Asn

Alá

Val

Alá

His

Val

Asp

Asp

Met

Pro

Asn

Alá

Leu

65

70

75

80

Ser

Alá

Leu

Ser

Asp

Leu

His

Alá

His

Lys

Leu

Arg

Val

Asp

Pro

Val

85

90

95

Asn

Phe

Lys

Leu

Leu

Ser

His

Cys

Leu

Leu

Val

Thr

Leu

Alá

Alá

His

100

105

110

Leu

Pro

Alá

Glu

Phe

Thr

Pro

Alá

Val

His

Alá

Ser

Leu

Asp

Lys

Phe

115

120

125

Leu

Alá

Ser

Val

Ser

Thr

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Tyr

Arg

130

135

140

(2) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 141 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 18. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

• · · · ·« 9 « -»* • · 4 4 · *· •9 · · · 4 4· • · · 4 ···· 4 ·· ·· «9 4 «·444

- 120 -

Ser

Leu

Thr

Lys

Thr

Glu

Arg

Thr

Ile

Ile

Val

Ser

Met

Trp

Alá

Lys

1

5

10

15

Ile

Ser

Thr

Gin

Alá

Asp

Thr

Ile

Gly

Thr

G1U

Thr

Leu

Glu

Arg

Leu

20

25

30

Phe

Leu

Ser

His

Pro

Gin

Thr

Lys

Thr

Tyr

Phe

Pro

His

Phe

Asp

Leu

35

40

45

His

Pro

Gly

Ser

Alá

Gin

Leu

Arg

Alá

His

Gly

Ser

Lys

Val

Val

Alá

50

55

60

Alá

Val

Gly

Asp

Alá

Val

Lys

Ser

He

Asp

Asp

Ile

Gly

Gly

Alá

Leu

65

70

75

80

Ser

Lys

Leu

Ser

Glu

Leu

His

Alá

Tyr

Ile

Leu

Arg

Val

Asp

Pro

Val

85

90

95

Asn

Phe

Lys

Leu

Leu

Ser

His

Cys

Leu

Leu

Val

Thr

Leu

Alá

Alá

Arg

100

105

110

Phe

Pro

Alá

Asp

Phe

Thr

Alá

Glu

Alá

His

Alá

Alá

Trp

Asp

Lys

Phe

115

120

125

Leu

Ser

Val

Val

Ser

Ser

Val

Leu

Thr

Glu

Lys

Tyr

Arg

130

135

140

(2) A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 146 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 19. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Alá Val Thr Alá Leu Trp Gly • · * · V « t • · · · · t *

•

- 121 -

• · · · • · ··

···· · ♦ ·

• » ♦ ····

1

5

10

15

Lys

Val

Asn

Val

Asp

Glu

Val

Gly

Gly

Glu

Alá

Leu

Gly

Arg

Leu

Leu

20

25

30

Val

Val

Tyr

Pro

Trp

Thr

Gin

Arg

Phe

Phe

Glu

Ser

Phe

Gly

Asp

Leu

35

40

45

Ser

Thr

Pro

Asp

Alá

Val

Met

Gly

Asn

Pro

Lys

Val

Lys

Alá

His

Gly

50

55

60

Lys

Lys

Val

Leu

Gly

Alá

Phe

Ser

Asp

Gly

Leu

Alá

His

Leu

Asp

Asn

65

70

75

80

Leu

Lys

Gly

Thr

Phe

Alá

Thr

Leu

Ser

Glu

Leu

His

Cys

Asp

Lys

Leu

85

90

95

His

Val

Asp

Pro

Glu

Asn

Phe

Arg

Leu

Leu

Gly

Asn

Val

Leu

Val

Cys

100

105

110

Val

Leu

Alá

His

His

Phe

Gly

Lys

Glu

Phe

Thr

Pro

Pro

Val

Gin

Alá

115

120

125

Alá

Tyr

Gin

Lys

Val

Val

Alá

Gly

Val

Alá

Asn

Alá

Leu

Alá

His

Lys

130

135

140

Tyr His

145 (2) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 146 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 20. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

···· 4· ·

- 122 -

Val

His

Leu

Thr

Pro

Glu

Glu

Lys

Thr

Alá

Val

Asn

Alá

Leu

Trp

Gly

1

5

10

15

Lys

Val

Asn

Val

Asp

Alá

Val

Gly

Gly

Glu

Alá

Leu

Gly

Arg

Leu

Leu

20

25

30

Val

Val

Tyr

Pro

Trp

Thr

Gin

Arg

Phe

Phe

Glu

Ser

Phe

Gly

Asp

Leu

35

40

45

Ser

Ser

Pro

Asp

Alá

Val

Met

Gly

Asn

Pro

Lys

Val

Lys

Alá

His

Gly

50

55

60

Lys

Lys

Val

Leu

Gly

Alá

Phe

Ser

Asp

Gly

Leu

Alá

His

Leu

Asp

Asn

65

70

75

80

Leu

Lys

Gly

Thr

Phe

Ser

Gin

Leu

Ser

Glu

Leu

His

Cys

Asp

Lys

Leu

85

90

95

His

Val

Asp

Pro

Glu

Asn

Phe

Arg

Leu

Leu

Gly

Asn

Val

Leu

Val

Cys

100

105

110

Val

Leu

Alá

Arg

Asn

Phe

Gly

Lys

Glu

Phe

Thr

Pro

Gin

Met

Gin

Alá

115

120

125

Alá

Tyr

Gin

Lys

Val

Val

Alá

Gly

Val

Alá

Asn

Alá

Leu

Alá

His

Lys

130

135

140

Tyr His

145 (2) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 146 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid • · ·

- 123 (xi) A 21. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly

His

Phe

Thr

Glu

Glu

Asp

Lys

Alá Thr

Ile

Thr

Ser

Leu

Trp

Gly

1

5

10

15

Lys

Val

Asn

Val

Glu

Asp

Alá

Gly

Gly

Glu

Thr

Leu

Gly

Arg

Leu

Leu

20

25

30

Val

Val

Tyr

Pro

Trp

Thr

Gin

Arg

Phe

Phe

Asp

Ser

Phe

Gly

Asn

Leu

35

40

45

Ser

Ser

Alá

Ser

Alá

Ile

Met

Gly

Asn

Pro

Lys

Val

Lys

Alá

His

Gly

50

55

60

Lys

Lys

Val

Leu

Thr

Ser

Leu

Gly

Asp

Alá

Ile

Lys

His

Leu

Asp

Asp

65

70

75

80

Leu

Lys

Gly

Thr

Phe

Alá

Gin

Leu

Ser

Glu

Leu

His

Cys

Asp

Lys

Leu

85

90

95

His

Val

Asp

Pro

Glu

Asn

Phe

Lys

Leu

Leu

Gly

Asn

Val

Leu

Val

Thr

100

105

110

Val

Leu

Alá

Ile

His

Phe

Gly

Lys

Glu

Phe

Thr

Pro

Glu

Val

Gin

Alá

115

120

125

Ser

Trp

Gin

Lys

Met

Val

Thr

Alá

Val

Alá

Ser

Alá

Leu

Ser

Ser

Arg

130 135 140

Tyr His

145 (2) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 146 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris

- 124 (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly

His

Phe

Thr

Glu

Glu

Asp

Lys

Alá

Thr

Ile

Thr

Ser

Leu

Trp

Gly

1

5

10

15

Lys

Val

Asn

Val

Glu

Asp

Alá

Gly

Gly

Glu

Thr

Leu

Gly

Arg

Leu

Leu

20

25

30

Val

Val

Tyr

Pro

Trp

Thr

Gin

Arg

Phe

Phe

Asp

Ser

Phe

Gly

Asn

Leu

35

40

45

Ser

Ser

Alá

Ser

Alá

Ile

Met

Gly

Asn

Pro

Lys

Val

Lys

Alá

His

Gly

50

55

60

Lys

Lys

Val

Leu

Thr

Ser

Leu

Gly

Asp

Alá

Ile

Lys

His

Leu

Asp

Asp

65

70

75

80

Leu

Lys

Gly

Thr

Phe

Alá

Gin

Leu

Ser

Glu

Leu

His

Cys

Asp

Lys

Leu

85

90

95

His

Val

Asp

Pro

Glu

Asn

Phe

Lys

Leu

Leu

Gly

Asn

Val

Leu

Val

Thr

100

105

110

Val

Leu

Alá

Ile

His

Phe

Gly

Lys

Glu

Phe

Thr

Pro

Glu

Val

Gin

Alá

115

120

125

Ser

Trp

Gin

Lys

Met

Val

Thr

Gly

Val

Alá

Ser

Alá

Leu

Ser

Ser

Arg

130 135 140

Tyr His

145 (2) A 23. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 146 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú

- 125 - (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 22. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Gly

His

Phe

Thr

Glu

Glu

Asp

Lys

Alá

Thr

Ile

Thr

Ser

Leu

Trp

Gly

1

5

10

15

Lys

Val

Asn

Val

Glu

Asp

Alá

Gly

Gly

Glu

Thr

Leu

Gly

Arg

Leu

Leu

20

25

30

Val

Val

Tyr

Pro

Trp

Thr

Gin

Arg

Phe

Phe

Asp

Ser

Phe

Gly

Asn

Leu

35

40

45

Ser

Ser

Alá

Ser

Alá

Ile

Met

Gly

Asn

Pro

Lys

Val

Lys

Alá

His

Gly

50

55

60

Lys

Lys

Val

Leu

Thr

Ser

Leu

Gly

Asp

Alá

Thr

Lys

His

Leu

Asp

Asp

6 5

70

75

80

Leu

Lys

Gly

Thr

Phe

Alá

Gin

Leu

Ser

Glu

Leu

His

Cys

Asp

Lys

Leu

85

90

95

His

Val

Asp

Pro

Glu

Asn

Phe

Lys

Leu

Leu

Gly

Asn

Val

Leu

Val

Thr

100

105

110

Val

Leu

Alá

Ile

His

Phe

Gly

Lys

Glu

Phe

Thr

Pro

Glu

Val

Gin

Alá

115

120

125

Ser

Trp

Gin

Lys

Met

Val

Thr

Alá

Val

Alá

Ser

Alá

Leu

Ser

Ser

Arg

130 135 140

Tyr His

145 (2) A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 146 aminosav (B) TÍPUS: aminosav

- 126 - (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 24. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val

His

Phe

Thr

Alá

Glu

Glu

Lys

Alá

Alá

Val

Thr

Ser

Leu

Trp

Ser

1

5

10

15

Lys

Met

Asn

Val

Glu

Glu

Alá

Gly

Gly

Glu

Alá

Leu

Gly

Arg

Leu

Leu

20

25

30

Val

Val

Tyr

Pro

Trp

Thr

Gin

Arg

Phe

Phe

Asp

Ser

Phe

Gly

Asn

Leu

35

40

45

Ser

Ser

Pro

Ser

Alá

Ile

Leu

Gly

Asn

Pro

Lys

Val

Lys

Alá

His

Gly

50

55

60

Lys

Lys

Val

Leu

Thr

Ser

Phe

Gly

Asp

Alá

Ile

Lys

Asn

Met

Asp

Asn

65

70

75

80

Leu

Lys

Pro

Alá

Phe

Alá

Lys

Leu

Ser

Glu

Leu

His

Cys

Asp

Lys

Leu

85

90

95

His

Val

Asp

Pro

Glu

Asn

Phe

Lys

Leu

Leu

Gly

Asn

Val

Met

Val

Ile

100

105

110

Ile

Leu

Alá

Thr

His

Phe

Gly

Lys

Glu

Phe

Thr

Pro

Glu

Val

Gin

Alá

115

120

125

Alá

Trp

Gin

Lys

Leu

Val

Ser

Alá

Val

Alá

Ile

Alá

Leu

Alá

His

Lys

130 135 140

Tyr His

145 (2) A 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 8 aminosav

			- 127 -
(ii) a (xi) A Met Tyr Arg	(B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris MOLEKULA TÍPUSA: peptid 25. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Leu Asn Lys Glu Glu

(2) A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 141 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 26. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met	Leu	Ser	Pro	Alá	Asp	Lys	Thr
1				5
Val	Gly	Alá	His	Alá	Gly	Glu	Tyr
			20
Phe	Leu	Ser	Phe	Pro	Thr	Thr	Lys
		35					40
Ser	His	Gly	Ser	Alá	Gin	Val	Lys
	50					55
Alá	Leu	Thr	Asn	Alá	Val	Alá	His
65					70
Ser	Alá	Leu	Ser	Asp	Leu	His	Alá

Asn	Val	Lys	Alá	Alá	Trp	Gly	Lys
	10					15
Gly	Alá	Glu	Alá	Leu	Glu	Arg	Met
25					30
Thr	Tyr	Phe	Pro	His	Phe	Asp	Leu
				45
Gly	His	Gly	Lys	Lys	Val	Alá	Asp
			60
Val	Asp	Asp	Met	Pro	Asn	Alá	Leu
		75					80
His	Lys	Leu	Arg	Val	Asp	Pro	Val

• · · ······ · · • · * · · · · ····

- 128 -

Asn

Phe

Lys

Leu 100

Leu

Ser

His

Cys

Leu 105

Leu

Val

Thr

Leu

Alá 110

Alá

His

Leu

Pro

Alá

Glu

Phe

Thr

Pro

Alá

Val

His

Alá

Ser

Leu

Asp

Lys

Phe

115

120

125

Leu

Alá

Ser

Val

Ser

Thr

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Tyr

Arg

130

135

140

(2) A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 141 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 27. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Val

Leu

Ser

Pro

Alá

Asp

Lys

Thr

Asn

Val

Lys

Alá

Alá

Trp

Gly

Lys

1

5

10

15

Val

Gly

Alá

His

Alá

Gly

Glu

Tyr

Gly

Alá

Glu

Alá

Leu

Glu

Arg

Met

20

25

30

Phe

Leu

Ser

Phe

Pro

Thr

Thr

Lys

Thr

Tyr

Phe

Pro

His

Phe

Asp

Leu

35

40

45

Ser

His

Gly

Ser

Alá

Gin

Val

Lys

Gly

His

Gly

Lys

Lys

Val

Alá

Asp

50

55

60

Alá

Leu

Thr

Asn

Alá

Val

Alá

His

Val

Asp

Asp

Met

Pro

Asn

Alá

Leu

65

70

75

80

Ser

Alá

Leu

Ser

Asp

Leu

His

Alá

His

Lys

Leu

Arg

Val

Asp

Pro

Val

85

90

95

Asn Phe Lys Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Alá Alá His

V • ♦

V ·

Phe

100

105

110

Leu

Pro

Ala

Glu

Phe

Thr

Pro

Ala

Val

His

Ala

Ser

Leu

Asp

115

120

125

Leu

Ala

Ser

Val

Ser

Thr

Val

Leu

Thr

Ser

Lys

Tyr

Arg

130

135

140

Lys (2) A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZÚSÁG: 146 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁLTIPUS: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: peptid (xi) A 28. SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met

His

Leu

Thr

Pro

Glu

Glu

Lys

Ser

Ala

Val

Thr

Ala

Leu

Trp

Gly

1

5

10

15

Lys

Val

Asn

Val

Asp

Glu

Val

Gly

Gly

Glu

Ala

Leu

Gly

Arg

Leu

Leu

20

25

30

Val

Val

Tyr

Pro

Trp

Thr

Gin

Arg

Phe

Phe

Glu

Ser

Phe

Gly

Asp

Leu

35

40

45

Ser

Thr

Pro

Asp

Ala

Val

Met

Gly

Asn

Pro

Lys

Val

Lys

Ala

His

Gly

50

55

60

Lys

Lys

Val

Leu

Gly

Ala

Phe

Ser

Asp

Gly

Leu

Ala

His

Leu

Asp

Asn

65

70

75

80

Leu

Lys

Gly

Thr

Phe

Ala

Thr

Leu

Ser

Glu

Leu

His

Cys

Asp

Lys

Leu

85

90

95

His

Val

Asp

Pro

Glu

Asn

Phe

Arg

Leu

Leu

Gly

Lys

Val

Leu

Val

Cys

100

105

110

130 ·«·« ««·· ·· ·*···« · · • · * · · ·· ····

Val

Leu

Alá 115

His

His

Phe

Gly

Lys 120

Glu

Phe

Thr

Pro

Pro Val 125

Gin

Alá

Alá

Tyr

Gin

Lys

Val

Val

Alá

Gly

Val

Alá

Asn

Alá

Leu

Alá

His

Lys

130

135

140

Tyr His

145

- 131 -

r—1

ω

Φ

μ

(0

3

3

ω

(Ü

ra

I—(

μ

P

3

a

P

tű

•Ή

JZ

JZ

iH

rH

r—I

i“4

i—1

<Ű

z

Φ

Φ

P

Φ

lL) >

a

Ei

<

0

o

<

>

0

iJ

Eh

ω

TÁBLÁZAT A HUMÁN GLOBIN ALEGYSÉGEK ELSŐDLEGES SZERKEZETE

>

ω

Φ

P

3

3

a

ω

(0

P

Φ

P

P

ZS

a

r-H

•H

Z

z

i-H

r-4

ω

rH

z

r—1

Λ

Φ

Φ

P

r—<

0

5C

a

EH

0

0

<

LJ

<

E-i

H

Eh

0

Eh

0

^W3P033WPfÖ>-l tŰ-HQJXMr-ír-I^XlrHfC K5>X₍JE-'CUU0iJE-'<>

C <0 3 a>

w <—i φ μr—i < < J ti0

<Ű

rH

P

(Ű

3

a

<—1

ω

3

Ρ

0

3

3

m

P

r-4

(0

JZ

r-4

Φ

μ

rH

<ϋ

Ή

Φ

Ζ

Ρ

r-i

r—1

Φ

<

>

Eh

<

Eh

Ü

>

X

Eh

dl

0

0

0

o

tH

CM

r>

<·

in

KD

CQ. rH

(Μ

ο

Ί·

in

lű

Γ

co

o

rH

rH

r-4

rH

r-4

rH

r-4

<Ű zμ φφ t>Q0

(M

n

o

«—1

CM

ΓΊ

<

<

rH

CM

ΓΊ

in

ω

co

Ch

f—<

r-4

r-4

r4

Z

Z

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

<

3

P

Ü)

P

3

t3

P

Φ

Φ

t—<

P

Z

a

(Ü

Φ

Z

>1

z

r—1

P

z

i-l

»—4

tű

Φ

Φ

μ

r—t

Eh

μ

Eh

0

<

Eh

H

H

>

0

s

Eh

<

rH

U)

(Ű

(Ű

a

>1

3

μ

0

(0

a

ω

μ

C

tű

>

r-4

r—(

μ

r-4

Φ

φ

μ

r—<

ω

>1

Z

ω

>

μ

<

<

Eh

u

μι

0

a

μ

Eh

<

o

r-4

CM

m

*3·

in

<N

n

in

lű

r-

co

σι

r4

t—(

1~(

r-4

r-4

T—(

X

Ή ι—I r-ι (Ν Ο Η CN η

Q) rt^rHtNCI'J’iniűr'COCTii-Hi—lrH<—<

J Ζ Ζ. ι< ι< < < C < *£. c rtj

A14 16 Lys Lys A14 17 Lys Lys Lys Lys • · · · · ··« • « 4 4 4 4 · « • · 4 *444*4 · 4 •4 ·· · »· *···

- 132 -

4->

0) S

G í—l 3 5 «5 >, >-< 3 rc>

U) (B Í—I r—I »—< r—1 ·—< ·—I r—I <>U0<U0O<

>1 tP 3 3<

Φ <-H ki 0) Φ (B(0 μι u < J μ) >>

rd

c

rd

0

Cb

OÍ

>1

>1

3

ki

5

>1

tP

5

5

r—1

r-4

<b

w

ib

rH

w

i—4

r—1

r-4

1—1

Λ

Φ

r-4

ki

Φ

Φ

05

05

>

<

>

0

u

0

0

Eh

0

<

μΐ

μι

>

>

1—1

C

rd

ex

<B

rH

>1

>1

3

05

5

tP

3

3

τ—<

ι—ι

«5

cn

05

cn

rH

(0

t—1

r—1

r-4

r-4

Φ

rd

μ

Φ

φ

ιΒ

(Β

>

<

>

<

<

>

0

0

0

μΐ

0

<

μΐ

μΐ

>

>

(folytatás )

rH

C

r-4

£Χ

3

rd

>1

>1

3

3

3

>1

cp

3

3

r-4

rd

(Β

tn

05

ω

r-4

05

r-4

rd

r-4

rH

Φ

r-4

ki

Φ

Φ

05

05

>

<

>

<

0

>

Q

0

0

<

μΐ

0

<

μΐ

μι

>

>

ω

<ρ

Ο

f—<

CM

Cn

in

kű

Γ-

co

σι

o

r-4

n)

cn

ιΗ

rd

CM

cm

CM

CM

CM

M

η)

n)

ni

m

ΓΊ

n

ΓΊ

cn

in r-4 <

o

rd

CM

cn

in

LO

r-4

CM

cn

LD

tO

>

co

σ\

r-4

r-4

rd

r-4

r-4

rH

r-4

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

Φ

ki

ki

c

05

cu

μ

Φ

ki

3

ki

3

3

tP

3

Φ

3

ki

r-4

Φ

X

r-d

rd

tt

X

rH

rd

JZ

r-4

x

Φ

rd

ki

Φ

X

Φ

Φ

H

co

éh

0

<

<

Eh

1—<

0

EH

0

Eh

μ)

0

μ)

Ck

μΐ

co

r-4

K r- 3

3

tt

d

>1

3

ki

<B

3

(B

3

tP

4-J

Φ

ki

05

rd

rd

-rl

rd

r-d

r-d

r-d

rH

r-4

rd

Φ

rd

ki

Φ

X

ώ

Φ

>

0

<

X

0

0

Eh

0

<

0

<

(3

0

<

8

Ch

hQ

CO

Γ

CO

CP

o

rd

CM

cn

•«í

in

lű

Γ-

00

σι

o

rd

nj

n

tn

r-d

r-d

r-d

n)

CM

CM

CM

ni

CM

ni

ηι

CM

η)

n

cn

n

cn

n

Phe His Cl 35 Tyr Tyr Tyr Tyr

in

kD

rd

o

rd

CM

m

in

kO

rd

rd

CQ

rd

CM

cn

in

l£>

co

cn

rd

rd

rd

rd

rd

rH

rd

rd

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

CQ

u

• · *· 9 9 9 9

9 9 9 9 9 · · ·· ·····« · · ·· ·· · ·· 9···

- 133 τ-

o

a

ki

C

tp

a)

a)

X

k

Φ

c

2

k

ki

0

k

(0

Φ

k

k

r-4

ki

X

x

tn

a)

XI

r-4

in

φ

a)

0)

ki

Φ

1—1

r-4

x

Eh

E-*

0

<

cu

PL,

<

ω

CL

0

<

x

ΙΛ

cn

X

ω

<

H

O

X

k

C

tP

Φ

φ

CL

k

φ

G

G

k

k

<0

k

<Ü

Φ

k

k

XI

1—4

k

X!

x

in

Φ

X

r-H

in

Φ

Φ

Φ

r—1

Φ

r-H

r-H

X

Eh

Eh

0

<

Cl

CL

<

w

CL

0

<

X

W

cn

<

w

<

H

0

CL

k

G

tP

Φ

Φ

5

k

Φ

X

CL

3

k

k

0

CL

(Ö

r—1

k

k

X

r-4

k

X

X

X

Φ

X

r-4

tn

Φ

Φ

Φ

k

in

1—1

<0

CL

E-i

H

0

<

CL

CL

0

ω

CL

0

<

X

ω

ω

CL

>

(folytatás)

o

CL

k

C

tP

Φ

Φ

5

k

Φ

CL

3

k

k

0

a

(Ü

i-H

k

k

X

r—<

k

X

X

r-4

Φ

X

r-4

in

Φ

Φ

X

k

tn

r-4

Π3

CL

Eh

0

<

CL

X

0

ω

CL

0

<

X

cn

Eh

CL

<

>

LO

CO

IP

o

r-4

CM

n

in

lű

t·

co

Ch

o

rH

CM

n

m

n

n

3·

-s·

•fl·

*3·

in

in

in

in

in

Met Met Met Leu

r-4

CM

r>

M1

in

VD

>

CO

CN

n

in

kD

Γ

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

Q

t-4

<N

n

in

ω

0

0

0

U

0

0

0

0

U

0

0

0

0

0

Q

a

Q

Q

Q

Q

0

C

k

tn

k

k

Φ

0

in

Φ

CL

5

in

0

k

<—1

X

>,

X

X

k

•r4

X

in

Φ

•H

k

CL

0

Eh

X

Eh

CL

CL

X

CL

X

X

X

O

k

k

U1

k

k

Φ

0

tn

Φ

CL

5

k

tn

k

X

X

>1

X

X

k

Ή

X

in

Φ

Φ

•r4

CL

Eh

Eh

X

Eh

Eh

CL

CL

K

CL

<

X

ω

X

C'

CO

CP

o

t-4

cm

r>

in

IŰ

r-

CD

cp

o

m

r>

m

•<3·

kí

-3·

’T

•<r

in

t-4

CM

n

•>3·

in

LD

Γ'

CO

C\J

ΓΊ

in

kD

«

H

H

H

H

M

W

M

0

0

0

0

0

0

0

0

0

0

o

0

0

Ο

« *

- 134 CE9 51 Gly Gly D7 56 Gly Gly Gly Gly

o

tn

fH

ω

aj

W

ω

ω

fH

3

φ

Pd

05

>1

rd

•<d

f-H

(0

φ

Λ

Φ

JZ

fH

tn

rd

Pd

Ml

>

Ml

<

S

0

Ml

>

Ml

ω

Pd

u

<

<

c

o

tn

rd

tn

<Ü

tn

>d

tn

tn

<—1

3

L

L

3

>1

a

rö

tn

P

Π3

>1

rd

•H

r—1

>1

tÜ

Φ

Λ

Φ

Φ

r-H

tn

rd

<

Cd

>

Ml

K

0

Ml

Ml

>

J

Ed

tn

Ml

0

<

c

o

tn

r~l

in

(0

tn

Sh

tn

tn

r-H

3

>d

05

Φ

P

a

>5

tn

P

>1

05

íp

rd

•rd

r-H

05

Φ

fH

rH

x

Φ

in

r—1

Pd

>

Ml

<

s

0

Ml

Ml

>

J

0

Pd

ω

<

0

>1

<ü

Φ

P

Cd

Sp

c

O

tn

rH

tn

05

in

>d

tn

tn

iH

3

F—1

rd

Λ

Φ

in

fH

in

P

05

rH

Ή

rH

>,

05

Φ

0

<

Pd

ΙΛ

<

0

<

Pd

Ml

>

Ml

<

K

u

Ml

Ml

>

Ml

σ

o

fH

<N

m

S

co

cn

o

rH

04

Cd

in

0

r-

co

0

r*

in

in

in

ID

ω

kO

0

0

0

0

kD

0

o

t—<

OJ

ΓΊ

<r

in

ω

r*

co

fH

OJ

co

in

U3

Γ-

co

σ>

rd

rH

fH

fH

rH

t—1

r-4

r*4

rH

M

M

W

w

’ M

W

Η

M

M

w

M

w

H

W

M

w

w

M

p

05

c

3

tn

<0

ω

P

tn

rd

r-i

(Ű

(0

fH

Od

<0

Φ

fH

rd

Φ

p

rd

•H

fH

Φ

>d

(0

05

rd

rd

05

r-H

tn

rd

ΙΛ

<

0

Ml

<

<

X

0

0

Ml

>

>

<

>

0

<

<

p

<0

M

rH

ÚJ

>d

ω

>1

ű*

tn

,-l

íu

Qd

<0

3

P

c

<c

Φ

fH

rd

05

>1

rd

•f4

rH

>d

Sp

«5

fH

in

rd

Φ

£

tn

i—1

Ui

0

>

0

X

0

Ml

Ml

>

<

<

<

Ml

Ed

<

<

<N

m

tT

0

Kű

r-

co

Ch

o

fH

m

m

0

0

0

co

σι

0

in

0

0

in

0

in

0

0

0

ÚO

0

0

0

0

0

0

	o	fH	OJ	n		in	0	r·**	co
	rd	fH	f4	fH	fH	fH	rd	fH	fH
wmwmmwmmw	W	M	M	W	W	w	M	W	W

E19 70 Val Val E19 75 Leu Leu Ile, Thr Ile

Ül

C

-P

a

a

3

ω

o

<0

φ

(0

ui

3

3

ül

ül

>1

ül

a)

üi

ül

Φ

>,

P

1—1

Λ

rH

>Ί

Φ

Φ

rH

Φ

•rl

>>

P

<

X

<

<

Pl

P

Λ

<

P

<

Pl

Pl

ül

0

P

X

u

10

ül

3

Ou

Q<

3

ül

>1

)H

Φ

<Ü

c

3

P

3

3

ül

ül

>1

H

Φ

V)

ül

Φ

>1

rH

X

X

rH

rH

Φ

Φ

r—(

Φ

•rH

>1

Pl

X

Pl

<

<

P

Pl

0

F·

P

<

0

Pl

ül

0

Pl

X

u

Eh tS3 '<

P

W '<

Fi

3

ül

3

a

c

3

ül

ki

Φ

ki

c

3

ki

3

3

ω

ül

rH

•rl

Φ

ül

<0

Φ

>1

rH

X

X

Φ

rH

Φ

Φ

rH

Φ

•H

>,

<

X

P

<

<

P

P

u

Eh

p

ül

0

P

ül

0

P

0

ül

3

P

c

3

ül

>1

ki

Φ

<0

ki

5

P

3

3

ül

ül

p

-rl

Φ

ül

ül

Φ

>1

rH

X

X

rH

X

Φ

Φ

rH

Φ

•rH

>5

ül

X

P

<

<

P

P

0

Eh

p

<

Eh

P

0

0

P

X

0

<

co

σ>

o

rH

ni

Cl

xf

in

ιο

Γ'

CD

σ

O

rH

Γ4

n

rí

Γ

CD

CO

CO

co

CO

co

co

co

CD

co

σ

σ

σ

σ

σ

o

rH

ni

n

xr

in

10

co

ni

P

P

pH

P

P

Pl

P

tn

rH

CN

n

M*

in

10

co

σ»

W

M

w

W

M

w

w

W

M

Ph

Uh

Ph

pH

Ph

Pn

ín

Ph

p

ül

Φ

a

a

Φ

>H

>1

3

3

kn

ül

3

>H

3

3

ül

<0

(H

>1

Φ

rH

ül

ül

rH

rH

rH

rH

Φ

Φ

>1

Φ

Φ

rH

Φ

•H

rH

>,

P

ül

H

<

M

0

0

<

P

ül

P

P

ül

0

P

X

<

Eh

(0

ω

rH

P

P

X

0

K

3

3

ki

fű

3

ín

P

3

ül

3

ül

rH

•H

tti

ül

ül

Φ

ki

ül

rH

Φ

Φ

rH

Φ

Φ

ül

Φ

•rH

rH

•rH

K

>

<

<

X

p

<

<

Ρ

ül

<

P

ül

<

P

X

<

X

rH

CN

xr

tn

10

r*

co

σ

ο

rH

ni

n

xr

in

IO

co

σ

n-

n-

r-

r-

r-

r-

r-

Γ

co

CO

co

co

co

co

co

co

co

CD

o

rH

CN

m

in

kO

00

rH

m

pH

pH

Ph

ín

P

pH

Ph

pH

rH

(Ni

m

in

kO

>·

co

on

0

W

M

W

PJ

W

w

pq

pq

pq

P

ín

Ph

Ph

Pn

Ph

ín

ín

’ Ph

Ph

FG2 90 Lys Ile FG2 95 Lys Lys Lys Lys ·· ·· · · · f • · · ···· · · • · · ······ · · ·· ·« · ·· ··««

- 136

(Λ

r-4

£!

o

3

c

0)

in

3

3

>1

c

f—1

+J

r-4

a)

a)

2

•H

in

r4

U)

φ

0)

r-4

tn

03

a)

<Ü

r4

r-4

aj

>

<

X

o

x

x

X

X

0

<

>

£

.>

H

H

X

3

tn

X

a

o

3

c

Φ

W

3

3

>1

c

rH

3

r-4

M

r-4

3

a)

•H

(Ö

tn

M

r-4

W

r

0)

Φ

r—4

in

IÜ

a)

03

JZ

03

Φ

x

>

<

X

0

<

X

X

X

i-J

0

>

X

>

>

kJ

3

in

í—4

a,

o

3

c

φ

tr

5

3

c

r4

3

r-4

to

r—l

3

Φ

•H

03

ω

Cl

.X

in

x

M

Φ

Φ

r-4

in

n3

Φ

<e

>1

rO

Φ

>

<

X

0

<

x

<

kJ

>J

0

<

>

kJ

>

U

>

kJ

(folytatás)

3

w

r-4

a

o

3

c

Φ

tr

3

3

>,

c

r4

3

r-4

r-4

3

Φ

•r4

ra

tn

r-4

in

X

Φ

Φ

r-4

in

03

Φ

03

>1

03

Φ

kJ

X

>

<

X

0

<

X

kJ

kJ

0

<

>

kJ

>

u

>

X

CO

r*

co

<r

<3

r4

<N

n

in

CO

Γ

co

cr\

o

r-4

CN

cn

^r

cr

cr

cr

cr

O

o

O

o

<3

o

O

o

o

o

X

r-4

r4

r4

r4

X

r-4

r4

X

r-4

r4

X

r-4

r-4

r-4

rd

r-4

r4

r4

r-4

ΓΊ

in

o

r4

(N

CO

in

kO

0

0

0

r4

fsJ

n

in

co

r-

co

CT

r4

H

r-4

r4

r-4

r-4

r-4

t-t

[X-4

|x<

0

0

0

0

U

0

0

0

o

0

0

0

0

O

0

0

3	tr	i—1	X	O	r-4	c	Φ	in
Φ			in	Ci	(Ü	in	X	>
kJ		>	<	X	>		X	X
3	tr	r“4	a	0	r-4	c	Φ	in
Φ		03	in		03	in	X	>1
kJ	<	>	<	X	>		X	kJ
r-4	CM	n	X	in	CO		co	cr
cn	tr	cr	cr	cr	cr	cr	cr	cr

3	3		ω	in	3	3	r4	Cl	3
Φ	Φ	Φ	•H		Φ	Φ	nj	X	Φ
kJ	X	tn	X	υ	X	X	>	Eh	X
3	3		in	in	3	3	X	C4	3
Φ	Φ	φ	•H	>4	Φ	Φ	Π5	X	Φ
X	X	cn	X	u	X	X	>	Eh	X
o	r-4	CM	m	•cr	in	CO	r-	co	cr
o	o	O	o	o	o	o	o	cr	o
r-4	r4	X	r4	X	X	r~4	X	r4	X

m

	in									o	r4	cm	n	X	in	co
0	0	X CM	n	’d4	in	co		co	cr	X	r4	X	r-4	X	X	X
	X	0 0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

G17 110 Alá Alá G17 115 Alá Alá Alá Alá

- 137 ·· V» · · · · «······ · • · · · ♦··· · · · ·· ·· · ·· ···« (folytatás)

G18 111 Alá Alá G18 116 His Arg Ile Thr

U]

0)

ω

3

Φ

L

o

3

rH

c

d

<Ö

CL

C

ω

3

•X

x

rH

r—I

X

X

P

Γ—<

cö

rH

»—1

r-l

L

rH

>1

Φ

CL

0

Ο

0

X

H

CL

0.

>

0

0

X

X

Μ Ο 3 XC

X Μ r—I (0X

Eh X 0 >0 ίο Ρ χ c ω 4->

< ω μ <—ι ω < w eh υ χ je

C

Φ

ω

3

Φ

P

O

C

X

c

<0

Ll

C

ω

rH

ω

X

t—<

»—1

X

X

L

rH

Φ

r-H

X

rH

>.

r-1

(0

*C

CL

0

0

CL

E-<

CL

0

s

0

<

<

Eh

0

x

>

in

Φ

>1

ω

3

Φ

h

0

0

rH

c

(Ú

d

c

in

rH

♦H

X

rH

>

rH

X

X

L

L

ιϋ

r-H

f—t

rH

rH

>1

ÍÜ

X

CL

0

0

CL

Eh

CL

CL

>

0

<

Eh

0

>

r-

co

cn

o

rH

CN

co

x

in

VD

r-

co

σχ

o

rH

CM

CO

rH

rH

rH

CM

CM

(N

CN

CM

CM

CM

CM

CM

CM

n

co

CO

n

rH

rH

rH

rH

r—1

rH

rH

rH

rH

rH

1—1

rH

rH

i—1

1—1

rH

rH

(Ti

rH

CN

m

X

in

o

o

rH

rH

K

X

X

X

X

rH

CM

co

in

<0

co

rH

rH

rH

0

0

0

0

0

0

X

X

X

X

X

X

X

tP

Φ

o

<Ú

a

Φ

L

«5

3

in

(0

rtj

X

X

«

Φ

X

c

rH

ω

X

X

rH

rH

rH

•H

rH

X

M

w

X

<

X

X

<

X

Eh

<

0

<

X

<

<

Eh

<

X

X

3

rs

(Ű

3

Φ

u

o

rH

cn

(tí

Ll

3

X

»Λ

Φ

•H

Φ

X

rH

rH

X

X

L

rH

fÚ

•H

rH

Φ

Φ

ω

X

X

X)

X

0

X

Eh

X

<

>

X

<

0

X

<

x

X

cm

r>

x

m

ID

r-

co

<P

o

rH

CM

CO

X

in

ιο

Γ-

co

i—1

rH

rH

rH

rH

rH

rH

rH

CN

CM

CM

CM

ni

(N

CM

<N

rH

rH

rH

rH

rH

rH

rH

X

rH

rH

rH

rH

X

X

X

rH

rH

σ»	rH	n>	cn	X	in
rH	X	SC	M	X	X
0	0	0	0	0	0

xiN^xinior-coiPOX

Η12 129 Leu Leu Η12 134 Val Val Val Val • · · · · · · · • · ···· · · • · · ·«»···· · · ·· ·· · ·· ····

- 138 (SÍ

ti	(ti	r—{	(ti	Φ	ró	t>	(ti	m	cn	t	co
<D	rH	ró	rH	r—i	r—|	Φ	rH	•rH			•H
CO	<	>		H		►q		K		É?

cm

(ti 1—1
ti		r—1	(ti
Λ	rH	ró	>—1
H	0	>	<

ki	(ti	3	t	ti	tn	t	m
Φ	1—1	Φ	Φ	Φ	ti	£	•H
co			co	co		K

ra ra

(ti		rH	(ti	c	<ti	3	(ti	ro	ro t	ro
i—1	rH	ró	rH	ro	i—1	Φ	i—1	-rH		-H
	0	>						w	ti H	K

	ró f-H	>, rH	rH ró	ró rH
Eh	<	u	>	<
	m	<0	r*	CD
m	m	m	m
	rH	rH	rH	rH

(folytatás) tS] ra ra ra o

CM

c	ró	2	ró	cn	tn	t	ro
OT	rH	Φ	rH	•rH			-H
		ti	<	w	ti		K	ra
cn	O	rH	cq	m		in	CD	ra
m			M*		<<	n*		ra
rH	rH	rH	tH	rH	rH	rH	rH	ra

cn i—I

m

in

CD

CO

cn

O

rH

rH

CN

cn

rH

rH

rH

rH

rH

rH

rH

<N

CN

u

U

o

K

w

K

w

K

K

K

w

K

M

w

w

ró

H

•

o Γ)

tSJ

ώ

ω

<

•

l J

ÍH

r-1

rH

ti

μ

rH

p

t

2

m

L

Cn

tSJ

ej

Φ

(ti

(ti

Φ

φ

ró

Φ

x:

rH

ti

ΓΖ)

N

ω

>

>

co

co

>

ti

H

0

ti

Eh

<

ω

o5

2

i—1

Γ4

ró

t

<—(

ti

t

rH

3

t

ÍH

tn

ti

Cn

vró

rH

Φ

(ti

Φ

Λ

(0

Φ

X!

Φ

>r

>1

t

co

>

CO

>

ti

Eh

ω

ti

ÍH

<

CO

O

rH

CN

ra

LH

CD

t

co

cn

o

rH

CS3

II

m

m

ra

ra

ra

m

ra

ra

m

ra

N<

(J J

r-1

rH

rH

rH

rH

rH

rH

rH

rH

rH

rH

rH

bq

ra ra • ra

cn	T	in	kD	t	CO	cn	o	rH	rH	CN	ra
rH	rH	rH	rH	rH	rH	rH	(N	CN	0	u	0
K	w	w		a	w	K		M	a	»	K

• · · « ·· ·· · · · •· ·· · * · ··»·

- 139 -

ω ω

+³ rö H

O ö Φ

Φ -P Φ

CN

cn rH ki

rn p

CN

in

ch Φ ÍH ra £ ^va P g

*5

Φ ε Φ x:

tv ε Φ JZ

Φ ε 0) x ra ra

Φ Φ

U O

		Φ	•H	•rH			CN cO
		P	rH	r—1
		•H	Φ	Φ			ö~
		W	JZ	JZ			—»
CN cO.	-P g	ü tó	M 1	w 1	CN cű	CN CQ	Φ ε φ
θ'		Q	tó	CQ	cT	eT	JZ

CO ö

Φ ε

Φ X <2 cT

a) ε φ x

OJ ε φ x

TÁBLÁZAT' TERMÉSZETES ALACSONY AFFINITÁSU HEMOGLOBIN MUTÁNSOK k

'a >

•P

CN σ>

CN •p <£>

CN <o o

cn

σ CN i r* CN

C\J *

o iri tó

X σ φ

-ρ £}

Φ Ρ

Γ υ C3 tó rtJ

C (0 c

•p co in

Ό cn co CN co cn c in

	Z—X		z—x	O
cn	CM	♦	o	Z—S	•
•	•	CN	•	r-4	ro
CM	CN	i-4	CM	CM	—'
N_Z	N—'	N—'	'χ-χ	'—	Lf)
o	o	CO	ΙΓ)		Γ-
TT	in		CO	CN	γο

	>leu	rH (0 > Λ	cn P fü Λ	c ra <0 Λ
ra	1 1	1 I	1 |	1 I
C 'aj	Φ	<D	S	tó
-p	JZ	JZ	Φ	ra
	ez	tó	r-4	ra
g
tö q_]	rH	r—1	x—.
Q	Q	Γ-	r—1
	U	U	Ul	o
X	N_-	'-T	—'
CO	ΓΟ	IO	•p
	-^r		CO	σ

	(0 i—4 c0
r-f	>1 r—4 ΰ>	tó M ra	Cn k ra
ω ρ	P	Λ	Λ	Λ
Ρ	Φ u	1 1	1 1	1 1
P	<0	a,	>5	tó
2	Λ	ra	rH	k
s	1 I	(0	Cn	P
d	1 r—4			-—X
-p	<0	co	ID	CO
<L>! >	CQ	cn	U
		N—X	N—Z	>*-*
	r~4	t-H		Γ-
		CM	CM	η

	k		i—4	k
0	Φ	<u	ra	Φ
k	ra	rH	>	ra
tó	Λ	A	Λ	Λ
Λ	1 I	1 I	1 I	1 I
1 1	1 Φ	1 Φ	1 <D	1 Φ
P	JZ	JZ		x
x:	tó	tó	tó	tó
P
	X—X	Z—X	X	Z—X
	r-4	r4	r-4
	Q	Q	Q	Q
O	U	U	U	O
•N—·	*—'	N—*	N—'
CO	CM	CM	CN	in
co			T*	Ν’

c	φ	C
Ή				r-4	Ή
XJ	•H			r—1	JZ
o				•r4	0	£
r—i	ra	0	P	>	r-4	Cn
D	ra	c	•r4	ra	Ü	•H
O	o	•H	JZ	zi	0	Φ
ε	k	k	ra	P	ε	r-4
ω	•H	O	o	•H	φ	(0
X	X	H	s	EH	X	Pí

P	JZ
□		TS	44	P	φ
u		r-4	U	•H	r—<
•H		•H	z	ε	r-4		Φ
P		JZ	0	«	•H	•H	r—I
o	ra	u	k	k	>	Cn	k
Φ	>	ra	Λ	Φ	ra	ra	0)
c	o	JZ	<D	ε		TJ	>
c	ra	P	N	ε		c	Φ
o	o	o	ra	ra	o	Φ	JZ
	X	tó	X	X	J	(Λ	o

- 140 Εη <

Ν '<

X cq <

Eh <4 in HŰ X <ΰ X >1 γ—!

Ο m cm η Μ·

CM CM CM

Ό	> rH	co rH	cn rH	o CM	rH CM	rH	ι—1
in	in
Φ	<D
o	o
•rH	•H
í—1	rH
Φ	Φ
X	X
		Φ	0)	Φ	Φ
Q	M	E	ε	ε	ε
1	1	a)	φ	φ	φ
o	CQ	x	X	X	χ

« ·

	• · · ···«·» 4 ·
• ·	·· · ·· ·*··
Ό	Γ-			o
CM	CM	CO	cn	n <-*
		CM	CM	ro

φX

X<0

-ΗC (ΛL

o	CM	o	rH
x-s.	•		•	♦	•	<—-
kO		rH	>	σ	co	co
CM	CM	Γ0	CM	rH	CM	CN
'—	S_~x	—	X—'	'—	*—
o		rH				CO
co	<0		a	o	in	ΓΊ
	•		•	•	•
	Γ'		co	in	co
	co		co	CM

ο ιη σ\ ο

ο ιη

co ω ο σ ο

rH

CN

Ο

C0

CM

tp

X

a

£X

Jn

c

r-H

L

p

X

c

X

tn

in

>1

in

(0

X

w

in

tP

«5

Φ

r-H

X

(0

ra

P

(0

>

X

Π3

rH

>1

L

A

ε

tP

A

A

A

A

A

A

A

A

tP

rH

ro

1

Λ

A

1

1 I

1 1

1 t

1 i

1 <

1 I

1 I

A |

A |

A 1

1 3

1 1

1 1

1 ω

1 rH

1 (Ö

l a

f a,

1 CL,

ω

>.

1

1 1

1 1

Φ

ω

in

fÜ

rH

in

in

in

>1

rH

3

3

3

r—t

>,

r-4

>

Π5

10

(0

(0

iH

tP

rH

rH

Φ

rH

rH

tp

CP

rH

χ—X

χ—χ

χ—X.

χ—K

X--.

X—X

x----

X—X

______,

o

rH

>

Γ

Ό

>

.—

,—,

x—X

Q

in

<p

r-H

rH

!—1

rH

rH

rH

lű

id

U

ω

W

w

w

W

w

M

W

w

tó

fcn

•—

χ_χ

-__

X—X·

*—·

x—'

X—X

X—'

----

-----

co

rH

Lfl

kO

>

o

ΓΊ

C0

m

CM

co

o

o

rH

ω

l£>

kO

10

CO

co

(P

<P

σ

φ X C •Η

Γσ ω ο ο rH <ο X. ο

L Ο C

Φ

3

tó

<0

<0

rH

Φ

>

CQ

1

•H

Φ

c

o

rH

3

1

Φ

Φ

tn

3

tp

X

θ'

O

o

X

X

0

Φ

rH

L

o

<0

0

X

0

u

u

ω

X

u

rH

•H

Φ

tp

Φ

a

•fH

rH

•rH

•H

•rH

<0

c

P

X

X

μ

tn

φ

L

0

a?

X

L

Φ

(0

o

o

(0

o

Cn

(0

PQ

u

o

CQ

in

>

tó

s

tó

tó

tó

<

o

Kansas 102(G4) asn—>thr 28.0(9.0) áfa

- 141 • · · · · β » · • · · « « · · · • · · · ««·· 9 Λ 9 * · ·· · 9 9 ·· ·«

CM	m	CO	in co	KŰ	r-	co	σ co	o
m	CO	•k		co	co	CO	t—1	fH
		fH

cű ö ο

etT c2

X •H r-H

0) SZ

I u

Φ ε Φ £ tű tói

KJ p

1--ί :o

I—ΐ

O •r~D

O o CM o

co co co CM

CM in

H Φ +³ ti 'Φ

H

N '<

1-4 tó '<

	o	in	o
Γ	σ	CM	σ
x—·'	·*—'	·
CO	Ch	CO	o
σ	CM	KO
	P		fH

O m pH

-P p 'Φ p r~_rÓ P c

P-<

rr·;

r~!

ω 'tó -P <0 P rd o m

	tó	tn	(1)	0	Cl.	&
P	P	ω	Cn	in	>1	x	P	ω	ω
Φ		>1	P	ra	P	cu	tn	Π5	ra
U)	-P	r-H	tó	Λ	Λ	Λ	A	Λ	Λ
Λ	Λ	Λ i	Λ I	1 1	1 1	1 |	1 j	1 |	1 1
1 1	1 1	1 1	1 1	1 c	1 c	r—1	r—(	>1	1 rtJ
c	c	C		V)	ω	Íö	fÜ	r—<	P
ω	tn	ω	rH	tó	(Ű	>	>	tn	rtJ
Λ	tó	CÚ	tn
				z—X	Z—X	Z—X	Z—X	Z—X	Z-X.
	z—X	,Ζ-χ	Z«X	o	o	CO	in	Tf	CO
		xr	σι	P	P	P	P	P	F“<
u	u	0	0	0	0	u	0	X	X
X__-	X—’		X—X	X—*·		'x-'		··	'X—-·
CM	CM	CM	Γ	CO	CO	P	co	0	o
O	O	O	o	o	o	P	P	co
r.	r-4	«—<	rH	P	P	1—1	P	P	fH

Ό tű ω N •H > tó

Φ κϊ

-p

P '(D > Φ t—I <D tó>

P P :o ρ :o

Λΐ

I o

rO ftó !>

•ra ^KO c x:

fH	φ	Π3	cn
Φ	Ό				Ή	3
tó	C			tó	P	0
P	tó	Ό		X	Φ	P	Λ4
U)	£	C		d	-P	0	P
H		O		N	>1	Λ	o		•H
	JJ	ε	Φ	•H	Λ	P			Ό
SZ	C	sz	Sí	SZ	tn	Φ		Φ	Φ
•P	Ή	o	P	tn	Φ	-P	s	tó	£
Φ	(0	•H	tó	o	P	Φ	Φ	0	•H
tn	cn	tó	CQ	>	tó	tó	z	tó	X

tn φ

-P p

(D fi

I o ffl M fi (D

PJ 'Φ -P <D CQ

Φ ·««« · · · • 99 ♦··*

- 142 A,, 2._Táblázat hivatkozásai

1) Hemoglobin 1987, 11, 241-308.

2) Ohba, Y. ; Miyaji, T.; Matsuoka, M. ; Yokoyama, M. ; Numakura, H. ; Nagata, K. ; Takebe, Y. ; Izumu, Y. ; Shibata, S. Biochemi. Biophys. Acta 1975, 405, 155160.

3) Beretta, A.; Prato, V.; Gallo, E.; Lehmarm, H. Natúré 1968, 217, 1016-1018.

4) Knuth, A.; Pribilla, W. ; Marti, H.R.; Winterhalter,

K.H. Acta Haematol 1979, 61, 121-124.

5) Schneider, R.G.; Atkins, R.J.; Hosty, T.S.; Tomiin, G.; Casey, R.; Lehmann, H.; Lorkin, P.A.; Nagei, K. Biochem Biophys, Acta 1975, 400, 365-373.

6) Moo-Penn, W.F.; Bechtel, K.C.; Schmidt, R.M. ;

Johnson, M.H.; Jue, D.L.; Schmidt, D.E.; Dunlap, W.M.; Opellá, S.J.; Boneventura, J.; Boneventura, C. Biochemistry 1977, 16 , 4872-4879.

7) Moo-Penn, W.F.; McPhedran, P. ; Bobrow, S.; Johnson,

M.H.; Jue, D.L.; Olsen, K.W. Amer. J, Hematol 1981, 11, 137-145.

8) Idelson, L.I.; Didkowsky, N.A.; Casey, R.; Lorkin, P.A.; Lehmann, H. Natúré 1974, 249, 768-770.

9) Gacon, G.; Belkhodja, 0.; Wajcman, H. ; LaJoie, D. Febs Lett 1977, 82, 243-246.

Blouquit.; Delanoe,-Garin, J. ; Lacombe, C.;

Arous, N. ; Cayre, Y.; Peduzzi, J.;

10) • ···· · · · ·· *· 9 9· ···«

- 143 11)

12)

13)

14)

15)

16) .

Braconnier, F.; Galacteros, F.; Febs Lett.

1984, 172, 155-158.

Dacíe, J.V.; Shinton, N.K.; Gaffney, P.J.; Carrell, R.W.; Lehmann, H. Natúré 1967, 216, 663-665.

Keeling, M.M. ; Ogden, L.L.; Wrightstone, R.N.; Wilson, J.B.; Reynolds, C.A.; Kitchens, J.L.; Huisman, T.H. J. Clin. Invest. 1971, 50, 2395-2402.

Bratu, V.; Larkin, P.A.; Lehmann, H.; Predescu, C. Biochem. Biophys. Acta. 1971, 251, 1-6.

Ogata, K. ; Ho, T. ; Okazaki, T. : Dán, K.; Nomura, T. ; Nozawa, Y.; Kajita, A. Hemoglobin 1986, 10 , 469-481.

Yeager, A.M.; Zinkham, W.H.; Jue, D.L.; Winslow, R.M.; Johnson, M.H.; McGuffey, J.E.; Moo-Penn, W.F. Ped. Rés. 1983, 17 , 503-507.

Charache, S. ; Brimhall, B.; Milner, P.; Cobb, L. J. Clin. Invest. 1973, 52., 28582864 .

17)	Marinucci, M. ; Giuliani,	A.; Maffi,	D. ;
	Mássá, A.; Giampolo, A.	; Mavilio,	f. ;
	Zannotti, M. ; Tantori,	L. Biochem.
	Biophys. Acta. 1981, 668,	209-215.

···#··* * • · · · ···« · · · ·· ·· · ·* ··«·

144

18) Garel, Μ . C . ; Hasson, W. ; Coguelet, M.T.;

Goosens, M. ; Rosa, J. ; Arous, N. Biochem

Biophys. Acta . 1976, 420, 97-104.

19) Shih, D.T.; Jones, R.T.; Shih, M.F.C.;

Jones, M.B.; Koler, R.D. ; Hemoglobin 1987, 11, 453-464.

20)

Steadman,

J.H.; Yates, A.; Huehns,

Brit., J.

Haematol 1970, 18, 435-446.

21) Stamotoyannopoulos, G.; Parer, J.T.; Finch,

C. New Enq. J. Med. 1969, 281, 915-919.

22)

Andersón,

Perutz,

Stamatoyannopoulos, G.

1973, 243, 275-276.

Natúré New Bioi.

23)

Jones, R.T.; Brimhall, B.;

Pootrakul, S.;

Gray, G. J. Mól. Evői. 1976, 9, 37-44.

24) Konotey-Ahulu, F.I.D.; Gallo, E.; Lehmann,

H.; Ringelhann, B. J. Med. Génét. 1968, 5, 107-111.

25)

Schneider, R.G.; Hosty, T.S.; Tomiin, G.;

Atkins, R.; Brimhall, B.; Jones, R.T.

Biochem Génét. 197 5, .13., 411-415.

26) Sugihara, J.; Imamura, T.; Nagafuchi, S.; Boneventura, J.; Boneventura, C. ; Cashon, R. J. Clin. Invest. 1985, 76, 1169-1173.

27) Tatsis, B. ; Sofroniadou, K. ; Stergiopoulas, C.I. Blood 1976, 47, 827-832.

• · · · ··*· ······« · • · · · ···· 9 9 ·· ·· · ·· ····

145

28)

29)

Merault, G.; Keclard, L.; Saint-Martin, C.; Jasmin, K.; Campier, A.; Delanoe Garin, J.; Arous, N. ; Fortune, R. ; Theodore, M. ; Seytor, S. ; Rosa, J. ; Blouquit, Y. ; Galacteros, F. Febs Lett. 1985, 184 , 1013 .

Imar, K. ; Morimoto, H. ; Kotani, M. ; Shibata, S.; Miyaji, T.l Matsutomo, K. Biochem. Biophys. Acta. 1970, 200, 197-202.

30) Ahern, E.; Ahern, V.; Hilton, T.; Serjeant,

G.D.; Serjeant, B.E.; Seakins, M. ; Láng, A.; Middleton, A.; Lehmann, H. Febs Lett.

1976, 69, 99-102.

31)

Boneventura, J.; Riggs, A.; J. Bioi. Chem.

1968, 243, 980-991.

32) Nagel, R.L.; Lynfield, J. ; Johnson, J. ;

Landeau, L. ; Bookchin, R.M. ; Hamis, M.B. N. Enq. J. Med. 1976, 295, 125-130.

33) Arous, N.; Braconnier, F. ; Thillet, J. ;

Blouquit, Y. ; Galacteros, F. ; Chevrier, M. ; Bordahandy, C.; Rosa, J. Febs Lett. 1981,

126, 114-116.

34) Efremov, G.D.; Huisman, T.H.J.; Smith,

L.L.; Wilson, J.B.; Kitchens, J.L.; Wrightston, R.N.; Adams, H.R.; J. Bioi. Chem. 1969, 244, 6105-6116.

35) Turner, J.W.; Jones, R.T.; Brimhall, B.; DuVal, M.C.; Koler, R.D. Biochem. Génét. 1976, 14, 577-585.

146

36) Imamura, T.; Fujita, S.; Ohta, Y.; Hanada,

M. ; Yanase, T. J. Clin. Invest. 1969, 48, 2341-2348.

37) Moo-Penn, W.F.; Wolff, J.A.; Simon, G.;

Vacek, M. ; Jue, D.L.; Johnson, M.H. Febs Lett. 1978, 92., 53-56.

38) King, M.A.R.; Willshire, B.G.; Lehmann, H. ;

Marimoto, H. Br. J. Haem. 1972, 22 , 125134 .

39) Ranney, H.M.; Jacobs, A.S.; Nagel, R.L. Natúré 1967, 213, 876-878.

40)

Minnich, V.; Hill, R.J.;

Khuri, P.D. ;

Anderson M.E. Blood 1965, 2.5, 830-838.

41)	Ohba, Y. ;	Miyaji, T.;	Murakami,	M. ;
	Kadowaki,	S . ; Fuj ita, T	. ; Oimoni,	M. ;
	Hatanaka,	H.; Ishikawa,	K. ; Baba,	S. ;

Hitaka, K,; Imái, K. Hemoglobin 1986, 10

109-126.

147

3. TÁBLÁZAT A NEM-TERMÉSZETESEN ELŐFORDULÓ ALACSONY

AFFINITÁSU MUTÁNSOK JELÖLTJEI

ALFA LÁNC,

46	phe-	- >thr
46	phe-	- >ser
46	phe-	- >ala
58	his-	- >phe
58	his -	- >trp
61	lys-	->thr
61	lys-	- >ser
61	lys-	- >met
61	lys-	- >asn
62	val-	- >leu
62	val -	- >ile
62	val -	- >phe
62	val-	- >trp
65	ala-	- >asp
94	asp-	- >gin
94	asp-	- >thr
94	asp-	- >ser
94	asp-	- >lys
94	asp-	->gly
94	asp-	- >arg

BÉTA LÁNC21 asp-->ala asp-->ser phe-->ala phe-->thr phe-->val his-->phe his-->trp lys-->ser lys-->asn

- 148 -

3 .	TÁBLÁZAT (folytatás)
67	vál-	->phe
67	va 1-	->trp
67	val-	->ile
70	ala-	->glu
70	ala-	->ser
70	ala-	->thr
96	leu-	->phe
96	leu-	->his
96	leu-	->lys
98	val-	->trp
98	val-	->phe

102 asn—>asp

102 asn—>glu

102 asn—>arg

102 asn-->his

102 asn—>gly

108 asn—>arg

108 asn-->glu

149

4. 'TÁBLÁZAT

NAGY OXIGÉN AFFINITÁSU TERMÉSZETESEN ELŐFORDULÓ

HEMOGLOBIN MUTÁNSOK

SZERKEZET NÉV ^A· alfa lánc mutánsok (A4) Asp->AlaSawara

Asp->AsnDunn Asp->ValFerndown Asp->TyrWoodville Lys->AsnAlbany-Suma

40	(C5)	Lys->GluKariya
44	(CE2)	Pro->LeúMilledgeville Pro->ArgKawachi
45	(CE3)	His->ArgFort de Francé
85	(F6)	Asp->AsnG-Norfolk
92	(FG4)	Arg->GlnJ-Cape Town Arg->LeuChesapeake
95	(G2)	Pro->LeuG-Georgia Pro->SerRampa Pro->AlaDenmark Hill Pro->ArgSt. Luké's
97	(G4)	Asn->LysDallas
126	(H9)	Asp->AsnTarrant
141	(HC3)	Arg->HisSuresnes

Arg->SerJ-Cubujuqui

Arg~>LeuLegnano

B.	béta lánc mutánsok
2	(NA2)	His->ArgDeer Lodge
		His->GlnOkayama
20	(B2)	Val->MetOlympia
23	(B5)	Val->AspStrasbourg
		Val->PhePalmerston North

• ·

- 150 4. TÁBLÁZAT (folytatás)

34	(B16)	Val->PhePitie-Salpetriere
36	(C2)	Pro->ThrLinkoping
37	(C3)	Trp->SerHirose
40	(C6)	Arg->LysAthens-Ga Arg->SerAustin
51	(D2)	Pro->ArgWillamette Leu->HisBrisbane
79	(EF3)	Asp->Gly G-Hsi-Tsou Lys->ThrRahere Lys->MetHelsinki
89	(F5)	Ser->AsnCreteil Ser->ArgVanderbilt
94	(FG1)	Asp->HisBarcelona Asp->AsnBunbury
96	(FG3)	Leu->Val Regina
97	(FG4)	His->GlnMalmo His->LeuWood
99	(Gl)	Asp->AsnKempsey Asp->HisYakima Asp->AlaRadcliffe Asp->Tyr Ypsilanti Asp->GlyHotel-Dieu Asp->Val Chemilly
100	(G2)	Pro->LeuBrigham
101	(G3)	Glu->LysBritish Columbia Glu->GlyAlberta Glu->AspPotornác
103	(G5)	Phe->LeuHeathrow
109	(Gll)	Val->MetSan Diego
121	(GH4)	Glu->GlnD-Los Angeles Pro->GlnTu Górd Ala->ProCrete
140	(H18)	Ala->ThrSt.-Jacques
142	(H20)	Ala->AspOhio
143	(H21)	His~>ArgAbruzzo

- 151 -

4. TÁBLÁZAT (folytatás)

144 (HC1)

145 (HC2)

146 (HC3)

His->GlnLittle Rock

His->ProSyracuse Lys->AsnAndrew-Minneapolis Tyr->HisBethesda

Tyr->CysRainier

Tyr->AspFort Gordon

Tyr->TermMcKees Rocks

His->AspHiroshima His->ProYork His->LeuCowtown

Claims (33)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Egy nem természetesen előforduló, pszeudotetramer hemoglobin-szerű protein azzal jellemezve, hogy négy globin-szerű domént tartalmaz, az említett pszeudotetramer két alapvetően homológ globin-szerű doménnel rendelkező pszeudodimer polipeptidet tartalmaz, melyek közül az egyiket úgy mutáltattuk, hogy az említett pszeudodimer polipeptid másik globin-szerű doménjében nem szereplő aszimmetrikus keresztköthető cisztein maradékot biztosítson, az említett pszeudotetramer továbbá legalább egy másik globin-szerű domén-hordozó polipeptidet tartalmaz.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti két vagy több pszeudotetramer hemoglobin-szerű proteinből felépülő nem természetesen előforduló multimer hemoglobin-szerű protein azzal jellemezve, hogy az első pszeudotetramer aszimmetrikus keresztköthető cisztein maradékát keresztkötöttük egy második pszeudotetramer aszimmetrikus keresztköthető cisztein maradékához.
3. 3. A 2. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a keresztkötés egy diszulfid kötést jelent.
4. 4. A 3. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a keresztkötést a pszeudotetramerek sokfunkciós tiol-specifikus keresztkötő reagenssel való reakciójából megvalósítható.
5. 5. A 4. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a keresztkötő reagens egy olyan keresztkötést hoz létre, mely az ugyanezen maradékok között létrejött diszulfid kötéseknél a plazmával endogén redukáló anyagokkal kevésbé redukálható.
6. 6. A 4. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a keresztkötés egy tioéter vagy tio-maleimid keresztkötést jelent.
7. 7. A 4. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a keresztkötő reagens tiol-specifikus reaktív egységekkel

   153 rendelkező polietilén glikol származékot jelent.
8. 8. A 2. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a protein két pszeudotetramerből áll.
9. 9. A 4. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a protein kettőnél több pszeudotetramerből áll.
10. 10. A 4. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a keresztkötő anyag egy pefctid egységet tartalmaz.
11. 11. A 10. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a keresztkötő anyag egy vagy több D-aminosavat tartalmaz.
12. 12. A 10. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a peptid egység egy stabil, kinyújtott másodlagos szerkezettel rendelkezik.
13. 13. A 12. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a peptid egység egy poliprolin hélixet képez.
14. 14. A 12. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a keresztkötő anyag egy kétszálú felcsavart orsót jelent.
15. 15. A 14. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a felcsavart orsó két szála diszulfid keresztkötéssel kapcsolódik.
16. 16. A 12. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a keresztkötő anyag négy helikális vagy egy négy-szálú felcsavart orsót tartalmaz.
17. 17. A 12. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a peptid egység egy elágazó láncot tartalmaz.
18. 18. A 4. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a keresztkötés egy negatív töltésű egységet tartalmaz, ahol a protein izoelektromos pontja csökkentettük.
19. 19. A 18. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a negatív töltésű egység Asp és/vagy Glu maradékok sokaságát tartalmazza.
20. 20. Egy nem-természetesen előforduló pszeudooligomer • <

    r polipeptid azzal jellemezve, hogy négy vagy több globin-szerű domént tartalmaz.
21. 21. A 20. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy az említett polipeptid interdomén spacerként egy poliprolin helixet tartalmaz.
22. 22. A 20. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy az említett polipeptid interdomén spacerként egy poliaszpartát vagy poliglutamát hélixek tartalmaz.
23. 23. A 20. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy az említett polipeptid interdomén spacerként egy Artemia kötőt tartalmaz.
24. 24. A 20. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy az említett polipeptid interdomén spacerként egy helikális felcsavart orsót tartalmaz.
25. 25. A 20. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy a globin-szerű domének humán alfa globin-szerű domének és az interdomén spacer megközelítően 20-50 Á lehet.
26. 26. A 25. igénypont szerinti polipeptid azzal jellemezve, hogy az interdomén spacer -(Gly)₇, - (Gly) ^3 (Alá) ₁₂-(Gly) i_₃ ,

    - (Gly) _ 3 (Pro) 12 - 16~ (Gly) 1 - 3 ' ~ (Gly) _ 3 (Asp) _ 3 q ~ (Gly) _ 3 lehet.
27. 27. Egy nem-természetesaen előforduló multimer hemoglobinszerű protein azzal jellemezve, hogy a 20-26 igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet és egy vagy több további globin-szerű domén-hordozó polipeptid láncot tartalmaz.
28. 28. Egy nem-természetesen előforduló oktamer hemoglobin-szerű protein azzal jellemezve, hogy két olyan tetramert tartalmaz, melyekben az egyes tetramerek két humán alfa globin-szerű domént és két béta globin-szerű domént tartalmaznak, az egyik tetramer ciszteinje a második dómén megfelelő ciszteinjéhez egy diszulfid • · « e ···» · * · ·· v 9· ··*· . ,. - 15 5 v kötéssel kapcsolódik, egy harmadik tetramer keresztkötődését alapjában véve szférikusán védjük ki, azzal a megkötéssel, hogy a keresztkötődő cisztein nem a béta 83-nál (Hemoglobin Ta Li) található.
29. 29. A 28. igénypont szerinti protein azzal jellemezve, hogy a keresztkötődő cisztein a 2. Ábrán bemutatott mutációs helynél található.
30. 30. A 2-19 és a 21-29 igénypontok bármelyike szerinti protein azzal jellemezve, hogy az említett protein P₅q értéke 24-32 körül mozog.
31. 31. A 2-19 és a 21-29 igénypontok bármelyike szerinti protein azzal jellemezve, hogy az említett protein a plazmában levő normál hemoglobin-mentes proteinnél jelentősen hoszabb intravasculáris retencióval rendelkezik.
32. 32. Eljárás a vér oxigén hordozó kapacitásának kiegészítésére azzal jellemezve, hogy egy betegnek a 32. igénypont szerinti összetételt adunk, vagy egy olyan összetételt mely a 2-19 és a 21-29 igénypontok bármelyike szerinti proteineket tartalmazza.
33. 33. A 2-19 és a 21-31 igénypontok bármelyike szerinti protein alkalmazása azzal jellemezve, hogy vérpótló összetétel előállítására használjuk.