KR20100089816A - 이황화 결합을 형성하기 위한 개선된 방법 - Google Patents
이황화 결합을 형성하기 위한 개선된 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 본 발명의 방법에 사용되는 (폴리)펩티드/단백질, 핵산, 벡터, 숙주 세포 및 박테리오파지를 포함하는, 분자간의 이황화 결합을 형성하는 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 박테리오파지 입자의 표면상에 (폴리)펩티드/단백질의 개선된 디스플레이를 위한 이러한 방법의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 이황화 결합을 형성하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.
다수의 문헌들이 본 명세서를 통해 인용된다. 이러한 문헌들의 개시물 내용은 본원에서 전체가 참고로 인용된다.
1985년에, 스미스는 섬유상 파지(filamentous phage)가 그의 유전자 III 단백질(pIII)에 삽입된 이종의 단백질 절편을 허용한다는 것을 최초로 증명하였고, 상기 단백질 절편이 상기 파지의 표면상에 존재한다는 것을 보여줬다(문헌[Smith, 1985]). 래드너는 이러한 개념을 파지 입자의 표면상에 디스플레이(display)되는 (폴리)펩티드 및/또는 단백질의 레퍼토리(repertoire)의 스크리닝(screening)으로 확장하였다(제WO 88/06630호, 제WO 90/02809호). 이후에, 파지 디스플레이(phage display)는 극적으로 진행되었고 상당한 성과를 달성하였다.
다양한 형식이 (폴리)펩티드/단백질 파지-디스플레이 라이브러리(library)를 만들고 스크리닝하기 위해 개발되었고, 다수의 해설 논문 및 연구 논문들은 이러한 개발을 다루고 요약한다(예를 들어, 문헌[Kay 등, 1996]; 문헌[Dunn, 1996]; 문헌[McGregor, 1996]). 많은 경우에, 섬유상 파지-기반의 시스템이 사용되었다.
단일-사슬의 Fv (scFv) 절편의 디스플레이(제WO 88/06630호; 또한 제WO 92/01047호를 참고함)로서 초기에 제안된 바와 같이, 본 방법은, Fab 절편과 같은 다중결합 단백질의 디스플레이(제WO 91/17271호; 제WO 92/01047호)를 포함하는, 다른 (폴리)펩티드/단백질(예를 들어, 소의 췌장 트립신 억제제(bovine pancreatic trypsin inhibitor, BPTI)(제WO 90/02809호), 펩티드 라이브러리(제WO 91/19818호, 인간의 성장 호르몬(제WO 92/09690호), 및 다양한 다른 단백질)의 디스플레이로 빠르게 확장되었다.
상기 (폴리)펩티드/단백질을 섬유상 박테리오파지 표면으로 고정시키기 위해, 대부분 파지 피막 단백질(coat protein)로의 유전자 융합이 사용되었다. 유전자 III 단백질(문헌[Parmley & Smith, 1988]) 또는 그의 절편(문헌[Bass 등, 1990]), 그리고 유전자 VIII 단백질(문헌[Greenwood 등, 1991])로의 융합이 바람직하다. 일 예로 유전자 Ⅵ이 사용되었고(문헌[Jespers 등, 1995]), 일 예로 유전자 Ⅶ 및 유전자 Ⅸ의 조합이 Fv 절편의 디스플레이를 위해 사용되었다(문헌[Gao 등, 1999]).
나아가, 파지 디스플레이는, 또한 파지 람다(phage lambda)를 달성하였다. 그 경우에, 유전자 V 단백질(Maruyama 등, 1994), 유전자 J 단백질, 및 유전자 D 단백질(문헌[Sternberg & Hoess, 1995]; 문헌[Mikawa 등, 1996])이 사용되었다.
유전자 융합을 사용함과 더불어, 이종의 펩티드 또는 단백질이 연관 도메인(association domain)을 통해 파지 표면에 부착되었다. 제WO 91/17271호에서, 파지 상에 디스플레이되는 태그(tag) 및 비-공유 디스플레이를 달성하도록 디스플레이되는 (폴리)펩티드/단백질에 융합된 태그-결합 리간드(tag-bonding ligand)를 사용하는 것이 제안되었다.
유사한 개념이 cDNA 라이브러리의 디스플레이에 대해 수행되었다(문헌[Crameri & Suter, 1993]). jun/fos의 상호작용이 cDNA 절편의 디스플레이를 전달하는 데에 사용되었다. 이들의 구조체(construct)에서, fos 뿐만 아니라 jun의 양쪽 말단의 측부에 위치한(flanking) 추가적인 시스테인 잔기(cysteine residues)는 2개의 이황화 결합을 형성함으로써 상호작용을 더 안정하게 한다.
원하는 표적에 결합된 파지를 최상으로 회수하는 방법이 무엇인지를 질문할 수 있다. 일반적으로, 이는 적당한 버퍼(buffer)로 용리하는 것에 의해, pH- 또는 염 구배(salt gradient)를 사용함으로써, 또는 용해성 표적을 사용한 특정 용리에 의해 달성된다. 그러나, 상기 표적에 높은 친화력으로 결합되는 가장 흥미로운 결합자가 이와 같은 접근법에 의해 손실될 수 있다. 몇몇 다른 방법들은, 디스플레이되는 (폴리)펩티드/단백질 및 융합 파트너(fusion partner) 사이에 절단 신호를 제공하거나, 대상이 되는 표적 및 상기 표적을 고체 표면에 고정시키는 운반체 사이에 절단 신호를 제공함으로써 상기 문제를 극복하는 시도를 설명하였다. 나아가, 상기에서 언급된 대부분의 접근법은 파지 피막 단백질 및 이종의 (폴리)펩티드/단백질 중 적어도 일부분을 포함하는 융합 단백질의 사용을 요구한다.
제WO 01/05909호에서, 완전히 다른 시스템이 융합 단백질을 요구하지 않는다고 설명되고, 따라서 많은 문제점들을 해결하였다. 제WO 01/05909호에서 설명되는, 이른바 "시스디스플레이(CysDisplay)" 시스템은 박테리오파지 피막 단백질 및 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편 사이의 공유 이황화 결합의 형성을 기반으로 한다. 상기 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편은 박테리오파지 입자의 표면상에 디스플레이된다. 이후에 유사한 기술이 제WO 03/060065호에서 개시되었다. 제WO 03/060065호는, 시스-태그된(cys-tagged) pIII 폴리펩티드가 파지미드(phagemid) 보다는 변형된 보조 파지를 통해 제공된다는 점에서 제WO 01/05909호와 상이하다. 나아가, 제WO 03/060065호는 박테리오파지 입자상에 (폴리)펩티드/단백질(예를 들어, 호모다중결합 단백질(homomultimeric protein)(PDGF, Max, RelA, 뉴로트로핀(neurotrophin)) 및 헤테로다중결합 단백질(heteromultimeric protein)(단백질 키나아제 복합체(protein kinase complexes), SH2-도메인 피막 단백질(SH2-domain coating proteins), Pal/Max, Hox/Pbx))을 디스플레이하는 데에 사용될 수 있는 다른 어댑터(adapter)를 또한 언급한다.
시스디스플레이 시스템이 잘 기능을 한다고 하더라도, 박테리오파지 입자상에 더 많은 양의 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이하는 시스템이 특정 상황에서 유리할 수 있고, 예를 들어 증가된 디스플레이 비율 특히 증가된 기능적인 디스플레이 비율을 갖는 개선된 시스템은 확실히 더 유익하고, 높은 친화력을 갖는 표적에 결합하는 결합자의 더 편리하고, 확실하고 특정한 분리를 가능하게 할 것이다.
문헌[Snyder 등, 1981]은 천연적으로 발생하는 단백질의 펩티드 중 반응성 시스테인 잔기의 국소적인 환경을 2-니트로벤조산(2-nitrobenzoic acid)으로 처리하여 조사하였고, 양의 전하를 띤(positively charged) 아미노산으로 둘러싸여진 시스테인 잔기가 더 높은 반응성을 나타낸다는 것을 관찰하였다. 이후의 연구에서, 문헌[Snyder 등, 1983]은 다양한 비-단백질성 분자와 이황화 결합을 형성하는 능력에 대한 16개 모델 펩티드의 동역학을 조사하였다. 상기 펩티드 및 상기 비-단백질성 반응물 상에 순(net) 전하의 존재가 반응성에 영향을 준다는 것을 관찰하였다. 문헌[Britto 등, 2002]은 튜뷸린(tubulin)에서 분자 내의 이황화 결합의 정전기적 환경을 조사하였고, 가장 반응성이 있는 시스테인 잔기들은 양의 전하를 띤 잔기가 6.5Å(angstrom) 이내에 있고, 이는 티올(thiol)을 티올레이트 음이온(thiolate anion)으로 분리하는 것으로 추정된다. 문헌[Hansen 등, 2005]은 조작된 YFP의 분자 내의 이황화 결합을 조사하였고, 양의 전하를 띤 아미노산이 반응성 시스테인 잔기에 인접하여 존재한다면 반응성이 증가한다는 것을 발견하였다. 문헌[Albrecht 등, 2006]은 시스테인 잔기를 통해 PEG에 부착되는 단일특이성의 다원자가 Fab's의 발생을 보고하였다.
그러나, 상기에서 언급된 어떤 연구들도, 분자 내의 이황화 결합이 제 1의 (폴리)펩티드/단백질 및 제 2의, 상이한 (폴리)펩티드/단백질 사이에서 형성되는 시스템을 설명하지는 않는다. 특히, 어떤 연구들에서도 숙주 세포의 주변 세포질 공간(periplasmatic space)에서 형성되는 이황화 결합이 없었다. 나아가, 상기 인용된 어떤 연구들에서도 박테리오파지 입자의 표면상에 디스플레이되는 (폴리)펩티드/단백질이 없었다.
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일 실시예는, 분자 내의 이황화 결합이 제 1의 (폴리)펩티드/단백질 및 제 2의, 상이한 (폴리)펩티드/단백질 사이에서 형성되는 시스템을 제공한다.
또한, 숙주 세포의 주변 세포질 공간(periplasmatic space)에서 형성되는 이황화 결합을 제공한다.
나아가, 박테리오파지 입자의 표면상에 디스플레이되는 (폴리)펩티드/단백질을 제공한다.
일 실시예에 따른 이황화 결합을 형성하는 방법은,
제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에의 부착을 야기하거나 허용하는 단계를 포함하고,
상기 부착은 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 1의 시스테인 잔기 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합을 형성함으로써 야기되고,
상기 (폴리)펩티드/단백질 중 하나는 하나 이상의 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 일 실시예에 따른 핵산 서열은 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이를 인코딩(encoding)하는 핵산 서열이며,
상기 변형된 변이는,
(a) 박테리오파지의 상기 야생형 피막 단백질 중 하나 이상의 부분들(상기 부분들 중 하나는 상기 파지 피막으로의 상기 피막 단백질의 편입을 야기하거나 허용하는 적어도 일부분을 포함함);
(b) 제 1의 시스테인 잔기; 및
(c) 상기 제 1의 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 일 실시예에 따른 핵산 서열은 변형된 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편을 인코딩하는 핵산 서열이며,
상기 변형된 면역글로불린 또는 기능적인 절편은,
(a) 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편;
(b) 시스테인 잔기; 및
(c) 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
일 실시예에 따른 시스템은, 분자 내의 이황화 결합이 제 1의 (폴리)펩티드/단백질 및 제 2의, 상이한 (폴리)펩티드/단백질 사이에서 형성된다.
또한, 이황화 결합이 숙주 세포의 주변 세포질 공간(periplasmatic space)에서 형성된다.
또한, (폴리)펩티드/단백질이 박테리오파지 입자의 표면상에 디스플레이된다.
도 1 : 일반적인 시스디스플레이 벡터
Fab 절편의 중쇄 및 연쇄는 lac 프로모터/작동자(lac promotor/operator) 영역의 통제하에 있다. 제 1의 발현 카세트는 신호 서열 ompA, 및 경쇄의 가변적이고(VL) 일정한 도메인(CL)을 포함하고, 제 2의 발현 카세트는 신호 서열 phoA, 및 중쇄의 가변적이고(VH) 일정한 도메인(CH1)을 포함한다. 중쇄 및 경쇄는 이황화 결합을 통해 연결되지는 않는다. 유전자 III는 또한 동일한 벡터(gIII) 상에 인코딩된다. 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기는 pIII의 N-말단 및 중쇄 Fd-절편의 C-말단(C로 지칭함)에 위치된다. AccI, AfIII, XbaI, EcoRI 및 HindIII는 디스플레이 벡터를 생성하거나 변경하는 데에 편리하게 사용될 수 있는 제한 부위를 가리킨다.
도 2 : Ni - NTA 플레이트에 결합
"pM25"는 본래의 "pMORPH25" 구조체를 나타내고, "pM25_A" 내지 "pM25_E"는 각각 구조체들인 "pMORPH25 버젼 A" 내지 "pMORPH25 버젼 E"를 나타낸다. "pM25 w/o HIS 태그"는 히스티딘 태그가 삭제된 구조체를 나타낸다. 흡광도는 370 nm에서 측정하였다.
도 3 : pMORPH25 버젼 A, B 및 C의 기능적인 디스플레이 비율
"pM25"는 본래의 "pMORPH25" 구조체를 나타내고, "pM25_A" 내지 "pM25_E"는 각각 구조체들인 "pMORPH25 버젼 A" 내지 "pMORPH25 버젼 E"를 나타낸다. 각각의 구조체에 대한 왼쪽부터 오른쪽까지의 바(bar)는 웰(well) 당 5.0e+10개의 박테리오파지 입자, 웰 당 5.0e+9개의 박테리오파지 입자, 웰 당 5.0e+8개의 박테리오파지 입자, 웰 당 5.0e+7개의 박테리오파지 입자, 25 mM DTT에 더하여 웰 당 5.0e+10개의 박테리오파지 입자, 및 BSA로 코팅된 플레이트에서 웰 당 5.0e+10개의 박테리오파지 입자와 같다.
도 4 : pMORPH 버젼 E의 기능적인 디스플레이 비율
"pM25"는 본래의 "pMORPH25" 구조체를 나타내고, "pM25_E"는 구조체 "pMORPH25 버젼 E"를 나타낸다. 각각의 구조체에 대한 왼쪽부터 오른쪽까지의 바(bar)는 웰 당 1.0e+10개의 박테리오파지 입자, 웰 당 1.0e+9개의 박테리오파지 입자, 웰 당 5.0e+8개의 박테리오파지 입자, 웰 당 2.5e+8개의 박테리오파지 입자, 웰 당 1.25e+8개의 박테리오파지 입자, 웰 당 6.25e+7개의 박테리오파지 입자, BSA로 코팅된 플레이트에서 웰 당 1.0e+10개의 박테리오파지 입자, 및 25 mM DTT에 더하여 웰 당 1.0e+10개의 박테리오파지 입자와 같다. 화살표는 pMORPH25 표준 및 pMORPH25 버젼 E 사이의 차이가 가장 두드러진 곳의 측정값을 나타낸다.
도 5 및 도 5a는 에스트라디올-BSA 특정 HuCAL Fab 절편을 함유하는 pMORPH23-유도체의 서열을 나타낸다.
도 6은 에스트라디올-BSA 특정 HuCAL Fab 절편을 함유하는 pMORPH23-유도체의 벡터 맵을 나타낸다.
도 7 및 도 7a는 에스트라디올-BSA 특정 HuCAL Fab 절편을 함유하는 pMORPH25-유도체의 서열을 나타낸다.
도 8은 에스트라디올-BSA 특정 HuCAL Fab 절편을 함유하는 pMORPH25-유도체의 벡터 맵을 나타낸다.
도 9는 일반적인 구조체의 라이브러리와 비교되는 본 발명에 기초한 Fab 절편 라이브러리의 상대적인 디스플레이 비율을 나타낸다. 일반적인 구조체(pMORPH23)의 디스플레이 비율을 각각의 개개의 구조체에 대해 1(즉, 100%)로 설정하였다. 개선된 구조체의 상대적인 디스플레이 비율을 나타내고, pMORPH23 구조체의 디스플레이 비율과 관련하여 pMORPH25 버젼 E에 의해 예시된다. 테스트된 다른 프레임워크(framework)가 x-축 상에 표시된다. 흰색 바(bar)는 람다 사슬 절편(lambda chain fragment)을 표시하고, 검은색 바는 카파 사슬 절편(kappa chain fragment)을 표시한다.
Fab 절편의 중쇄 및 연쇄는 lac 프로모터/작동자(lac promotor/operator) 영역의 통제하에 있다. 제 1의 발현 카세트는 신호 서열 ompA, 및 경쇄의 가변적이고(VL) 일정한 도메인(CL)을 포함하고, 제 2의 발현 카세트는 신호 서열 phoA, 및 중쇄의 가변적이고(VH) 일정한 도메인(CH1)을 포함한다. 중쇄 및 경쇄는 이황화 결합을 통해 연결되지는 않는다. 유전자 III는 또한 동일한 벡터(gIII) 상에 인코딩된다. 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기는 pIII의 N-말단 및 중쇄 Fd-절편의 C-말단(C로 지칭함)에 위치된다. AccI, AfIII, XbaI, EcoRI 및 HindIII는 디스플레이 벡터를 생성하거나 변경하는 데에 편리하게 사용될 수 있는 제한 부위를 가리킨다.
도 2 : Ni - NTA 플레이트에 결합
"pM25"는 본래의 "pMORPH25" 구조체를 나타내고, "pM25_A" 내지 "pM25_E"는 각각 구조체들인 "pMORPH25 버젼 A" 내지 "pMORPH25 버젼 E"를 나타낸다. "pM25 w/o HIS 태그"는 히스티딘 태그가 삭제된 구조체를 나타낸다. 흡광도는 370 nm에서 측정하였다.
도 3 : pMORPH25 버젼 A, B 및 C의 기능적인 디스플레이 비율
"pM25"는 본래의 "pMORPH25" 구조체를 나타내고, "pM25_A" 내지 "pM25_E"는 각각 구조체들인 "pMORPH25 버젼 A" 내지 "pMORPH25 버젼 E"를 나타낸다. 각각의 구조체에 대한 왼쪽부터 오른쪽까지의 바(bar)는 웰(well) 당 5.0e+10개의 박테리오파지 입자, 웰 당 5.0e+9개의 박테리오파지 입자, 웰 당 5.0e+8개의 박테리오파지 입자, 웰 당 5.0e+7개의 박테리오파지 입자, 25 mM DTT에 더하여 웰 당 5.0e+10개의 박테리오파지 입자, 및 BSA로 코팅된 플레이트에서 웰 당 5.0e+10개의 박테리오파지 입자와 같다.
도 4 : pMORPH 버젼 E의 기능적인 디스플레이 비율
"pM25"는 본래의 "pMORPH25" 구조체를 나타내고, "pM25_E"는 구조체 "pMORPH25 버젼 E"를 나타낸다. 각각의 구조체에 대한 왼쪽부터 오른쪽까지의 바(bar)는 웰 당 1.0e+10개의 박테리오파지 입자, 웰 당 1.0e+9개의 박테리오파지 입자, 웰 당 5.0e+8개의 박테리오파지 입자, 웰 당 2.5e+8개의 박테리오파지 입자, 웰 당 1.25e+8개의 박테리오파지 입자, 웰 당 6.25e+7개의 박테리오파지 입자, BSA로 코팅된 플레이트에서 웰 당 1.0e+10개의 박테리오파지 입자, 및 25 mM DTT에 더하여 웰 당 1.0e+10개의 박테리오파지 입자와 같다. 화살표는 pMORPH25 표준 및 pMORPH25 버젼 E 사이의 차이가 가장 두드러진 곳의 측정값을 나타낸다.
도 5 및 도 5a는 에스트라디올-BSA 특정 HuCAL Fab 절편을 함유하는 pMORPH23-유도체의 서열을 나타낸다.
도 6은 에스트라디올-BSA 특정 HuCAL Fab 절편을 함유하는 pMORPH23-유도체의 벡터 맵을 나타낸다.
도 7 및 도 7a는 에스트라디올-BSA 특정 HuCAL Fab 절편을 함유하는 pMORPH25-유도체의 서열을 나타낸다.
도 8은 에스트라디올-BSA 특정 HuCAL Fab 절편을 함유하는 pMORPH25-유도체의 벡터 맵을 나타낸다.
도 9는 일반적인 구조체의 라이브러리와 비교되는 본 발명에 기초한 Fab 절편 라이브러리의 상대적인 디스플레이 비율을 나타낸다. 일반적인 구조체(pMORPH23)의 디스플레이 비율을 각각의 개개의 구조체에 대해 1(즉, 100%)로 설정하였다. 개선된 구조체의 상대적인 디스플레이 비율을 나타내고, pMORPH23 구조체의 디스플레이 비율과 관련하여 pMORPH25 버젼 E에 의해 예시된다. 테스트된 다른 프레임워크(framework)가 x-축 상에 표시된다. 흰색 바(bar)는 람다 사슬 절편(lambda chain fragment)을 표시하고, 검은색 바는 카파 사슬 절편(kappa chain fragment)을 표시한다.
따라서, 본 발명은 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 1의 시스테인 잔기 및 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기 사이에, 바람직하게는 서로 상이한 (폴리)펩티드/단백질 사이에 이황화 결합을 형성하는 개선된 방법을 제공한다. 상기 개선된 방법은, 바람직하게는 상기 시스테인 잔기의 높은 반응성을 야기할 것이고, 이에 의해 증가된 디스플레이 비율, 특히 증가된 기능적인 디스플레이 비율을 제공한다.
이러한 기술적인 문제는 청구항에서 특징 지워지는 실시예를 제공함으로써 해결된다. 기본적인 문제를 해결하고 본 발명의 기초를 형성하는 기술적인 해결책, 즉 공간적 맥락(spatial context)에 있는 양의 전하를 띤 아미노산을 반응성 시스테인 잔기에 도입하는 것은 종래 기술에서 제공되지도 제안되지도 않았다.
특정 실시예에서, 본 발명은 파지 피막 단백질을 갖는 융합 단백질을 사용할 필요가 없이 박테리오파지 입자의 표면상에 (폴리)펩티드/단백질의 디스플레이를 위한 개선된 시스템을 제공한다. 이에 의해, 상기 시스테인 잔기의 더 높은 반응성은 더 높은 디스플레이 비율을 야기하고, 특히 더 높은 기능적인 디스플레이 비율을 야기한다.
따라서, 그 중에서도, 본 발명은 박테리오파지 입자의 표면상에 디스플레이되는 (폴리)펩티드/단백질의 거대한 라이브러리를 스크리닝(screening)하는 개선된 방법을 제공한다.
특정 실시예에서, 본 발명은 이황화 결합(disulphide bond)을 형성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에의 부착을 야기하거나 허용하는 단계를 포함하며, 상기 부착은 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 1의 시스테인 잔기 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합을 형성함으로써 야기되고, 상기 (폴리)펩티드/단백질 중 하나는 하나 이상의 상기 시스테인 잔기 의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함한다. 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질 또는 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함될 수 있다. 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 상기 야생형(wild type) (폴리)펩티드/단백질에서 대응되는 아미노산 위치에 존재하지 않을 수 있다. 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 인공적으로 도입될 수 있다. 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은, 동일한 (폴리)펩티드/단백질 상의 시스테인 잔기에 인접한 10개의 아미노산 내에, 바람직하게는 동일한 (폴리)펩티드/단백질 상의 시스테인 잔기에 인접한 5개의 아미노산 내에 포함될 수 있다. 상기 제 1의 시스테인 잔기는 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 N-말단 또는 C-말단에, 또는 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 N-말단 또는 C-말단의 근처에 존재할 수 있다. 상기 제 1의 시스테인 잔기는 또한 N-말단 또는 C-말단의 시스테인 잔기일 수 있다. 상기 제 2의 시스테인 잔기는 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 N-말단 또는 C-말단의 근처에 존재할 수 있다. 상기 제 2의 시스테인 잔기는 또한 N-말단 또는 C-말단의 시스테인 잔기일 수 있다. 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 박테리오파지 입자의 표면 상에 디스플레이될 수 있다. 상기 제 1의 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 적당한 숙주 세포에서 발현되고 조립(assembly)될 수 있다. 상기 이황화 결합은 숙주 세포의 주변 세포질 공간(periplasmatic space)에서 형성될 수 있다. 상기 이황화 결합은 분자 내의 이황화 결합일 수 있다. 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 리신(lysine) 및 아르기닌(arginine)으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 리신일 수 있다. 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 서로 상이할 수 있다. 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은 박테리오파지 입자의 단백질 피막의 구성성분일 수 있다. 상기 단백질 피막의 구성성분은 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 절단된 변이(truncated variant)일 수 있고, 상기 절단된 변이는 상기 박테리오파지 입자의 단백질 피막으로 상기 피막 단백질의 편입을 야기하는 상기 야생형 피막 단백질 중 적어도 일부분을 포함한다. 상기 단백질 피막의 구성성분은 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이(modified variant)일 수 있고, 상기 변형된 변이는 상기 박테리오파지 입자의 단백질 피막으로 편입될 수 있다. 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질에서 대응되는 아미노산 위치에 존재할 수 있다. 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질에서 대응되는 아미노산 위치에 존재하지 않을 수 있다. 상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질에 인공적으로 도입될 수 있다. 상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 절단된 변이에 인공적으로 도입될 수 있다. 상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이에 인공적으로 도입될 수 있다. 상기 박테리오파지 입자는 섬유상 박테리오파지의 박테리오파지 입자일 수 있다. 박테리오파지 입자의 상기 단백질 피막의 구성성분은 야생형 피막 단백질 pIII일 수 있거나, 또는 야생형 피막 단백질 pIII로부터 유래될 수 있다. 박테리오파지 입자의 상기 단백질 피막의 구성성분은 야생형 피막 단백질 pIX일 수 있거나, 또는 야생형 피막 단백질 pIX로부터 유래될 수 있다. 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 상기 제 2의 시스테인 잔기는 야생형의 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에서 대응되는 아미노산 위치에 존재하지 않을 수 있다. 상기 제 2의 시스테인 잔기는 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 인공적으로 도입될 수 있다. 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편을 포함할 수 있다. 상기 기능적인 절편은 scFv 또는 Fab 절편일 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 박테리오파지 입자의 표면상에 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 단백질 피막의 구성성분으로 발현한 후 (폴리)펩티드/단백질의 부착을 야기하거나 허용하는 단계를 포함하며, 상기 부착은 상기 단백질 피막의 구성성분에 포함되는 제 1의 시스테인 잔기 및 상기 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합을 형성함으로써 야기되고, 상기 (폴리)펩티드/단백질 또는 상기 단백질 피막의 구성성분은 상기 제 1의 또는 제 2의 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함한다.
특정 실시예에서, 본 발명은 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이를 인코딩(encoding)하는 핵산 서열을 제공하며, 상기 변형된 변이는 하기의 (a), (b), 및 (c)를 포함한다:
(a) 박테리오파지의 상기 야생형 피막 단백질 중 하나 이상의 부분들(상기 부분들 중 하나는 상기 파지 피막으로의 상기 피막 단백질의 편입을 허용하거나 야기하는 적어도 일부분을 포함함);
(b) 제 1의 시스테인 잔기; 및
(c) 상기 제 1의 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산.
특정 실시예에서, 본 발명은 변형된 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편을 인코딩하는 핵산 서열을 제공하며, 상기 변형된 면역글로불린 또는 기능적인 절편은 하기를 포함한다:
(a) 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편;
(b) 시스테인 잔기; 및
상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산. 변형된 면역글로불린의 상기 기능적인 절편은 scFv 또는 Fab 절편일 수 있다.
상기에서 언급된 임의의 핵산 서열은 정제 및/또는 검출 목적으로 하나 이상의 펩티드 서열을 더 인코딩할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 상기에서 언급된 임의의 핵산 서열을 포함하는 벡터(vector)를 제공한다. 상기 벡터는 제 2의 시스테인 잔기를 포함하는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 더 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 상기에서 언급된 임의의 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포(host cell)를 제공한다. 상기 숙주 세포는 제 2의 시스테인 잔기를 포함하는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 제 2의 벡터를 포함할 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은, 상기에서 언급된 임의의 핵산 서열에 의해 인코딩되는, 상기에서 언급된 임의의 벡터에 의해 인코딩되거나 상기에서 언급된 임의의 숙주 세포에 의해 생성되는, (폴리)펩티드/단백질을 제공한다.
특정 실시예에서, 본 발명은 상기에서 언급된 방법에 의해 수득가능한 (폴리)펩티드/단백질을 박테리오파지 입자의 표면상에 디스플레이하는 박테리오파지 입자를 제공한다. 상기 박테리오파지 입자상에 디스플레이되는 (폴리)펩티드/단백질은 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편일 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 본원에서 언급된 바와 같은 박테리오파지 입자의 다양한 집합물(collection)을 제공하고, 각각의 상기 박테리오파지 입자는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 다양한 집합물 밖의 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이한다.
특정 실시예에서, 본 발명은 원하는 성질을 갖는 (폴리)펩티드/단백질을 수득하는 방법을 제공하며, 상기 방법은,
(a) 상기에서 언급된 바와 같은 박테리오파지 입자의 다양한 집합물을 제공하는 단계; 및
(b) 원하는 성질을 갖는 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이하는 하나 이상의 박테리오파지 입자를 수득하기 위해, 상기 다양한 집합물을 스크리닝하거나, 그리고/또는 상기 다양한 집합물로부터 선택하는 단계;를 포함한다. 상기 방법 중 단계 (b)는 하기의 (ba), (bb) 및 (bc)를 더 포함한다:
(ba) 박테리오파지 입자의 상기 다양한 집합물을 대상이 되는 표적과 접촉시키는 단계;
(bb) 상기 대상이 되는 표적에 결합하지 않은 박테리오파지 입자를 용리시키는 단계; 및
(bc) 환원 조건하에서, 단계 (ba)에서 형성된 대상이 되는 표적과 상기 표적에 결합한 박테리오파지의 복합체를 처리함으로써 상기 대상이 되는 표적에 결합한 박테리오파지를 용리시키는 단계. 상기 원하는 성질은 대상이 되는 표적에의 결합, 대상이 되는 표적을 억제, 대상이 되는 표적을 차단, 표적-매개된 반응의 활성 또는 효소 활성일 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 제 1의 시스테인 잔기를 포함하는 제 1의 (폴리)펩티드/단백질, 및 제 2의 시스테인 잔기를 포함하는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 포함하는 복합체를 제공하며, 상기 (폴리)펩티드/단백질 중 하나는 하나 이상의 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 더 포함하고, 상기 제 1의 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 상기 시스테인 잔기들을 통해 이황화 결합을 형성한다. 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은, 복수의 박테리오파지 입자들의 다양한 집합물 상에 디스플레이되는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 다양한 집합물의 구성성분일 수 있다. 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은 파지 피막 단백질일 수 있다. 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편을 포함할 수 있다. 상기 기능적인 절편은 scFv 또는 Fab 절편일 수 있다.
특정 실시예에서, 본 발명은 상기에서 언급된 임의의 복합체를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
특정 실시예에서, 본 발명은 이황화 결합(disulphide bond)을 형성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에의 부착을 야기하거나 허용하는 단계를 포함하며, 상기 부착은 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 1의 시스테인 잔기 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합을 형성함으로써 야기되고, 상기 (폴리)펩티드/단백질 중 하나는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함한다. 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 하나 이상의 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 줄 수 있다.
본 발명의 상세한 설명
"이황화 결합(disulphide bond)"은 2개의 티올(thiol) 그룹의 반응에 의해 형성되는 공유 결합이다. 이황화 결합은 (폴리)펩티드 및 단백질의 폴딩(folding) 및 안정성에서 중요한 역할을 한다. 이황화 결합을 갖는 많은 단백질들이 분비된다. 많은 세포내 구획(cellular compartment)은 환원 환경이고, 이황화 결합은 시토졸(cytosol)에서 일반적으로 불안정하다. (폴리)펩티드 및 단백질에서 이황화 결합은 시스테인 잔기들의 티올 그룹 사이에서 일반적으로 형성되며, 2개의 시스테인 잔기는 산화되어 공유 이황화 결합을 형성한다. 이황화 결합은 분자내의 결합(intra-molecular bond) 또는 분자간의 결합(inter-molecular bond)일 수 있다. 원핵생물(prokaryote)에서, 이황화 결합은 원형질막의 산화 환경에서 바람직하게 형성된다. 진핵세포(eukaryotic cell)에서, 이황화 결합은 시토졸의 환원 환경이 아니라(산화 센서(oxidation sensor)로서 기능을 하는 시스테인 잔기를 갖는 일부 시토졸성 단백질(cytosolic protein)을 제외함), 소포체(endoplasmic reticulum)의 산화 환경에서 일반적으로 형성된다. 이황화 결합은 분비성 단백질, 리소좀 단백질(lysosomal protein), 및 막 단백질(membrane protein)의 외형질 도메인(exoplasmic domain)에서 대부분 발견된다. 이황화 결합은 또한 고무의 가황(vulcanization)에서 중요한 역할을 한다.
"pl" 또는 "등전점(isoelectric point)"은 분자 또는 표면이 순(net) 전기적인 전하를 소지하지 않는 지점에서의 pH이다. 높은 등전점을 갖기 위해, 분자(또는 표면)은 양쪽성(amphoteric)이어야 하고, 즉 산성 작용기 및 염기성 작용기 둘 모두를 가져야 한다. 단백질 및 아미노산은 이러한 요구를 충족시키는 분자들이다. 20개의 천연적으로 발생하는 아미노산의 pl값을 표 1에서 열거하였다. 그러나, 천연적으로 발생되지 않은 아미노산이 본 발명의 방법을 실시하는 데에 사용될 수도 있다.
| 아미노산 | 등전점(pl) |
| 아스파르트산(aspartic acid) | 2.77 |
| 글루탐산(glutamic acid) | 3.22 |
| 시스테인(cysteine) | 5.02 |
| 아스파라긴(asparagine) | 5.41 |
| 페닐알라닌(phenylalanine) | 5.48 |
| 트레오닌(threonine) | 5.64 |
| 글루타민(glutamine) | 5.65 |
| 티로신(tyrosine) | 5.66 |
| 세린(serine) | 5.68 |
| 메티오닌(methionine) | 5.74 |
| 트립토판(tryptophan) | 5.89 |
| 이소류신(isoleucine) | 5.94 |
| 발린(valine) | 5.96 |
| 글리신(glycine) | 5.97 |
| 류신(leucine) | 5.98 |
| 알라닌(alanine) | 6.00 |
| 프롤린(proline) | 6.30 |
| 히스티딘(histidine) | 7.47 |
| 리신(lysine) | 9.59 |
| 아르기닌(arginine) | 11.15 |
1개의 아민 그룹 및 1개의 카복실 그룹을 갖는 아미노산에 대해, pl은 이러한 분자의 pKa 값으로부터 계산될 수 있다. 2개 이상의 이온화될 수 있는 그룹을 갖는 아미노산(예를 들어, 리신)에 대해, 2개의 pKa 값은 아미노산의 중성 형태로부터 전하를 잃고 얻는 pl값을 계산하는 데에 사용된다. 각각의 계산은 당해 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 공지되었고 생화학 교과서(예를 들어, 문헌[ Nelson DL, Cox MM (2004). Lehninger Principles of Biochemistry. W. H. Freeman; 4th edition])에서 발견될 수 있다.
단백질은 등전위 초점화(isoelectric focussing)를 통한 pl에 따라 분리될 수 있다. pl 미만의 pH에서, 단백질은 순(net) 양의 전하를 운반한다. pl 초과의 pH에서는, 단백질은 순(net) 음의 전하를 운반한다. 전기 영동 겔의 pH는 상기 겔에 사용되는 버퍼(buffer)에 의해 결정된다. 상기 버퍼의 pH가 작동 중인 단백질의 pl값을 초과한다면, 상기 단백질은 양극(positive pole)으로 이동할 것이다(음의 전하는 양극에 부착된다). 상기 버퍼의 pH가 작동 중인 단백질의 pl 미만이라면, 상기 단백질은 상기 겔의 음극(negative pole)으로 이동할 것이다(양의 전하는 음극에 부착된다). 단백질이 pl과 동등한 버퍼 pH에서 작동된다면, 상기 단백질은 전혀 이동하지 않을 것이다. 이는 또한 개개의 아미노산에 대해서도 진실이다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 제 1의 및/또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함한다. 다른 바람직한 실시예에서, 상기 제 1의 및/또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 9 초과, 10 초과 또는 11 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함한다. 다른 바람직한 실시예에서, 8 초과, 9 초과, 10 초과 또는 11 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 존재한다. 다른 바람직한 실시예에서, 8 초과, 9 초과, 10 초과 또는 11 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 존재한다. 다른 바람직한 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 리신 및 아르기닌으로부터 선택된다. 특정의 바람직한 실시예에서, 상기 아미노산은 리신이다. 다른 바람직한 실시예에서, 상기 아미노산은 아르기닌이다.
특정의 바람직한 실시예에서, 본 발명의 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은 하나 이상의 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명의 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 하나 이상의 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 제 1의 및/또는 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 하나 이상의 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 5개 이상의 아미노산을 포함한다.
다른 바람직한 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산에 직접적으로 인접한 아미노산 잔기는 히스티딘 잔기이다. 특정 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산에 대한 아미노산 잔기의 직접적인 N-말단은 히스티딘 잔기이다. 다른 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산에 대한 아미노산 잔기의 직접적인 C-말단은 히스티딘 잔기이다. 다른 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산에 대한 아미노산 잔기의 직접적인 N-말단 및 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산에 대한 아미노산 잔기의 직접적인 C-말단 둘 모두는 히스티딘 잔기들이다. 나아가, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산에 직접적으로 인접한 바람직한 범위의 폴리펩티드는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 8개의 히스티딘 잔기의 길이를 갖는 폴리펩티드이고, 하나 이상의 히스티딘 잔기는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산, 바람직하게는 리신으로 치환된다. 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산에 직접적으로 인접한 바람직한 범위의 폴리펩티드는 6개의 히스티딘 잔기의 길이를 갖는 폴리펩티드이고, 1개, 2개 또는 3개의 히스티딘 잔기는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산, 바람직하게는 리신으로 치환된다. 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산에 직접적으로 인접한 하기의 폴리펩티드가 특히 바람직하다: HHHHHH, HHHKHH, HHHHHK, HKHKHK(1개의 문자 모드에 있는 아미노산, 즉 H=히스티딘, K= 리신임). 특정 실시예에서, 상기 제 1의 및/또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 1의 및/또는 제 2의 시스테인 잔기는 일정 범위의 히스티딘 잔기에 대한 직접적인 C-말단이고, 하나 이상의 히스티딘 잔기는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산, 바람직하게는 리신으로 치환된다.
다른 실시예에서, 상기 제 1의 및/또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 1의 및/또는 제 2의 시스테인 잔기는 일정 범위의 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 8개의 히스티딘 잔기에 대한 직접적인 C-말단이고, 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산, 바람직하게는 리신에 대한 직접적인 N-말단이다. 선택적으로 상기 제 1의 및/또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 1의 및/또는 제 2의 시스테인 잔기에 대한 히스티딘 잔기의 직접적인 N-말단 중 하나는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산, 바람직하게는 리신으로 추가적으로 치환된다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 바와 같이 "반응성을 높이도록 영향을 주는"이라는 용어는, 2개의 티올 그룹이 이황화 결합을 형성하기 위해 반응하는 반응의 평형이 생성물 쪽으로 이동하는 상황, 즉 공지된 시스템(예를 들어, 제WO 01/05909호에서 설명되는 "시스디스플레이" 시스템)과 비교할 때 더 많은 이황화 결합이 형성되는 상황을 의미한다. 각각의 티올 그룹의 반응성은 제WO 01/05909호 및 본 발명에서 설명되는 바와 같이 쉽게 검출되고 측정될 수 있다. 본원의 하기에서 언급되는 바와 같이, 상대적인 디스플레이 비율 또는 기능적인 디스플레이 비율은 적당한 테스트 시스템일 수 있다. 본 발명에 따라, 평형의 이동은 반응물들(즉, 제 1의 또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질) 중 하나에 존재하는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 통해 달성된다. 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 1의 시스테인 잔기 또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기의 근처에 어느 정도의 공간적으로 위치되어 평형의 이동에 영향을 줄 수 있다.
일부 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 상기 제 1의 또는 상기 제 2의 시스테인 잔기에 직접적으로 인접한 10개의 아미노산 내에, 바람직하게는 8개의 아미노산 내에, 더 바람직하게는 6개의 아미노산 내에, 그리고 가장 바람직하게는 5개의 아미노산 내에 위치된다. 특정 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 상기 제 1의 또는 상기 제 2의 시스테인 잔기에 존재하는 N-말단이다. 다른 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 상기 제 1의 또는 상기 제 2의 시스테인 잔기에 존재하는 C-말단이다.
다른 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 제 1의 또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 1의 또는 상기 제 2의 시스테인 잔기로부터 이격된 10개 초과의 아미노산 내에 위치되나, 상기 제 1의 또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 3차원 구조를 가져서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 상기 제 1의 또는 상기 제 2의 시스테인 잔기에 공간적으로 인접하도록 야기된다. 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산 및 상기 아미노산에 의해 영향을 받는 시스테인 잔기는 동일한 (폴리)펩티드/단백질, 예를 들어 동일한 (폴리)펩티드/단백질의 다른 도메인 상에 포함될 수 있다. 다르게는, 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산 및 상기 아미노산에 의해 영향을 받는 시스테인 잔기는 상이한 (폴리)펩티드/단백질 상에 포함될 수 있고, 예를 들어 제 1의 (폴리)펩티드/단백질 상에 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산이 포함되고, 그리고 제 2의 (폴리)펩티드/단백질 상에 상기 아미노산에 의해 영향을 받는 시스테인 잔기기 포함될 수 있거나, 또는 역으로 포함될 수 있다. 이 경우에, 하나의 (폴리)펩티드/단백질 상에 포함되는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산은 다른 하나의 (폴리)펩티드/단백질 상에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 준다. 당해 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자는, 주어진 (폴리)펩티드/단백질 내의 아미노산의 위치가 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 도입하도록 선택될 수 있다는 것을 알 것이다. (폴리)펩티드/단백질의 3차원 구조를 결정하는 다양한 기술이 X-선 결정법 또는 NMR 기술과 같이 공지되었다. 나아가, 많은 (폴리)펩티드/단백질의 3차원 구조는 적당한 아미노산 위치의 선택을 쉽게 하는 데에 이미 이용가능하다. 특히, 다양한 면역글로불린 또는 기능적인 절편(예를 들어, scFv 또는 Fab 절편)의 3차원 구조는 다양한 데이터 베이스(예를 들어, PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) 또는 PubMed (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/sites/entrez?db=Structure))를 통해 공개적으로 이용가능하다.
본 발명의 맥락에서, "박테리오파지(bacteriophage)"라는 용어는, 파지의 복제를 요구하는 핵산을 함유하는, 단백질 피막으로 이루어진 패키지(package)를 형성하는 박테이라 바이러스에 관련된 것이다. 상기 핵산은 이중 가닥 또는 단일 가닥의, 선형 또는 원형인 DNA 또는 RNA일 수 있다. 박테리오파지(예를 들어, 파지 람다(phage lambda) 또는 섬유상 파지(예를 들어, M13, fd, 또는 f1)는 당해 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 잘 공지되었다. 특정 실시예에서, 섬유상 파지가 바람직하다. 본 발명의 맥락에서, "박테리오파지 입자(bacteriophage particles)"라는 용어는 본 발명에 따른 입자를 의미하며, 즉 이황화 결합을 통해 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이하는 입자를 의미한다. 특정 실시예에서, 섬유상 파지의 박테리오파지 입자가 바람직하다.
박테리오 파지를 조립하는 동안에, 핵산 서열이 패키지 신호를 포함한다면, 피막 단백질은 상이한 핵산 서열을 패키지할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 박테리오파지 또는 박테리오파지 입자에 함유되는 "핵산 서열(nucleic acid sequences)"이라는 용어는, 박테리오파지 또는 박테리오파지 입자가 조립되는 동안에 박테리오파지 피막 단백질에 의해 패키지되는 능력을 갖는 핵산 서열 또는 벡터에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 핵산 서열 또는 벡터는 박테리오파지의 천연적으로 발생하는 게놈으로부터 유래되고, 예를 들어 섬유상 파지의 경우에 파지 및 파지미드 벡터를 포함한다. 후자는 플라스미드(plasmid) 특징에 더하여 패키지 신호 및 파지의 복제 원점을 함유하는 플라스미드이다.
특정 실시예에서, 상기 제 1의 또는 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 박테리오파지 입자의 표면상에 디스플레이된다. 바람직한 실시예에서, 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 박테리오파지 입자의 표면상에 디스플레이된다. 다른 실시예에서, 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은 박테리오파지 입자의 표면상에 디스플레이된다. 섬유상 박테리오파지 입자가 바람직하다.
특정 실시예에서, 상기 제 1의 또는 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 박테리오파지 입자의 단백질 피막의 구성성분이다. 바람직한 실시예에서, 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은 박테리오파지 입자의 단백질 피막의 구성성분이다. 다른 실시예에서, 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 박테리오파지 입자의 단백질 피막의 구성성분이다. 바람직한 실시예에서, 박테리오파지 입자의 상기 단백질 피막의 구성성분은 야생형 피막 단백질 pIII이거나 야생형 피막 단백질 pIII로부터 유래된다. 다른 실시예에서, 박테리오파지 입자의 상기 단백질 피막의 구성성분은 야생형 피막 단백질 pIX이거나 야생형 피막 단백질 pIX로부터 유래된다.
본 발명의 맥락에서, "유래된다"라는 용어는 변형을 의미하고, 변형된 단백질은 박테리오파지 입자의 단백질 피막으로 편입될 수 있다. 바람직하게, 야생형 단백질에 대응되는 변형된 단백질의 부분은, 대응되는 야생형 서열과 비교할 때 약 50%, 약 60%, 약 70%, 바람직하게는 약 80%, 및 가장 바람직하게는 약 90%를 초과하는 아미노산 동일성을 나타낸다.
나아가 바람직한 실시예에서, 본 발명은 방법에 관련된 것이며, 상기 단백질 피막의 구성성분은 박테리오파지의 야생형 피막 단백질이다.
"야생형 피막 단백질(wild type coat protein)"이라는 용어는 천연적으로 발생하는 박테리오파지의 파지 피막을 형성하는 단백질을 의미한다. 섬유상 박테리오파지의 경우에, 상기 야생형 단백질은 유전자 III 단백질 (pIII), 유전자 VI 단백질(pVI), 유전자 VII 단백질 (pVII), 유전자 VIII 단백질 (pVIII), 및 유전자 IX 단백질 (pIX)이다. 섬유상 박테리오파지들(예를 들어, f1, fd, 또는 M13)의 밀접하게 관련된 구성성분 사이에서의 차이를 포함하는 서열은 당해 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 잘 공지되었다(문헌[kay 등, 1996]을 참고함).
다른 바람직한 실시예에서, 상기 단백질 피막의 구성성분은 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이이고, 상기 변형된 변이는 박테리오파지 입자의 단백질 피막으로 편입될 수 있다.
"변형된 변이(modified variant)"라는 용어는, 야생형 서열과 비교될 때 변형된, 상기에서 언급된 야생형 단백질로부터 유래되는 단백질을 의미한다. 그러한 변형은 야생형 서열과 비교될 때 임의의 아미노산 치환, 아미노산 결실 또는 추가적인 아미노산의 편입을 포함할 수 있다. "변형된 변이"라는 용어는 하기에서 정의되는 바와 같이 "절단된 변이(truncated variants)"를 포함한다.
본 발명에 따른 야생형 단백질의 변형을 달성하는 방법은 당해 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 잘 공지되었고, 표준의 클로닝(cloning) 및/또는 돌연변이 유발(mutagenesis) 기술을 포함한다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는 야생형 단백질의 변형된 변이를 인코딩하는 핵산 분자를 제조하는 방법, 파지 및/또는 파지미드 벡터의 제조를 포함하는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제조하는 방법, 상기 벡터를 적당하게 선택된 숙주 세포로 도입하는 방법, 상기 변형된 단백질의 발현을 야기하거나 허용하는 방법은 당해 기술분야에서 잘 공지되었다(문헌[Sambrook 등, 2001]; 문헌[Ausubel 등, 1999]; 문헌[Kay 등, 1996]을 참고함). 본 발명에 따른 변형된 변이를 확인하기 위해, 검색 태그(detection tag)가 변이에 융합될 수 있고, 변이가 상기 변이의 존재하에서 형성되는 박테리오파지의 파지 피막으로 편입될 수 있거나 편입되는 지를 결정하기 위해 분석될 수 있다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 단백질 피막의 구성성분은 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 절단된 변이이고, 상기 절단된 변이는 박테리오파지 입자의 단백질 피막으로 상기 피막 단백질의 편입을 야기하는 상기 야생형 피막 단백질 중 적어도 일부분을 포함한다.
"절단된 변이(truncated variant)"라는 용어는, 야생형 서열의 적어도 일부분이 결실됨으로써 변형되는 상기에서 언급된 야생형 단백질로부터 유래되는 단백질을 의미한다. 이는 박테리오파지 돌연변이(문헌[Crissman & Smith, 1984])에서 발견되거나 또는 표준의 파지 디스플레이 방법의 과정(예를 들어, 문헌[Bass 등, 1990]; Krebber, 1996])에서 발생되는 절단된 유전자 III 단백질 변이와 같은 변이를 포함한다. 예를 들어, 상기 절단된 변이는 유전자 III 단백질의 C-말단 도메인으로 이루어지거나 또는 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 절단된 변이를 확인하기 위해, 검색 태그(detection tag)가 변이에 융합될 수 있고, 변이가 상기 변이의 존재하에서 형성되는 박테리오파지 입자의 파지 피막으로 편입되는 지를 결정하기 위해 분석될 수 있다.
야생형 단백질의 일부분을 결실하여 야생형 단백질을 절단하는 방법에 의해, 상기 야생형 단백질이 결실된 부분에 포함되는 제 2의 시스테인과 이황화 결합을 형성하도록 시스테인 잔기가 이용될 수 있다.
"(폴리)펩티드((poly)peptide)"라는 용어는 펩티드 결합을 통해 연결되는 다수개의, 즉 2개 이상의 아미노산 중 하나 이상의 사슬을 포함하는 분자를 의미한다.
"단백질(protein)"이라는 용어는 (폴리)펩티드를 의미하고, 상기 (폴리)펩티드의 적어도 일부분은 (폴리)펩티드 사슬(들) 내에 및/또는 사이에 2차, 3차, 또는 4차의 구조를 형성함으로써 정의된 3차원 배열을 갖거나 또는 획득할 수 있다. 이러한 정의는 천연적으로 발생하거나 적어도 부분적으로 인공적인 단백질 뿐만 아니라, 이러한 절편 또는 도메인이 상기에서 언급된 바와 같이 정의된 3차원 배열을 획득할 수 있는 한 전체 단백질의 절편 또는 도메인을 포함한다.
하나의 사슬로 이루어진 (폴리)펩티드/단백질의 예는 단일-사슬의 Fv 항체 절편이고, 그 이상의 사슬로 이루어진 (폴리)펩티드/단백질의 예는 Fab 항체 절편이다.
제 1의 시스테인 잔기가 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 C-말단에 위치되는 경우에, 통상적인 디스플레이에 대응되는 디스플레이 형식은 파지 피막 단백질의 구성성분에 유전적으로 융합되는 C-말단을 제공한다. 그러나, 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 N-말단을 사용함으로써, 상기 디스플레이 형식은 상기에서 언급된 문헌[Crameri & Suter]의 pJuFO 시스템에서 격세 유전(revert)될 수 있다(문헌[Crameri & Suter, 1993]).
"박테리오파지 입자의 표면(surface of a bacteriophage particle)"이라는 용어는, 상기 입자가 함유되고 접근가능한 매질과 접촉되는 박테리오파지 입자의 일부분을 의미한다. 상기 표면은 적당한 숙주 세포에서 파지가 생성되는 동안에 조립되는 파지 피막의 일부분인 단백질(상기 입자의 단백질 피막의 구성성분)에 의해 결정된다.
"발현한 후(after expression)"라는 용어는, 박테리오파지 피막 단백질을 갖는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산이 발현되는 접근법과 대조적으로, 상기 피막에 제 2의 (폴리)펩티드/단백질이 부착되기 이전에 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산이 숙주 세포에서 발현되는 상황을 의미한다. 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산의 발현 및 상기 부착을 야기하거나 허용하는 단계는, 분리된 단계 및/또는 환경에서 수행될 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 발현 및 상기 부착을 야기하거나 허용하는 단계는 적당한 숙주 세포에서 연속적으로 수행된다.
"상기 부착이 이황화 결합의 형성에 의해 야기된다"라는 용어는, 상기 이황화 결합이 부착의 원인이 되는 상황, 예를 들어 pJuFO 시스템의 경우에서(문헌[Crameri & Suter, 1993]) 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 존재하는 제 2의 도메인과 상호작용하는 상호작용 도메인이 상기 단백질 피막의 구성성분에 재조합적으로 융합되는 상황을 의미한다.
바람직한 실시예에서, 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이하는 박테리오파지 입자는 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산을 함유한다.
본 발명에 따른 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산을 제조하는 방법, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제조하는 방법, 상기 벡터를 적당하게 선택된 숙주 세포로 도입하는 방법, 상기 (폴리)펩티드/단백질의 발현을 야기하거나 허용하는 방법은 당해 기술분야에서 잘 공지되었다(문헌[Sambrook 등, 2001]; 문헌[Ausubel 등, 1999]; 문헌[Ge 등, 1995]을 참고함). 나아가, 적당한 숙주 세포에서 후대의(progeny) 박테리오파지 또는 박테리오파지 입자를 생성하는 데에 필요한 유전적인 물질을 도입하는 방법, 그리고 상기 후대의 박테리오파지 또는 박테리오파지 입자의 생성을 야기하거나 또는 허용하는 방법이 잘 공지되었다(문헌[Kay 등, 1996]을 참고함).
특정 실시예에서, 본 발명은 방법에 관한 것이고, 상기 제 1의 시스테인 잔기는 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 야생형 버젼(wild type version)에서 대응되는 아미노산 위치에 존재한다. 더 바람직하게, 상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질에서 대응되는 아미노산 위치에 존재한다.
더 바람직한 실시예에서, 상기 제 1의 시스테인 잔기는 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 야생형 버젼에서 대응되는 아미노산 위치에 존재하지 않는다. 더 바람직하게, 상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질에서 대응되는 아미노산 위치에 존재하지 않는다.
본 발명의 맥락에서, (폴리)펩티드/단백질의 "야생형 버젼(wild type version)"이라는 용어는 천연적으로 발생하는 아미노산 서열을 갖는 (폴리)펩티드/단백질을 의미한다.
더 바람직한 실시예에서, 상기 제 1의 시스테인 잔기는 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 인공적으로 도입되었다. 더 바람직한 실시예에서, 상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질에 인공적으로 도입되었다. 다른 실시예에서, 상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이에 인공적으로 도입되었다. 다른 실시예에서, 상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 절단된 변이에 인공적으로 도입되었다.
특정 실시예에서, 본 발명은 방법에 관한 것이고, 상기 제 2의 시스테인 잔기는 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 야생형 버젼에서 대응되는 아미노산 위치에 존재한다. 더 바람직하게, 상기 제 2의 시스테인 잔기는 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편에서 대응되는 아미노산 위치에 존재한다.
더 바람직한 실시예에서, 상기 제 2의 시스테인 잔기는 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 야생형 버젼에서 대응되는 아미노산 위치에 존재하지 않는다. 더 바람직하게, 상기 제 2의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질에서 대응되는 아미노산 위치에 존재하지 않는다.
더 바람직한 실시예에서, 상기 제 2의 시스테인 잔기는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 인공적으로 도입되었다. 더 바람직한 실시예에서, 상기 제 2의 시스테인 잔기는 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편에 인공적으로 도입되었다. 바람직하게, 상기 기능적인 절편은 scFv 또는 Fab 절편이다.
특정 실시예에서, 본 발명은 방법에 관한 것이고, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 제 1의 또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 야생형 버젼에서 대응되는 아미노산 위치에 존재한다. 더 바람직하게, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은, 박테리오파지 또는 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편, 바람직하게는 scFv 또는 Fab 절편의 야생형 피막 단백질에서 대응되는 아미노산 위치에 존재한다.
더 바람직한 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 제 1의 또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 야생형 버젼에서 대응되는 아미노산 위치에 존재하지 않는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은 야생형 (폴리)펩티드/단백질이 아니고, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 야생형 버젼에 존재하지 않는다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 야생형 (폴리)펩티드/단백질이 아니고, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 야생형 버젼에 존재하지 않는다. 더 바람직하게, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 박테리오파지 또는 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편, 바람직하게는 scFv 또는 Fab 절편의 야생형 피막 단백질에서 대응되는 아미노산 위치에 존재하지 않는다.
더 바람직한 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 제 1의 또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 야생형 버젼에서 인공적으로 도입되었다. 더 바람직한 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 박테리오파지 또는 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편, 바람직하게는 scFv 또는 Fab 절편의 야생형 피막 단백질에서 인공적으로 도입되었다.
본 발명의 맥락에서, "인공적으로 도입된(artificially introduced)"이라는 용어는, (폴리)펩티드/단백질이 예를 들어 재조합 수단에 의해 변형되는 상황을 의미한다. 본 발명에서, 다양한 (폴리)펩티드/단백질이 변형될 수 있다. 예를 들어, 제 1의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산은, 변형된 제 1의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 생성하는, 시스테인 코돈(cysteine codon)을 도입하기 위해 표준의 절차에 의해 조작될 수 있으며, 시스테인 잔기는 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 삽입 또는 상기 시스테인 잔기의 추가에 의해 인공적으로 도입되거나, 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질 또는 상기 시스테인 잔기에 의한 변형된 단백질에 포함되는 아미노산 잔기의 치환에 의해 인공적으로 도입되거나, 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질과 상기 제 2의 시스테인 잔기를 포함하는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 융합에 의해 인공적으로 도입되거나, 상기 삽입, 추가, 치환 또는 융합의 임의의 조합에 의해 인공적으로 도입된다. 가장 바람직하게, 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은, 박테리오파지 또는 이들의 변경되거나 절단된 변이의 야생형 피막 단백질이다.
마찬가지로, 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산은 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 대해 언급된 바와 동일한 방식으로, 시스테인 코돈을 도입하기 위해 표준의 절차에 의해 조작될 수 있다. 바람직한 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 면역글로불린 도는 이들의 기능적인 절편을 포함한다. 특히 scFv 또는 Fab 절편이 바람직하다.
마찬가지로, 제 1의 또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산은 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산에 대해 인코딩하는, 아미노산 코돈을 도입하기 위해 표준의 절차에 의해 조작될 수 있다.
제 1의 (폴리)펩티드/단백질이 박테리오파지의 야생형 피막 단백질인 경우에, 재조합적으로 도입된 시스테인 코돈을 포함하는 핵산의 발현은, 시스테인 잔기를 포함하는 야생형 피막 단백질의 변이의 형성을 야기한다.
가장 바람직한 실시예에서, 상기 제 1의 시스테인은 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 절단된 변이에 인공적으로 도입되었다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 제 1의 시스테인은 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이에 인공적으로 도입되었다.
본 발명에 따른 인공적인 도입을 달성하는 방법은 당해 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 잘 공지되었고, 표준의 클로닝 및/또는 돌연변이 유발 기술을 포함한다. 본 발명에 따른 방법에 사용되는 야생형 단백질의 변형된 변이를 인코딩하는 핵산 분자를 제조하는 방법, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제조하는 방법, 상기 벡터를 적당하게 선택된 숙주 세포로 도입하는 방법, 상기 융합 단백질의 발현을 야기하거나 달성하는 방법은 당해 기술분야에서 잘 공지되었다(문헌[Sambrook 등, 2001]; 문헌[Ausubel 등, 1999]을 참고함).
또 다른 실시예에서, 본 발명은 방법에 관한 것이고, 제 1의 시스테인 잔기는 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 상기 구성성분 중 C-말단 또는 N-말단 근처에 존재한다. 바람직한 실시예에서, 상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지 입자의 단백질 피막의 구성성분 중 C-말단 또는 N-말단 근처에 존재한다. 특정 실시예에서, 상기 제 1의 시스테인 잔기는 N-말단 시스테인 잔기이다. 다른 실시예에서, 상기 제 1의 시스테인 잔기는 C-말단 시스테인 잔기이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 방법에 관한 것이고, 제 2의 시스테인 잔기는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 상기 구성성분 중 C-말단 또는 N-말단 근처에 존재한다. 바람직한 실시예에서, 상기 제 2의 시스테인 잔기는 면역글로불린, 또는 이들의 기능적인 절편, 바람직하게는 scFv 또는 Fab 절편 중 C-말단 또는 N-말단 근처에 존재한다. 특정 실시예에서, 상기 제 2의 시스테인 잔기는 N-말단 시스테인 잔기이다. 다른 실시예에서, 상기 제 2의 시스테인 잔기는 C-말단 시스테인 잔기이다.
"~의 근처에(in the vicinity of)"라는 용어는, 상기 제 1의 또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 N-말단 또는 C-말단 둘 모두의 경우에 포함되는, 최대 15개, 더 바람직하게는 최대 10개의 아미노산, 더 바람직하게는 최대 5개의 아미노산의 범위를 의미한다.
바람직한 실시예에서, 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은 박테리오파지 입자의 단백질 피막의 구성성분, 바람직하게는 pIII를 포함한다.
바람직한 실시예에서, 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편, 바람직하게는 scFv 또는 Fab 절편을 포함한다.
이러한 맥락에서, "면역글로불린(immunoglobulin)"은 "항체(antibody)"에 대한 유의어로서 사용된다. "기능적인 절편(functional fragment)"이라는 용어는 면역글로불린의 항원-결합 부분을 보유하는 면역글로불린의 절편을 의미한다. 본 발명에 따른 기능적인 면역글로불린 절편은, Fv(문헌[Skerra & Pluckthun, 1988]), scFv(문헌[Bird 등, 1988]; 문헌[Huston 등, 1988]), 디설피드-연결된 Fv(문헌[Glockshuber 등, 1992]; 문헌[Brinkmann 등, 1993]), Fab, F(ab')2 절편, 또는 면역글로불린 또는 면역글로불린 절편의 변경가능한 도메인을 포함하는 당해 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 공지된 다른 절편들일 수 있다. 특히, scFv 또는 Fab 절편이 바람직하다.
특정 실시예에서, 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 상이하다. 이러한 맥락에서 "상이한"이라는 용어는 2개의 (폴리)펩티드/단백질들이 완전히 동일하지 않다는 것을 의미한다. 바람직한 실시예에서, 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 변형된 변이 또는 절단된 변이가 아니다. 가장 바람직한 실시예에서, 제 1의 및 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 상이한 기능적인 (폴리)펩티드/단백질에 대해 인코딩하고, 예를 들어 하나의 (폴리)펩티드/단백질은 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이에 대해 인코딩하고, 다른 하나의 (폴리)펩티드/단백질은 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편에 대해 인코딩한다. 다른 바람직한 실시예에서, 제 1의 및 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 상이한 종(specie)으로부터 유래되며, 예를 들어 하나의 (폴리)펩티드/단백질은 박테리오파지로부터 유래되고, 다른 하나의 (폴리)펩티드/단백질은 인간으로부터 유래된다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 박테리오파지 입자의 표면상에 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 단백질 피막의 구성성분으로 발현한 후 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 부착을 야기하거나 또는 허용하는 단계를 포함하고, 상기 부착은 상기 단백질 피막의 구성성분에 포함되는 제 1의 시스테인 잔기 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합을 형성함으로써 야기되고, 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 상기 제 1의 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함한다.
다른 바람직한 실시예에서, 상기 제 1의 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 적당한 숙주 세포에서 발현되고 조립된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 방법을 제공한다:
(a) 제 1의 시스테인 잔기를 포함하는 제 1의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 제 1의 핵산 서열을 포함하는 제 1의 핵산 서열, 및 제 2의 시스테인 잔기를 포함하는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 제 2의 핵산 서열을 포함하는 제 2의 핵산 서열을 포함하는, 숙주 세포를 제공하는 단계(상기 (폴리)펩티드/단백질 중 하나는 하나 이상의 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함함);
(b) 상기 제 1의 및 상기 제 2의 핵산 서열의 발현을 야기하거나 허용하는 단계; 및
(c) 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 상기 제 2의 시스테인 잔기에 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 상기 제 1의 시스테인 잔기의 부착을 야기하거나 또는 허용하는 단계.
상기 단계 (b) 및 (c)는 연속적으로, 순서대로 또는 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "발현을 야기하거나 허용하는"이라는 용어는 핵산 서열이 발현되는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 설명한다.
본 발명에 따른 제 1의 또는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산을 제조하는 방법, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제조하는 방법, 상기 벡터를 적당하게 선택된 숙주 세포로 도입하는 방법, (폴리)펩티드/단백질의 발현을 야기하거나 허용하는 방법은 당해 기술분야에서 잘 공지되었다(문헌[Sambrook 등, 2001]; 문헌[Ausubel 등, 1999]을 참고함). 나아가, 적당한 숙주 세포에서 후대의(progeny) 박테리오파지 또는 박테리오파지 입자를 생성하는 데에 필요한 유전적인 물질을 도입하는 방법, 및 상기 후대의 박테리오파지 또는 박테리오파지 입자의 생성을 야기하거나 또는 허용하는 방법이 잘 공지되었다(문헌[Kay 등, 1996]을 참고함). 박테리오파지 입자의 생성을 야기하거나 허용하는 단계는, 예를 들어 파지미드와 함께 작업하는 경우에 적당한 보조 파지의 사용을 요구할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이를 인코딩하는 핵산 서열에 관한 것이고, 상기 변형된 변이는 하기의 (a), (b), 및 (c)를 포함하거나 이들로 이루어진다:
(a) 박테리오파지의 상기 야생형 피막 단백질 중 하나 이상의 부분들(상기 부분들 중 하나는 파지 피막으로 상기 피막 단백질의 편입을 야기하거나 또는 허용하는 적어도 일부분을 포함함);
(b) 제 1의 시스테인 잔기; 및
(c) 상기 제 1의 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산. 또 다른 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 준다. 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 서열은 분리된 핵산 서열이다. 다른 실시예에서, 상기 핵산 서열은 정제 및/또는 검출 목적을 위해 하나 이상의 펩티드 서열에 대해 더 인코딩한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은 변형된 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편을 인코딩하는 핵산 서열에 관한 것이고, 상기 변형된 면역글로불린 또는 기능적인 절편은 하기의 (a), (b) 및 (c)로 이루어진다:
(a) 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편;
(b) 시스테인 잔기; 및
(c) 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산. 이러한 맥락에서 사용된 바와 같이, 상기 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편은 본 발명의 용어에 따른 제 2의 (폴리)펩티드/단백질과 동등하다. 또 다른 실시예에서, 또 다른 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 또 다른 (폴리)펩티드/단백질에 포함된다. 이러한 다른 (폴리)펩티드/단백질은 본 발명의 용어에 따른 제 1의 (폴리)펩티드/단백질과 동등하다. 바람직한 실시예에서, 변형된 면역글로불린의 상기 기능적인 절편은 scFv 또는 Fab 절편이다. 바람직한 실시예에서, 상기 핵산 서열은 분리된 핵산 서열이다. 다른 실시예에서, 상기 핵산 서열은 정제 및/또는 검출 목적을 위해 하나 이상의 펩티드 서열에 대해 더 인코딩한다.
본 발명의 맥락에서, 시스테인 잔기에 의한 야생형 피막 단백질 서열에서 아미노산 잔기의 치환에 의해 수득되는 변형된 변이는, 추가적인 시스테인 잔기에 의해 연결된 상기 야생형 단백질의 2개의 부분으로 구성된 변이로 간주될 수 있다. 결과적으로, 야생형 서열과 비교되는 몇몇 돌연변이를 포함하는 야생형 피막 단백질의 변이는 몇몇 야생형 부분으로 구성된다고 간주될 수 있고, 상기 개개의 부분들은 돌연변이된 잔기에 의해 연결된다. 그러나, 상기 변이는, 야생형 피막 단백질의 C-말단 또는 N-말단에, 시스테인 잔기를 포함하는 최대 6개의 잔기를 추가함으로써 야기될 수 있다.
마찬가지로, 야생형 또는 모체의(parental) 면역글로불린 단백질 서열 또는 이들의 기능적인 절편에 아미노산 잔기를 치환하여 수득되는 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편의 변형된 변이는, 추가적인 시스테인 잔기에 의해 연결된 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편의 2개의 부분으로 구성된 변이로 간주될 수 있다. 동일한 방식에서, 야생형 피막 단백질의 변형된 변이, 또는 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편의 변형된 변이는, 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 추가적인 아미노산에 의해 연결된 2개의 부분으로 구성된 변이로 간주될 수 있다. 둘 모두의 경우에, 시스테인 잔기 및 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산은 야생형 피막 단백질의 변형된 변이, 또는 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편의 변형된 변이에 도입되고, 그런 다음 상기 단백질이 더 많은 돌연변이를 포함한다면, 상기 단백질은 3개의 부분 또는 더 많은 부분으로 구성된 변이로 간주될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명의 핵산 서열은 정제 및/또는 검출 목적을 위해 하나 이상의 펩티드 서열에 대해 더 인코딩한다. 본 발명의 특정 실시예에서, 본 발명의 핵산 서열은 숙주 세포에 포함된다.
금속 이온에 결합될 수 있는 5개 이상의 히스티딘 잔기를 포함하는 펩티드가 특히 바람직하고(문헌[Hochuli 등, 1988]), 따라서 상기 펩티드가 융합되는 단백질의 정제에 사용될 수 있다(문헌[Lindner 등, 1992]). 또한, c-myc 및 FLAG 태그(문헌[Hopp 등 1988]; Knappik & Pluckthun, 1994]), Strep-태그(문헌[Schmidt & Skerra, 1994]; 문헌[Schmidt 등 1996]), 또는 E-태그(GE Healthcare)와 같은 추가적인 부분들이 본 발명에 의해 제공된다.
본 발명의 제 1의 및 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 변형된 변이는 클로닝을 위해, 발현을 위해, 단백질 운반을 위해 요구되는 아미노산 잔기를 더 포함할 수 있다. 클로닝을 위해 요구되는 아미노산 잔기는, 핵산 서열을 적당한 벡터로 클로닝하기 위해 편입되는 제한 효소(restriction endonucleases)에 대한 인식 서열을 포함하는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 잔기를 포함할 수 있다. 발현을 위해 요구되는 아미노산 잔기는, (폴리)펩티드/단백질의 용해도 또는 안정성을 증가시키는 잔기를 포함할 수 있다. 단백질 운반을 위해 요구되는 아미노산 잔기는, 대장균(E.coli)의 주변세포질에 변형된 변이의 운반을 야기하는, 신호전달 서열 및/또는 상기 신호전달 서열의 유효한 분열을 촉진하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 나아가, 상기에서 언급된 바와 같이 클로닝, 발현, 단백질 운반, 정제 및/또는 검출 목적을 위해 요구되는 아미노산 잔기는 당해 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 잘 공지된 다수의 부분(moiety)이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
바람직한 실시예에서, 벡터는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지며, 상기 변형된 변이는 하기의 (a), (b) 및 (c)를 포함하거나 이루어진다:
(a) 박테리오파지의 상기 야생형 피막 단백질 중 하나 이상의 부분들(상기 부분들 중 하나는 파지 피막으로 상기 피막 단백질의 편입을 야기하거나 또는 허용하는 적어도 일부분을 포함함);
(b) 제 1의 시스테인 잔기; 및
(c) 상기 제 1의 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산. 다른 실시예에서, 상기 벡터는 변형된 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편을 인코딩하는 핵산 서열을 더 포함하며, 상기 변형된 면역글로불린 또는 기능적인 절편은 (a) 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편, 및 (b) 제 2의 시스테인 잔기로 이루어진다.
바람직한 실시예에서, 벡터는 변형된 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하거나 이들로 이루어지며, 상기 변형된 면역글로불린 또는 기능적인 절편은 하기의 (a), (b) 및 (c)를 포함하거나 이루어진다:
(a) 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편;
(b) 시스테인 잔기; 및
(c) 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산. 다른 실시예에서, 상기 벡터는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이를 인코딩하는 핵산 서열을 더 포함하고, 상기 변형된 변이는 하기의 (a) 및 (b)를 포함하거나 이들로 이루어진다:
(a) 박테리오파지의 상기 야생형 피막 단백질 중 하나 이상의 부분들(상기 부분들 중 하나는 파지 피막으로 상기 피막 단백질의 편입을 야기하거나 또는 허용하는 적어도 일부분을 포함함); 및
(b) 또 다른 시스테인 잔기.
본 발명의 특정 실시예에서, 본 발명의 벡터는 숙주 세포에 포함된다.
가장 바람직한 실시예에서, 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편을 포함한다.
상기에서 언급된 단일-사슬의 Fv 항체 절편의 경우에, 벡터는 (폴리)펩티드 연결자에 의해 연결되는 VH 및 VL 도메인을 인코딩하는 하나의 핵산 서열을 포함하고, Fab 항체 절편의 경우에, 벡터는 VH-CH 및 VL-CL 사슬을 인코딩하는 2개 이상의 핵산 서열을 포함한다.
다른 실시예에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 핵산 서열 또는 본 발명에 따른 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은, 본 발명의 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산으로서 동일한 벡터 상에 포함되는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 그러한 경우에, 상기 숙주 세포는 둘 모두의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나의 벡터를 포함할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은, 본 발명의 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산으로서 상이한 벡터 상에 포함되는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. 그러한 경우에, 상기 숙주 세포는 2개의 다른 벡터, 즉 제 1의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 1개의 벡터, 및 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 1개의 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, "숙주 세포(host cell)"라는 용어는 이종의 단백질의 제조에 공통적으로 사용되는 세포들 중 임의의 세포들일 수 있으며, 상기 세포들은 대장균과 같은 박테리아(문헌[Ge 등, 1995]), 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(문헌[Wu 등, 1993]), 효모균과 같은 진균류(문헌[Horwitz 등, 1988]; 문헌[Ridder 등, 1995]), 또는 섬유상 진균류(문헌[Nyyssonen 등, 1993]), 식물 세포(문헌[Hiatt & Ma, 1993]; 문헌[Whitelam 등, 1994]), 곤충 세포(문헌[Potter 등, 1993]; 문헌[Ward 등, 1995]) 또는 포유류의 세포(문헌[Trill 등, 1995])를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 실시예에서, 상기 숙주 세포는 원핵의 숙주 세포이고, 더 바람직하게는 그램-음성의 숙주 세포(Gram-negative host cell)이고, 가장 바람직하게는 대장균이다.
다른 바람직한 실시예에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 핵산 서열에 의해 인코딩되는 야생형 박테리오파지 피막 단백질의 변형된 변이, 본 발명에 따른 벡터 또는 본 발명의 숙주 세포에 의해 생성되는 벡터에 관한 것이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 박테리오파지 입자의 표면상에 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이하는 박테리오파지 입자에 관한 것이다:
단백질 피막의 구성성분으로 발현한 후 상기 (폴리)펩티드/단백질의 부착을 야기하거나 허용하는 단계(상기 부착은 상기 단백질 피막의 구성성분에 포함되는 제 1의 시스테인 잔기 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합의 형성에 의해 야기되고, 상기 (폴리)펩티드/단백질 또는 상기 단백질 피막의 구성성분은 상기 제 1의 또는 상기 제 2의 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함함). 특정 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 상기 (폴리)펩티드/단백질 내에 포함된다. 다른 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 상기 단백질 피막의 구성성분 내에 포함된다. 바람직한 실시예에서, 상기 (폴리)펩티드/단백질은 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편이다. 다른 실시예에서, 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산은 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되고, 바람직하게는 단백질 피막의 구성성분에 포함되고, 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산은 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되고, 바람직하게는 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편에 포함된다.
본 발명의 더 바람직한 실시예에서, 박테리오파지 입자는 본 발명에 따른 벡터를 함유하고, 상기 벡터는 제 1의 시스테인 잔기를 포함하는 제 1의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 제 1의 핵산 서열을 포함하는 제 1의 핵산 서열 및 제 2의 시스테인 잔기를 포함하는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 제 2의 핵산 서열을 포함하는 제 2의 핵산 서열을 포함하고, 상기 (폴리)펩티드/단백질 중 하나는 하나 이상의 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함한다. 가장 바람직하게는, 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 면역글로불린의 하나 이상의 기능적인 도메인을 포함한다.
상기에서 언급된 본 발명의 방법 중 바람직한 실시예에는, 필요한 부분만 수정하면 본 발명의 박테리오파지에 적용된다.
다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 박테리오파지 입자의 다양한 집합물에 관한 것이고, 각각의 상기 박테리오파지 입자는 (폴리)펩티드/단백질의 다양한 집합물 밖의 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이한다.
"박테리오파지 입자의 다양한 집합물"은 "라이브러리(library)로 언급될 뿐만 아니라 "복수의 박테리오파지 입자"로 언급될 수도 있다. 그러한 라이브러리의 각각의 구성성분은 상기 라이브러리의 구별되는 구성성분을 디스플레이한다.
본 발명의 맥락에서, "다양한 집합물(diverse collection)"이라는 용어는 조성, 성질 및/또는 서열의 적어도 일부분이 상이한 2개 이상의 입자 또는 분자의 집합물을 의미한다. 예를 들어, (폴리)펩티드/단백질의 다양한 집합물은 서열 중 하나 이상의 아미노산 위치가 다른 한 세트(set)의 (폴리)펩티드/단백질이다. (폴리)펩티드/단백질 중 그러한 다양한 집합물은 다양한 방법에 의해 수득될 수 있으며, 예를 들어 개시(starting) (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산 서열 중 하나 이상의 코돈의 임의적인 돌연변이 유발에 의한 방법, 개시 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 증폭시키는 실수-유발(error-prone) PCR을 사용하는 방법, 또는 본 발명에 따른 방법에서 숙주 세포로서 돌연변이 유발 균주(mutator strain)를 사용하는 방법에 의해 수득될 수 있다. (폴리)펩티드/단백질의 다양한 집합물을 생성하기 위한 이러한 방법 및 추가적이거나 다른 방법은 당해 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 잘 공지되었다. "박테리오파지 입자의 다양한 집합물"은 라이브러리 또는 복수의 박테리오파지 입자를 의미할 수 있다. 그러한 라이브러리 중 각각의 구성성분은 상기 라이브러리의 구별되는 구성성분을 디스플레이한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 원하는 성질을 갖는 (폴리)펩티드/단백질을 수득하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기의 (a) 및 (b) 단계를 포함한다:
(a) 본 발명에 따른 박테리오파지 입자의 다양한 집합물을 제공하는 단계; 및
(b) 상기 원하는 성질을 갖는 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이하는 하나 이상의 박테리오파지 입자를 수득하기 위해, 상기 다양한 집합물을 스크리닝하는 하거나, 그리고/또는 상기 다양한 집합물로부터 선택하는 단계.
본 발명의 맥락에서, "원하는 성질(desired property)"이라는 용어는, (폴리)펩티드/단백질의 다양한 집합물 밖의 (폴리)펩티드/단백질 중 하나가 가져야 하는 기결정된 성질, 그리고 상기 다양한 집합물을 스크리닝 하거나 그리고/또는 선택하는 기준을 형성하는 기결정된 성질을 의미한다. 그러한 원하는 성질은 표적에의 결합, 표적의 차단, 표적-매개된 반응의 활성, 효소 활성, 및 당해 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 공지된 다른 성질과 같은 성질들을 포함한다. 원하는 성질의 유형에 따라, 당해 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자는, 스크리닝 및/또는 선택을 수행하는 형식 및 필요한 단계를 확인할 수 있다. 상기 원하는 성질이 대상이 되는 표적에의 결합인 것이 가장 바람직한 방법이다.
상기 대상이 되는 표적은, 당해 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 공지된 다양한 방법에서 박테리오파지 입자의 상기 다양한 집합물에 제시될 수 있고, 상기 방법은 고체 상의 바이오패닝(solid phase biopanning)을 위해 표면상에 코팅하는 방법, 용액에서 바이오패닝을 위해 자성 구슬(magnetic bead)과 같은 입자에 연결하는 방법, 또는 전체 세포의 바이오패닝 또는 조직 절편상에 바이오패닝을 위해 세포의 표면상에 디스플레이하는 방법을 예로 들 수 있다. 상기 표적에 결합된 것을 갖는 박테리오파지 입자는 당해 기술분야에서 평균적 지식을 가진 자에게 공지된 다양한 방법에 의해 회수될 수 있고, 상기 방법은 적당한 버퍼로 용리하는 방법, pH- 또는 염 구배를 사용하는 방법, 또는 용해성 표적을 사용하여 특정 용리에 의한 방법을 예로 들 수 있다.
바람직한 실시예에서, (폴리)펩티드/단백질을 수득하는 방법은 하기의 (ba), (bb) 및 (bc)를 더 포함한다:
(ba) 박테리오파지 입자의 상기 다양한 집합물을 대상이 되는 표적에 접촉시키는 단계;
(bb) 상기 대상이 되는 표적에 결합하지 않은 박테리오파지 입자를 용리시키는 단계;
(bc) 환원 조건하에서, 단계 (ba)에서 형성된 상기 대상이 되는 표적과 상기 표적에 결합한 박테리오파지의 복합체를 처리함으로써 상기 대상이 되는 표적에 결합한 박테리오파지를 용리시키는 단계.
DTT로 배양에 의한 것과 같은 환원 조건하에서, 이황화 결합은 분열되어, 바이오패닝의 추가적인 라운드(round) 및/또는 상기 표적에 특이하게 결합하는 (폴리)펩티드/단백질의 확인을 위한 특정 박테리오파지 입자를 회수하는 것을 허용한다.
다른 실시예에서, 본 발명은, 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 제 1의 또는 제 2의 (폴리)펩티드/로 도입함으로써, 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산이 도입되지 않은 동등한 시스테인 디스플레이 시스템에서 보다, 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 1의 시스테인 잔기가 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기와 이황화 결합을 더 바람직하게 형성하여, 시스테인 디스플레이 시스템을 개선시키는 방법에 관한 것이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 (a) 제 1의 시스테인 잔기를 포함하는 제 1의 (폴리)펩티드/단백질, 및 (b) 제 2의 시스테인 잔기를 포함하는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 포함하는 복합체에 관한 것이고, 상기 (폴리)펩티드/단백질 중 하나는 하나 이상의 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 더 포함하고, 상기 제 1의 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 상기 시스테인 잔기를 통해 이황화 결합을 형성한다. 바람직한 실시예에서, 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 복수의 박테리오파지 입자의 다양한 집합물 상에 디스플레이되는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 다양한 집합물의 구성성분이다. 특정의 바람직한 실시예에서, 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은 파지 피막 단백질이다. 다른 바람직한 실시예에서, 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편을 포함하고, 더 바람직하게는 scFv 또는 Fab 절편을 포함한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 상기에서 언급되는 임의의 복합체를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
예들
예 1 : 새로운 벡터의 제조
벡터는 제WO 01/05909호에서 설명되는 공지된 발현 벡터를 기초로 한다. Fab 절편의 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)는 lac 프로모터/작동자 영역의 통제하에서 mRNA의(dicistronic) 파지미드로부터 발현된다. 제 1의 발현 카세트(expression cassette)는 신호 서열 ompA, 및 경쇄의 가변적이고 일정한 도메인을 포함한다. 제 2의 발현 카세트는 신호 서열 phoA, 및 중쇄의 가변적이고 일정한 도메인을 포함한다. 중쇄 및 경쇄는 이황화 결합을 통해 연결되지는 않는다. 유전자 III는 동일한 벡터 상에 인코딩된다. 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기는 pIII의 N-말단 및 중쇄 Fd-절편의 C-말단에 위치된다. 일반적인 시스디스플레이 벡터의 주된 특징을 도 1에 도시하였다.
새로운 디스플레이 벡터 변이(pMORPH25 버젼 A, B, C 및 E)는 pMORPH23의 유도체(제WO 04/013276호)인 pMORPH25를 기초로 제조되었다. 에스트라디올-BSA 특정 HuCAL Fab 절편을 함유하는 pMORPH23 및 pMORPH25의 서열 및 벡터 맵(vector map)은 도 5(도 5a), 6, 7(7a) 및 8에 도시되었다. pMORPH23 및 pMORPH25의 시스테인-태그 서열은 동일하다.
변형된 시스테인-태그를 갖는 벡터 변이를 제조하기 위해, pMORPH25는 C-말단의 야생형 서열(pMORPH25_WT 태그)을 제거하는 EcoRI 및 HindIII에 의해 소화(digest)되었다. 새로운 C-말단 태그의 버젼 A, B, C 및 E는, EcoRI 및 HindIII 소화된 디스플레이 벡터 pMORPH25에 대해 양립가능한 오버행(overhang)을 갖는 어닐링된(annealed) 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드(ds oligonucleotide)의 결찰에 의해 삽입되었다.
각각의 올리고뉴클레오티드의 서열을 표 2에서 요약하였다. 이중 가닥의 올리고뉴클레오티드를 하기의 절차에 따라 어닐링하였다. 200 ng의 각각의 올리고뉴클레오티드의 조합(예를 들어, pMORPH25 버젼 A에 대한 서열번호 1 및 서열번호 2)을 20분 동안 99℃에서 배양한 후 실온으로 냉각하였고, 상보적인 서열을 어닐링하였다. 어닐링된 dsDNA를 표준의 DNA 기술(문헌[Sambrook 등, 2001]; 문헌[Ausubel 등, 1999]; 문헌[Kay 등, 1996]을 참고함)에 따라 pMORPH25로 결찰시켰고, 전자-항체 반응을 일으키는(electro-competent) Top10F 세포(인비트로젠(Invitrogen))로 형질변환시켰다.
| 서열번호 1 : pMORPH25_A_for 5'aattcccaggggggagcggaggtgcgccgcaccatcatcaccatcactgcaaatgata3' |
| 서열번호 2 : pMORPH25_A_rev 5'agcttatcatttgcagtgatggtgatgatggtgcggcgcacctccgctcccccctggg3' |
| 서열번호 3 : pMORPH25_B_for 5'aattcccaggggggagcggaggtgcgccgcaccatcataaacatcactgctgata3' |
| 서열번호 4 : pMORPH25_B_rev 5'agcttatcagcagtgatgtttatgatggtgcggcgcacctccgctcccccctggg3' |
| 서열번호 5 : pMORPH25_C_for 5'aattcccaggggggagcggaggtgcgccgcaccatcatcaccataaatgctgata3' |
| 서열번호 6 : pMORPH25_C_rev 5'agcttatcagcatttatggtgatgatggtgcggcgcacctccgctcccccctggg3' |
| 서열번호 7 : pMORPH25_E_for 5'aattcccaggggggagcggaggtgcgccgcacaaacataaacataaatgctgata3' |
| 서열번호 8 : pMORPH25_E_rev 5'agcttatcagcatttatgtttatgtttgtgcggcgcacctccgctcccccctggg3' |
대조군 구조체 pMORPH25의 중쇄 절편의 C-말단의 아미노산 서열을 표 3에서 나타내었다. 4개의 유도체들을 "pMORPH25 버젼 A", "pMORPH25 버젼 B", "pMORPH25 버젼 C", 및 "pMORPH25 버젼 E"로서 표 3에 표기하였다. 하나의 변이는 C-말단(변이 A)에서 추가적인 리신 잔기를 운반한다. 변이 B 및 C에서, 히스티딘 잔기, 반응성 시스테인 잔기에 대한 N-말단에서 3개 및 1개의 아미노산은 리신 잔기와 교환되었다. 변이 E에서, 반응성 시스테인 잔기에 대한 직접적인 N-말단에서 5개의 히스티딘 잔기 밖의 3개는 리신 잔기로 교환되었다.
| 구조체 | 중쇄 절편의 C-말단 |
| pMORPH25 | PGGSGGAPHHHHHHC |
| pMORPH25 버젼 A | PGGSGGAPHHHHHHC K |
| pMORPH25 버젼 B | PGGSGGAPHHHKHHC |
| pMORPH25 버젼 C | PGGSGGAPHHHHHK C |
| pMORPH25 버젼 E | PGGSGGAPHKHKHK C |
예 2 : Ni-NTA 플레이트에 결합한 파지
pMORPH25에서 반응성 시스테인 잔기에 대한 직접적인 N-말단에서 6개의 히스티딘 잔기는 Ni-NTA 플레이트(plate)에 결합될 수 있는 능력을 갖는 박테리오파지 입자를 제공한다. 버젼 A에서, 리신 잔기는 반응성 시스테인 잔기에 대한 C-말단에 도입되었다. pMORPH25의 버젼 B, C, 및 E에서, 이러한 범위의 6개의 히스티딘 잔기는 하나 이상의 리신을 각각의 상기 6개의 히스티딘 범위로 도입하는 방법에 의해 붕괴되었다. 아마도, 이는 Ni-NTA 플레이트에 결합하는 Fab 절편을 디스플레이하는 박테리오파지 입자의 능력의 손실을 야기한다.
Fab 절편을 디스플레이하는 박테리오파지 입자는 표준 기술(예를 들어, 문헌[Kay 등, 1996] 및 제WO 01/05909호의 예 2.2를 참고함)을 통해 제조된다. Ni-NTA 플레이트에 대한 박테리오파지 입자의 결합은 간략히 약술한 바와 같이 결정되었다. 차단 용액(TBS로 희석된 Chemiblock, 0.1% Tween20)으로 2시간 동안 미리-배양된 파지 입자(8×10/웰(well))를 미리-차단된 HIS-select iLAP HC 니켈 코팅된 96 웰 플레이트(well plate)(Sigma-Aldrich Co)에 첨가하였다. PBST 및 PBS로 세척한 후에, 남아있는 파지를 항-M13-HRP 컨쥬게이트(anti-M13-HRP conjugate)(Amersham Pharmacia Biotech) 및 BM 블루 용해(BM blue soluble)(Boehringer Mannheim)로 눈에 보이게 하였다.
결과를 도 2에서 도시하였다.
도 2에서 살펴본 바와 같이, pMORPH25의 버젼 B 및 E는 히스티딘 태그를 효과적으로 붕괴시켰다. 본래의 구조체는 Ni-NTA 플레이트에 여전히 결합하였다. 6개의-히스티딘 태그를 운반하는 버젼 A 뿐만 아니라, 5개의-히스티딘 태그를 운반하는 버젼 C에 대해 동일한 것을 보유하고, Ni-NTA 플레이트에 박테리오파지 입자를 결합시키기에 충분한 것 같다.
예 3 : 상대적인 디스플레이 비율
다양한 벡터 구조체(예 1에서 약술된 바와 같은, 버젼 A, 버젼 E)의 파지 입자의 상대적인 디스플레이 비율은 하기에서 설명된 바와 같이 결정되었다.
파지 입자는 표준 절차(예를 들어, 문헌[Kay 등, 1996] 및 제WO 01/05909호의 예 2.2를 참고함)에 의해 제조된다. 파지 입자의 개수(number) 및 공지되지 않은 파지 입자 용액의 항체 디스플레이 비율은 2개의 독립적인 ELISA 실험에서 결정되었다. 파지 조제(phage preparation)의 파지 입자 타이터(titer)는 항-pIII 캡쳐 ELISA(anti-pIII capture ELISA)를 통해 결정되었고, 파지 조제의 항체 디스플레이 비율은 항-Fd 캡쳐 ELISA(anti-Fd capture ELISA)를 통해 결정되었다. 상대적인 디스플레이 비율은 항-pIII 캡쳐 ELISA 신호에 의해 분할되는 항-Fd 신호로서 정의된다.
Maxisorp Nunc-Immuno 마이크로타이터 플레이트를, 4℃에서 12시간 동안 2.5㎍/ml의 항-pIII 캡쳐 항체 용액(MoBiTech, Gottingen, 독일)의 100㎕ 및 0.5㎍/ml의 항-Fd 캡쳐 항체 용액의 100㎕를 갖는 제 2의 플레이트로 코팅하였고, 실온에서 2시간 동안 TPBS에서 1:2로 희석된 Chemiblock 용액(chemichon, International)으로 차단하였다. 파지 입자의 계단 희석(serial dilutiion)을 2시간 동안 상기 플레이트에 첨가하였다. TBST로 5회 세척한 후에, 캡쳐된 파지 입자를 항-M13-HRP 항체(항-g8p 특성, Amersham)를 통해 검출한 후 형광 검출(QuantaBlue, Pierce)을 실시하였다.
파지 입자 타이터는 공지된 입자 농도를 갖는 기준이 되는 파지 용액의 교정 곡선(calibration curve)으로부터 계산될 수 있다. 디스플레이 비율은, 공지된 항체 절편 디스플레이 비율과 함께, 정의된 기준이 되는 파지 입자의 조제로부터 계산되었다. 이러한 기준이 되는 파지 조제의 디스플레이 비율은 문헌[Johansen, L. K. 등 (1995)]에 따라 결정되었다.
상대적인 디스플레이 비율을 표 4에서 요약하였다. 본래의 pMORPH25의 디스플레이 비율을 100%로 맞추었다.
| 실험 1 | 실험 2 | 실험 3 | |
| pMORPH25 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| pMORPH25 버젼 A | 0,98 | 1,52 | |
| pMORPH25 버젼 B | 1,29 | 2,14 | 1,51 |
| pMORPH25 버젼 C | 1,25 | 1,67 | |
| pMORPH25 버젼 E | 2,57 |
살펴본 바와 같이, pMORPH25의 모든 4개의 유도체들은 pMORPH25 그 자체와 비교할 때 더 높은 상대적인 디스플레이 비율을 나타내었다. pMORPH25 버젼 E가 가장 높은 디스플레이 비율을 나타내었고, 그 값은 본래의 구조체인 pMORPH25에 비해 2.57배 증가된 디스플레이 비율을 나타내었다.
이러한 실험은, 양의 전하를 띤 아미노산 리신의 도입을 통해 달성되는 6개의-히스티딘 태그의 소실(消失)이 박테리오파지 입자상에 증가된 디스플레이 비율을 야기한다는 놀라운 결과를 나타낸다.
예 4 : 기능적인 디스플레이 비율
기능적인 디스플레이 비율은, 본 연구에서 사용된 특정 결합자에 대해 특이적인, 항원 결합자 ELISA 검사로 측정되었다.
1㎍의 재조합 단백질을, 4℃에서 12시간 동안 Maxisorp Nunc-Immuno 마이크로타이터 플레이트 상으로 코팅하였고, 실온에서 2시간 동안 5% 탈지 분유(skimmed milk powder)를 함유하는 PBS(J. M. Gabler Saliter GmbH & Co KG)로 차단하였다. 다양한 태그 구조체로부터 파지 조제를, 20 mM의 DTT의 존재 또는 부재 하에서, PBS, 5%의 탈지 분유 및 0.05%의 Tween 20에서 미리-배양하였다. 미리-차단된 박테리오파지 입자의 계단 희석을 코팅된 Maxisorp 웰에 첨가하였고, 2시간 동안 배양하였다. PBST 및 PBS로 세척한 후에, 남아있는 파지를 항-M13-HRP 컨쥬게이트(Amersham Pharmacia Biotech) 및 BM 블루 용해(Boehringer Mannheim)로 눈에 보이게 하였다.
제 1 세트의 대조군 실험에서, 25 mM DTT를 웰에 추가적으로 첨가하였다. 제 2 세트의 대조군 실험에서, 플레이트를 BSA만으로 코팅하였다. pMORPH25 버젼 A, B, 및 C에 대한 결과를 도 3에 나타내었고, pMORPH25 버젼 E에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.
기능적인 박테리오파지 입자는 테스트된 모든 구조체에 대해 확인되었다. pMORPH25 버젼 A는 표준의 pMORPH25 보다 약간 더 우수했다. pMORPH25의 버젼 B 및 C는 표준의 pMORPH25 보다 분명히 더 우수했다. 개개의 웰들이 웰 당 적어도 5e+08개의 박테리오파지 입자로 접종되는 경우에 가장 두드러진 차이가 있었다. pMORPH25 버젼 E의 기능적인 디스플레이 비율은 표준의 pMORPH25의 디스플레이 비율보다 약 4배 더 높다(도 4에서 화살표에 의해 지칭됨). 모든 대조군 측정, 즉 추가적인 25 mM DTT가 첨가된 웰 및 BSA로 코팅된 플레이트에 있는 웰은 배경상에 신호를 주지 않았다.
이러한 실험은, 양의 전하를 띤 아미노산 리신의 도입을 통해 달성되는 6개의-히스티딘 태그의 소실(消失)이, 박테리오파지 입자상에 증가된 디스플레이 비율을 야기하는 것 뿐만 아니라, 증가된 디스플레이 비율이 박테리오파지 입자의 기능적인 결합과 관련된다는 놀라운 결과를 나타낸다. 사실은, 기능적인 디스플레이 비율의 증가는 앞선 실험에서 측정되는 상대적인 디스플레이 비율의 증가보다 더 높다.
예 5 : 다양한 라이브러리의 디스플레이
이러한 실험은 변형된 태그 버젼에 의한 디스플레이 비율에서의 개선(표 4를 참고함)이 특정의 Fab 절편에 제한되는 것이 아니라, 다양한 Fab 절편 라이브러리에 일반적으로 적용될 수 있다는 것을 나타낸다. pMORPH25 버젼 E(C-말단 : -HKHKHKC)의 중쇄 절편을 함유하는 Fab 라이브러리의 상대적인 디스플레이 비율을 본래의 pMORPH23 벡터(C-말단 : -HHHHHHC)의 중쇄 절편을 함유하는 Fab 라이브러리와 비교하였다. 비교에 대한 표 3을 참고하라(pMORPH23 및 pMORPH25의 시스테인-태그 서열은 동일함). 실험 설정은 예 3에서 설명된 바와 같이 동일하였다. 결과를 도 9에 도시하였다.
살펴본 바와 같이, 본질적으로 본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 모든 프레임워크(framework)는 통상적인 벡터(세트 1)와 비교할 때 분명히 개선된 디스플레이 비율을 나타낸다. 나아가, 증가된 상대적인 디스플레이 비율이 람다(lambda) 및 카파(kappa) 사슬의 절편 둘 모두에서 관찰된다.
SEQUENCE LISTING
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<120> IMPROVED METHODS FOR THE FORMATION OF DISULPHIDE BONDS
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1 5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
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atgattacga atttctagta tacgagggca aaaaatgaaa aaactgctgt tcgcgattcc 120
gctggtggtg ccgttctata gccatagcga ctactgcgac atcgagtttg cagaaacagt 180
tgaaagttgt ttagcaaaac cccatacaga aaattcattt actaacgtct ggaaagacga 240
caaaacttta gatcgttacg ctaactatga gggctgtctg tggaatgcta caggcgttgt 300
agtttgtact ggtgacgaaa ctcagtgtta cggtacatgg gttcctattg ggcttgctat 360
ccctgaaaat gagggtggtg gctctgaggg tggcggttct gagggtggcg gctctgaggg 420
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tcttgaggag tctcagcctc ttaatacttt catgtttcag aataataggt tccgaaatag 600
gcagggggca ttaactgttt atacgggcac tgttactcaa ggcactgacc ccgttaaaac 660
ttattaccag tacactcctg tatcatcaaa agccatgtat gacgcttact ggaacggtaa 720
attcagagac tgcgctttcc attctggctt taatgaggat ccattcgttt gtgaatatca 780
aggccaatcg tctgacctgc ctcaacctcc tgtcaatgct ggcggcggct ctggtggtgg 840
ttctggtggc ggctctgagg gtggcggctc tgagggtggc ggttctgagg gtggcggctc 900
tgagggtggc ggttccggtg gcggctccgg ttccggtgat tttgattatg aaaaaatggc 960
aaacgctaat aagggggcta tgaccgaaaa tgccgatgaa aacgcgctac agtctgacgc 1020
taaaggcaaa cttgattctg tcgctactga ttacggtgct gctatcgatg gtttcattgg 1080
tgacgtttcc ggccttgcta atggtaatgg tgctactggt gattttgctg gctctaattc 1140
ccaaatggct caagtcggtg acggtgataa ttcaccttta atgaataatt tccgtcaata 1200
tttaccttct ttgcctcagt cggttgaatg tcgcccttat gtctttggcg ctggtaaacc 1260
atatgaattt tctattgatt gtgacaaaat aaacttattc cgtggtgtct ttgcgtttct 1320
tttatatgtt gccaccttta tgtatgtatt ttcgacgttt gctaacatac tgcgtaataa 1380
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aaaaacataa agtgtatgcg tgcgaagtga cccatcaagg tctgagcagc ccggtgacta 2100
aatcttttaa tcgtggcgag gcctgataag catgcgtagg agaaaataaa atgaaacaaa 2160
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aattggtgga aagcggcggc ggcctggtgc aaccgggcgg cagcctgcgt ctgagctgcg 2280
cggcctccgg atttaccttt tcttcttatg gtggtaattg ggtgcgccaa gcccctggga 2340
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cgaccaaagg tccaagcgtg tttccgctgg ctccgagcag caaaagcacc agcggcggca 2640
cggctgccct gggctgcctg gttaaagatt atttcccgga accagtcacc gtgagctgga 2700
acagcggggc gctgaccagc ggcgtgcata cctttccggc ggtgctgcaa agcagcggcc 2760
tgtatagcct gagcagcgtt gtgaccgtgc cgagcagcag cttaggcact cagacctata 2820
tttgcaacgt gaaccataaa ccgagcaaca ccaaagtgga taaaaaagtg gaaccgaaaa 2880
gcgaattccc aggggggagc ggaggcgcgc cgcaccatca tcaccatcac tgctgataag 2940
cttgacctgt gaagtgaaaa atggcgcaga ttgtgcgaca ttttttttgt ctgccgttta 3000
atgaaattgt aaacgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct 3060
cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg 3120
agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact 3180
ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacga gaaccatcac 3240
cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga 3300
gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga 3360
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cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg aaaacggtgt 4620
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<220>
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polynucleotide"
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Claims (57)
- 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에의 부착을 야기하거나 허용하는 단계를 포함하고,
상기 부착은 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 1의 시스테인 잔기 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합을 형성함으로써 야기되고,
상기 (폴리)펩티드/단백질 중 하나는 하나 이상의 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 이황화 결합을 형성하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은, 상기 야생형 (폴리)펩티드/단백질에서 대응되는 아미노산 위치에 존재하지 않은 것을 특징으로 하는 방법. - 제 4 항에 있어서,
8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 인공적으로 도입된 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은, 동일한 (폴리)펩티드/단백질 상에서 상기 시스테인 잔기에 인접한 10개의 아미노산 내에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 6 항에 있어서,
8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은, 동일한 (폴리)펩티드/단백질 상에서 상기 시스테인 잔기에 인접한 5개의 아미노산 내에 포함되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1의 시스테인 잔기는 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 N-말단 또는 C-말단에, 또는 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 N-말단 또는 C-말단의 근처에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 8 항에 있어서,
상기 제 1의 시스테인 잔기는 N-말단 또는 C-말단의 시스테인 잔기인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 2의 시스테인 잔기는 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 N-말단 또는 C-말단에, 또는 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 N-말단 또는 C-말단의 근처에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 10 항에 있어서,
상기 제 2의 시스테인 잔기는 N-말단 또는 C-말단의 시스테인 잔기인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 박테리오파지 입자의 표면 상에 디스플레이되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 제 1의 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 적당한 숙주 세포에서 발현되고 조립되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 이황화 결합은 숙주 세포의 주변 세포질 공간에서 형성되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 이황화 결합은 분자간의 이황화 결합인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 리신 및 아르기닌으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 16 항에 있어서,
상기 아미노산은 리신인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 상이한 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은 박테리오파지 입자의 단백질 피막의 구성성분인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 단백질 피막의 구성성분은 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 절단된 변이(truncated variant)이고, 상기 절단된 변이는 상기 야생형 피막 단백질 중 적어도 일부분을 포함하여 상기 박테리오파지 입자의 단백질 피막으로 상기 피막 단백질이 편입되는 것을 야기하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 단백질 피막의 구성성분은 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이(modified variant)이고, 상기 변형된 변이는 상기 박테리오파지 입자의 단백질 피막으로 편입될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질에서 대응되는 아미노산 위치에 존재하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 19 항에 있어서,
상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질에서 대응되는 아미노산 위치에 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 23 항에 있어서,
상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질로 인공적으로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 20 항에 있어서,
상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 절단된 변이로 인공적으로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 21 항에 있어서,
상기 제 1의 시스테인 잔기는 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이로 인공적으로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 박테리오파지 입자는 섬유상(filamentous) 박테리오파지의 박테리오파지 입자인 것을 특징으로 하는 방법. - 제 19 항에 있어서,
박테리오파지 입자의 상기 단백질 피막의 구성성분은 상기 야생형 피막 단백질 pIII이거나, 또는 상기 야생형 피막 단백질 pIII로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 19 항에 있어서,
박테리오파지 입자의 상기 단백질 피막의 구성성분은 상기 야생형 피막 단백질 pIX이거나, 또는 상기 야생형 피막 단백질 pIX로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 상기 제 2의 시스테인 잔기는 야생형의 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에서 대응되는 아미노산 위치에 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 30 항에 있어서,
상기 제 2의 시스테인 잔기는 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질로 인공적으로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 32 항에 있어서,
상기 기능적인 절편은 scFv 또는 Fab 절편인 것을 특징으로 하는 방법. - 박테리오파지 입자의 표면상에 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
단백질 피막의 구성성분으로 발현한 후 상기 (폴리)펩티드/단백질의 부착을 야기하거나 허용하는 단계를 포함하고,
상기 부착은 상기 단백질 피막의 구성성분에 포함되는 제 1의 시스테인 잔기 및 상기 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합을 형성함으로써 야기되고,
상기 (폴리)펩티드/단백질 또는 상기 단백질 피막의 구성성분은 상기 제 1의 또는 제 2의 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 박테리오파지의 야생형 피막 단백질의 변형된 변이를 인코딩(encoding)하는 핵산 서열에 있어서,
상기 변형된 변이는,
(a) 박테리오파지의 상기 야생형 피막 단백질 중 하나 이상의 부분들(상기 부분들 중 하나는 상기 파지 피막으로의 상기 피막 단백질의 편입을 야기하거나 허용하는 적어도 일부분을 포함함);
(b) 제 1의 시스테인 잔기; 및
(c) 상기 제 1의 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열. - 변형된 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편을 인코딩하는 핵산 서열에 있어서,
상기 변형된 면역글로불린 또는 기능적인 절편은,
(a) 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편;
(b) 시스테인 잔기; 및
(c) 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열. - 제 36 항에 있어서,
변형된 면역글로불린의 상기 기능적인 절편은 scFv 또는 Fab 절편인 것을 특징으로 하는 핵산 서열. - 제 35 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵산 서열은 정제 및/또는 검출 목적을 위해 하나 이상의 펩티드 서열을 더 인코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산 서열. - 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
- 제 39 항에 있어서,
제 2의 시스테인 잔기를 포함하는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터. - 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열, 또는 제 39 항 또는 제 40 항의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제 39 항에 따른 벡터 및 제 2의 시스테인 잔기를 포함하는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 제 2의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제 35 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열, 제 39 항 또는 제 40 항의 벡터에 의해 인코딩되거나, 또는 제 41 항 또는 제 42 항의 숙주 세포에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 (폴리)펩티드/단백질.
- 제 34 항의 방법에 의해 수득될 수 있는, 박테리오파지 입자의 표면상에 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이하는 것을 특징으로 하는 박테리오파지 입자.
- 제 44 항에 있어서,
상기 (폴리)펩티드/단백질은 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편인 것을 특징으로 하는 박테리오파지 입자. - 제 44 항 또는 제 45 항에 따른 박테리오파지 입자의 다양한 집합물에 있어서,
각각의 상기 박테리오파지 입자는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 다양한 집합물 밖의 제 2의 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이하는 것을 특징으로 하는 집합물. - 원하는 성질을 갖는 (폴리)펩티드/단백질을 수득하는 방법에 있어서,
상기 방법은,
(a) 제 46 항의 박테리오파지 입자의 다양한 집합물을 제공하는 단계; 및
(b) 원하는 성질을 갖는 (폴리)펩티드/단백질을 디스플레이하는 하나 이상의 박테리오파지 입자를 수득하기 위해, 상기 다양한 집합물을 스크리닝(screening)하거나, 그리고/또는 상기 다양한 집합물로부터 선택하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 47 항에 있어서,
상기 단계 (b)는,
(ba) 박테리오파지 입자의 상기 다양한 집합물을 대상이 되는 표적과 접촉시키는 단계;
(bb) 상기 대상이 되는 표적에 결합하지 않은 박테리오파지 입자를 용리시키는 단계; 및
(bc) 환원 조건하에서, 단계 (ba)에서 형성된 대상이 되는 표적과 상기 표적에 결합한 박테리오파지의 복합체를 처리함으로써 상기 대상이 되는 표적에 결합한 박테리오파지를 용리시키는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제 47 항 또는 제 48 항에 있어서,
상기 원하는 성질은, 대상이 되는 표적에의 결합, 대상이 되는 표적을 억제, 대상이 되는 표적을 차단, 표적-매개된 반응의 활성 또는 효소 활성인 것을 특징으로 하는 방법. - (a) 제 1의 시스테인 잔기를 포함하는 제 1의 (폴리)펩티드/단백질; 및
(b) 제 2의 시스테인 잔기를 포함하는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질;을 포함하고,
상기 (폴리)펩티드/단백질 중 하나는 하나 이상의 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 더 포함하고,
상기 제 1의 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 상기 시스테인 잔기를 통해 이황화 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는 복합체. - 제 49 항에 있어서,
상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 복수의 박테리오파지 입자들의 다양한 집합물 상에 디스플레이되는 제 2의 (폴리)펩티드/단백질의 다양한 집합물의 구성성분인 것을 특징으로 하는 복합체. - 제 49 항에 있어서,
상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질은 파지 피막 단백질인 것을 특징으로 하는 복합체. - 제 49 항에 있어서,
상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질은 면역글로불린 또는 이들의 기능적인 절편을 포함하는 것을 특징으로 하는 복합체. - 제 53 항에 있어서,
상기 기능적인 절편은 scFv 또는 Fab 절편인 것을 특징으로 하는 복합체. - 제 49 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 따른 복합체를 포함하는 숙주 세포.
- 제 1의 (폴리)펩티드/단백질의 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에의 부착을 야기하거나 허용하는 단계를 포함하며,
상기 부착은 상기 제 1의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 1의 시스테인 잔기 및 상기 제 2의 (폴리)펩티드/단백질에 포함되는 제 2의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합을 형성함으로써 야기되고,
상기 (폴리)펩티드/단백질 중 하나는 8 초과의 pl값을 갖는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 이황화 결합을 형성하는 방법. - 제 56 항에 있어서,
8 초과의 pl값을 갖는 상기 아미노산은 하나 이상의 상기 시스테인 잔기의 반응성을 높이도록 영향을 주는 것을 특징으로 하는 방법.
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