CN101772574A - 改良的用于二硫键形成的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子间二硫键的形成方法，包括这些方法中使用的(多)肽/蛋白质、核酸、载体、宿主细胞和噬菌体。此外，本发明涉及该方法用于改良(多)肽/蛋白质在噬菌体颗粒的表面上的展示的用途。
Description
本说明书通篇引用了许多文献。这些文献的公开内容通过引用其整体在此并入。
发明背景
1985年，Smith首次证实丝状噬菌体耐受外源蛋白质片段插入到它们的基因III蛋白(pIII)，且能够显示出，该蛋白质片段存在于噬菌体表面(Smith，1985)。Ladner将这一概念延伸至噬菌体颗粒的表面上展示的(多)肽库和/或蛋白质库的筛选(WO 88/06630；WO 90/02809)。自此，噬菌体展示经历了显著地进步，并获得大量的成果。
已开发了多种形式以构建和筛选(多)肽/蛋白质噬菌体展示文库，并且许多综述型文章和专论涵盖并总结了这些发展(例如Kay等人，1996；Dunn，1996；McGregor，1996)。最常见地是，已经使用基于丝状噬菌体的系统。
最初提供为单链Fv(scFv)片段的展示(WO 88/06630；还参见WO92/01047)，该方法已经迅速延伸至其他(多)肽/蛋白质的展示，包括诸如Fab片段(WO 91/17271；WO 92/01047)的多亚基蛋白的展示，所述其他(多)肽/蛋白质诸如牛胰胰蛋白酶抑制剂(BPTI)(WO 90/02809)、肽文库(WO 91/19818)、人类生长激素(WO 92/09690)和多种其他蛋白质。
为了将(多)肽/蛋白质锚定于丝状噬菌体表面，主要使用噬菌体的外壳蛋白的基因融合物。优选的是与基因III蛋白(Parmley & Smith，1988)或其片段(Bass等人，1990)，以及基因VIII蛋白(Greenwood等人，1991)的融合物。在一种情况下，使用了基因VI(Jespers等人，1995)，且在一种情况下，已将基因VII和基因IX的组合用于Fv片段的展示(Gao等人，1999)。
此外，还在噬菌体λ上实现噬菌体展示。在此情况下，使用了基因V蛋白(Maruyama等人，1994)、基因J蛋白和基因D蛋白(Sternberg & Hoess，1995；Mikawa等人，1996)。
除了使用基因融合物之外，外源肽或蛋白质已经由相关结构域连接于噬菌体表面。在WO 91/17271中，其建议使用噬菌体上展示的标签和融合于待展示的(多)肽/蛋白质的标签结合的配体以实现非共价展示。
实行类似的概念用于cDNA文库的展示(Crameri & Suter，1993)。其中，jun/fos相互作用用于调节cDNA片段的展示。在它们的构建体中，位于jun以及fos的全部末端的侧翼的额外半胱氨酸残基通过形成两个二硫键而进一步稳定该相互作用。
过去，一个问题是如何最佳地恢复已经结合于所需靶的噬菌体。通常，这是通过用合适的缓冲液洗脱，无论通过使用pH或盐梯度，或通过使用可溶的靶的特定洗脱来实现。然而，以高亲和力结合于靶的最感兴趣的结合子通过该方法可能脱去。已描述了几种可选的方法，其试图克服该问题，其通过在所展示的(多)肽/蛋白质和其融合配偶体之间，或在感兴趣的靶和将该靶锚定于固体表面的它的载体之间提供切割信号。此外，上文涉及的方法中的大多数需要使用包括至少部分的噬菌体外壳蛋白和外源(多)肽/蛋白质的融合蛋白。
在WO 01/05909中，描述了完全不同的系统，其不需要融合蛋白，且因此解决了这些问题中的许多问题。描述于WO 01/05909的称为“CysDisplay”的系统是基于噬菌体外壳蛋白和免疫球蛋白或其功能片段之间的共价二硫键的形成。免疫球蛋白或其功能片段展示于噬菌体颗粒的表面上。随后，在WO 03/060065中公开了相似的技术。WO 03/060065不同于WO 01/05909的是，加Cys标签的pIII多肽是经改良的辅助噬菌体而非噬菌粒来提供。此外，WO 03/060065还提到了可用于在噬菌体颗粒上展示(多)肽/蛋白质的其他适配子，诸如同源多亚基蛋白(PDGF、Max、ReIA、神经营养蛋白)和异源多亚基蛋白(蛋白质k激酶复合体、含SH2-结构域的蛋白质(SH2-domain conating protein)、aPaI/Max、Hox/Pbx)。
尽管CysDisplay系统具有良好的功能，但在噬菌体颗粒上展示出较高量的(多)肽/蛋白质的系统在某些情况下可能是有利的，例如，这种具有提高的展示速率，特别是提高的功能展示速率的改良的系统，将确定是有益的，且能够更加方便地、可靠地和特定地分离结合子，特别是以高亲和力结合于它们的靶的结合子。
Snyder等人，1981通过用2-硝基苯甲酸处理来研究天然存在的蛋白质的肽的活性半胱氨酸残基的局部环境，并观察到由带正电的氨基酸包围的半胱氨酸残基显示出较高反应性。在继续研究中，Snyder等人，1983研究了二硫键形成的动力学，并得出基本相同的结论。Bulaj等人，1998研究了16种模型肽与不同的非蛋白质分子形成二硫键的能力的动力学。它们观察到肽和非蛋白质试剂上存在静电荷对反应性具有影响。Britto等人，2002研究了微管蛋白中分子内二硫键的静电环境，并发现最具活性的半胱氨酸残基在6.5埃带正电的残基中，可能促进硫醇解离成硫醇盐阴离子。Hansen等人，2005研究了工程YFP的分子内二硫键，并发现如果带正电的氨基酸存在于活性半胱氨酸残基的附近，则反应性增加。Albrecht等人，2006报道了经半胱氨酸残基连接于PEG的单一特异性多价Fab的产生。
然而，以上的研究中没有描述其中在第一(多)肽/蛋白质和不同的第二(多)肽/蛋白质之间形成分子间二硫键的系统。特别地，在这些研究中，没有在宿主细胞的周质间隙中形成这种二硫键。此外，在引用的研究中，没有展示于噬菌体颗粒的表面上的(多)肽/蛋白质。
发明概述
因此，本发明提供了用于在包含于第一(多)肽/蛋白质中的第一半胱氨酸残基和包含于第二(多)肽/蛋白质(优选不同的(多)肽/蛋白质)中的第二半胱氨酸残基之间形成二硫键的改良的方法。所述改良应该优选引起所述半胱氨酸残基的较高反应性，由此提供提高的展示速率，特别是提高的功能展示速率。
通过提供在权利要求中表征的实施方案，实现对这一技术问题的解决方法。该技术解决方法解决根本的问题，并形成本发明的基础，即在空间背景中将带正电的氨基酸引入活性半胱氨酸残基，该解决方法在现有技术中即未提供，也未建议。
在特定的实施方案中，本发明提供了用于(多)肽/蛋白质在噬菌体颗粒的表面上展示，且不需要使用与噬菌体外壳蛋白的融合蛋白的改良的系统。所述半胱氨酸残基的较高反应性因此引起较高的展示速率，特别是较高的功能展示速率。
因此，本发明特别提供了筛选在噬菌体颗粒的表面上展示的(多)肽/蛋白质的巨大文库的改良的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了形成二硫键的方法，其包括：引起或使得第一(多)肽/蛋白质连接于第二(多)肽/蛋白质，其中所述连接是通过在包含于所述第一(多)肽/蛋白质中的第一半胱氨酸残基和包含于所述第二(多)肽/蛋白质中的第二半胱氨酸残基之间形成二硫键而引起，其中所述(多)肽/蛋白质之一包括具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述半胱氨酸残基中的至少一个的反应性。所述具有大于8的pI的氨基酸可包含于所述第一(多)肽/蛋白质或所述第二(多)肽/蛋白质中。所述具有大于8的pI的氨基酸可能不存在于所述野生型(多)肽/蛋白质中对应的氨基酸位置。所述具有大于8的pI的氨基酸可能已被人工地引入。所述具有大于8的pI的氨基酸可被包含在相同(多)肽/蛋白质上的半胱氨酸残基邻接的10个氨基酸内，优选地在相同(多)肽/蛋白质上的半胱氨酸残基邻接的5个氨基酸内。所述第一半胱氨酸残基可存在于或邻近所述第一(多)肽/蛋白质的N-末端或C-末端。所述第一半胱氨酸残基还可以是N-末端半胱氨酸残基或C-末端半胱氨酸残基。所述第二半胱氨酸残基可存在于或邻近所述第二(多)肽/蛋白质的N-末端或C-末端。所述第二半胱氨酸残基还可以是N-末端半胱氨酸残基或C-末端半胱氨酸残基。所述第二(多)肽/蛋白质可展示于噬菌体颗粒的表面上。所述第一(多)肽/蛋白质和所述第二(多)肽/蛋白质可在合适的宿主细胞中表达和装配。所述二硫键可在宿主细胞的周质间隙中形成。所述二硫键可以是分子间二硫键。所述具有大于8的pI的氨基酸可选自赖氨酸和精氨酸，优选赖氨酸。所述第一(多)肽/蛋白质和所述第二(多)肽/蛋白质可能是不同的。所述第一(多)肽/蛋白质可能是噬菌体颗粒的蛋白质外壳的成员。所述蛋白质外壳的成员可能是噬菌体的野生型外壳蛋白的截短的变体，其中所述截短的变体包括至少引起所述外壳蛋白并入噬菌体颗粒的蛋白质外壳的所述野生型外壳蛋白的那一部分。所述蛋白质外壳的成员可以是噬菌体的野生型外壳蛋白的修饰的变体，其中所述修饰的变体能够并入到噬菌体颗粒的蛋白质外壳。包含于所述第一(多)肽/蛋白质中的所述第一半胱氨酸残基可存在于噬菌体的野生型外壳蛋白中的对应氨基酸位置。包含于所述第一(多)肽/蛋白质中的所述第一半胱氨酸残基可不存在于噬菌体的野生型外壳蛋白中的对应氨基酸位置。所述第一半胱氨酸残基可能已被人工地引入噬菌体的野生型外壳蛋白。所述第一半胱氨酸残基可能已被人工地引入噬菌体的野生型外壳蛋白的截短的变体。所述第一半胱氨酸残基可能已被人工地引入噬菌体的野生型外壳蛋白的修饰的变体。所述噬菌体颗粒可以是丝状噬菌体的噬菌体颗粒。所述噬菌体颗粒的蛋白质外壳的成员可以是野生型外壳蛋白pIII，或可以衍生自野生型外壳蛋白pIII。所述噬菌体颗粒的蛋白质外壳的成员可以是野生型外壳蛋白pIX，或可以衍生自野生型外壳蛋白pIX。包含于所述第二(多)肽/蛋白质中的所述第二半胱氨酸残基可不存在于所述第二(多)肽/蛋白质的野生型中的对应氨基酸位置。所述第二半胱氨酸残基可能已被人工地引入所述第二(多)肽/蛋白质。所述第二(多)肽/蛋白质可包括免疫球蛋白或其功能片段。所述功能片段可以是scFv或Fab片段。
在某些实施方案中，本发明提供了在噬菌体颗粒的表面上展示第二(多)肽/蛋白质的方法，其包括：引起或使得所述(多)肽/蛋白质在表达后连接于蛋白质外壳的成员，其中所述连接是通过在包含于所述蛋白质外壳的成员中的第一半胱氨酸残基和包含于所述(多)肽/蛋白质中的第二半胱氨酸残基之间形成二硫键而引起，其中所述(多)肽/蛋白质或所述蛋白质外壳的成员包括具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述第一半胱氨酸残基或所述第二半胱氨酸残基的反应性。
在某些实施方案中，本发明提供了编码噬菌体的野生型外壳蛋白的修饰的变体的核酸序列，其中所述修饰的变体包括：
(a)所述噬菌体的野生型外壳蛋白的一个或多个部分，其中所述部分之一包括至少引起或使得所述外壳蛋白并入噬菌体外壳的那一部分。
(b)第一半胱氨酸残基，以及
(c)具有大于8的pI的氨基酸，其积极地影响所述第一半胱氨酸残基的反应性。
在某些实施方案中，本发明提供了编码修饰的免疫球蛋白或其功能片段的核酸序列，其中所述修饰的免疫球蛋白或功能片段包括：
(a)免疫球蛋白或其功能片段，
(b)半胱氨酸残基，以及
具有大于8的pI的氨基酸，其积极地影响所述半胱氨酸残基的反应性。所述修饰的免疫球蛋白的功能片段可以是scFv或Fab片段。
任何以上提到的核酸序列还可编码用于纯化和/或检测目的的一种或多种肽序列。
在某些实施方案中，本发明提供了包含任何以上提到的核酸序列的载体。所述载体还可包括编码第二(多)肽/蛋白质的一种或多种核酸序列，所述第二(多)肽/蛋白质包括第二半胱氨酸残基。
在某些实施方案中，本发明提供了包含任何以上提到的核酸序列或载体的宿主细胞。所述宿主细胞可包括第二载体，所述第二载体包括编码第二(多)肽/蛋白质的一种或多种核酸序列，所述第二(多)肽/蛋白质包括第二半胱氨酸残基。
在某些实施方案中，本发明提供了由任何以上提到的核酸序列编码的(多)肽/蛋白质、由任何以上提到的载体编码的(多)肽/蛋白质或由任何以上提到的宿主细胞产生的(多)肽/蛋白质。
在某些实施方案中，本发明提供了以上提到的方法可获得的在其表面上展示(多)肽/蛋白质的噬菌体颗粒。在所述噬菌体颗粒上展示的所述(多)肽/蛋白质可以是免疫球蛋白或其功能片段。
在某些实施方案中，本发明提供了如上文提到的噬菌体颗粒的不同集合，其中所述噬菌体颗粒中的每一个展示出第二(多)肽/蛋白质的不同集合中的第二(多)肽/蛋白质。
在某些实施方案中，本发明提供了获得具有所需性质的(多)肽/蛋白质的方法，其包括：
(a)提供如上文描述的噬菌体颗粒的不同集合，以及
(b)筛选所述不同集合和/或从所述不同集合中选择以获得至少一种展示具有所需性质的(多)肽/蛋白质的噬菌体颗粒。所述方法的步骤(b)还可包括：
(ba)使所述噬菌体颗粒的不同集合与感兴趣的靶接触；
(bb)洗脱没有结合于所感兴趣的靶的噬菌体颗粒；以及
(bc)通过在还原条件下处理在步骤(ba)下形成的感兴趣的靶与结合于所述感兴趣的靶的噬菌体的复合体，来洗脱结合于感兴趣的靶的噬菌体颗粒。所述所需的性质可以是对感兴趣的靶的结合、抑制感兴趣的靶、阻断感兴趣的靶、活化靶介导的反应或酶促活性。
在某些实施方案中，本发明提供了一种复合体，其包括
第一(多)肽/蛋白质，其包括第一半胱氨酸残基，以及
第二(多)肽/蛋白质，其包括第二半胱氨酸残基，
其中所述(多)肽/蛋白质之一还包括具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述半胱氨酸残基中的至少一个的反应性，且其中所述第一(多)肽/蛋白质和所述第二(多)肽/蛋白质经所述半胱氨酸残基形成二硫键。所述第二(多)肽/蛋白质可以是展示于多个噬菌体颗粒的不同集合上的第二(多)肽/蛋白质的不同集合的成员。所述第一(多)肽/蛋白质可以是噬菌体外壳蛋白。所述第二(多)肽/蛋白质可包括免疫球蛋白或其功能片段。所述功能片段可以是scFv或Fab片段。
在某些实施方案中，本发明提供了包含任何以上提到的复合体的宿主细胞。
在某些实施方案中，本发明提供了形成二硫键的方法，其包括：引起或使得第一(多)肽/蛋白质连接于第二(多)肽/蛋白质，其中所述连接是通过在包含于所述第一(多)肽/蛋白质中的第一半胱氨酸残基与包含于所述第二(多)肽/蛋白质中的第二半胱氨酸残基之间形成二硫键而引起，其中所述(多)肽/蛋白质之一包括具有大于8的pI的氨基酸。所述具有大于8的pI的氨基酸可积极地影响所述半胱氨酸残基中的至少一个的反应性。
发明详述
“二硫键”是由两个硫醇基的反应形成的共价键。二硫键在(多)肽和蛋白质的折叠和稳定性中起重要作用。分泌了许多具有二硫键的蛋白质。许多细胞区室是还原环境，且二硫键在胞质溶胶中一般是不稳定的。(多)肽和蛋白质中的二硫键通常在半胱氨酸残基的硫醇基之间形成，其中两个半胱氨酸残基的氧化形成共价二硫键。二硫键可以是分子内或分子之间的键。在原核生物中，二硫键优选地在周质的氧化环境中形成。在真核细胞中，二硫键通常在内质网的氧化环境中形成，而不是在胞质溶胶的还原环境中(除了具有起氧化传感器作用的半胱氨酸残基的一些胞质溶胶蛋白之外)。二硫键最常见于分泌蛋白、溶酶体蛋白和膜蛋白的外质结构域。二硫键还在橡胶的硫化中起重要作用。
“pI”或“等电点”是分子或表面不带静电荷的pH。为了具有明显的等电点，分子(或表面)必须是两性的，即其必须具有酸性和碱性官能团。蛋白质和氨基酸是满足这一需要的分子。二十种天然存在的氨基酸的pI列于表1。然而，非天然存在的氨基酸也可用于实践本发明的方法。
表1：二十种天然存在的氨基酸的等电点(pI)(以pI增加为序)。
| 氨基酸 | 等电点(pI) |
| 天冬氨酸 | 2.77 |
| 谷氨酸 | 3.22 |
| 半胱氨酸 | 5.02 |
| 氨基酸 | 等电点(pI) |
| 天冬酰胺 | 5.41 |
| 苯丙氨酸 | 5.48 |
| 苏氨酸 | 5.64 |
| 谷氨酰胺 | 5.65 |
| 酪氨酸 | 5.66 |
| 丝氨酸 | 5.68 |
| 甲硫氨酸 | 5.74 |
| 色氨酸 | 5.89 |
| 异亮氨酸 | 5.94 |
| 缬氨酸 | 5.96 |
| 甘氨酸 | 5.97 |
| 亮氨酸 | 5.98 |
| 丙氨酸 | 6.00 |
| 脯氨酸 | 6.30 |
| 组氨酸 | 7.47 |
| 赖氨酸 | 9.59 |
| 精氨酸 | 11.15 |
对于仅具有一个氨基基团和一个羧基基团的氨基酸，可由该分子的pKa计算pI。对于具有多于两个可离子化的基团的氨基酸，诸如赖氨酸，那两个pKa用于计算pI，其从氨基酸的中性形式失去或获得电荷。各种计算为本领域技术人员所知，且可参见任何生物化学教科书[例如Nelson DL，Cox MM(2004).Lehninger Principles of Biochemistry(生物化学的Lehninger原理).W.H.Freeman；第4版]。
蛋白质可根据它们的pI，经等电点聚焦分离。在低于pI的pH下，蛋白质带静正电荷。在pI之上，蛋白质带静负电荷。电泳凝胶的pH通过用于此凝胶的缓冲液确定。如果缓冲液的pH是在运行的蛋白质的pI之上，则该蛋白质将迁移至正极(负电荷被吸引至正极)。如果缓冲液的pH是在运行的蛋白质的pI之下，则该蛋白质将迁移至凝胶的负极(正电荷被吸引至负极)。如果蛋白质用pH等于pI的缓冲液运行，其将根本不迁移。这对个体氨基酸也是事实。
在优选的实施方案中，本发明的第一(多)肽/蛋白质和/或第二(多)肽/蛋白质包括具有大于8的pI的氨基酸。在其他优选的实施方案中，所述第一(多)肽/蛋白质和/或第二(多)肽/蛋白质包括具有大于9、大于10或大于11的pI的氨基酸。在其他优选的实施方案中，所述具有大于8、大于9、大于10或大于11的pI的氨基酸存在于第一(多)肽/蛋白质。在可选的优选的实施方案中，所述具有大于8、大于9、大于10或大于11的pI的氨基酸存在于第二(多)肽/蛋白质。在其他优选的实施方案中，所述具有大于8的pI的氨基酸选自赖氨酸和精氨酸。在某些优选的实施方案中，所述氨基酸是赖氨酸。在可选的优选的实施方案中，所述氨基酸是精氨酸。
在某些优选的实施方案中，本发明的第一(多)肽/蛋白质包括多于一个具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述半胱氨酸残基中的至少一个的反应性。在可选的优选的实施方案中，本发明的第二(多)肽/蛋白质包括多于一个具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述半胱氨酸残基中的至少一个的反应性。在一些实施方案中，所述第一(多)肽/蛋白质和/或所述第二(多)肽/蛋白质包括至少2个、至少3个、至少4个或至少5个具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述半胱氨酸残基中的至少一个的反应性。
在更进一步的实施方案中，直接邻接于所述具有大于8的pI的氨基酸的氨基酸残基是组氨酸残基。在某些实施方案中，直接至所述具有大于8的pI的氨基酸的N-末端的氨基酸残基是组氨酸残基。在其他的实施方案中，直接至所述具有大于8的pI的氨基酸的C-末端的氨基酸残基是组氨酸残基。在另外其他的实施方案中，直接至所述具有大于8的pI的氨基酸的N-末端的氨基酸残基和直接至所述具有大于8的pI的氨基酸的C-末端的氨基酸残基两者都是组氨酸残基。进一步优选的直接邻接于所述具有大于8的pI的氨基酸的多肽的一段序列是长度为3、4、5、6、7或8个组氨酸残基的多肽，其中至少一个组氨酸残基用具有大于8的pI的氨基酸(优选赖氨酸)代替。最优选的直接邻接于所述具有大于8的pI的氨基酸的多肽的一段序列是长度为6个组氨酸残基的多肽，其中1、2或3个组氨酸残基用具有大于8的pI的氨基酸(优选赖氨酸)代替。特别优选直接邻接于所述具有大于8的pI的氨基酸的以下多肽：HHHHHH、HHHKHH、HHHHHK、HKHKHK(所有氨基酸是以单字母密码，即H＝组氨酸，K＝赖氨酸)。在某一实施方案中，包含在所述第一(多)肽/蛋白质和/或第二(多)肽/蛋白质中的第一半胱氨酸残基和/或第二半胱氨酸残基直接至组氨酸残基的这段序列的C-末端，其中至少一个组氨酸残基用具有大于8的pI的氨基酸(优选赖氨酸)代替。
在其他的实施方案中，包含在所述第一(多)肽/蛋白质和/或第二(多)肽/蛋白质中的第一半胱氨酸残基和/或第二半胱氨酸残基直接至3、4、5、6、7或8个组氨酸残基的一段序列的C-末端，且直接至具有大于8的pI的氨基酸(优选赖氨酸)的N-末端。任选地，直接至包含在所述第一(多)肽/蛋白质和/或第二(多)肽/蛋白质中的第一半胱氨酸残基和/或第二半胱氨酸残基的N-末端的组氨酸残基之一用具有大于8的pI的氨基酸(优选赖氨酸)额外地代替。
如本发明的上下文中所用，术语“积极地影响反应性”指如下情况：其中两个硫醇基反应以形成二硫键的反应的平衡被移动至产物一侧，即与已知系统，诸如例如WO 01/05909中描述的“CysDisplay”系统比较，形成较大量的二硫键。按照WO 01/05909和本发明所描述，可容易地检测和测量各个硫醇基的反应性。如下文所描述，相对展示速率或功能展示速率可以是合适的测试系统。根据本发明，这种平衡的移动经存在于反应物之一(即第一(多)肽/蛋白质或第二(多)肽/蛋白质)的具有大于8的pI的氨基酸实现。所述具有大于8的pI的氨基酸以一种方式空间地位于包含在第一(多)肽/蛋白质中的第一半胱氨酸残基或包含在第二(多)肽/蛋白质中的第二半胱氨酸残基的附近，使得其可影响这种平衡的移动。
在一些实施方案中，所述具有大于8的pI的氨基酸位于直接邻接所述第一半胱氨酸残基或所述第二半胱氨酸残基的10个氨基酸内，优选8个氨基酸内，更优选6个氨基酸内，且最优选5个氨基酸内。在某些实施方案中，所述具有大于8的pI的氨基酸存在于所述第一半胱氨酸残基或所述第二半胱氨酸残基的N-末端。在其他的实施方案中，所述具有大于8的pI的氨基酸存在于所述第一半胱氨酸残基或所述第二半胱氨酸残基的C-末端。
在其他的实施方案中，所述具有大于8的pI的氨基酸位于距离包含在所述第一(多)肽/蛋白质或第二(多)肽/蛋白质中的第一半胱氨酸残基或第二半胱氨酸残基超过10个氨基酸处，但所述第一(多)肽/蛋白质或第二(多)肽/蛋白质具有三维结构，以致使得所述具有大于8的pI的氨基酸与所述第一半胱氨酸残基或所述第二半胱氨酸残基在空间上接近。具有大于8的pI的氨基酸和由所述氨基酸影响的半胱氨酸残基可包含在相同的(多)肽/蛋白质上，例如在相同(多)肽/蛋白质的不同结构域上。可选地，具有大于8的pI的氨基酸和由所述氨基酸影响的半胱氨酸残基可包含在不同的(多)肽/蛋白质上，例如具有大于8的pI的氨基酸在第一(多)肽/蛋白质上，且由所述氨基酸影响的半胱氨酸残基在第二(多)肽/蛋白质上，或反之亦然。在这种情况下，包含在一个(多)肽/蛋白质上的具有大于8的pI的氨基酸积极地影响包含在其他(多)肽/蛋白质上的第二半胱氨酸残基的反应性。本领域技术人员将了解，可选择给定(多)肽/蛋白质中的何种氨基酸位置以引入积极地影响半胱氨酸残基的反应性的具有大于8的pI的氨基酸。用于确定(多)肽/蛋白质的三维结构的多种技术是已知的，诸如X射线衍射晶体分析法或NMR技术。此外，许多(多)肽/蛋白质的三维结构是已经获得的，使得容易选择合适的氨基酸位置。特别地，多种免疫球蛋白或功能片段，诸如scFv或Fab片段的三维结构是经多种数据库，诸如PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)或PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝Structure)公众可得的。
在本发明的上下文中，术语“噬菌体”指细菌病毒，其形成由含有噬菌体复制所需的核酸的蛋白质外壳组成的包装。核酸可以是DNA或RNA，其为双链或单链，线状或环状。诸如噬菌体λ或丝状噬菌体(诸如M13、fd或f1)的噬菌体为本领域普通技术人员所公知。在某些实施方案中，优选丝状噬菌体。在本发明的上下文中，术语“噬菌体颗粒”指根据本发明的颗粒，即指经二硫键展示(多)肽/蛋白质的颗粒。在某些实施方案中，优选丝状噬菌体的噬菌体颗粒。
在噬菌体的装配期间，外壳蛋白可包装不同的核酸序列，条件是它们包括包装信号。在本发明的上下文中，术语包含在噬菌体或噬菌体颗粒中的“核酸序列”指具有在噬菌体或噬菌体颗粒装配期间被噬菌体外壳蛋白包装的能力的核酸序列或载体。优选地，所述核酸序列或载体衍生自天然存在的噬菌体的基因组，且例如在丝状噬菌体的情况下，包括噬菌体和噬菌粒载体。后者是质粒，其除了含有质粒特征之外，还含有包装信号和复制的噬菌体源。
在某些实施方案中，所述第一(多)肽/蛋白质或所述第二(多)肽/蛋白质展示在噬菌体颗粒的表面上。在优选的实施方案中，所述第二(多)肽/蛋白质展示在噬菌体颗粒的表面上。在可选的实施方案中，所述第一(多)肽/蛋白质展示在噬菌体颗粒的表面上。优选的是丝状噬菌体颗粒。
在某些实施方案中，所述第一(多)肽/蛋白质或所述第二(多)肽/蛋白质是噬菌体颗粒的蛋白质外壳的成员。在优选的实施方案中，所述第一(多)肽/蛋白质是噬菌体颗粒的蛋白质外壳的成员。在可选的实施方案中，所述第二(多)肽/蛋白质是噬菌体颗粒的蛋白质外壳的成员。在优选的实施方案中，所述噬菌体颗粒的蛋白质外壳的成员是野生型外壳蛋白pIII，或衍生自野生型外壳蛋白pIII。在其他的实施方案中，所述噬菌体颗粒的蛋白质外壳的成员是野生型外壳蛋白pIX，或衍生自野生型外壳蛋白pIX。
在本发明的上下文中，术语“衍生自”指修饰，其中修饰的蛋白质能够并入噬菌体颗粒的蛋白质外壳。优选地，修饰的蛋白质对应野生型蛋白质的那些部分表现出与对应的野生型序列对比，超过约50％、约60％、约70％、优选约80％和最优选约90％的氨基酸同一性。
在又进一步的优选的实施方案中，本发明涉及一种方法，其中所述蛋白质外壳的成员是噬菌体的野生型外壳蛋白。
术语“野生型外壳蛋白”指形成天然存在的噬菌体的噬菌体外壳的那些蛋白质。在丝状噬菌体的情况中，所述野生型蛋白质是基因III蛋白(pIII)、基因VI蛋白(pVI)、基因VII蛋白(pVII)、基因VIII蛋白(pVIII)和基因IX蛋白(pIX)。序列，包括丝状噬菌体的紧密相关的成员，诸如f1、fd和M13之间的差异，为本领域普通技术人员所公知(参见例如Kay等人，1996)。
在进一步优选的实施方案中，所述蛋白质外壳的成员是噬菌体的野生型外壳蛋白的修饰的变体，其中所述修饰的变体能够并入噬菌体颗粒的蛋白质外壳。
术语“修饰的变体”指衍生自以上所指的野生型蛋白质的蛋白质，其与野生型序列对比，是被修饰的。这种修饰可包括与野生型序列相比的任何氨基酸置换、氨基酸缺失或并入额外的氨基酸。术语“修饰的变体”包括如下文定义的“截短的变体”。
用于实现根据本发明的野生型蛋白质的修饰的方法为本领域普通技术人员所公知，且包括标准克隆和/或诱变技术。本领域中公知：用于构建核酸分子的方法，所述核酸分子编码用于根据本发明的方法的野生型蛋白质的修饰的变体；用于构建包含所述核酸分子的载体的方法，包括构建噬菌体和/或噬菌粒载体的方法；用于将所述载体引入适当选择的宿主细胞的方法；用于引起或使得所述修饰的蛋白质表达的方法(参见例如Sambrook等人，2001；Ausubel等人，1999；Kay等人，1996)。为了鉴别根据本发明的修饰的变体，可将检测标签融合于变体，并可建立测定以确定变体是否能够或被并入到变体存在时形成的噬菌体颗粒的噬菌体外壳中。
在进一步优选的实施方案中，所述蛋白质外壳的成员是噬菌体的野生型外壳蛋白的截短的变体，其中所述截短的变体包括至少引起所述外壳蛋白并入噬菌体颗粒的蛋白质外壳的所述野生型外壳蛋白的那一部分。
术语“截短的变体”指衍生自以上所指的野生型蛋白质的蛋白质，其通过缺失至少一部分野生型序列来修饰。这包括变体，诸如截短的基因III蛋白变体，其已出现在噬菌体突变体中(Crissman & Smith，1984)或已在标准噬菌体展示方法的过程中产生(例如Bass等人，1990；Krebber，1996)。例如，所述截短的变体可由基因III蛋白的C-末端结构域组成，或可包括基因III蛋白的C-末端结构域。为了鉴别根据本发明的截短的变体，可将检测标签融合于变体，并可建立测定以确定变体是否并入到变体存在时形成的噬菌体颗粒的噬菌体外壳中。
通过由缺失一部分野生型蛋白质来截短野生型蛋白质，可获得半胱氨酸残基，其在野生型蛋白质中与包含在缺失部分中的第二半胱氨酸形成二硫键。
术语“(多)肽”指包括经肽键连接的多个(即两个或更多个)氨基酸的一个或多个链的分子。
术语“蛋白质”指(多)肽，其中至少部分(多)肽通过在其(多)肽链的内部和/或之间形成二级、三级或四级结构而具有或能够获得确定的三维排列。这一定义包括诸如以下的蛋白质，诸如天然存在的蛋白质或至少部分人工地蛋白质，以及全蛋白的片段或结构域，只要这些片段或结构域能够获得如上描述的确定的三维排列。
由单链组成的(多)肽/蛋白质的实例是单链Fv抗体片段，且由多个链组成的(多)肽/蛋白质的实例是Fab抗体片段。
当第一半胱氨酸残基位于第一(多)肽/蛋白质的C-末端时，展示形式对应C-末端遗传地融合于噬菌体外壳蛋白成员的常规展示结构。然而，通过使用第一(多)肽/蛋白质的N-末端，可恢复展示形式，如在以上所提到的Crameri & Suter的pJuFO系统中(Crameri & Suter，1993)。
术语“噬菌体颗粒的表面”指与包含噬菌体颗粒的介质接触的，且可到达的噬菌体颗粒的部分。通过蛋白质确定该表面，该蛋白质是噬菌体外壳的一部分(颗粒的蛋白质外壳的成员)，其在合适的宿主细胞中，在噬菌体产生期间装配。
术语“表达后”指以下情况：编码所述第二(多)肽/蛋白质的核酸在该第二(多)肽/蛋白质连接至所述外壳前在宿主细胞中表达，该情况相对于其中表达编码具有噬菌体外壳蛋白的融合蛋白的核酸的方法。编码所述第二(多)肽/蛋白质的核酸的表达，以及引起或使得连接的步骤可在不同的步骤和/或环境中进行。然而，优选地，表达和引起或使得连接的步骤在合适的宿主细胞中依次进行。
术语“其中所述连接通过形成二硫键而引起”指如下情况，其中二硫键负责连接，且其中没有用于与存在于第二(多)肽/蛋白质中的第二结构域相互作用的相互作用结构域被重组地融合于所述蛋白质外壳的成员，如例如在pJuFo系统的情况下(Crameri & Suter，1993)。
在优选的实施方案中，展示第二(多)肽/蛋白质的噬菌体颗粒含有编码第二(多)肽/蛋白质的核酸序列。
本领域公知：用于构建编码根据本发明的(多)肽/蛋白质的核酸分子的方法，用于构建包含所述核酸分子的载体的方法，用于将所述载体引入适当地选择的宿主细胞的方法，用于引起或使得所述(多)肽/蛋白质表达的方法(参见例如Sambrook等人，2001；Ausubel等人，1999；Ge等人，1995)。进一步公知：用于将产生子代噬菌体或噬菌体颗粒所需的遗传物质引入合适的宿主细胞的方法，和用于引起或使得所述子代噬菌体或噬菌体颗粒产生的方法(参见例如Kay等人，1996)。
在某一实施方案中，本发明涉及一种方法，其中所述第一半胱氨酸残基存在于所述第一(多)肽/蛋白质的野生型型式的对应氨基酸位置。更加优选地，所述第一半胱氨酸残基存在于噬菌体的野生型外壳蛋白中的对应氨基酸位置。
在一个更加优选的实施方案中，所述第一半胱氨酸残基没有存在于所述第一(多)肽/蛋白质的野生型型式中的对应氨基酸位置。甚至更加优选地，所述第一半胱氨酸残基没有存在于噬菌体的野生型外壳蛋白中的对应氨基酸位置。
在本发明的上下文中，术语(多)肽/蛋白质的“野生型型式”指具有天然存在的氨基酸序列的(多)肽/蛋白质。
在一个甚至更加优选的实施方案中，所述第一半胱氨酸残基已被人工地引入第一(多)肽/蛋白质。在更加优选的实施方案中，所述第一半胱氨酸残基已被人工地引入噬菌体的野生型外壳蛋白。在其他的实施方案中，所述第一半胱氨酸残基已被人工地引入噬菌体的野生型外壳蛋白的修饰的变体。在另外其他的实施方案中，所述第一半胱氨酸残基已被人工地引入噬菌体的野生型外壳蛋白的截短的变体。
在某一实施方案中，本发明涉及一种方法，其中所述第二半胱氨酸残基存在于所述第二(多)肽/蛋白质的野生型型式中的对应氨基酸位置。更加优选地，所述第二半胱氨酸残基存在于免疫球蛋白或其功能片段中的对应氨基酸位置。
在一个更加优选的实施方案中，所述第二半胱氨酸残基没有存在于所述第二(多)肽/蛋白质的野生型型式中的对应氨基酸位置。甚至更加优选地，所述第二半胱氨酸残基没有存在于噬菌体的野生型外壳蛋白中的对应氨基酸位置。
在一个更加优选的实施方案中，所述第二半胱氨酸残基已被人工地引入第二(多)肽/蛋白质。在更加优选的实施方案中，所述第二半胱氨酸残基已被人工地引入免疫球蛋白或其功能片段。优选地，所述功能片段是scFv或Fab片段。
在某一实施方案中，本发明涉及一种方法，其中所述具有大于8的pI的氨基酸存在于第一(多)肽/蛋白质或第二(多)肽/蛋白质的野生型型式中的对应氨基酸位置。更加优选地，所述具有大于8的pI的氨基酸存在于噬菌体的野生型外壳蛋白或免疫球蛋白或其功能片段(优选scFv或Fab片段)中的对应氨基酸位置。
在一个更加优选的实施方案中，所述具有大于8的pI的氨基酸没有存在于第一(多)肽/蛋白质或第二(多)肽/蛋白质的野生型型式中的对应氨基酸位置。在另一个优选的实施方案中，所述第一(多)肽/蛋白质不是野生型(多)肽/蛋白质，且所述具有大于8的pI的氨基酸没有存在于所述第一(多)肽/蛋白质的野生型型式中。在另一个优选的实施方案中，所述第二(多)肽/蛋白质不是野生型(多)肽/蛋白质，且所述具有大于8的pI的氨基酸没有存在于所述第二(多)肽/蛋白质的野生型型式中。甚至更加优选地，所述具有大于8的pI的氨基酸没有存在于噬菌体的野生型外壳蛋白或免疫球蛋白或其功能片段(优选scFv或Fab片段)中的对应氨基酸位置。
在一个甚至更加优选的实施方案中，所述具有大于8的pI的氨基酸已被人工地引入第一(多)肽/蛋白质或第二(多)肽/蛋白质的野生型型式。在更加优选的实施方案中，所述具有大于8的pI的氨基酸已被人工地引入噬菌体的野生型外壳蛋白或免疫球蛋白或其功能片段，优选scFv或Fab片段。
在本发明的上下文中，术语“人工地引入”指如下情况，其中(多)肽/蛋白质已通过，例如重组方法被修饰。在本发明中，多种(多)肽/蛋白质可以被修饰。例如，编码第一(多)肽/蛋白质的核酸可通过标准程序操作以引入半胱氨酸密码子，产生编码修饰的第一(多)肽/蛋白质的核酸序列，其中半胱氨酸残基通过以下被人工地引入：通过插入到所述第一(多)肽/蛋白质，或将所述半胱氨酸残基添加到所述第一(多)肽/蛋白质，或通过取代包含在所述第一(多)肽/蛋白质中的氨基酸残基，或由所述半胱氨酸残基修饰的蛋白质，或通过将所述第一(多)肽/蛋白质与包含所述第二半胱氨酸残基的第二(多)肽/蛋白质融合，或通过所述插入、添加、取代或融合的任何组合。最优选地，所述第一(多)肽/蛋白质是噬菌体的野生型外壳蛋白，或其修饰的或截短的变体。
类似地，编码第二(多)肽/蛋白质的核酸可通过标准程序操作以便以与第一(多)肽/蛋白质所描述的相同方式引入半胱氨酸密码子。优选的所述第二(多)肽/蛋白质包括免疫球蛋白或其功能片段。特别优选的是scFv或Fab片段。
类似地，编码第一(多)肽/蛋白质或第二(多)肽/蛋白质的核酸可通过标准程序操作以引入氨基酸密码子，编码具有大于8的pI的氨基酸。
在其中第一(多)肽/蛋白质是噬菌体的野生型外壳蛋白的情况中，包括这种重组地引入的半胱氨酸密码子的核酸的表达引起包含半胱氨酸残基的野生型外壳蛋白的变体的形成。
在一个进一步最优选的实施方案中，所述第一半胱氨酸已被人工地引入噬菌体的野生型外壳蛋白的截短的变体。
在又进一步的优选的实施方案中，所述第一半胱氨酸已被人工地引入噬菌体的野生型外壳蛋白的修饰的变体。
用于实现根据本发明的人工引入的方法对本领域普通技术人员是公知的，且包括标准克隆和/或诱变技术。本领域中公知：用于构建核酸分子的方法，所述核酸分子编码用于根据本发明的方法的野生型蛋白质的修饰的变体；用于构建包含所述核酸分子的载体的方法；用于将所述载体引入适当选择的宿主细胞的方法；用于引起或实现所述融合蛋白表达的方法(参见例如Sambrook等人，2001；Ausubel等人，1999)。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其中所述第一半胱氨酸残基存在于或邻近所述第一(多)肽/蛋白质的成员的C-末端或N-末端。在优选的实施方案中，所述第一半胱氨酸残基存在于或邻近噬菌体颗粒的蛋白质外壳的成员的C-末端或N-末端。在某些实施方案中，所述第一半胱氨酸残基是N-末端半胱氨酸残基。在其他的实施方案中，所述第一半胱氨酸残基是C-末端半胱氨酸残基。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其中所述第二半胱氨酸残基存在于或邻近所述第二(多)肽/蛋白质的成员的C-末端或N-末端。在优选的实施方案中，所述第二半胱氨酸残基存在于或邻近免疫球蛋白或其功能片段(优选scFv或Fab片段)的C-末端或N-末端。在某些实施方案中，所述第二半胱氨酸残基是N-末端半胱氨酸残基。在其他的实施方案中，所述第二半胱氨酸残基是C-末端半胱氨酸残基。
术语“邻近”指在从所述第一(多)肽/蛋白质或第二(多)肽/蛋白质的N-末端或C-末端起计算的两种情况中，至多15，更优选至多10个氨基酸，且甚至更优选至多5个氨基酸的一段序列。
在优选的实施方案中，所述第一(多)肽/蛋白质包括噬菌体颗粒的蛋白质外壳的成员，优选pIII。
在优选的实施方案中，所述第二(多)肽/蛋白质包括免疫球蛋白或其功能片段，优选scFv或Fab片段。
在本文中，“免疫球蛋白”作为“抗体”的同义词使用。术语“功能片段”指保留免疫球蛋白的抗原结合部分的免疫球蛋白的片段。根据本发明的功能免疫球蛋白片段可以是Fv(Skerra & Plückthun，1988)、scFv(Bird等人，1988；Huston等人，1988)、二硫键连接的Fv(Glockshuber等人，1992；Brinkmann等人，1993)、Fab、F(ab′)2片段或本领域技术人员公知的其他片段，其包括免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的可变结构域。特别优选的是scFv或Fab片段。
在某些实施方案中，所述第一(多)肽/蛋白质和所述第二(多)肽/蛋白质是不同的。在本文中，“不同的”指两种(多)肽/蛋白质不是完全相同的。在优选的实施方案中，所述第一(多)肽/蛋白质不是所述第二(多)肽/蛋白质的修饰的变体或截短的变体。在最优选的实施方案中，第一(多)肽/蛋白质和第二(多)肽/蛋白质编码不同的功能(多)肽/蛋白质，例如一种(多)肽/蛋白质编码噬菌体的野生型外壳蛋白的修饰的变体，且另一种(多)肽编码免疫球蛋白或其功能片段。在其他优选的实施方案中，第一(多)肽/蛋白质和第二(多)肽/蛋白质衍生自不同的种属(例如一种(多)肽/蛋白质衍生自噬菌体，且另一种(多)肽衍生自人类)。
在优选的实施方案中，本发明提供了在噬菌体颗粒的表面上展示第二(多)肽/蛋白质的方法，其包括：引起或使得所述第二(多)肽/蛋白质在表达后连接于蛋白质外壳的成员，其中所述连接是通过在包含于所述蛋白质外壳的成员中的第一半胱氨酸残基和包含于所述第二(多)肽/蛋白质中的第二半胱氨酸残基之间形成二硫键而引起，其中所述第二(多)肽/蛋白质包括具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述第一半胱氨酸残基的反应性。
在其他优选的实施方案中，所述第一(多)肽/蛋白质和所述第二(多)肽/蛋白质在合适的宿主细胞中被表达和装配。
在又进一步的实施方案中，本发明提供了包括以下步骤的方法：
(a)提供宿主细胞，其含有包含编码第一(多)肽/蛋白质的第一核酸序列的第一核酸序列，和含有包含编码第二(多)肽/蛋白质的第二核酸序列的第二核酸序列，所述第一(多)肽/蛋白质包含第一半胱氨酸残基，且所述第二(多)肽/蛋白质包含第二半胱氨酸残基，其中所述(多)肽/蛋白质之一包含具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述半胱氨酸残基中的至少一个的反应性；
(b)引起或使得所述第一核酸序列和所述第二核酸序列表达；且
(c)引起或使得包含于所述第一(多)肽/蛋白质中的所述第一半胱氨酸残基连接于包含于所述第二(多)肽/蛋白质中的所述第二半胱氨酸残基。
步骤(b)和(c)可以任何次序依次执行，或同时执行。
在本发明的上下文中，术语“引起或使得表达”描述在致使核酸序列被表达的条件下培养宿主细胞。
本领域公知：用于构建编码根据本发明的第一(多)肽/蛋白质或第二(多)肽/蛋白质的核酸分子的方法，用于构建包含所述核酸分子的载体的方法，用于将所述载体引入适当地选择的宿主细胞的方法，用于引起或使得(多)肽/蛋白质表达的方法(参见例如Sambrook等人，2001；Ausubel等人，1999)。进一步公知：用于将产生子代噬菌体或噬菌体颗粒所需的遗传物质引入合适的宿主细胞的方法，和用于引起或使得所述子代噬菌体或噬菌体颗粒产生的方法(参见例如Kay等人，1996)。引起或使得噬菌体颗粒产生的步骤可能需要使用合适的辅助噬菌体，例如在用噬菌粒工作的情况中。
在优选的实施方案中，本发明涉及编码噬菌体的野生型外壳蛋白的修饰的变体的核酸序列，其中所述修饰的变体包括或由以下组成：
(a)所述噬菌体的野生型外壳蛋白的一个或多个部分，其中所述部分之一包括至少引起或使得所述外壳蛋白并入噬菌体外壳的那一部分。
(b)第一半胱氨酸残基，以及
(c)具有大于8的pI的氨基酸，其积极地影响所述第一半胱氨酸残基的反应性。在另一个实施方案中，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响包含于第二(多)肽/蛋白质中的第二半胱氨酸残基的反应性。在优选的实施方案中，所述核酸序列是分离的核酸序列。在其他的实施方案中，所述核酸序列还编码用于纯化和/或检测目的的一种或多种肽序列。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及编码修饰的免疫球蛋白或其功能片段的核酸序列，其中所述修饰的免疫球蛋白或功能片段由以下组成：
(a)免疫球蛋白或其功能片段，
(b)半胱氨酸残基，以及
(c)具有大于8的pI的氨基酸，其积极地影响所述半胱氨酸残基的反应性。如本文所用，根据本发明的术语，免疫球蛋白或其功能片段等于第二(多)肽/蛋白质。在另一个实施方案中，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响包含于另一(多)肽/蛋白质中的另一半胱氨酸残基的反应性。根据本发明的术语，这一其他(多)肽/蛋白质等于第一(多)肽/蛋白质。在优选的实施方案中，所述修饰的免疫球蛋白的功能片段是scFv或Fab片段。在优选的实施方案中，所述核酸序列是分离的核酸序列。在其他的实施方案中，所述核酸序列还编码用于纯化和/或检测目的的一种或多种肽序列。
在本发明的上下文中，通过由半胱氨酸残基取代野生型外壳蛋白序列中的氨基酸残基获得的修饰的变体，可认定为包含通过额外的半胱氨酸残基连接的两部分所述野生型蛋白质的变体。相应地，与野生型序列相比，包括几个突变的野生型外壳蛋白的变体可认定为包含几个野生型部分，其中各个部分通过突变的残基连接。然而，所述变体还可得自将至多6个残基，包括半胱氨酸残基，添加到野生型外壳蛋白的C-末端和/或N-末端。
类似地，通过取代野生型或母体免疫球蛋白蛋白质序列或其功能片段中的氨基酸残基获得的免疫球蛋白或其功能片段的修饰的变体，可认定为包含通过额外的半胱氨酸残基连接的两部分免疫球蛋白或功能片段的变体。以相同的方式，野生型外壳蛋白的修饰的变体，或免疫球蛋白或其功能片段的修饰的变体可认定为包含通过额外的具有大于8的pI的氨基酸连接的两部分的变体，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述半胱氨酸残基的反应性。当半胱氨酸残基和具有大于8的pI的氨基酸两者都引入野生型外壳蛋白的修饰的变体，或免疫球蛋白或其功能片段的修饰的变体时，则所述蛋白质可认定为包含三个部分或甚至更多部分的变体，只要所述蛋白质包括甚至更多个突变。
在一些实施方案中，本发明的核酸序列还编码用于纯化和/或检测目的的一种或多种肽序列。在本发明的某些实施方案中，本发明的核酸序列包含在宿主细胞中。
特别优选的是包括至少5个组氨酸残基的肽(Hochuli等人，1988)，其能够结合金属离子，且因此可用于纯化它们融合至的蛋白质(Lindner等人，1992)。本发明还提供了额外的部分，诸如通常使用的c-myc和FLAG标签(Hopp等人，1988；Knappik & Plückthun，1994)、Strep-标签(Schmidt &Skerra，1994；Schmidt等人，1996)或E-标签(GE Healthcare)。
本发明的第一(多)肽/蛋白质和第二(多)肽/蛋白质的修饰的变体还可包括克隆、表达或蛋白质转运所需的氨基酸残基。克隆所需的氨基酸残基可包括由包含限制性内切核酸酶的识别序列的核酸序列编码的残基，所述识别序列被并入，从而能够将核酸序列克隆到合适的载体。表达所需的氨基酸残基可包括导致(多)肽/蛋白质溶解性或稳定性增加的残基。蛋白质转运所需的氨基酸残基可包括负责将修饰的变体运输至大肠杆菌周质的信号序列，和/或促进所述信号序列有效切割的氨基酸残基。此外，以上所指的克隆、表达、蛋白质转运、纯化和/或检测目的所需的氨基酸残基是本领域技术人员公知的几个部分。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含根据本发明的核酸序列的载体。
在优选的实施方案中，载体包括编码噬菌体的野生型外壳蛋白的修饰的变体的一种或多种核酸序列，或由所述一种或多种核酸序列组成，其中所述修饰的变体包括或由以下组成：
(a)所述噬菌体的野生型外壳蛋白的一个或多个部分，其中所述部分之一包括至少引起或使得所述外壳蛋白并入噬菌体外壳的那一部分；
(b)第一半胱氨酸残基，以及
(c)具有大于8的pI的氨基酸，其积极地影响所述第一半胱氨酸残基的反应性。在进一步的实施方案中，所述载体还包括编码修饰的免疫球蛋白或其功能片段的核酸序列，其中所述修饰的免疫球蛋白或功能片段由以下组成：(a)免疫球蛋白或其功能片段，以及
(b)第二半胱氨酸残基。
在优选的实施方案中，载体包括编码修饰的免疫球蛋白或其功能片段的一种或多种核酸序列，或由所述一种或多种核酸序列组成，其中所述修饰的免疫球蛋白或功能片段包括或由以下组成：
(a)免疫球蛋白或其功能片段，
(b)半胱氨酸残基，以及
(c)具有大于8的pI的氨基酸，其积极地影响所述半胱氨酸残基的反应性。在进一步的实施方案中，所述载体还包括编码噬菌体的野生型外壳蛋白的修饰的变体的核酸序列，其中所述修饰的变体包括或由以下组成：
(a)所述噬菌体的野生型外壳蛋白的一个或多个部分，其中所述部分之一包括至少引起或使得所述外壳蛋白并入噬菌体外壳的那一部分；以及
(b)另一半胱氨酸残基。
在本发明的某些实施方案中，本发明的载体包含在宿主细胞中。
在最优选的实施方案中，所述第二(多)肽/蛋白质包含免疫球蛋白或其功能片段。
在上文所指的单链Fv抗体片段的情况中，载体包括编码由(多)肽连接体连接的VH和VL结构域的一种核酸序列，且在Fab抗体片段的情况中，载体包括编码VH-CH和VL-CL链的两种核酸序列。
在进一步的实施方案中，本发明涉及含有根据本发明的核酸序列或根据本发明的载体的宿主细胞。本发明的第一(多)肽/蛋白质可由包含在与编码本发明的第二(多)肽/蛋白质的核酸相同的载体上的核酸序列编码。在这种情况下，宿主细胞可包括一种载体，该载体包含编码两种(多)肽/蛋白质的核酸序列。可选地，本发明的第一(多)肽/蛋白质可由包含在与编码本发明的第二(多)肽/蛋白质的核酸不同的载体上的核酸序列编码。在此情况下，宿主细胞可包括两种不同的载体，一种包含编码第一(多)肽/蛋白质的核酸序列，且一种包含编码第二(多)肽/蛋白质的核酸序列。
在本发明的上下文中，术语“宿主细胞”可以是生产异源蛋白质中许多通常使用的细胞中的任何一种，包括但不限于细菌，诸如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)(Ge等人，1995)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Wu等人，1993)；真菌，诸如酵母(Horwitz等人，1988；Ridder等人，1995)或丝状真菌(
等人，1993)；植物细胞(Hiatt & Ma，1993；Whitelam等人，1994)；昆虫细胞(Potter等人，1993；Ward等人，1995)或哺乳动物细胞(Trill等人，1995)。在优选的实施方案中，宿主细胞是原核宿主细胞，更优选革兰氏阴性宿主细胞，且最优选大肠埃希氏杆菌。
在又进一步的优选的实施方案中，本发明涉及由根据本发明的核酸序列编码的、由根据本发明的载体编码的，或由根据本发明的宿主细胞产生的野生型噬菌体外壳蛋白的修饰的变体。
在另一个实施方案中，本发明涉及通过以下方法可获得的噬菌体颗粒，其在其表面上展示(多)肽/蛋白质，所述方法包括：
引起或使得所述(多)肽/蛋白质在表达后连接至蛋白质外壳的成员，其中所述连接通过在包含于所述蛋白质外壳的成员中的第一半胱氨酸残基与包含于所述第二(多)肽/蛋白质中的第二半胱氨酸残基之间形成二硫键而引起，其中所述(多)肽/蛋白质或所述蛋白质外壳的成员包括具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述第一半胱氨酸残基或所述第二半胱氨酸残基的反应性。在某些实施方案中，所述具有大于8的pI的氨基酸包含于所述(多)肽/蛋白质中。在其他的实施方案中，所述具有大于8的pI的氨基酸包含于所述蛋白质外壳的成员中。在优选的实施方案中，所述(多)肽/蛋白质是免疫球蛋白或其功能片段。在另外其他的实施方案中，具有大于8的pI的氨基酸包含于所述第一(多)肽/蛋白质，优选在蛋白质外壳的成员中，且具有大于8的pI的氨基酸包含于所述第二(多)肽/蛋白质，优选免疫球蛋白或其功能片段中。
在本发明的高度优选的实施方案中，噬菌体颗粒含有根据本发明的载体，其中所述载体含有包含编码第一(多)肽/蛋白质的第一核酸序列的第一核酸序列，和含有包含编码第二(多)肽/蛋白质的第二核酸序列的第二核酸序列，所述第一(多)肽/蛋白质包含第一半胱氨酸残基，且所述第二(多)肽/蛋白质包含第二半胱氨酸残基，其中所述(多)肽/蛋白质之一包含具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述半胱氨酸残基中的至少一个的反应性。更加优选地，所述第二(多)肽/蛋白质至少包含免疫球蛋白的功能结构域。
已作必要的修正的上文所指的本发明的方法的优选实施方案应用于本发明的噬菌体。
在进一步的实施方案中，本发明涉及根据本发明的噬菌体颗粒的不同集合，其中所述噬菌体颗粒中的每一个展示出(多)肽/蛋白质的不同集合中的第二(多)肽/蛋白质。
“噬菌体颗粒的不同集合”也可称为“文库”或“多个噬菌体颗粒”。这种文库的每个成员展示文库的不同成员。
在本发明的上下文中，术语“不同集合”指至少一部分它们的组成、性质和/或序列不同的至少两种颗粒或分子的集合。例如，(多)肽/蛋白质的不同集合是一组(多)肽/蛋白质，它们在它们的序列的至少一个氨基酸位置处不同。这种(多)肽/蛋白质的不同集合可以多种方式获得，例如通过随机诱变编码起始(多)肽/蛋白质的核酸序列的至少一个密码子，通过使用易错PCR扩增编码起始(多)肽/蛋白质的核酸序列，或通过使用增变株作为在根据本发明的方法中的宿主细胞。产生(多)肽/蛋白质的不同集合的这些和其他的或可选的方法为本领域普通技术人员所公知。“噬菌体颗粒的不同集合”可称为文库或多个噬菌体颗粒。这种文库的每个成员展示文库的不同成员。
在另一个实施方案中，本发明涉及获得具有所需性质的(多)肽/蛋白质的方法，其包括：
(a)提供根据本发明的噬菌体颗粒的不同集合，以及
(b)筛选所述不同集合和/或从所述不同集合中选择以获得至少一种展示具有所述所需性质的(多)肽/蛋白质的噬菌体颗粒。
在本发明的上下文中，术语“所需性质”指(多)肽/蛋白质的不同集合中的(多)肽/蛋白质之一应该具有的，以及形成筛选和/或选择不同集合的基础的预先确定的性质。这种所需性质包括以下性质，诸如对靶的结合、阻断靶、活化靶介导的反应、酶促活性和本领域普通技术人员所知的其他性质。依据所需性质的类型，本领域普通技术人员将能够识别执行筛选和/或选择的形式和必要步骤。最优选其中所述期望特性是结合于感兴趣的靶的方法。
所述感兴趣的靶可以本领域普通技术人员公知的多种方式呈递于所述噬菌体颗粒的不同集合，所述方式诸如包裹在表面上以便固相生物淘选，连接至诸如磁珠的颗粒以便在溶液中生物淘选，或展示在细胞表面上以便全细胞生物淘选或在组织切片上生物淘选。已结合至所述靶的噬菌体颗粒可通过本领域普通技术人员公知的多种方法来恢复，所述方法诸如通过用合适的缓冲液洗脱，无论是使用pH梯度或盐梯度，或通过使用可溶性靶特异性洗脱。
在优选的实施方案中，获得(多)肽/蛋白质的方法还包括：
(ba)使所述噬菌体颗粒的不同集合与感兴趣的靶接触；
(bb)洗脱没有结合于所感兴趣的靶的噬菌体颗粒；
(bc)通过在还原条件下处理在步骤(ba)中形成的感兴趣的靶与结合于所述感兴趣的靶的噬菌体的复合体，来洗脱结合于感兴趣的靶的噬菌体颗粒。
在还原条件下，诸如通过用DTT孵育，二硫键被切割，因此使得具体噬菌体颗粒恢复，用于下一轮生物淘选，和/或用于鉴别特异性结合于所述靶的(多)肽/蛋白质。
在其他的实施方案中，本发明涉及改善半胱氨酸展示系统的方法，其通过将具有大于8的pI的氨基酸引入第一或第二(多)肽/，以致包含在所述第一(多)肽/蛋白质中的第一半胱氨酸残基与包含在第二(多)肽/蛋白质中的第二半胱氨酸残基比在没有引入这种具有大于8的pI的氨基酸的同等半胱氨酸展示系统中更加优选地形成二硫键。
在其他的实施方案中，本发明涉及一种复合体，其包括：
(a)第一(多)肽/蛋白质，其包括第一半胱氨酸残基，以及
(b)第二(多)肽/蛋白质，其包括第二半胱氨酸残基，
其中所述(多)肽/蛋白质之一还包括具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述半胱氨酸残基中的至少一个的反应性，且其中所述第一(多)肽/蛋白质和所述第二(多)肽/蛋白质经所述半胱氨酸残基形成二硫键。在优选的实施方案中，所述第二(多)肽/蛋白质是展示于多个噬菌体颗粒的不同集合上的第二(多)肽/蛋白质的不同集合的成员。在某些优选的实施方案中，所述第一(多)肽/蛋白质是噬菌体外壳蛋白。在其他优选的实施方案中，所述第二(多)肽/蛋白质包括免疫球蛋白或其功能片段，更优选scFv或Fab片段。在其他实施方案中，本发明提供了包含任何上文描述的复合体的宿主细胞。
实施例
实施例1：新载体的构建
载体是基于WO 01/05909中描述的已知表达载体。Fab片段的重链和轻链是从在lac启动子/操纵子区控制下的双顺反子噬菌粒表达的。第一表达盒包括信号序列ompA和轻链的可变和恒定结构域。第二表达盒包括信号序列phoA和重链的可变和恒定结构域。重链和轻链未经二硫键连接。基因III也在相同的载体上编码。形成二硫键的半胱氨酸残基位于pIII的N-末端和重链Fd-片段的C-末端。典型的CysDisplay载体的主要特征显示于图1。
已基于pMORPH25载体构建新展示载体变体(pMORPH25型式A、B、C和E)，所述pMORPH25载体是pMORPH23的衍生物(描述于WO04/013276)。含有雌二醇-BSA特异性HuCAL Fab片段的pMORPH23和pMORPH25的序列和载体图显示于图5、6、7和8。pMORPH23和pMORPH25的半胱氨酸-标签序列是相同的。
对于用修饰的半胱氨酸-标签构建载体变体，pMORPH25由EcoRI和HindIII消化以除去C-末端野生型序列(pMORPH25_WT标签)。通过将具有相容突出端的退火双链(ds)寡核苷酸连接至EcoRI和HindIII消化的展示载体pMORPH25，插入型式A、B、C和E的新C-末端标签。
各个寡核苷酸的序列归纳于表2。根据以下程序，将双链寡核苷酸退火。200ng各个寡核苷酸组合的每一个(例如pMORPH25型式A的Seq IDNo1和Seq ID No2)在99℃下孵育20分钟，随后冷却至室温，使得互补序列退火。退火dsDNA根据标准DNA技术连接至消化的pMORPH25(参见例如Sambrook等人，2001；Ausubel等人，1999；Kay等人，1996)，并转化入电感受态Top10F细胞(Invitrogen)。
表2：用于展示标签盒构建的寡核苷酸
| Seq ID No1：pMORPH25_A_for5’aattcccaggggggagcggaggtgcgccgcaccatcatcaccatcactgcaaatgata3’ |
| Seq ID No2：pMORPH25_A_rev5’agcttatcatttgcagtgatggtgatgatggtgcggcgcacctccgctcccccctggg3’ |
| Seq ID No3 pMORPH25_B_for5’aattcccaggggggagcggaggtgcgccgcaccatcataaacatcactgctgata3’ |
| Seq ID No4 pMORPH25_B_rev5’agcttatcagcagtgatgtttatgatggtgcggcgcacctccgctcccccctggg3’ |
| Seq ID No5 pMORPH25_C_for5’aattcccaggggggagcggaggtgcgccgcaccatcatcaccataaatgctgata3’ |
| Seq ID No6 pMORPH25_C_rev5’agcttatcagcatttatggtgatgatggtgcggcgcacctccgctcccccctggg3’ |
| Seq ID No7 pMORPH25_E_for5’aattcccaggggggagcggaggtgcgccgcacaaacataaacataaatgctgata3’ |
| Seq ID No8 pMORPH25_E_rev5’agcttatcagcatttatgtttatgtttgtgcggcgcacctccgctcccccctggg3’ |
对照构建体pMORPH25的重链片段的C-末端的氨基酸序列显示于表3。在表3中，四种这种衍生物被标记为“pMORPH25型式A”、“pMORPH25型式B”、“pMORPH25型式C”和“pMORPH25型式E”。一个变体恰好在C-末端携带额外的赖氨酸残基(变体A)。在变体B和C中，组氨酸残基，分别是至活性半胱氨酸残基的N-末端的第三个和第一个氨基酸，被交换为赖氨酸残基。在变体E中，直接至活性半胱氨酸残基的N-末端的5个组氨酸残基中的3个被交换为赖氨酸残基。
表3：本发明中使用的重链片段的C末端的氨基酸序列
| 构建体 | 重链片段的C-末端 |
| pMORPH25 | PGGSGGAPHHHHHHC |
| pMORPH25 version A | PGGSGGAPHHHHHHCK |
| pMORPH25 version B | PGGSGGAPHHHKHHC |
| pMORPH25 version C | PGGSGGAPHHHHHKC |
| pMORPH25 version E | PGGSGGAPHKHKHKC |
实施例2：结合至Ni-NTA板的噬菌体
pMORPH25中的直接至活性半胱氨酸残基的N-末端的6个组氨酸残基为噬菌体颗粒赋予了结合至Ni-NTA板的能力。在型式A中，将赖氨酸残基引入活性半胱氨酸残基的C-末端。在pMORPH25的型式B、C和E中，通过将至少一个赖氨酸残基引入所述六组氨酸序列段的每一个的方式来破坏这一六个组氨酸残基的序列段。据推测，这应该导致展示Fab片段的噬菌体颗粒结合至Ni-NTA板的能力丧失。
展示Fab片段的噬菌体颗粒经标准技术产生(参见例如Kay等人，1996和WO 01/05909的实施例2.2)。如简单地描述，来确定噬菌体颗粒对Ni-NTA板的结合。噬菌体颗粒(8x108/孔)用封闭溶液(用TBS，0.1％Tween20稀释的Chemiblock)预孵育2小时，将其加入以预封闭的HIS-选择iLAP HC镍包被的96孔板(Sigma-Aldrich Co)。用PBST和PBS洗涤后，剩余的噬菌体用抗M13-HRP偶联物(Amersham Pharmacia Biotech)和可溶性BM蓝(BM blue soluble)(Boehringer Mannheim)显示。
结果描述于图2中。
如图2所示，pMORPH25的型式B和E有效地破坏了组氨酸标签。原始构建体仍然结合于Ni-NTA板。这种结合对型式A以及型式C仍然适用，型式A仍然携带六组氨酸标签，型式C仍然携带五组氨酸标签，其似乎足以能够将噬菌体颗粒结合至Ni-NTA板。
实施例3：相对展示速率
按照以下所描述，确定多种载体构建体的噬菌体颗粒的相对展示速率(型式A-型式E，如实施例1所描述)。
通过标准程序产生噬菌体颗粒(参见例如Kay等人，1996和WO01/05909的实施例2.2)。在两个独立的ELISA实验中，确定未知噬菌体颗粒溶液的噬菌体颗粒数量和抗体展示速率。噬菌体制品的噬菌体颗粒效价经抗pIII捕获ELISA确定，且噬菌体制品的抗体展示速率经抗Fd捕获ELISA确定。相对展示速率定义为抗Fd信号除以抗pIII捕获ELISA信号。
Maxisorp Nunc-Immuno微量滴定板用100μl 2.5μg/ml抗pIII捕获抗体溶液(MoBiTech，
，Germany)包被，且第二板用100μl 0.5μg/ml抗Fd捕获抗体溶液包被，这在4℃下持续12小时，且在室温下用在TPBS中以1∶2稀释的Chemiblock溶液(Chemichon，International)封闭2小时。将噬菌体颗粒的一系列稀释液加入到板中，持续2小时。用TBST洗涤5次后，经抗M13-HRP抗体(抗g8p特异性，Amersham)，随后荧光检测(QuantaBlue，Pierce)来检测捕获的噬菌体颗粒。
噬菌体颗粒效价可由具有已知颗粒浓度的参照噬菌体溶液的校准曲线来计算。展示速率由确定的具有已知抗体片段展示速率的参照噬菌体颗粒制品来计算。已根据Johansen，L.K.等人(1995)确定这一参照噬菌体制品的展示速率。
相对展示速率归纳于表4。原始pMORPH25构建体的展示速率设置为100％。
表4：这一研究的构建体的相对展示速率
| 实验#1 | 实验#2 | 实验#3 | |
| pMORPH25 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| pMORPH25型式A | 0,98 | 1,52 | |
| pMORPH25型式B | 1,29 | 2,14 | 1,51 |
| pMORPH25型式C | 1,25 | 1,67 | |
| pMORPH25型式E | 2,57 |
如其所示，pMORPH25的所有四种衍生物与pMORPH25自身相比，显示出较高的相对展示速率。pMORPH25型式E显示出最高展示速率，其表现出超出原始构建体pMORPH25 2.57倍的增加的展示速率。
这一实验显示出令人惊讶的结果，经引入带正电的氨基酸赖氨酸实现的六组氨酸标签的破坏产生噬菌体颗粒上的增加的展示速率。
实施例4：功能展示速率
在抗原结合ELISA测定中测量功能展示速率，所述测定对在这一研究中使用的具体结合子具有特异性。
4℃下，将1μg重组蛋白包被在Maxisorp Nunc-lmmuno微量滴定板上，持续12小时，并用含有5％脱脂奶粉的PBS(J.M.Gabler Saliter GmbH &Co KG)在室温下封闭2小时。在存在或缺少20mM DTT时，在PBS、5％脱脂奶粉和0.05％吐温20中预孵育来自各种标签构建体的噬菌体制品。将预封闭的噬菌体颗粒的一系列稀释液加入到包被的Maxisorp孔中，并孵育2小时。用PBST和PBS洗涤后，剩余的噬菌体用抗M13-HRP偶联物(Amersham Pharmacia Biotech)和可溶性BM蓝(Boehringer Mannheim)显示。
在第一组对照实验中，额外地将25mM DTT加入到孔中。在第二组对照实验中，板仅用BSA包被。pMORPH25型式A、B和C的结果显示于图3，且pMORPH25型式E的结果在图4中。
鉴别测试的所有构建体的功能噬菌体颗粒。pMORPH25型式A略微好于标准pMORPH25。pMORPH25的型式B和C明显好于标准pMORPH25。当各个孔用至少5e+08个噬菌体颗粒/孔接种时，差异最显著。pMORPH25型式E的功能展示速率甚至比标准pMORPH25的展示速率高约4倍(由图4中的箭头所示)。所有对照测量，即额外加入25mM DTT的孔和用BSA包被的板中的孔，没有给出超过背景的信号。
这一实验显示出令人惊讶的结果，经引入带正电的氨基酸赖氨酸实现的六组氨酸标签的破坏不仅产生噬菌体颗粒上的增加的展示速率，而且增加的展示速率同时伴随着噬菌体颗粒的功能结合。事实上，功能展示速率的增加甚至高于在以上实验中测量的相对展示速率的增加。
实施例5：不同文库的展示
这一实施例显示由修饰的标签型式(参见表4)引起的展示速率的增加不限于特异性Fab片段，但可一般地应用于不同的Fab片段文库。含有pMORPH25型式E的重链片段(C-末端：-HKHKHKC)的Fab文库的相对展示速率对比含有原始pMORPH23载体的重链片段(C-末端：-HHHHHHC)的Fab文库。对比参见表3(pMORPH23和pMORPH25的半胱氨酸-标签序列是相同的)。实验设置与实施例3中所描述是相同的。结果显示于图9。
如其所示，与常规载体(设置为1)相比，基本上包含根据本发明的多肽的所有构架显示出明显地提高的展示速率。此外，在λ和κ链片段两者中观察到增加的相对展示速率。
附图简述
图1：典型CysDisplay载体
Fab片段的重链和轻链处在lac启动子/操纵子区的控制之下。第一表达盒包括信号序列ompA和轻链的可变(VL)结构域和恒定(CL)结构域，第二表达盒包括信号序列phoA和重链的可变(VH)结构域和恒定(CH1)结构域。重链和轻链未经二硫键连接。基因III也在相同的载体(gIII)上编码。形成二硫键的半胱氨酸位于pIII的N-末端和重链Fd-片段的C-末端(由‘C’表示)。AccI、AfIII、XbaI、EcoRI和HindIII表示可方便地用于产生或修饰展示载体的限制位点。
图2：对Ni-NTA板的结合
“pM25”代表原始“pMORPH25”构建体，且“pM25_A”至“pM25_E”分别代表构建体“pMORPH25型式A”至“pMORPH25型式E”。“pM25 w/oHIS标签”代表其中缺失组氨酸标签的构建体。吸光度在370nm处测量。
图3：pMORPH型式A、B和C的功能展示速率
“pM25”代表原始“pMORPH25”构建体，且“pM25_A”至“pM25_E”分别代表构建体“pMORPH25型式A”至“pMORPH25型式E”。从左至右的每个构建体的柱体如下：每孔5.0e+10个噬菌体颗粒、每孔5.0e+9个噬菌体颗粒、每孔5.0e+8个噬菌体颗粒、每孔5.0e+7个噬菌体颗粒、每孔5.0e+10个噬菌体颗粒加25mM DTT和在用BSA包被的板中的每孔5.0e+10个噬菌体颗粒。
图4：pMORPH型式E的功能展示速率
“pM25”代表原始“pMorph25”构建体，且“pM25_E”代表构建体“pMORPH25型式E”。从左至右的每个构建体的柱体如下：每孔1.0e+10个噬菌体颗粒、每孔1.0e+9个噬菌体颗粒、每孔5.0e+8个噬菌体颗粒、每孔2.5e+8个噬菌体颗粒、每孔1.25e+8个噬菌体颗粒、每孔6.25e+7个噬菌体颗粒、在用BSA包被的板中的每孔1.0e+10个噬菌体颗粒和每孔1.0e+10个噬菌体颗粒加25mM DTT。箭头指示那些测量值，其中标准pMORPH25和pMORPH25型式E之间的差异是最显著的。
图5显示含有雌二醇-BSA特异性HuCAL Fab片段的pMORPH23衍生物的序列。
图6显示含有雌二醇-BSA特异性HuCAL Fab片段的pMORPH23衍生物的载体图。
图7显示含有雌二醇-BSA特异性HuCAL Fab片段的pMORPH23衍生物的序列。
图8显示含有雌二醇-BSA特异性HuCAL Fab片段的pMORPH25衍生物的载体图。
图9显示与常规构建体的文库相比的基于本发明的Fab片段文库的相对展示速率。每一单个构建体的常规构建体(pMORPH23)的展示速率设置为1(即100％)。显示了与pMORPH23构建体的展示速率相比，由pMORPH25-型式E示例的改善的构建体的相对展示速率。在x轴上指示测试的不同构架。白柱指示λ链片段，且黑柱指示κ链片段。
参考文献
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Claims (57)
1.一种形成二硫键的方法，其包括：
引起或使得第一(多)肽/蛋白质连接于第二(多)肽/蛋白质，
其中所述连接是通过在包含于所述第一(多)肽/蛋白质中的第一半胱氨酸残基和包含于所述第二(多)肽/蛋白质中的第二半胱氨酸残基之间形成二硫键而引起，其中所述(多)肽/蛋白质之一包括具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述半胱氨酸残基中的至少一个的反应性。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述具有大于8的pI的氨基酸包含于所述第一(多)肽/蛋白质中。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述具有大于8的pI的氨基酸包含于所述第二(多)肽/蛋白质中。
4.如权利要求2或3所述的方法，其中所述具有大于8的pI的氨基酸没有存在于所述野生型(多)肽/蛋白质中的对应氨基酸位置。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述具有大于8的pI的氨基酸已被人工地引入。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述具有大于8的pI的氨基酸包含在相同(多)肽/蛋白质上的邻接所述半胱氨酸残基的10个氨基酸内。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述具有大于8的pI的氨基酸包含在相同(多)肽/蛋白质上的邻接所述半胱氨酸残基的5个氨基酸内。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述第一半胱氨酸残基存在于或邻近所述第一(多)肽/蛋白质的N-末端或C-末端。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述第一半胱氨酸残基是N-末端半胱氨酸残基或C-末端半胱氨酸残基。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述第二半胱氨酸残基存在于或邻近所述第二(多)肽/蛋白质的N-末端或C-末端。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述第二半胱氨酸残基是N-末端半胱氨酸残基或C-末端半胱氨酸残基。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述第二(多)肽/蛋白质展示在噬菌体颗粒的表面上。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述第一(多)肽/蛋白质和所述第二(多)肽/蛋白质在合适的宿主细胞中表达和装配。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述二硫键在宿主细胞的周质间隙中形成。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述二硫键是分子间二硫键。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述具有大于8的pI的氨基酸选自赖氨酸和精氨酸。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述氨基酸是赖氨酸。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述第一(多)肽/蛋白质和所述第二(多)肽/蛋白质是不同的。
19.如权利要求1所述的方法，其中所述第一(多)肽/蛋白质是噬菌体颗粒的蛋白质外壳的成员。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质外壳的成员是噬菌体的野生型外壳蛋白的截短的变体，其中所述截短的变体包括至少引起所述外壳蛋白并入所述噬菌体颗粒的蛋白质外壳的所述野生型外壳蛋白的那一部分。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述蛋白质外壳的成员是噬菌体的野生型外壳蛋白的修饰的变体，其中所述修饰的变体能够并入到所述噬菌体颗粒的蛋白质外壳。
22.如权利要求19所述的方法，其中包含于所述第一(多)肽/蛋白质中的所述第一半胱氨酸残基存在于噬菌体的野生型外壳蛋白中的对应氨基酸位置。
23.如权利要求19所述的方法，其中包含于所述第一(多)肽/蛋白质中的所述第一半胱氨酸残基没有存在于噬菌体的野生型外壳蛋白中的对应氨基酸位置。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述第一半胱氨酸残基已被人工地引入噬菌体的野生型外壳蛋白。
25.如权利要求20所述的方法，其中所述第一半胱氨酸残基已被人工地引入噬菌体的野生型外壳蛋白的截短的变体。
26.如权利要求21所述的方法，其中所述第一半胱氨酸残基已被人工地引入噬菌体的野生型外壳蛋白的修饰的变体。
27.如权利要求12所述的方法，其中所述噬菌体颗粒是丝状噬菌体的噬菌体颗粒。
28.如权利要求19所述的方法，其中所述噬菌体颗粒的蛋白质外壳的成员是野生型外壳蛋白pIII，或衍生自野生型外壳蛋白pIII。
29.如权利要求19所述的方法，其中所述噬菌体颗粒的蛋白质外壳的成员是野生型外壳蛋白pIX，或衍生自野生型外壳蛋白pIX。
30.如权利要求1所述的方法，其中包含于所述第二(多)肽/蛋白质中的所述第二半胱氨酸残基没有存在于所述第二(多)肽/蛋白质的野生型中的对应氨基酸位置。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述第二半胱氨酸残基已被人工地引入所述第二(多)肽/蛋白质。
32.如权利要求1所述的方法，其中所述第二(多)肽/蛋白质包括免疫球蛋白或其功能片段。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述功能片段是scFv或Fab片段。
34.一种在噬菌体颗粒的表面上展示第二(多)肽/蛋白质的方法，其包括：
引起或使得所述(多)肽/蛋白质在表达后连接于蛋白质外壳的成员，
其中所述连接是通过在包含于所述蛋白质外壳的成员中的第一半胱氨酸残基和包含于所述(多)肽/蛋白质中的第二半胱氨酸残基之间形成二硫键而引起，其中所述(多)肽/蛋白质或所述蛋白质外壳的成员包括具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述第一半胱氨酸残基或所述第二半胱氨酸残基的反应性。
35.一种编码噬菌体的野生型外壳蛋白的修饰的变体的核酸序列，其中所述修饰的变体包括：
(a)所述噬菌体的野生型外壳蛋白的一个或多个部分，其中所述部分之一包括至少引起或使得所述外壳蛋白并入噬菌体外壳的那一部分，
(b)第一半胱氨酸残基，以及
(c)具有大于8的pI的氨基酸，其积极地影响所述第一半胱氨酸残基的反应性。
36.一种编码修饰的免疫球蛋白或其功能片段的核酸序列，其中所述修饰的免疫球蛋白或功能片段包括：
(a)免疫球蛋白或其功能片段，
(b)半胱氨酸残基，以及
(c)具有大于8的pI的氨基酸，其积极地影响所述半胱氨酸残基的反应性。
37.如权利要求36所述的核酸序列，其中修饰的免疫球蛋白的所述功能片段是scFv或Fab片段。
38.如权利要求35至37中的任何一项所述的核酸序列，其中所述核酸序列还编码用于纯化和/或检测目的的一种或多种肽序列。
39.一种载体，其包含权利要求35至38中的任何一项所述的核酸。
40.如权利要求39所述的载体，其还包括编码第二(多)肽/蛋白质的一种或多种核酸序列，所述第二(多)肽/蛋白质包括第二半胱氨酸残基。
41.一种宿主细胞，其包含权利要求35至38中的任何一项所述的核酸序列，或权利要求39或40所述的载体。
42.一种宿主细胞，其包含权利要求39所述的载体和第二载体，所述第二载体包括编码第二(多)肽/蛋白质的一种或多种核酸序列，所述第二(多)肽/蛋白质包括第二半胱氨酸残基。
43.一种(多)肽/蛋白质，其由权利要求35至38中的任何一项所述的核酸序列编码，由权利要求39或40所述的载体编码，或由权利要求41或42所述的宿主细胞产生。
44.一种噬菌体颗粒，所述噬菌体颗粒在其表面上展示(多)肽/蛋白质，所述噬菌体颗粒可通过权利要求34所述的方法获得。
45.如权利要求44所述的噬菌体颗粒，其中所述(多)肽/蛋白质是免疫球蛋白或其功能片段。
46.一种权利要求44或45所述的噬菌体颗粒的不同集合，其中所述噬菌体颗粒中的每一个展示出第二(多)肽/蛋白质的不同集合中的第二(多)肽/蛋白质。
47.一种获得具有所需性质的(多)肽/蛋白质的方法，其包括：
(a)提供权利要求46所述的噬菌体颗粒的不同集合，以及
(b)筛选所述不同集合和/或从所述不同集合中选择以获得至少一种展示具有所需性质的(多)肽/蛋白质的噬菌体颗粒。
48.如权利要求47所述的方法，其中步骤(b)还包括：
(ba)使所述噬菌体颗粒的不同集合与感兴趣的靶接触；
(bb)洗脱没有结合于所述感兴趣的靶的噬菌体颗粒；以及
(bc)通过在还原条件下处理在步骤(ba)下形成的所述感兴趣的靶与结合于所述感兴趣的靶的噬菌体的复合体，来洗脱结合于所述感兴趣的靶的噬菌体颗粒。
49.如权利要求47或48所述的方法，其中所述所需性质是对感兴趣的靶的结合、抑制感兴趣的靶、阻断感兴趣的靶、活化靶介导的反应、酶促活性。
50.一种复合体，其包括
(a)第一(多)肽/蛋白质，其包括第一半胱氨酸残基，以及
(b)第二(多)肽/蛋白质，其包括第二半胱氨酸残基，
其中所述(多)肽/蛋白质之一还包括具有大于8的pI的氨基酸，所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述半胱氨酸残基中的至少一个的反应性，且其中所述第一(多)肽/蛋白质和所述第二(多)肽/蛋白质经所述半胱氨酸残基形成二硫键。
51.如权利要求49所述的复合体，其中所述第二(多)肽/蛋白质是展示于多个噬菌体颗粒的不同集合上的第二(多)肽/蛋白质的不同集合的成员。
52.如权利要求49所述的复合体，其中所述第一(多)肽/蛋白质是噬菌体外壳蛋白。
53.如权利要求49所述的复合体，其中所述第二(多)肽/蛋白质包括免疫球蛋白或其功能片段。
54.如权利要求53所述的复合体，其中所述功能片段是scFv或Fab片段。
55.一种宿主细胞，其包括权利要求49至54中的任何一项所述的复合体。
56.一种形成二硫键的方法，其包括：
引起或使得第一(多)肽/蛋白质连接于第二(多)肽/蛋白质，
其中所述连接是通过在包含于所述第一(多)肽/蛋白质中的第一半胱氨酸残基与包含于所述第二(多)肽/蛋白质中的第二半胱氨酸残基之间形成二硫键而引起，其中所述(多)肽/蛋白质之一包括具有大于8的pI的氨基酸。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述具有大于8的pI的氨基酸积极地影响所述半胱氨酸残基中的至少一个的反应性。
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