JPH0744951B2 - 抗凝血性医用材料 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，抗凝血性医用材料に関するものである。

（従来の技術） 従来から，人口臓器，人口血管，カテーテル，輸血装置
等，直接血液に接触して使用される医用器材の材料とし
て，抗凝血性の材料が求められている。このような材料
を得るためにすでに種々の提案がなされ，一部実用にも
供されている。例えば，フツ素樹脂やシリコーン樹脂等
の疎水性表面のポリマー（外科治療29巻,585頁,1973
年），カルボキシセルロース，クロルスルホン化ポリエ
チレン等の負電荷を有するポリマー〔マクロモレキユラ
ー・ケミストリー（Marcromol.Chem.）179巻,1121頁,19
78年〕，ポリ−２−ヒドロキシエチルメタクリレート等
の親水性のポリマー〔ネイチヤー（Nature）185巻,117
頁,1960年〕，親水性のポリウレタンと疎水性のポリジ
メチルシロキサンのコポリマーのようなミクロドメイン
構造を有するポリマー（人工臓器,10巻,1066頁,1981
年）等，材質そのものの特性を利用したものが知られて
いる。

しかし，これらの材料においては，抗凝血性が不十分で
あったり，まるいは材質の表面構造がミクロドメイン化
等のように複雑であるため，製造が困難であったりして
いた。これら欠点を改良する試みとして，血液凝固阻害
剤であるヘパリンを固定化した材料〔トランスアクシヨ
ンズ・アメリカン・ソサイアテイー・アーテイフイシヤ
ル・インターナル・オルガンズ（Trans.Amer.Soc.Arti
f.Int.Organs）21巻,436頁,1975年〕，線溶活性物質で
あるウロキナーゼ，ストレプトキナーゼを固定化した材
料（特開昭54−26394号公報）等が提案されている。

（発明が解決しようとする問題点） しかし，これらの薬剤は生体高分子であることから，安
定性に乏しく，充分満足できるものではなかった。しか
も，優れた抗凝血性の材料を得るためには，大量の薬剤
を付着する必要があり，そのため，出血過多を生ずる恐
れがある等，完全に満足できるものではなく，改良が望
まれていた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは，このような問題点を解決するために鋭意
検討の結果，抗凝血性材料にジアデノシン四リン酸が利
用できることを見い出し，本発明を完成した。

すなわち，本発明は，種々の形状を有する構造物からな
る医用材料におて，該構造物にジアデノシン四リン酸が
固定化されていることを特徴とする抗凝血性医用材料を
要旨とするものである。

本発明における医用材料とは，綿，紙，布，不織布，織
物，編物等の繊維集合体，パイプ，チユーブ，フイル
ム，モノフイラメント，スポンジ，粉末，マイクロカプ
セル等種々の形状を有する構造物及びこれらの構造物を
複合した構造物からなる公知の材料をいう。それらの構
造物を構成する素材としては，例えば，セルロース，再
生セルロース，セルロースアセテート等のセルロース誘
導体，絹，コラーゲン，カゼイン，ゼラチン等の蛋白
質，ポリエステル，ポリアミド，ポリウレタン，ポリア
クリロニトリル，ポリアクリルアミド，ポリアクリル酸
エステル，ポリエチレン，ポリプロピレン，ポリ塩化ビ
ニル，シリコーン，ポリビニルアルコール，ポリヒドロ
キシエチルメタクリレート，ポリビニルピロリドン，ポ
リカーボネート，ポリアルキルシロキサン，スルホン化
ポリスチエン等の合成高分子ならびにこれらの共重合
体，ガラス，アスベスト，雲母，活性炭，ポリフオスフ
アゼン等の無機物質等があげられる。

本発明に用いられるジアデノシン四リン酸（以下Ap₄Aを
略記する。）としては，ジアデノシン−５′,5−
Ｐ′，P⁴−テトラホスフエート又はこのものの塩があげ
られる。このAp₄A又はその塩には，血栓形成を防ぐ作用
はまったく知られていない。このAp₄Aは，アデノシン−
５′−二リン酸（以下ADPと略記する。）の二量体構造
を有しており，アデノシン−５′−リン酸モルホリデー
トとアデノシン−５′−三リン酸（以下ATPと略記す
る。）との反応により化学合成された例が報告されてい
る〔レイス，モフアツト（Reiss,Moffatt）ジヤーナル
・オーガニック・ケミストリー（J.Org.Chem.）30巻,33
81頁,1965年〕。また，Ap₄Aの酵素法による合成法とし
ては，例えば，アミノアシル−tRNA合成酵素を用いた方
法が報告されている〔ジヤクボフスキー（Jakubowski）
アクタ・ビオキミカ・ポロニカ（Acta Biochimica Polo
nica）30巻,50頁,1983年〕。

本発明において，上記の製造法によってもAp₄Aを得るこ
とができるが，高純度のAp₄Aを得るためには,ADPをATP
に変換する酵素の存在下に，アミノアシル−tRNA合成酵
素の触媒作用により,ATPとアミノ酸とを反応させてAp₄A
を製造するのが望ましい。特に，アデノシン−５′−一
リン酸（以下AMPと略記する。）をADPに変換する酵素
と,ADPをATPに変換する酵素の存在下で行うことが好ま
しい。

また，アミノアシル−tRNA合成酵素としては，Ap₄Aを合
成する能力を有するものであればいかなるものでもよい
が，エシエリキタ・コリ由来のリジル−tRNA合成酵素，
ヒスチジル−tRNA合成酵素，フエニルアラニル−tRNA合
成酵素，酵母由来のリジル−tRNA合成酵素，フエニルア
ラニル−tRNA合成酵素，フザリウム由来のフエニルアラ
ニル−tRNA合成酵素，バチルス・ステアロサーモフイル
ス等の耐熱性細菌由来のロイシル−tRNA合成酵素，羊肝
細胞由来のフエニルアラニル−tRNA合成酵素等が具体例
としてあげることができる。

また，アミノ酸としては，例えば，チロシン，アラニ
ン，ロイシン，イソロイシン，フエニルアラニン，メチ
オニン，リジン，セリン，バリン，アスパラギン，アス
パラギン酸，グリシン，グルタミン，グルタミン酸，シ
ステイン，トレオニン，トリプトフアン，ヒスチジン，
プロリン，アルギニン等のα−アミノ酸があげられ,L
体,D体のいずれでもよい。

このとき，アミノアシル−tRNA合成酵素は，アミノ酸に
特異性のあるものが用いられ，例えば，ロイシンに特異
性のあるものとしては，ロイシル−tRNA合成酵素が用い
られる。

さらに,AMPをADPに変換する酵素としては，例えば，ア
デニル酸キナーゼが使用され，この際,AMPへのリン酸供
与体としては,ATPが使用される。また,ADPをATPに変換
する酵素としては，酢酸キナーゼ，カルバミン酸キナー
ゼ，クレアチンキナーゼ,3−ホスホグリセリン酸キナー
ゼ，ピルビン酸キナーゼ，ポリリン酸キナーゼ等，多く
のものが使用できるが，酵素の入手の容易さ等を勘案す
ると，酢酸キナーゼを使用するのが最も有利であり，こ
の際，リン酸供与体としては，アセチルリン酸が使用さ
れる。アセチルリン酸は，アンモニウム塩，カリウム・
リチウム塩，ナトリウム塩等の塩として使用することが
できるが，入手のしやすさから二ナトリウム塩を用いる
ことが好ましい。

このように，アデニル酸キナーゼと酢酸キナーゼを使用
するに際して，各酵素のリン酸供与体としては,ATPとア
セチルリン酸を使用することになるが，リン酸供与体と
してのATPは，最終変換物であるATPを循環使用すること
ができるので，結局リン酸供与体としてはアセチルリン
酸だけを供給すればよいことになる。

本発明において，Ap₄Aと医用材料とを固定化させるに
は，種々の方法で行うことができる。例えば，構造物が
カルボキシル基，アミノ基，クロロホルミル基，クロル
トリアジニル基，アジド基，ジアゾニウム基の塩，エポ
キシ基，ホルミル基，酸無水物基，ブロモアセチル基，
イソシアナート基，イミノカーボネート基等の共有結合
を形成しうる反応性官能基，あるいはアミノ基，アンモ
ニウム基，カルボキシル基，カルボキシレート基，スル
ホキシル基，スルホネート基，ホスホニウム基，スルホ
ニウム基等のイオン交換基を有する場合は，Ap₄Aを含む
溶液にて構造物を処理することにより，Ap₄Aを構造物に
共有結合させるか，あるいはイオン結合させることがで
きる。また，構造物が共有結合を形成しうる官能基及び
イオン交換基を有しない場合は，予め構造物にそれらの
基を高分子反応により導入した後，Ap₄Aをその構造物に
結合させることができる。

種々の構造物にAp₄Aを結合させる例を以下に列記する。

（１）絹，コラーゲン，カゼイン，ゼラチン等の蛋白質
は，共有結合を形成しうる官能基でもあり，かつイオン
交換基でもあるアミノ基及びカルボキシル基を有するも
ので，蛋白質を素材とする構造物の場合には，前処理を
しなくてもAp₄Aを共有結合させるか，あるいはイオン結
合させることができる。共有結合させる場合は，ジシク
ロヘキシルカルボジイミド,1−シクロヘキシル−３−
（２−モルホリニノエチル）−カルボジイミド−メト−
Ｐ−トルエンスルホネート等の脱水縮合剤を用いるのが
好ましい。

（２）木綿，再生セルロース，セルロースアセテート等
のセルロースあるいはセルロース誘導体，あるいはポリ
ビニルアルコールを素材とする構造物の場合は，それら
の構造物をグルタルアルデヒド，ジアルデヒドでんぷん
等のポリアルデヒドにより処理して構造物にホルミル基
を導入し，しかる後ホルミル基が導入された構造物をAp
₄Aにより処理することにより，Ap₄Aを共有結合させるこ
とができる。ポリアルデヒドの代わりに，ブロムシアン
によりイミノカーボネート基，ブロモアセチルブロミド
によりブロモアセチル基，無水マレイン酸共重合体等の
ポリ無水マレイン酸により酸無水物基，トルエンジイソ
シアナート，ヘキサメチレンジイソシアナート等のポリ
イソシアナートによりイソシアナート基，エチレングリ
コール，テトラメチレングリコール，グリセリン等のポ
リグルシジル誘導体によりエポキシ基，塩化シアヌルに
よりクロルトリアジニル基を構造物に導入することがで
きるので，これらの共有結合を形成しうる官能基を用い
てAp₄Aを結合させることもできる。ホルミル基，イミノ
カーボネート基，ブロモアセチル基，酸無水物基，イソ
シアナート基，エポキシ基，クロルトリアジニル基が導
入された構造物は，ポリエチレンイミン等のポリアミン
により処理することによりアミノ化される。イオン交換
基であるアミノ基を有する構造物には，Ap₄Aをイオン結
合させることができる。

（３）ポリアミドやポリエステルのように，末端カルボ
キシル基を有する高分子物質を素材とする構造物の場合
は，それらの構造物を脱水縮合剤存在下にポリエチレン
イミンで処理し，引き続き無水マレイン酸共重合体で処
理することにより，構造物に酸無水物基が導入される。
酸無水物基が導入された構造物は，Ap₄Aにより処理する
ことにより，Ap₄Aを共有結合させることができる。ポリ
エチレンイミンにより処理して得られたアミノ化構造
物，あるいはそのアミノ化構造物を臭化エチル，エチレ
ンブロムヒドリン等により４級塩化したものには，Ap₄A
をイオン結合させることができる。

（４）カルボキシル基，アミノ基，クロロホルミル基，
クロロトリアジニル基，アジド基，ジアゾニウム基，エ
ポキシ基，ホルミル基，酸無水物基，ブロモアセチル
基，イソシアナート基，イミノカーボネート基などの共
有結合を形成しうる反応性官能基，あるいはアミノ基，
アンモニウム基，カルボキシル基，カルボキシレート
基，スルホキシル基，スルホネート基，ホスホニウム
基，スルホニウム基等のイオン交換基を有する場合は，
Ap₄Aを含む溶液にて構造物を処理することにより，Ap₄A
を構造物に共有結合させるか，あるいはイオン結合させ
ることができる。

また，本発明の抗凝血性医用材料は，次のようにして構
造物にAp₄Aを吸着させることによっても製造することが
できる。

すなわち，構造物を湿潤しうるか，あるいは溶解しうる
溶媒に膨潤し，あるいは溶解し，かつAp₄Aを溶解しうる
溶媒にAp₄Aを溶解し，この溶液により構造物を処理する
ことにより，構造物にAp₄Aを吸着させた抗凝血性医用材
料を製造することができる。この場合，溶媒としては，
例えば，水あるいはメタノール，エタノール，アセト
ン，ジオキサン，テトラヒドロフラン等の一般有機溶媒
が用いられるが，必要ならばこれらは２種以上混合して
用いても差し支えない。さらに，酸，アルカリ，塩等を
添加し，構造物の湿潤性，膨潤性，溶解性，あるいはAp
₄Aの溶解性等を調節することができる。吸着させる場合
も，数種類のAp₄Aを溶解した混合溶液にして構造物を処
理することができる。処理温度は，溶媒の融点以上で，
かつ溶媒の沸点以下であればよいが,0〜100℃の範囲が
特に望ましい。また，処理に際しては，構造物表面を更
新しながら行うことが望ましい。

また，本発明の抗凝血性医用材料は，スポンジ等のゲル
の微細な格子の中にAp₄Aを包み込んだり，ポリマーのゾ
ルにAp₄Aを加えて混合した後，マイクロカプセル，フイ
ルム，板，チユーブ等の構造物に成形加工する混入法に
よっても製造することができる。

また，本発明においては，Ap₄Aと共に線溶活性酵素又は
血液凝固系阻害因子を構造物に結合するか，吸着する
か，混入するかすることができる。ここに用いられる線
溶活性酵素とは，フイブリンの溶解に寄与する酵素をい
い，例えば，プラスミン，プリノラーゼ，ウロキナー
ゼ，ストレプトキナーゼ等があげられる。血液凝固系阻
害因子とは，フイブリンの凝固に関与する因子を阻害す
る物質をいい，例えば，ヘパリン等があげられる。

（実施例） 次に，本発明を実施例により具体的に説明する。

なお，抗血栓性の評価は,R.I.Lee及びP.D.Whiteによっ
て提案された方法（Am.J.Med.Sci.,145巻,495頁,1918
年）に基づいて行うか，あるいは以下のように変法とし
て行った。

すなわち，材料を小片にして，内径10mmの試験管内に入
れ，これにヒトクエン酸血1mlを加え，試験管を１分毎
に傾けて，血液の凝固時間を測定した。また，材料がチ
ューブ形状の場合には,Chandlerの回転チューブ法（A.
B.Chandler,Laboratory Investigation,7巻,110頁,1958
年）により，ヒトクエン酸血をチユーブ内に注入し，Ca
⁺⁺を添加した後の血栓形成時間を用いて血栓形成時間を
測定することにより行った。

実施例１ 内径3mm,外径5mmのナイロン６チユーブの内部に,3N塩酸
を100ml/minの速度で10分間循環した後，イオン交換水
で塩酸を置換洗浄した。この塩酸処理後，チユーブ内を
50ml/minの速度で10％ポリエチレンイミン水溶液100ml
とメタノール500mlとからなる混合液で30℃で１時間循
環した。

次に，ジシクロヘキシルカルボジイミドの5wt％メタノ
ール溶液200mlを添加して，引き続き50ml/minの流速で
６時間循環した。チユーブ内より処理液を流し出した
後，メタノールを循環して洗浄した。チユーブを減圧乾
燥することにより，ポリエチレンイミン処理ナイロンチ
ユーブを得た。

上記のポリエチレンイミン処理ナイロンチユーブに，Ap
₄Aアンモニウム塩（シグマ社製）50mg及び１−（３−ジ
メチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩
酸塩200mgを5mlのイオン交換水に溶かした溶液を,30℃
で50ml/minの速度で６時間循環して処理した。処理後の
チユーブを水洗し，減圧乾燥した。

このようにして得たAp₄A結合ナイロンチユーブを,Chand
ler法で血栓形成時間を測定したところ,40分であった。

比較のため，同一内径の未処理ナイロン６チユーブ及び
医用シリコーンチユーブの血栓形成時間を測定したとこ
ろ，それぞれ10分及び20分であった。

実施例２ 内径3mm,外径4mmのポリエチレンテレフタレートチユー
ブの内部に,4wt％の水酸化ナトリウム水溶液を90℃で１
時間循環した。水酸化ナトリウム溶液を取り出した後,
0.1N塩酸を同様90℃で１時間循環した。水洗後，実施例
１と同様にして,10％ポリエチレンイミンとジシクロヘ
キシルカルボジイミド処理より，ポリエチレンイミン処
理したポリエチレンテレフタレートチユーブを得た。こ
のチユーブを実施例１と同様にしてAp₄A結合チユーブを
得た。

次いで,Chandlerの回転チユーブ法に従って血栓形成時
間を求めた。

その結果，血栓形成時間は45分以上であった。

実施例３ バチルス・ステアロサーモフイルスより調製したロイシ
ル−tRNA合成酵素及びバチルス・ステアロサーモフイル
ス由来の酢酸キナーゼとアデニル酸キナーゼ（生化学工
業社製）を用いて，バツチ法でAp₄Aの合成を行った。

このとき,ATP12.7mM,ロイシン10mM,塩化マグネシウム６
水和物20mM,ピロホスフアターゼ（ベーリンガーマンハ
イム社製）２ユニツト/ml,酢酸キナーゼ30ユニツト/ml,
アデニル酸キナーゼ46ユニツト/ml,ロイシン−tRNA合成
酵素0.25ユニツト/ml,ヘペス緩衝液（pH7.5）100mMから
なる反応溶液に，アセチルリン酸を反応スタート時に１
当り14m mol添加し,40℃で２時間反応させた後,1当
り4.6m molを追加し,2時間反応させた後，さらに１当
り4.6m molを加えた後,5時間反応させた。

得られた反応生成物を，カスタムパツクカートリツジC
₁₈−300Å（ウオーターズ社製）カラムを用いて高速液
体クロマトグラフイーで分離し,5mM（収率約80％）のAp
₄Aを得た。リン核磁気共鳴スペクトルで分析したとこ
ろ，得られたAp₄A中にはジアデノシン−三リン酸,AMP,A
DPは検出されなかった。

このようにして得たAp₄A20mgを用いて，実施例１と同様
にしてポリエチレンイミン処理ナイロン６チユーブにAp
₄Aを結合した。このチユーブは,Chandler法で血栓形成
時間を測定したところ,45分以上であった。

実施例４ バチルス・ステアロサーモフイルス由来の酢酸キナーゼ
とアデニル酸キナーゼ（生化学工業社製），ロイシル−
tRNA合成酵素及びピロホスフアターゼ（ベーリンガーマ
ンハイム社製）を，それぞれCN−Br−活性化セフアロー
ス4B（フアルマシア社製）に固定化した。固定化酢酸キ
ナーゼ300ユニツト，固定化アデニル酸キナーゼ400ユニ
ツト，固定化ロイシル−tRNA合成酵素10ユニツト及び固
定化ピロホスフアターゼ20ユニツトを１つのカラム（カ
ラム容量5ml）に充填した。

次に,10mMの塩化マグネシウムを含む100mMヘペス緩衝液
（pH7.0）に，溶解した10mMのATP,5mMのアセチルリン
酸,10μＭのロイシンからなる原料を，固定化酵素充填
カラムの上端から1ml/hrの流速で供給し，カラムの下端
から反応生成物を連続的に抜き取った。

得られた反応生成物を実施例３と同じ方法により分離
し,4mM（収率約80％）のAp₄Aを得た。

一方,70％ジメチルシラン−30％ヒドロキシプロピルメ
チルシランコポリマーとメチルトリアセトキシシランを
100:5（重量比）の割合でジオキサン５倍容量に混合し
て得た溶液に，ナイロン66製タフタをジオキサンで洗浄
した後，浸漬した。次いで,30分間風乾した後,100℃で1
0分間加熱してシリコーンコートされたナイロンタフタ
を得た。このタフタを5wt％ブロムシアン溶液（pH11）
に浸漬し,pHを11に保ちながら５分間攪拌した。0.1Mの
重炭酸ソーダで洗浄することにより，ブロムシアン活性
化タフタを得た。

次いで,5wt％のヘキサメチレンジアミン水溶液に，上記
のようにして得た活性化タフタを浸漬し,5時間振盪攪拌
した後，イオン交換水で洗浄した。

上記のようにして得たタフタに,5wt％のジシクロヘキシ
ルカルボジイミドのメタノール溶液を加え,30分後にメ
タノール溶液を除き，さらに上記で得た1wt％Ap₄A水溶
液をタフタに加え，浸漬し,4℃で１夜振盪攪拌した後，
イオン交換水で洗浄した。

得られたタフタを小片に切断し，試験管に入れ，ヒトク
エン酸血を用いて，血液凝固時間をLeeとWhiteの方法で
測定した結果,80分であった。

なお，比較のため，Ap₄Aを含まない液で同様のタフタを
浸漬したものでは，凝固時間は20分であった。

実施例５ 実施例１で得られたポリエチレンイミン処理ナイロンチ
ユーブを，臭化エチルを3wt％含有する含水エタノール
溶液（エタノール：水＝1:1重量比）によりチユーブ内
を満たして,3日間放置した後，処理水を流し出し，エタ
ノールで洗浄した。次に,0.05N水酸化ナトリウムにより
チユーブ内を満たして,2時間室温で放置した後，イオン
交換水で洗浄した。

上記のようにして得た４級化処理ナイロンチユーブに，
実施例３で得た5wt％のAp₄Aと，ウロキナーゼ（ミドリ
十字社製）500単位/mlを含む溶液を循環した。室温で５
時間処理した後，水洗して，Ap₄Aとウロキナーゼを共に
固定化したナイロンチユーブを得た。

得られたチユーブを長さ10cmに切り，一方をクリップで
閉じ，ヒトクエン酸血1mlを加え,LeeとWhiteの方法に従
って血液凝固時間を測定したところ,90分であった。

実施例６ ポリヒドロキシエチルメタアクリレートを0.1M炭酸ソー
ダ中に浸し,1N水酸化ナトリウムでpHを11に調製しなが
ら,7wt％のブロムシアン水溶液を加え,4℃で２時間反応
させた。反応後，ポリマーを濾別し,0.1Nの重炭酸ソー
ダで洗浄後，水洗し，活性化ポリマーを得た。これに5w
t％のヘキサメチレンジアミン水溶液を加え,4℃で５時
間反応させた。水洗後,5wt％の１−シクロヘキシル−３
−（２−モルホリニノエチル）−カルボジイミド−メト
−Ｐ−トルエンスルホネートと,5wt％のAp₄Aアンモニウ
ム塩水溶液を加え,10℃で３時間反応させた。反応後，
ポリマーを濾別した後，水洗し，Ap₄A固定化ポリマーを
得た。

得られたポリマーを試験管に入れ,LeeとWhiteの方法に
準じて血液凝固時間を測定したところ,87分であった。

（発明の効果） 本発明の抗凝血性医用材料は，生体高分子を使用しない
ため，非常に安定であり，しかも優れた抗血栓性を有
し，また，その効果が長時間持続する特徴を有するの
で，血液接触医療材料，例えば，人工血管，カテーテ
ル，人工弁，人工心臓，人工肺，人工腎臓，血管縫合糸
等として有用である。

さらに，本発明の抗凝血性医用材料は，それを製造する
操作が非常に簡便であり，かつ原料も安価であるので，
コスト的にも極めて有利なものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】種々の形状を有する構造物からなる医用材
   料において，該構造物にジアデノシン四リン酸が固定化
   されていることを特徴とする抗凝血性医用材料。