JPH0740938B2 - 変異型の糖質加水分解酵素、該酵素の変異遺伝子及び該酵素を用いたオリゴ糖の製造方法 - Google Patents
変異型の糖質加水分解酵素、該酵素の変異遺伝子及び該酵素を用いたオリゴ糖の製造方法Info
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- JPH0740938B2 JPH0740938B2 JP5069303A JP6930393A JPH0740938B2 JP H0740938 B2 JPH0740938 B2 JP H0740938B2 JP 5069303 A JP5069303 A JP 5069303A JP 6930393 A JP6930393 A JP 6930393A JP H0740938 B2 JPH0740938 B2 JP H0740938B2
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- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アミラーゼ及び類縁の
糖質加水分解酵素において酵素の活性中心を構成するチ
ロシン残基を他のアミノ酸残基に置換せしめた糖転移活
性の増強された変異型の糖質加水分解酵素に関する。さ
らに本発明は、前記糖質加水分解酵素を生産する形質転
換体の遺伝子において、前記チロシン残基をコードする
塩基配列を変異せしめた遺伝子、前記チロシン残基を置
換せしめた変異酵素、及び前記変異酵素を用いた種々の
オリゴ糖等の製造方法に関する。
糖質加水分解酵素において酵素の活性中心を構成するチ
ロシン残基を他のアミノ酸残基に置換せしめた糖転移活
性の増強された変異型の糖質加水分解酵素に関する。さ
らに本発明は、前記糖質加水分解酵素を生産する形質転
換体の遺伝子において、前記チロシン残基をコードする
塩基配列を変異せしめた遺伝子、前記チロシン残基を置
換せしめた変異酵素、及び前記変異酵素を用いた種々の
オリゴ糖等の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】近年、
砂糖に代わる虫歯をつくらない人工甘味料として、また
機能性食品の素材等として種々の重合度の各種オリゴ糖
が注目され、実用に供されている。本発明者らはすでに
酵母Saccharomycopsis fibuligera のα−アミラーゼ
（Sfamy ）のアミノ酸配列の８４番目のトリプトファン
残基をロイシン残基に置換せしめた変異α−アミラーゼ
（Sfamy Ｗ８４Ｌ）において、糖転移活性が増強されて
いること、及び該変異α−アミラーゼを用いた重合度７
以上のマルトオリゴ糖の製造方法に関して報告した（特
開平４−１０８３８６号公報）。しかし、この時点では
何故にSfamy Ｗ８４Ｌ酵素では糖転移活性が上昇してい
るのか不明であり、Sfamy 及び他の糖質加水分解酵素に
おいて合理的に糖転移活性を増強する方法の発見には至
っていない。
砂糖に代わる虫歯をつくらない人工甘味料として、また
機能性食品の素材等として種々の重合度の各種オリゴ糖
が注目され、実用に供されている。本発明者らはすでに
酵母Saccharomycopsis fibuligera のα−アミラーゼ
（Sfamy ）のアミノ酸配列の８４番目のトリプトファン
残基をロイシン残基に置換せしめた変異α−アミラーゼ
（Sfamy Ｗ８４Ｌ）において、糖転移活性が増強されて
いること、及び該変異α−アミラーゼを用いた重合度７
以上のマルトオリゴ糖の製造方法に関して報告した（特
開平４−１０８３８６号公報）。しかし、この時点では
何故にSfamy Ｗ８４Ｌ酵素では糖転移活性が上昇してい
るのか不明であり、Sfamy 及び他の糖質加水分解酵素に
おいて合理的に糖転移活性を増強する方法の発見には至
っていない。
【０００３】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、糖
質加水分解酵素の糖転移活性を合理的に増強すべく鋭意
研究を重ねた結果、前記Sfamy のＹ８３残基に相当する
チロシン残基が複数のα−アミラーゼ及びシクロマルト
デキストリングルカノトランスフェラーゼなどのアミラ
ーゼ類縁の糖質加水分解酵素において相同な位置に完全
に保存されていること、これらのチロシン残基は酵素の
活性中心に存在し、そのフェノール性ＯＨ基が酵素反応
の反応中間体への水分子の付与に決定的に重要な機能を
有すると考えられることを見い出した。そして前記チロ
シン残基を他のアミノ酸残基で置換することによって加
水分解反応におけるこのチロシン残基の機能を損なわせ
ることにより、前記糖質加水分解酵素の糖転移活性を増
強することができることを見いだした。本発明はこの知
見に基づきなされるに至ったものである。
質加水分解酵素の糖転移活性を合理的に増強すべく鋭意
研究を重ねた結果、前記Sfamy のＹ８３残基に相当する
チロシン残基が複数のα−アミラーゼ及びシクロマルト
デキストリングルカノトランスフェラーゼなどのアミラ
ーゼ類縁の糖質加水分解酵素において相同な位置に完全
に保存されていること、これらのチロシン残基は酵素の
活性中心に存在し、そのフェノール性ＯＨ基が酵素反応
の反応中間体への水分子の付与に決定的に重要な機能を
有すると考えられることを見い出した。そして前記チロ
シン残基を他のアミノ酸残基で置換することによって加
水分解反応におけるこのチロシン残基の機能を損なわせ
ることにより、前記糖質加水分解酵素の糖転移活性を増
強することができることを見いだした。本発明はこの知
見に基づきなされるに至ったものである。
【０００４】すなわち本発明は （１） α−アミラーゼ及びシクロマルトデキストリン
グルカノトランスフェラーゼからなる群から選ばれる糖
質加水分解酵素において、酵素の活性中心に存在し、反
応中間体に水分子を付与する機能を有するチロシン残基
を他のアミノ酸残基に置換せしめたことを特徴とする変
異型の糖質加水分解酵素、 （２）前記チロシン残基が、３個の直接の触媒残基であ
る酸性アミノ酸残基の５Å以内に存在し、反応中間体に
水分子を付与する機能を有するチロシン残基であること
を特徴とする（１）項記載の変異型の糖質加水分解酵
素、 （３）（１）項記載の変異型の糖質加水分解酵素であっ
て、サッカロミコプスイス フィブリゲラ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｖｌｇｅｒａ）のα
−アミラーゼにおいて、酵素の活性中心に存在し、反応
中間体に水分子を付与する機能を有する、アミノ酸配列
の８３番目のチロシン残基をフェニルアラニン、トリプ
トファン、ロイシン又はアスパラギン残基に置換せしめ
たことを特徴とする変異α−アミラーゼ、 （４）サッカロミコプスイス フィブリゲラ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）の
α−アミラーゼ遺伝子において、酵素の活性中心に存在
して反応中間体に水分子を付与する機能を有するチロシ
ン残基をコードする、構造遺伝子部分の３２５〜３２７
番目の塩基配列（ＴＡＣ）をＴＴＣ、ＴＧＧ、ＣＴＣ又
はＡＡＣに変異せしめたことを特徴とする（１）項記載
の変異型の糖質加水分解酵素を生産する形質転換体の変
異α−アミラーゼ遺伝子、 （５） マルトオリゴ糖を基質とし、（３）項記載の変
異α−アミラーゼを用いて糖転移反応を行うことを特徴
とする重合度７以上のマルトオリゴ糖の製造方法、 （６）（１）項記載の変異型の糖質加水分解酵素であっ
て、バチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃ
ｅｒａｎｓ）のシクロマルトデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼにおいて、酵素の活性中心に存在し、反
応中間体に水分子を付与する機能を有する、アミノ酸配
列の１００番目のチロシン残基をトリプトファン残基に
置換せしめたことを特徴とする変異シクロマルトデキス
トリングルカノトランスフェラーゼ、 （７） バチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍ
ａｃｅｒａｎｓ）のシクロマルトデキストリングルカノ
トランスフェラーゼ遺伝子において、酵素の活性中心に
存在して反応中間体に水分子を付与する機能を有するチ
ロシン残基をコードする、構造遺伝子部分３７９〜３８
１番目の塩基配列（ＴＡＣ）をＴＧＧに変異せしめたこ
とを特徴とする（１）項記載の変異型の糖質加水分解酵
素を生産する形質転換体の変異シクロマルトデキストリ
ングルカノトランスフェラーゼ遺伝子、及び （８） デンプン及びショ糖を基質とし、（６）項記載
の変異シクロマルトデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼを用いて糖転移反応を行うことを特徴とするα−
マルトピラノシル−β−Ｄ−フラクトフラノシド及びα
−マルトトリピラノシル−β−Ｄ−フラクトフラノシド
を高濃度に含むオリゴ糖の製造方法を提供するものであ
る。
グルカノトランスフェラーゼからなる群から選ばれる糖
質加水分解酵素において、酵素の活性中心に存在し、反
応中間体に水分子を付与する機能を有するチロシン残基
を他のアミノ酸残基に置換せしめたことを特徴とする変
異型の糖質加水分解酵素、 （２）前記チロシン残基が、３個の直接の触媒残基であ
る酸性アミノ酸残基の５Å以内に存在し、反応中間体に
水分子を付与する機能を有するチロシン残基であること
を特徴とする（１）項記載の変異型の糖質加水分解酵
素、 （３）（１）項記載の変異型の糖質加水分解酵素であっ
て、サッカロミコプスイス フィブリゲラ（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｖｌｇｅｒａ）のα
−アミラーゼにおいて、酵素の活性中心に存在し、反応
中間体に水分子を付与する機能を有する、アミノ酸配列
の８３番目のチロシン残基をフェニルアラニン、トリプ
トファン、ロイシン又はアスパラギン残基に置換せしめ
たことを特徴とする変異α−アミラーゼ、 （４）サッカロミコプスイス フィブリゲラ（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａ）の
α−アミラーゼ遺伝子において、酵素の活性中心に存在
して反応中間体に水分子を付与する機能を有するチロシ
ン残基をコードする、構造遺伝子部分の３２５〜３２７
番目の塩基配列（ＴＡＣ）をＴＴＣ、ＴＧＧ、ＣＴＣ又
はＡＡＣに変異せしめたことを特徴とする（１）項記載
の変異型の糖質加水分解酵素を生産する形質転換体の変
異α−アミラーゼ遺伝子、 （５） マルトオリゴ糖を基質とし、（３）項記載の変
異α−アミラーゼを用いて糖転移反応を行うことを特徴
とする重合度７以上のマルトオリゴ糖の製造方法、 （６）（１）項記載の変異型の糖質加水分解酵素であっ
て、バチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃ
ｅｒａｎｓ）のシクロマルトデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼにおいて、酵素の活性中心に存在し、反
応中間体に水分子を付与する機能を有する、アミノ酸配
列の１００番目のチロシン残基をトリプトファン残基に
置換せしめたことを特徴とする変異シクロマルトデキス
トリングルカノトランスフェラーゼ、 （７） バチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍ
ａｃｅｒａｎｓ）のシクロマルトデキストリングルカノ
トランスフェラーゼ遺伝子において、酵素の活性中心に
存在して反応中間体に水分子を付与する機能を有するチ
ロシン残基をコードする、構造遺伝子部分３７９〜３８
１番目の塩基配列（ＴＡＣ）をＴＧＧに変異せしめたこ
とを特徴とする（１）項記載の変異型の糖質加水分解酵
素を生産する形質転換体の変異シクロマルトデキストリ
ングルカノトランスフェラーゼ遺伝子、及び （８） デンプン及びショ糖を基質とし、（６）項記載
の変異シクロマルトデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼを用いて糖転移反応を行うことを特徴とするα−
マルトピラノシル−β−Ｄ−フラクトフラノシド及びα
−マルトトリピラノシル−β−Ｄ−フラクトフラノシド
を高濃度に含むオリゴ糖の製造方法を提供するものであ
る。
【０００５】以下に本発明を詳細に説明する。本発明者
らは、すでに報告した変異型Sfamy Ｗ８４Ｌでは、８４
番目のトリプトファン残基を置換したことが隣の８３番
目のチロシン残基（Ｙ８３）に何らかの影響を与え、Ｙ
８３残基の機能を変化させることが糖転移活性を増強さ
せていること、つまり糖転移活性が増強した主要因はＹ
８３残基のもつ機能の喪失によることを見いだした。従
来、酵素活性を発現する上で最も重要なアミノ酸残基
は、そのアミノ酸残基の種類ばかりではなく空間的相対
配置が、異なる生物由来の類縁酵素においてもよく保存
されているという一般的な経験則が知られている。そこ
でSfamy のＹ８３残基に相当するチロシン残基につい
て、酵素の立体構造上での位置をSfamy などの１０種の
生物由来のα−アミラーゼについて調べた。その結果、
チロシン残基の位置が、１０種類のα−アミラーゼのす
べてにおいて完全に保存されていることがわかった。
らは、すでに報告した変異型Sfamy Ｗ８４Ｌでは、８４
番目のトリプトファン残基を置換したことが隣の８３番
目のチロシン残基（Ｙ８３）に何らかの影響を与え、Ｙ
８３残基の機能を変化させることが糖転移活性を増強さ
せていること、つまり糖転移活性が増強した主要因はＹ
８３残基のもつ機能の喪失によることを見いだした。従
来、酵素活性を発現する上で最も重要なアミノ酸残基
は、そのアミノ酸残基の種類ばかりではなく空間的相対
配置が、異なる生物由来の類縁酵素においてもよく保存
されているという一般的な経験則が知られている。そこ
でSfamy のＹ８３残基に相当するチロシン残基につい
て、酵素の立体構造上での位置をSfamy などの１０種の
生物由来のα−アミラーゼについて調べた。その結果、
チロシン残基の位置が、１０種類のα−アミラーゼのす
べてにおいて完全に保存されていることがわかった。
【０００６】検討した十種のα−アミラーゼは次の通り
である。 １．放線菌（ストレプトミセス ヒグロスコピクス St
reptomyces hygroscopicus )； ２．ブタすい臓； ３．枯草菌（バチルス サブチリス B. subtilis）； ４．枯草菌（バチルス サーキュランス B. ciculan
s）； ５．酵母（サッカロミコプスイス フィブリゲラ S. fi
buligera)； ６．黄コウジカビ（アスペルギス オリザエ Aspergil
lus oryzae) ； ７．好熱性枯草菌 （バチルス ステアロサーモフィラス B. Stearothermo
philus）； ８．枯草菌（バチルス リヘンホルミス B. lichenform
is）； ９．枯草菌（バチルス アミロリキファシエンス B. am
yloliquefaciens）； １０．大麦 これら十種類の異なる生物由来のα−アミラーゼについ
て、それらの一時配列並置データに基づき、酵素活性部
位を構成するアミノ酸残基の保存性の高さを、Sfamy 酵
素の立体構造上で比較検討した。その結果、３つの直接
の触媒残基（２つのＡｓｐ残基と１つのＧｌｕ残基）の
５Å以内の近傍にSfamy のＹ８３に相当する１つのＴｙ
ｒ残基が存在し、この４つの残基が前記十種のα−アミ
ラーゼタンパク質中で完全に保存されており、酵素活性
中心を形成していることが明らかになった。ここでSfam
y のＹ８３残基に相当するチロシン残基は、そのフェノ
ール性ＯＨ基により酵素反応中間体への水分子の付与に
重要な機能を有しているものと思われる。
である。 １．放線菌（ストレプトミセス ヒグロスコピクス St
reptomyces hygroscopicus )； ２．ブタすい臓； ３．枯草菌（バチルス サブチリス B. subtilis）； ４．枯草菌（バチルス サーキュランス B. ciculan
s）； ５．酵母（サッカロミコプスイス フィブリゲラ S. fi
buligera)； ６．黄コウジカビ（アスペルギス オリザエ Aspergil
lus oryzae) ； ７．好熱性枯草菌 （バチルス ステアロサーモフィラス B. Stearothermo
philus）； ８．枯草菌（バチルス リヘンホルミス B. lichenform
is）； ９．枯草菌（バチルス アミロリキファシエンス B. am
yloliquefaciens）； １０．大麦 これら十種類の異なる生物由来のα−アミラーゼについ
て、それらの一時配列並置データに基づき、酵素活性部
位を構成するアミノ酸残基の保存性の高さを、Sfamy 酵
素の立体構造上で比較検討した。その結果、３つの直接
の触媒残基（２つのＡｓｐ残基と１つのＧｌｕ残基）の
５Å以内の近傍にSfamy のＹ８３に相当する１つのＴｙ
ｒ残基が存在し、この４つの残基が前記十種のα−アミ
ラーゼタンパク質中で完全に保存されており、酵素活性
中心を形成していることが明らかになった。ここでSfam
y のＹ８３残基に相当するチロシン残基は、そのフェノ
ール性ＯＨ基により酵素反応中間体への水分子の付与に
重要な機能を有しているものと思われる。
【０００７】次に、前記α−アミラーゼにおいて酵素活
性中心を形成するＴｙｒ残基（Ｙ）に着目し、このＹ残
基がα−アミラーゼに類縁する下記のシクロマルトデキ
ストリングルカノトランスフェラーゼにも存在するか否
かを調べた。α−アミラーゼとしてSfamy を用いて両者
のアミノ酸配列を比較した。 ＣＧＴ シクロマルトデキストリングルカノトランスフ
ェラーゼ、枯草菌（バチルス マセランス Bacillus m
acerans ）；両者のアミノ酸一次配列を比較した結果、
相同性のある６つの高保存性領域が確認された。その６
つの高保存性領域のうち、アミノ−末端（Ｎ末端）より
かぞえてはじめに存在する３つの保存性領域のアミノ酸
配列を示す（図１）。着目しているＹ残基（Sfamy 酵素
のＹ８３残基に相当する）は領域１に存在し、シクロマ
ルトデキストリングルカノトランスフェラーゼにおいて
も相同な位置に完全に保存されていた（図１の領域１の
枠内に示される）。また、シクロマルトデキストリング
ルカノトランスフェラーゼにおいても、このＴｙｒ残基
が前記Sfamy と同様に３つの直接の触媒残基（２つのＡ
ｓｐ残基と１つのＧｌｕ残基）の５Å以内の近傍に存在
することがわかった。ここでSfamy のＹ８３残基に相当
するチロシン残基は、ＣＧＴａｓｅでは１００番目に存
在している。さらに図１から、これら３つの高保存性領
域はほぼ一定の間隔で並んでいることが明らかになっ
た。以上の事実と、α−アミラーゼにおいてはこれら３
つの領域に存在するアミノ酸残基（Ｔｙｒ残基、Ｇｌｕ
残基及び２つのＡｓｐ残基）が酵素活性部位を形成して
いることから、前記完全な保存性を有するＹ残基（領域
１に存在し、SfamyのＹ８３残基に相当する）はシクロ
マルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの酵素
活性中心に存在し基質の加水分解反応に決定的に重要な
役割をになうものと考えられる。またチロシン残基はそ
のフェノール性ＯＨ基により酵素反応における反応中間
体への水分子の付与に機能するものと考えられる。
性中心を形成するＴｙｒ残基（Ｙ）に着目し、このＹ残
基がα−アミラーゼに類縁する下記のシクロマルトデキ
ストリングルカノトランスフェラーゼにも存在するか否
かを調べた。α−アミラーゼとしてSfamy を用いて両者
のアミノ酸配列を比較した。 ＣＧＴ シクロマルトデキストリングルカノトランスフ
ェラーゼ、枯草菌（バチルス マセランス Bacillus m
acerans ）；両者のアミノ酸一次配列を比較した結果、
相同性のある６つの高保存性領域が確認された。その６
つの高保存性領域のうち、アミノ−末端（Ｎ末端）より
かぞえてはじめに存在する３つの保存性領域のアミノ酸
配列を示す（図１）。着目しているＹ残基（Sfamy 酵素
のＹ８３残基に相当する）は領域１に存在し、シクロマ
ルトデキストリングルカノトランスフェラーゼにおいて
も相同な位置に完全に保存されていた（図１の領域１の
枠内に示される）。また、シクロマルトデキストリング
ルカノトランスフェラーゼにおいても、このＴｙｒ残基
が前記Sfamy と同様に３つの直接の触媒残基（２つのＡ
ｓｐ残基と１つのＧｌｕ残基）の５Å以内の近傍に存在
することがわかった。ここでSfamy のＹ８３残基に相当
するチロシン残基は、ＣＧＴａｓｅでは１００番目に存
在している。さらに図１から、これら３つの高保存性領
域はほぼ一定の間隔で並んでいることが明らかになっ
た。以上の事実と、α−アミラーゼにおいてはこれら３
つの領域に存在するアミノ酸残基（Ｔｙｒ残基、Ｇｌｕ
残基及び２つのＡｓｐ残基）が酵素活性部位を形成して
いることから、前記完全な保存性を有するＹ残基（領域
１に存在し、SfamyのＹ８３残基に相当する）はシクロ
マルトデキストリングルカノトランスフェラーゼの酵素
活性中心に存在し基質の加水分解反応に決定的に重要な
役割をになうものと考えられる。またチロシン残基はそ
のフェノール性ＯＨ基により酵素反応における反応中間
体への水分子の付与に機能するものと考えられる。
【０００８】これらの事実は、前記２種のアミラーゼ類
縁酵素の糖転移活性を、酵素活性中心を構成するチロシ
ン残基を他のアミノ酸残基で置換することにより増強で
きることを示すものである。次に本発明の変異酵素の作
成方法及び該変異酵素において前記酵素の活性中心に存
在するチロシン残基を置換したことの酵素活性への影響
について述べる。図１の領域１に存在し、前記２種のア
ミラーゼ類縁酵素において完全に保存されているＹ残基
の機能を明らかにするために、２つの酵素（Sfamy とＣ
ＧＴａｓｅ）について、Sfamy のＹ８３残基及びＣＧＴ
ａｓｅのＹ１００残基を他のアミノ酸残基に置換した変
異酵素を作成し、その置換がこれらの酵素の糖質加水分
解活性に与える影響と糖転移活性に与える影響を調べ
た。
縁酵素の糖転移活性を、酵素活性中心を構成するチロシ
ン残基を他のアミノ酸残基で置換することにより増強で
きることを示すものである。次に本発明の変異酵素の作
成方法及び該変異酵素において前記酵素の活性中心に存
在するチロシン残基を置換したことの酵素活性への影響
について述べる。図１の領域１に存在し、前記２種のア
ミラーゼ類縁酵素において完全に保存されているＹ残基
の機能を明らかにするために、２つの酵素（Sfamy とＣ
ＧＴａｓｅ）について、Sfamy のＹ８３残基及びＣＧＴ
ａｓｅのＹ１００残基を他のアミノ酸残基に置換した変
異酵素を作成し、その置換がこれらの酵素の糖質加水分
解活性に与える影響と糖転移活性に与える影響を調べ
た。
【０００９】１．変異型Sfamy α−アミラーゼの１例としてSfamy のＹ８３残基残基を
Ｆ、Ｗ、ＬおよびＮ残基に置換した変異型酵素を作成
し、糖転移活性を確認した。変異遺伝子作成はＫｕｎｋ
ｅｌ法を用いた。まず、Sfamy 酵素遺伝子を含むプラス
ミドｐＳｆα１よりSfamy 構造遺伝子を含むEcoRＩ−Ps
t Ｉ断片（２．５ｋｂ）をＭ１３ファージの、マルチク
ローニングサイトにサブクローニングし、この目的ＤＮ
Ａ断片を含むＭ１３ファージ複製型（ＲＦ）ＤＮＡをウ
ラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｕｎｇ）の欠損大腸菌
株ＣＪ２３６に感染させ、大腸菌培養上清よりファージ
粒子を回収し、これよりウラシル−１本鎖ＤＮＡ（マイ
ナス鎖）を得た。次にこの１本鎖ＤＮＡとＹ残基をコー
ドする暗号部分に変異を含む合成オリゴヌクレオチドを
アニーリングさせ、これにＴ4 ＤＮＡポリメラーゼを作
用させ、１本鎖部分（プラス鎖）を修復し、２本鎖ＤＮ
Ａ（Ｕ−ＲＦ ＤＮＡ）を形成させた。このＤＮＡをｕ
ｎｇ+ の大腸菌に取り込ませ、この大腸菌培養上清より
ファージ粒子を回収し、１本鎖ＤＮＡを得た。この１本
鎖ＤＮＡの塩基配列を解析することにより、目的とする
変異を含むＲＦ ＤＮＡを選択した。このＲＦ ＤＮＡ
よりEcoRＩ−Pst Ｉ断片（２．５ｋｂ）を切り出し、酵
母での発現ベクターＹＥｐ３５１のマルチクローニング
サイトに挿入連結することにより変異酵素の発現ベクタ
ーpSA5 Y83F 、pSA5 Y83W 、pSA5 Y83L 、pSA5 Y83Nを
構築した。
Ｆ、Ｗ、ＬおよびＮ残基に置換した変異型酵素を作成
し、糖転移活性を確認した。変異遺伝子作成はＫｕｎｋ
ｅｌ法を用いた。まず、Sfamy 酵素遺伝子を含むプラス
ミドｐＳｆα１よりSfamy 構造遺伝子を含むEcoRＩ−Ps
t Ｉ断片（２．５ｋｂ）をＭ１３ファージの、マルチク
ローニングサイトにサブクローニングし、この目的ＤＮ
Ａ断片を含むＭ１３ファージ複製型（ＲＦ）ＤＮＡをウ
ラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｕｎｇ）の欠損大腸菌
株ＣＪ２３６に感染させ、大腸菌培養上清よりファージ
粒子を回収し、これよりウラシル−１本鎖ＤＮＡ（マイ
ナス鎖）を得た。次にこの１本鎖ＤＮＡとＹ残基をコー
ドする暗号部分に変異を含む合成オリゴヌクレオチドを
アニーリングさせ、これにＴ4 ＤＮＡポリメラーゼを作
用させ、１本鎖部分（プラス鎖）を修復し、２本鎖ＤＮ
Ａ（Ｕ−ＲＦ ＤＮＡ）を形成させた。このＤＮＡをｕ
ｎｇ+ の大腸菌に取り込ませ、この大腸菌培養上清より
ファージ粒子を回収し、１本鎖ＤＮＡを得た。この１本
鎖ＤＮＡの塩基配列を解析することにより、目的とする
変異を含むＲＦ ＤＮＡを選択した。このＲＦ ＤＮＡ
よりEcoRＩ−Pst Ｉ断片（２．５ｋｂ）を切り出し、酵
母での発現ベクターＹＥｐ３５１のマルチクローニング
サイトに挿入連結することにより変異酵素の発現ベクタ
ーpSA5 Y83F 、pSA5 Y83W 、pSA5 Y83L 、pSA5 Y83Nを
構築した。
【００１０】これら発現ベクターをパン酵母Saccharomy
ces cerevisiae KK4株に形質転換することにより、 KK
4：pSA5 Y83F 、KK4:pSA5 Y83W 、KK4:pSA5 Y83L 、KK
4:pSA5Y83N を得た。同様に野生型酵素遺伝子を含む形
質転換体 KK4：pSA5も作成した。これら形質転換体をＹ
ＰＤ培地で培養し、培養上清より、種々の精製手法によ
り、精製変異酵素SfamyY83F 、SfamyY83W 、SfamyY83L
、SfamyY83N ならびに精製野生型酵素Sfamy を得た。
なお、本発明により造成された４つの変異SfamyY83F 、
SfamyY83W 、SfamyY83L 、SfamyY83N 酵素はいずれも糖
質加水分解活性に比べ糖転移活性が著しく増強されたも
のとなっており、出発基質の重合度により、各々特徴的
な産物を産生する。例えば、マルトヘプタオース（Ｇ
7 ）を基質とする場合には、一部は低分子に分解される
が、大部分はＧ10、Ｇ11、Ｇ12に変換される。マルトペ
ンタオース（Ｇ5 ）を基質とする場合には糖転移産物Ｇ
7 、Ｇ8 が産生され、また、マルトヘキサオース（Ｇ
6 ）からはＧ9 を産生することができる。得られた反応
混合物からは、ゲルろ過法等により分離、精製すること
により、用いた基質から特定な鎖長だけ増したマルトオ
リゴ糖をそれぞれ得ることができる。上記の糖転移酵素
反応の条件としては、例えば温度３０℃、ｐＨ５．５程
度が最適であり、また反応時間は、基質の重合度、濃度
及び酵素濃度により各々異なるが通常は１５分で十分で
ある。
ces cerevisiae KK4株に形質転換することにより、 KK
4：pSA5 Y83F 、KK4:pSA5 Y83W 、KK4:pSA5 Y83L 、KK
4:pSA5Y83N を得た。同様に野生型酵素遺伝子を含む形
質転換体 KK4：pSA5も作成した。これら形質転換体をＹ
ＰＤ培地で培養し、培養上清より、種々の精製手法によ
り、精製変異酵素SfamyY83F 、SfamyY83W 、SfamyY83L
、SfamyY83N ならびに精製野生型酵素Sfamy を得た。
なお、本発明により造成された４つの変異SfamyY83F 、
SfamyY83W 、SfamyY83L 、SfamyY83N 酵素はいずれも糖
質加水分解活性に比べ糖転移活性が著しく増強されたも
のとなっており、出発基質の重合度により、各々特徴的
な産物を産生する。例えば、マルトヘプタオース（Ｇ
7 ）を基質とする場合には、一部は低分子に分解される
が、大部分はＧ10、Ｇ11、Ｇ12に変換される。マルトペ
ンタオース（Ｇ5 ）を基質とする場合には糖転移産物Ｇ
7 、Ｇ8 が産生され、また、マルトヘキサオース（Ｇ
6 ）からはＧ9 を産生することができる。得られた反応
混合物からは、ゲルろ過法等により分離、精製すること
により、用いた基質から特定な鎖長だけ増したマルトオ
リゴ糖をそれぞれ得ることができる。上記の糖転移酵素
反応の条件としては、例えば温度３０℃、ｐＨ５．５程
度が最適であり、また反応時間は、基質の重合度、濃度
及び酵素濃度により各々異なるが通常は１５分で十分で
ある。
【００１１】以下に、前記変異型α−アミラーゼの理化
学的性質を述べる。 （１）作用 本変異酵素は糖転移活性が野生型酵素より著しく増強さ
れており、野生型酵素が糖転移活性を示さない低基質濃
度（２mM）でも変異酵素は強い糖転移活性を示す。マル
トオリゴ糖に作用させると、もとの基質より長鎖のマル
トオリゴ糖を生産する。その生産物は出発基質の重合度
により、おのおの特徴的な産物を生産する。たとえばマ
ルトヘプタオース（Ｇ7 ）を基質とすると、一部は分解
されるが、大部分はＧ10，Ｇ11，Ｇ12に変換される。マ
ルトペンタオース（Ｇ5 ）を基質とするとＧ7 ，Ｇ8 が
生産され、マルトヘキサオース（Ｇ6 ）を基質とすると
Ｇ9 が生産される。 （２）基質特異性 本変異酵素はデンプン、グリコーゲン、マルトオリゴ糖
とよく反応するが、プルラン、デキストラン、セルロー
スとは反応しない。 （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 本変異酵素は４０℃にてｐＨ５．４〜５．６が至適であ
り、ｐＨ４〜１０で安定である。 （４）至適温度 本変異酵素はｐＨ５．５にて至適温度は５０℃である。 （５）失活の条件 本変異酵素はｐＨ５．５、７０℃、１０分間の加熱で１
０％の残存活性を示す。ｐＨ４以下、ｐＨ１０以上で不
安定である。 （６）阻害、活性化及び安定化 本変異酵素は水銀、鉛、EDTAの存在で阻害を受ける。カ
ルシウムイオンで安定化される。 （７）糖転移活性の測定法 酵素反応を所定時間後に停止し、その反応生物をペーパ
ークロマトグラフィーで展開分離し、グルコアミラーゼ
処理により増感し、硝酸銀で発色させた。さらに各スポ
ットの分子種の同定と定量をデンシトメーターにより行
い、酵素反応による産物の経時変化を測定し、糖転移活
性を測定した。 （８）酵素の分子量 本変異酵素の分子量は51,000である（ディスクゲル電気
泳動法）。
学的性質を述べる。 （１）作用 本変異酵素は糖転移活性が野生型酵素より著しく増強さ
れており、野生型酵素が糖転移活性を示さない低基質濃
度（２mM）でも変異酵素は強い糖転移活性を示す。マル
トオリゴ糖に作用させると、もとの基質より長鎖のマル
トオリゴ糖を生産する。その生産物は出発基質の重合度
により、おのおの特徴的な産物を生産する。たとえばマ
ルトヘプタオース（Ｇ7 ）を基質とすると、一部は分解
されるが、大部分はＧ10，Ｇ11，Ｇ12に変換される。マ
ルトペンタオース（Ｇ5 ）を基質とするとＧ7 ，Ｇ8 が
生産され、マルトヘキサオース（Ｇ6 ）を基質とすると
Ｇ9 が生産される。 （２）基質特異性 本変異酵素はデンプン、グリコーゲン、マルトオリゴ糖
とよく反応するが、プルラン、デキストラン、セルロー
スとは反応しない。 （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 本変異酵素は４０℃にてｐＨ５．４〜５．６が至適であ
り、ｐＨ４〜１０で安定である。 （４）至適温度 本変異酵素はｐＨ５．５にて至適温度は５０℃である。 （５）失活の条件 本変異酵素はｐＨ５．５、７０℃、１０分間の加熱で１
０％の残存活性を示す。ｐＨ４以下、ｐＨ１０以上で不
安定である。 （６）阻害、活性化及び安定化 本変異酵素は水銀、鉛、EDTAの存在で阻害を受ける。カ
ルシウムイオンで安定化される。 （７）糖転移活性の測定法 酵素反応を所定時間後に停止し、その反応生物をペーパ
ークロマトグラフィーで展開分離し、グルコアミラーゼ
処理により増感し、硝酸銀で発色させた。さらに各スポ
ットの分子種の同定と定量をデンシトメーターにより行
い、酵素反応による産物の経時変化を測定し、糖転移活
性を測定した。 （８）酵素の分子量 本変異酵素の分子量は51,000である（ディスクゲル電気
泳動法）。
【００１２】２．変異型ＣＧＴａｓｅ α−アミラーゼの類縁酵素の１つとしてBacillus macer
ans のシクロマルトデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）のＹ１００残基（Sfamy のＹ８
３残基に相当する）をＷ残基に置換した変異酵素（ＣＧ
ＴａｓｅＹ１００Ｗ）を作成し、その糖転移活性を確認
した。まず、ＣＧＴａｓｅ遺伝子クローニングを行っ
た。B. macerans ＩＡＭ １２４３株の染色体ＤＮＡを
Ｓａｕ３ＡＩ及びＨｉｎｄIIIで処理した後、ｐＢＲ３
２２に連結し、大腸菌ＨＢ１０１に導入した。ＣＧＴａ
ｓｅ遺伝子を持つクローニング株の検出は、デンプンを
含む寒天培地上でのヨードデンプン反応により行った。
その結果、ＣＧＴａｓｅ遺伝子を含む４ｋｂのＤＮＡが
挿入された組換えプラスミドｐＭＡＣ１を得た。ｐＭＡ
Ｃ１をＳａｕ３ＡＩで部分消化し、プラスミドｐＨＹ３
００ＰＬＫのＢａｍＨＩ部位に挿入連結し、ｐＭＡＡ１
を得た。これをα−アミラーゼの欠損した枯草菌 B. Su
btilis ２０７−２５株に導入し、テトラサイクリン耐
性でデンプン寒天培地上でヨードデンプン反応のハロー
形成能を持つ形質転換株２０７−２５：ｐＭＡＡ１を得
た。B. macerans ＩＡＭ １２４３株と B. Subtilis
２０７−２５：ｐＭＡＡ１培養上清より得られた精製Ｃ
ＧＴａｓｅを可溶性デンプンと反応させ、酵素反応産物
をペーパークロマトグラフィーで分析した。両酵素反応
とも主生産物はα−シクロデキストリンであり、その他
の酵素学的諸性質においても両者は区別できなかった。
さらには、プラスミドｐＭＡＡ１の挿入ＤＮＡ断片の塩
基配列を決定したところ２１４２ｂｐからなるＣＧＴａ
ｓｅの構造遺伝子部分の塩基配列及びアミノ酸配列が明
らかになった。
ans のシクロマルトデキストリングルカノトランスフェ
ラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）のＹ１００残基（Sfamy のＹ８
３残基に相当する）をＷ残基に置換した変異酵素（ＣＧ
ＴａｓｅＹ１００Ｗ）を作成し、その糖転移活性を確認
した。まず、ＣＧＴａｓｅ遺伝子クローニングを行っ
た。B. macerans ＩＡＭ １２４３株の染色体ＤＮＡを
Ｓａｕ３ＡＩ及びＨｉｎｄIIIで処理した後、ｐＢＲ３
２２に連結し、大腸菌ＨＢ１０１に導入した。ＣＧＴａ
ｓｅ遺伝子を持つクローニング株の検出は、デンプンを
含む寒天培地上でのヨードデンプン反応により行った。
その結果、ＣＧＴａｓｅ遺伝子を含む４ｋｂのＤＮＡが
挿入された組換えプラスミドｐＭＡＣ１を得た。ｐＭＡ
Ｃ１をＳａｕ３ＡＩで部分消化し、プラスミドｐＨＹ３
００ＰＬＫのＢａｍＨＩ部位に挿入連結し、ｐＭＡＡ１
を得た。これをα−アミラーゼの欠損した枯草菌 B. Su
btilis ２０７−２５株に導入し、テトラサイクリン耐
性でデンプン寒天培地上でヨードデンプン反応のハロー
形成能を持つ形質転換株２０７−２５：ｐＭＡＡ１を得
た。B. macerans ＩＡＭ １２４３株と B. Subtilis
２０７−２５：ｐＭＡＡ１培養上清より得られた精製Ｃ
ＧＴａｓｅを可溶性デンプンと反応させ、酵素反応産物
をペーパークロマトグラフィーで分析した。両酵素反応
とも主生産物はα−シクロデキストリンであり、その他
の酵素学的諸性質においても両者は区別できなかった。
さらには、プラスミドｐＭＡＡ１の挿入ＤＮＡ断片の塩
基配列を決定したところ２１４２ｂｐからなるＣＧＴａ
ｓｅの構造遺伝子部分の塩基配列及びアミノ酸配列が明
らかになった。
【００１３】変異遺伝子作成はＫｕｎｋｅｌ法を用い
た。まず、ｐＭＡＡ１よりＣＧＴａｓｅ構造遺伝子を含
むＸｂａＩ−EcoRＩ断片（２．５ｋｂ）をＭ１３ファー
ジにサブクローニングし、この目的のＤＮＡ断片を含む
Ｍ１３ファージＲＦ ＤＮＡをｕｎｇ- の大腸菌ＣＪ２
３６に感染させ、大腸菌培養上清よりファージ粒子を回
収し、これよりウラシル−１本鎖ＤＮＡ（マイナス鎖）
を得た。次にこの１本鎖ＤＮＡとＹ１００残基をコード
する暗号部分に変異を含む合成オリゴヌクレオチドをア
ニーリングさせ、１本鎖部分（プラス鎖）を修復し、２
本鎖ＤＮＡ（Ｕ−ＲＦ ＤＮＡ）を形成させた。このＤ
ＮＡをｕｎｇ+ の大腸菌に取り込ませ、この大腸菌培養
上清よりファージ粒子を回収し、ＲＦ ＤＮＡを得た。
このＲＦ ＤＮＡの塩基配列を解析することにより、目
的とする変異を含むＤＮＡ断片（２．５ｋｂのＸｂａＩ
−EcoRＩ断片）を切り出し、 B. Subtilis での発現ベ
クターＰＨＹ３００ＰＬＫのＸｂａＩ，EcoRＩサイトに
挿入連結することにより変異酵素の発現ベクターｐＭＡ
Ａ１ Ｙ１００Ｗを構築した。これら野生型酵素遺伝子
と変異型酵素遺伝子を含む発現ベクターを B. Subtilis
２０７−２５株に形質転換することにより、形質転換
体 B. Subtilis ２０７−２５：ｐＭＡＡ１と２０７−
２５：ｐＭＡＡ１ Ｙ１００Ｗを得た。これら形質転換
体を１％可溶性デンプンを含むＮＢ培地で培養し、培養
上清から種々の精製手法により、精製野生型酵素と精製
変異型酵素ＣＧＴａｓｅＹ１００Ｗを得た。なお、ＣＧ
Ｔａｓｅはデンプンに作用してシクロデキストリンを生
成する以外に、デンプンとともに転移する受容体が存在
するときは、マルトオリゴ糖をそれらの受容体に転移す
るが、本発明により造成された変異酵素ＣＧＴａｓｅＹ
１００Ｗは野生型酵素に比べ糖転移活性が増強されてい
た。例えば、５％可溶性デンプンと５％ショ糖を含む溶
液にＣＧＴａｓｅＹ１００Ｗを作用させる場合には、反
応初期には少量のシクロデキストリンの生成が認められ
るが、反応の後期にはシクロデキストリンは再分解して
消失し、使用したショ糖の５０％が転移作用における受
容体として利用され、製造されたオリゴ糖中にはショ糖
２４％のほかにＧ2 Ｆ（α−マルトピラノシル−β−Ｄ
−フラクトフラノシド）、Ｇ3 Ｆ（α−マルトトリピラ
ノシル−β−Ｄ−フラクトフラノシド）、がそれぞれ２
１％、１２％含まれている。このように変異酵素ＣＧＴ
ａｓｅＹ１００Ｗを用いれば高効率にＧ2 Ｆ、Ｇ3 Ｆを
含むオリゴ糖を製造することができる。上記の糖転移酵
素の反応の条件としては、例えば温度５０℃、ｐＨ５．
５程度が最適であり、また反応時間は、基質濃度及び酵
素濃度により各々異なるが通常は１５分で十分である。
た。まず、ｐＭＡＡ１よりＣＧＴａｓｅ構造遺伝子を含
むＸｂａＩ−EcoRＩ断片（２．５ｋｂ）をＭ１３ファー
ジにサブクローニングし、この目的のＤＮＡ断片を含む
Ｍ１３ファージＲＦ ＤＮＡをｕｎｇ- の大腸菌ＣＪ２
３６に感染させ、大腸菌培養上清よりファージ粒子を回
収し、これよりウラシル−１本鎖ＤＮＡ（マイナス鎖）
を得た。次にこの１本鎖ＤＮＡとＹ１００残基をコード
する暗号部分に変異を含む合成オリゴヌクレオチドをア
ニーリングさせ、１本鎖部分（プラス鎖）を修復し、２
本鎖ＤＮＡ（Ｕ−ＲＦ ＤＮＡ）を形成させた。このＤ
ＮＡをｕｎｇ+ の大腸菌に取り込ませ、この大腸菌培養
上清よりファージ粒子を回収し、ＲＦ ＤＮＡを得た。
このＲＦ ＤＮＡの塩基配列を解析することにより、目
的とする変異を含むＤＮＡ断片（２．５ｋｂのＸｂａＩ
−EcoRＩ断片）を切り出し、 B. Subtilis での発現ベ
クターＰＨＹ３００ＰＬＫのＸｂａＩ，EcoRＩサイトに
挿入連結することにより変異酵素の発現ベクターｐＭＡ
Ａ１ Ｙ１００Ｗを構築した。これら野生型酵素遺伝子
と変異型酵素遺伝子を含む発現ベクターを B. Subtilis
２０７−２５株に形質転換することにより、形質転換
体 B. Subtilis ２０７−２５：ｐＭＡＡ１と２０７−
２５：ｐＭＡＡ１ Ｙ１００Ｗを得た。これら形質転換
体を１％可溶性デンプンを含むＮＢ培地で培養し、培養
上清から種々の精製手法により、精製野生型酵素と精製
変異型酵素ＣＧＴａｓｅＹ１００Ｗを得た。なお、ＣＧ
Ｔａｓｅはデンプンに作用してシクロデキストリンを生
成する以外に、デンプンとともに転移する受容体が存在
するときは、マルトオリゴ糖をそれらの受容体に転移す
るが、本発明により造成された変異酵素ＣＧＴａｓｅＹ
１００Ｗは野生型酵素に比べ糖転移活性が増強されてい
た。例えば、５％可溶性デンプンと５％ショ糖を含む溶
液にＣＧＴａｓｅＹ１００Ｗを作用させる場合には、反
応初期には少量のシクロデキストリンの生成が認められ
るが、反応の後期にはシクロデキストリンは再分解して
消失し、使用したショ糖の５０％が転移作用における受
容体として利用され、製造されたオリゴ糖中にはショ糖
２４％のほかにＧ2 Ｆ（α−マルトピラノシル−β−Ｄ
−フラクトフラノシド）、Ｇ3 Ｆ（α−マルトトリピラ
ノシル−β−Ｄ−フラクトフラノシド）、がそれぞれ２
１％、１２％含まれている。このように変異酵素ＣＧＴ
ａｓｅＹ１００Ｗを用いれば高効率にＧ2 Ｆ、Ｇ3 Ｆを
含むオリゴ糖を製造することができる。上記の糖転移酵
素の反応の条件としては、例えば温度５０℃、ｐＨ５．
５程度が最適であり、また反応時間は、基質濃度及び酵
素濃度により各々異なるが通常は１５分で十分である。
【００１４】以下に、変異型CGTaseの理化学的性質につ
いて述べる。 （１）作用 本変異酵素は糖転移活性が野生型酵素より著しく増強さ
れており、受容体としてショ糖の存在下、可溶性澱粉と
作用させると、グルコシル基、マルトシル基、マルトト
リオシル基を受容体（ショ糖）に転移させ、還元末端に
フラクトースの入った種々の長さのマルトオリゴ糖誘導
体を野生型酵素より高効率に生成する。 （２）基質特異性 本変異酵素はデンプン、マルトオリゴ糖とよく反応する
が、プルラン、デキストラン、セルロースとは反応しな
い。 （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 本変異酵素は４０℃にてｐＨ５．４〜５．６が至適であ
り、ｐＨ３〜１１で安定である。 （４）至適温度 本変異酵素はｐＨ５．５にて至適温度は６０℃である。 （５）失活の条件 本変異酵素はｐＨ５．５、７０℃、１０分間の加熱で３
０％の残存活性を示す。ｐＨ３以下、ｐＨ１１以上で不
安定である。 （６）阻害、活性化及び安定化 本変異酵素は水銀、鉛、EDTAの存在で阻害を受ける。カ
ルシウムイオンで安定化される。 （７）糖転移活性の測定法 酵素反応を所定時間後に停止し、その反応生産物をペー
パークロマトグラフィーで展開分離し、グルコアミラー
ゼ処理により増感し、硝酸銀で発色させた。さらに各ス
ポットの分子種の同定と定量をデンシトメーターにより
行い、酵素反応による生産物の経時変化を測定し、糖転
移活性を測定した。 （８）酵素の分子量 本変異酵素の分子量は74,000である（ディスクゲル電気
泳動法）。
いて述べる。 （１）作用 本変異酵素は糖転移活性が野生型酵素より著しく増強さ
れており、受容体としてショ糖の存在下、可溶性澱粉と
作用させると、グルコシル基、マルトシル基、マルトト
リオシル基を受容体（ショ糖）に転移させ、還元末端に
フラクトースの入った種々の長さのマルトオリゴ糖誘導
体を野生型酵素より高効率に生成する。 （２）基質特異性 本変異酵素はデンプン、マルトオリゴ糖とよく反応する
が、プルラン、デキストラン、セルロースとは反応しな
い。 （３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 本変異酵素は４０℃にてｐＨ５．４〜５．６が至適であ
り、ｐＨ３〜１１で安定である。 （４）至適温度 本変異酵素はｐＨ５．５にて至適温度は６０℃である。 （５）失活の条件 本変異酵素はｐＨ５．５、７０℃、１０分間の加熱で３
０％の残存活性を示す。ｐＨ３以下、ｐＨ１１以上で不
安定である。 （６）阻害、活性化及び安定化 本変異酵素は水銀、鉛、EDTAの存在で阻害を受ける。カ
ルシウムイオンで安定化される。 （７）糖転移活性の測定法 酵素反応を所定時間後に停止し、その反応生産物をペー
パークロマトグラフィーで展開分離し、グルコアミラー
ゼ処理により増感し、硝酸銀で発色させた。さらに各ス
ポットの分子種の同定と定量をデンシトメーターにより
行い、酵素反応による生産物の経時変化を測定し、糖転
移活性を測定した。 （８）酵素の分子量 本変異酵素の分子量は74,000である（ディスクゲル電気
泳動法）。
【００１５】
【発明の効果】本発明の変異型の糖質加水分解酵素は、
酵素活性中心に存在するチロシン残基を変異せしめたこ
とにより野生型よりも糖質加水分解活性が増強されてい
る。該変異型酵素を用いると重合度７以上の特定の重合
度のマルトオリゴ糖や、Ｇ2 Ｆ及びＧ3 Ｆを高濃度に含
むオリゴ糖などを高収率で得ることができる。よって該
変異酵素は、種々のオリゴ糖を工業的規模で量産化しよ
うとする場合において好適に用いられるものである。ま
た本発明の変異遺伝子から、アミラーゼ及び類縁の糖質
分解酵素であって、マルトオリゴ糖などの有用な酵素生
産物を生産するために必要な糖転移活性を合理的に付与
された変異酵素を得ることができる。
酵素活性中心に存在するチロシン残基を変異せしめたこ
とにより野生型よりも糖質加水分解活性が増強されてい
る。該変異型酵素を用いると重合度７以上の特定の重合
度のマルトオリゴ糖や、Ｇ2 Ｆ及びＧ3 Ｆを高濃度に含
むオリゴ糖などを高収率で得ることができる。よって該
変異酵素は、種々のオリゴ糖を工業的規模で量産化しよ
うとする場合において好適に用いられるものである。ま
た本発明の変異遺伝子から、アミラーゼ及び類縁の糖質
分解酵素であって、マルトオリゴ糖などの有用な酵素生
産物を生産するために必要な糖転移活性を合理的に付与
された変異酵素を得ることができる。
【００１６】
【実施例】次に本発明を下記の実施例に基づき、さらに
詳細に説明する。 実施例１ 変異型Sfamy 酵素の作成法 Sfamy の構造遺伝子を部位特異的変位法により変異せし
めた変異遺伝子を作製した。変異遺伝子作成はＫｕｎｋ
ｅｌ法を用いた。Sfamy 遺伝子を含むプラスミドｐＳｆ
α１よりSfamy 構造遺伝子を含むEcoRＩ−Pst Ｉ ＤＮ
Ａ断片（２．５ｋｂ）をＭ１３ファージｍｐ１８のマル
チクローニングサイトに挿入連結した。この目的ＤＮＡ
断片を含むＭ１３ファージ複製型（ＲＦ）ＤＮＡをウラ
シル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｕｎｇ）の欠損した大腸
菌株ＣＪ２３６に感染させ、この感染菌をＬＢ培地（１
％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％食
塩 ０．１％グルコース）で培養し、この培養上清より
ファージ粒子を回収し、これをフェノール抽出すること
によりウラシル含有１本鎖ＤＮＡ（マイナス鎖）を得
た。
詳細に説明する。 実施例１ 変異型Sfamy 酵素の作成法 Sfamy の構造遺伝子を部位特異的変位法により変異せし
めた変異遺伝子を作製した。変異遺伝子作成はＫｕｎｋ
ｅｌ法を用いた。Sfamy 遺伝子を含むプラスミドｐＳｆ
α１よりSfamy 構造遺伝子を含むEcoRＩ−Pst Ｉ ＤＮ
Ａ断片（２．５ｋｂ）をＭ１３ファージｍｐ１８のマル
チクローニングサイトに挿入連結した。この目的ＤＮＡ
断片を含むＭ１３ファージ複製型（ＲＦ）ＤＮＡをウラ
シル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｕｎｇ）の欠損した大腸
菌株ＣＪ２３６に感染させ、この感染菌をＬＢ培地（１
％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％食
塩 ０．１％グルコース）で培養し、この培養上清より
ファージ粒子を回収し、これをフェノール抽出すること
によりウラシル含有１本鎖ＤＮＡ（マイナス鎖）を得
た。
【００１７】次にＹ８３残基（遺伝子暗号：ＴＡＣ）を
フェニルアラニン（遺伝子暗号：ＴＴＣ）、トリプトフ
ァン（遺伝子暗号：ＴＧＧ）、ロイシン（遺伝子暗号：
ＣＴＣ）、アスパラギン（遺伝子暗号：ＡＡＣ）に変換
するために、５′ＴＡＴ ＣＡＴ ＧＧＴ ＴＡＣ Ｔ
ＧＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ３′というオリゴヌクレオチド
の配列のうち下線を付したコドンが目的の上記した４種
のアミノ酸のコドンに変化した２１量体のオリゴヌクレ
オチドを４種類合成した。この合成オリゴヌクレオチド
とウラシル含有１本鎖ＤＮＡをアニーリングさせ、これ
にＴ4 ＤＮＡポリメラーゼとＴ4 ＤＮＡリガーゼを作用
させ、１本鎖部分（プラス鎖）を修復し、２本鎖ＤＮＡ
（Ｕ−ＲＦ ＤＮＡ）を形成させた。このＵ−ＲＦ Ｄ
ＮＡをｕｎｇ+ の大腸菌（ＭＶ１１９０株）に取り込ま
せるとウラシルの含まれた側のＤＮＡはｕｎｇにより分
解され、変異の導入された側のＤＮＡから複製されたフ
ァージ粒子あるいはＲＦ ＤＮＡが得られる。具体的に
は塩化カルシウム法でＤＮＡ受容率が高められたＭＶ１
１９０株にＵ−ＲＦ ＤＮＡを導入し、指示菌（ＭＶ１
１９０）とともにＬＢ固体培地上にまき、３７℃で一夜
保温した。翌日でてきたプラークよりファージ粒子をＴ
Ｅ液（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０））に写し、４℃で保存するととも
に、そのうちの４クローンを各々別々に２ｍｌのＬＢ液
体培地中でＭＶ１１９０株に感染させ、３７℃で７時間
培養した。この培養液を遠心し、その上清よりファージ
粒子をポリエチレングリコール沈殿として回収し、これ
をフェノール処理することにより１本鎖ＤＮＡの単離を
行った。そしてその塩基配列を確認し、変異が正しくは
いったファージクローンを選択した。
フェニルアラニン（遺伝子暗号：ＴＴＣ）、トリプトフ
ァン（遺伝子暗号：ＴＧＧ）、ロイシン（遺伝子暗号：
ＣＴＣ）、アスパラギン（遺伝子暗号：ＡＡＣ）に変換
するために、５′ＴＡＴ ＣＡＴ ＧＧＴ ＴＡＣ Ｔ
ＧＧ ＡＴＧ ＡＡＧ ３′というオリゴヌクレオチド
の配列のうち下線を付したコドンが目的の上記した４種
のアミノ酸のコドンに変化した２１量体のオリゴヌクレ
オチドを４種類合成した。この合成オリゴヌクレオチド
とウラシル含有１本鎖ＤＮＡをアニーリングさせ、これ
にＴ4 ＤＮＡポリメラーゼとＴ4 ＤＮＡリガーゼを作用
させ、１本鎖部分（プラス鎖）を修復し、２本鎖ＤＮＡ
（Ｕ−ＲＦ ＤＮＡ）を形成させた。このＵ−ＲＦ Ｄ
ＮＡをｕｎｇ+ の大腸菌（ＭＶ１１９０株）に取り込ま
せるとウラシルの含まれた側のＤＮＡはｕｎｇにより分
解され、変異の導入された側のＤＮＡから複製されたフ
ァージ粒子あるいはＲＦ ＤＮＡが得られる。具体的に
は塩化カルシウム法でＤＮＡ受容率が高められたＭＶ１
１９０株にＵ−ＲＦ ＤＮＡを導入し、指示菌（ＭＶ１
１９０）とともにＬＢ固体培地上にまき、３７℃で一夜
保温した。翌日でてきたプラークよりファージ粒子をＴ
Ｅ液（１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０））に写し、４℃で保存するととも
に、そのうちの４クローンを各々別々に２ｍｌのＬＢ液
体培地中でＭＶ１１９０株に感染させ、３７℃で７時間
培養した。この培養液を遠心し、その上清よりファージ
粒子をポリエチレングリコール沈殿として回収し、これ
をフェノール処理することにより１本鎖ＤＮＡの単離を
行った。そしてその塩基配列を確認し、変異が正しくは
いったファージクローンを選択した。
【００１８】変異遺伝子の塩基配列の決定はダイデオキ
シ法を用いた。まず構造遺伝子のマイナス鎖に相補性を
示し全構造遺伝子部分をカバーできる１７量体のオリゴ
ヌクレオチド１０種（Ｐ1 からＰ10）を合成した。この
内変異させた部位（構造遺伝子部分の塩基配列の３２５
番目から３２７番目）の５′末端側に位置し、２６７番
目から２８３番目に相当するオリゴヌクレオチドＰ2
（２．５ｎｇ）を先に単離した１本鎖ＤＮＡ（マイナス
鎖）１μｇと加温徐冷でアニールさせた。これに５μＣ
ｉの［α−32Ｐ］ｄＣＴＰと市販のシークエンスイング
キットを用い、３７℃でプラス鎖の伸長反応、ラベル化
反応、ターミネーション反応を行わせた。
シ法を用いた。まず構造遺伝子のマイナス鎖に相補性を
示し全構造遺伝子部分をカバーできる１７量体のオリゴ
ヌクレオチド１０種（Ｐ1 からＰ10）を合成した。この
内変異させた部位（構造遺伝子部分の塩基配列の３２５
番目から３２７番目）の５′末端側に位置し、２６７番
目から２８３番目に相当するオリゴヌクレオチドＰ2
（２．５ｎｇ）を先に単離した１本鎖ＤＮＡ（マイナス
鎖）１μｇと加温徐冷でアニールさせた。これに５μＣ
ｉの［α−32Ｐ］ｄＣＴＰと市販のシークエンスイング
キットを用い、３７℃でプラス鎖の伸長反応、ラベル化
反応、ターミネーション反応を行わせた。
【００１９】この試料を１００℃、２分間保温後、氷中
急冷し、これを８．３Ｍの尿素を含む８％アクリルアミ
ドゲル（厚さ０．２ｍｍ、長さ５０ｃｍ）に添加し、Ｔ
ＢＥ液（１ｍＭのＥＤＴＡを含む４５ｍＭトリス−ホウ
酸緩衝液（ｐＨ８．３））で２時間電気泳動した。電気
泳動後、ゲルをろ紙に移しとり乾燥させ、これを用いて
−８０℃で３時間Ｘ線フィルムを感光させ、オートラジ
オグラムを得た。そしてそこに表われたバンドを順次読
み取ることにより塩基配列の決定を行った。この操作で
３２５番目から３２７番目のチロシン（Ｙ）コドンに相
当する塩基配列部分がフェニルアラニン（Ｆ）、トリプ
トファン（Ｗ）、ロイシン（Ｌ）またはアスパラギン
（Ｎ）コドンに変異したファージクローンが得られた。
これらに関して、さらに他の合成オリゴヌクレオチド９
種を用い、全構造遺伝子の塩基配列の確認を行い、目的
とする変異以外はまったく変異が存在しないことを明ら
かにし、これらのファージクローンをM13SfamyY83F、M1
3SfamyY83W、M13SfamyY83L、M13SfamyY83Nと命名した。
急冷し、これを８．３Ｍの尿素を含む８％アクリルアミ
ドゲル（厚さ０．２ｍｍ、長さ５０ｃｍ）に添加し、Ｔ
ＢＥ液（１ｍＭのＥＤＴＡを含む４５ｍＭトリス−ホウ
酸緩衝液（ｐＨ８．３））で２時間電気泳動した。電気
泳動後、ゲルをろ紙に移しとり乾燥させ、これを用いて
−８０℃で３時間Ｘ線フィルムを感光させ、オートラジ
オグラムを得た。そしてそこに表われたバンドを順次読
み取ることにより塩基配列の決定を行った。この操作で
３２５番目から３２７番目のチロシン（Ｙ）コドンに相
当する塩基配列部分がフェニルアラニン（Ｆ）、トリプ
トファン（Ｗ）、ロイシン（Ｌ）またはアスパラギン
（Ｎ）コドンに変異したファージクローンが得られた。
これらに関して、さらに他の合成オリゴヌクレオチド９
種を用い、全構造遺伝子の塩基配列の確認を行い、目的
とする変異以外はまったく変異が存在しないことを明ら
かにし、これらのファージクローンをM13SfamyY83F、M1
3SfamyY83W、M13SfamyY83L、M13SfamyY83Nと命名した。
【００２０】配列番号１〜４に前記４種の変異型Sfamy
酵素の構造遺伝子部分について塩基配列をアミノ酸配列
とともに示す。これらの配列中にＹ８３残基を置換せし
めたアミノ酸残基をコードする塩基配列には下線を付し
て示した。酵母用の発現ベクターの構築は以下のように
して行った。まず前述した４種のファージクローン（M1
3SfamyY83F、M13SfamyY83W、M13SfamyY83L、M13SfamyY8
3N）を大腸菌ＭＶ１１９０株に感染させ、この菌体内よ
りアルカリ溶菌法によりＲＦ ＤＮＡを単離し、これを
制限酵素EcoRＩとPst Ｉで処理し、アガロース電気泳動
にかけ、変異したα−アミラーゼ遺伝子を含む２．５ｋ
ｂ ＤＮＡ断片を得た。この断片中にはα−アミラーゼ
の発現に必要なプロモーター、ターミネーター領域がも
ともと含まれているので、これを同じ２種の制限酵素で
切り開いた酵母−大腸菌シャトルベクターＹＥｐ３５１
のマルチクローニングサイトに挿入連結した。この組換
えプラスミドで大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｅｕ株を形質転換
し、得られた形質転換体の菌体内よりプラスミドＤＮＡ
をアルカリ溶菌法により単離し、その一部を用い、マル
チクローニングサイトに目的の２．５ｋｂＤＮＡ断片が
挿入されていることを確認し、この組換えプラスミドを
各々、pSA5Y83F、pSA5Y83W 、pSA5Y83L、pSA5Y83Nと命
名した。これら組換え酵母発現ベクター３μｇを用い、
Hinnenらの方法で、パン酵母（サッカロミセス セレビ
ズィエ Saccharomyces cerevisiae）KK4 株を形質転換
し、ベクターのロイシン生合成遺伝子を選択マーカーと
して、４種の形質転換体（ KK4：pSA5Y83F、 KK4：pSA5
Y83W、 KK4：pSA5Y83L、 KK4：pSA5Y83N）を単離した。
ここで宿種菌サッカロマイセス セレビジイエ（Saccha
romyces cerevisiac）KK4 株は公知菌であり、遺伝子マ
ーカー（α，ura 3, his 1/3，trp 1, leu2, gal80 ）
がついたものである。また、酵母ベクターpSA5は酵母ベ
クターYEp351［イースト（Yeast ），1986，2, 163-16
9］のマルチクローニングサイトに酵母サッカロマイコ
プシス（Saccharomycopsis）α−アミラーゼ遺伝子が挿
入されている。
酵素の構造遺伝子部分について塩基配列をアミノ酸配列
とともに示す。これらの配列中にＹ８３残基を置換せし
めたアミノ酸残基をコードする塩基配列には下線を付し
て示した。酵母用の発現ベクターの構築は以下のように
して行った。まず前述した４種のファージクローン（M1
3SfamyY83F、M13SfamyY83W、M13SfamyY83L、M13SfamyY8
3N）を大腸菌ＭＶ１１９０株に感染させ、この菌体内よ
りアルカリ溶菌法によりＲＦ ＤＮＡを単離し、これを
制限酵素EcoRＩとPst Ｉで処理し、アガロース電気泳動
にかけ、変異したα−アミラーゼ遺伝子を含む２．５ｋ
ｂ ＤＮＡ断片を得た。この断片中にはα−アミラーゼ
の発現に必要なプロモーター、ターミネーター領域がも
ともと含まれているので、これを同じ２種の制限酵素で
切り開いた酵母−大腸菌シャトルベクターＹＥｐ３５１
のマルチクローニングサイトに挿入連結した。この組換
えプラスミドで大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｅｕ株を形質転換
し、得られた形質転換体の菌体内よりプラスミドＤＮＡ
をアルカリ溶菌法により単離し、その一部を用い、マル
チクローニングサイトに目的の２．５ｋｂＤＮＡ断片が
挿入されていることを確認し、この組換えプラスミドを
各々、pSA5Y83F、pSA5Y83W 、pSA5Y83L、pSA5Y83Nと命
名した。これら組換え酵母発現ベクター３μｇを用い、
Hinnenらの方法で、パン酵母（サッカロミセス セレビ
ズィエ Saccharomyces cerevisiae）KK4 株を形質転換
し、ベクターのロイシン生合成遺伝子を選択マーカーと
して、４種の形質転換体（ KK4：pSA5Y83F、 KK4：pSA5
Y83W、 KK4：pSA5Y83L、 KK4：pSA5Y83N）を単離した。
ここで宿種菌サッカロマイセス セレビジイエ（Saccha
romyces cerevisiac）KK4 株は公知菌であり、遺伝子マ
ーカー（α，ura 3, his 1/3，trp 1, leu2, gal80 ）
がついたものである。また、酵母ベクターpSA5は酵母ベ
クターYEp351［イースト（Yeast ），1986，2, 163-16
9］のマルチクローニングサイトに酵母サッカロマイコ
プシス（Saccharomycopsis）α−アミラーゼ遺伝子が挿
入されている。
【００２１】パン酵母の形質転換法（Hinnenらの方法）
は以下のようである。ＹＰＤ液体培地でＫＫ４株を３０
℃で一夜培養し、この菌液３ｍｌを１００ｍｌのＹＰＯ
培地に接種し、３０℃で数時間培養した。対数増殖期
（Ｋｌｅｔｔ値が１８０〜２００）に達した時に遠心分
離機で集菌し、４０ｍｌのＴＥ液に洗浄し、菌体を６ｍ
ｌのＴＥ液に懸濁させた。この２ｍｌをＬ字型試験管に
移し、これに２ｍｌの０．２Ｍ酢酸リチウム液を加え、
３０℃で１時間振盪した。さらに０．７ｍｌのグリセロ
ールを加え、これに９０μｇの組換えプラスミドＤＮＡ
を加え撹拌し、３０℃で３０分間保温した。これに４．
５ｍｌの７０％ポリエチレングリコール＃４０００を加
え混和し、３０℃で１時間保温した。次いで４２℃で５
分間加温し、すぐに室温で冷やしたのち、１０．５ｍｌ
の水と混和した。これから遠心分離機で集菌し、再度１
０．５ｍｌの水で菌体を洗浄し、集菌したのち、最終的
に７．５ｍｌの水に懸濁した。この形質転換細胞を含む
懸濁液０．５ｍｌを２．５ｍｌの０．７％ソフト寒天に
まぜ、ブドウ糖を唯一の炭素源として含みロイシンを含
まない固体合成選択培地にまき、３０℃で数日間培養
し、形質転換パン酵母を単離した。これらの形質転換体
（ KK4：pSA5Y83F、 KK4：pSA5Y83W、 KK4：pSA5Y83L、
KK4：pSA5Y83N）は工業技術院生命工学工業技術研究所
に受託番号第FERM P-13494号、同第FERM P-13493号、同
第FERM P-13492号、同第FERM P-13491号として寄託され
ている。また野生型α−アミラーゼ（Sfamy ）遺伝子に
ついても同様な発現ベクターを構築し、これをpSA5と命
名し、形質転換体 KK4：pSA5と命名した。形質転換体 K
K4：pSA5Y83Fは、α−アミラーゼの Y83残基をＦに置換
せしめる遺伝子を含むベクター（pSA5Y83F）を保持して
いる前記 KK4株である。同様に KK4：pSA5Y83Wは Y83残
基をＷに置換せしめる遺伝子を含むベクター（pSA5Y83
W）を、 KK4：pSA5Y83Lは Y83残基をＬに置換せしめる
遺伝子を含むベクター（pSA5Y83L）を、 KK4：pSA5Y83N
は Y83残基をＮに置換せしめる遺伝子を含むベクター
（pSA5Y83N）をそれぞれ保持している。
は以下のようである。ＹＰＤ液体培地でＫＫ４株を３０
℃で一夜培養し、この菌液３ｍｌを１００ｍｌのＹＰＯ
培地に接種し、３０℃で数時間培養した。対数増殖期
（Ｋｌｅｔｔ値が１８０〜２００）に達した時に遠心分
離機で集菌し、４０ｍｌのＴＥ液に洗浄し、菌体を６ｍ
ｌのＴＥ液に懸濁させた。この２ｍｌをＬ字型試験管に
移し、これに２ｍｌの０．２Ｍ酢酸リチウム液を加え、
３０℃で１時間振盪した。さらに０．７ｍｌのグリセロ
ールを加え、これに９０μｇの組換えプラスミドＤＮＡ
を加え撹拌し、３０℃で３０分間保温した。これに４．
５ｍｌの７０％ポリエチレングリコール＃４０００を加
え混和し、３０℃で１時間保温した。次いで４２℃で５
分間加温し、すぐに室温で冷やしたのち、１０．５ｍｌ
の水と混和した。これから遠心分離機で集菌し、再度１
０．５ｍｌの水で菌体を洗浄し、集菌したのち、最終的
に７．５ｍｌの水に懸濁した。この形質転換細胞を含む
懸濁液０．５ｍｌを２．５ｍｌの０．７％ソフト寒天に
まぜ、ブドウ糖を唯一の炭素源として含みロイシンを含
まない固体合成選択培地にまき、３０℃で数日間培養
し、形質転換パン酵母を単離した。これらの形質転換体
（ KK4：pSA5Y83F、 KK4：pSA5Y83W、 KK4：pSA5Y83L、
KK4：pSA5Y83N）は工業技術院生命工学工業技術研究所
に受託番号第FERM P-13494号、同第FERM P-13493号、同
第FERM P-13492号、同第FERM P-13491号として寄託され
ている。また野生型α−アミラーゼ（Sfamy ）遺伝子に
ついても同様な発現ベクターを構築し、これをpSA5と命
名し、形質転換体 KK4：pSA5と命名した。形質転換体 K
K4：pSA5Y83Fは、α−アミラーゼの Y83残基をＦに置換
せしめる遺伝子を含むベクター（pSA5Y83F）を保持して
いる前記 KK4株である。同様に KK4：pSA5Y83Wは Y83残
基をＷに置換せしめる遺伝子を含むベクター（pSA5Y83
W）を、 KK4：pSA5Y83Lは Y83残基をＬに置換せしめる
遺伝子を含むベクター（pSA5Y83L）を、 KK4：pSA5Y83N
は Y83残基をＮに置換せしめる遺伝子を含むベクター
（pSA5Y83N）をそれぞれ保持している。
【００２２】野生型及び変異型α−アミラーゼの発現分
泌と酵素の精製は以下のようにして行った。野生型、変
異型Sfamy 遺伝子を保持する上記５種の形質転換パン酵
母を前述のＹＰＤ液体培地（１リットル）に接種し、３
０℃で５日間振盪培養した。この後培養上清を遠心分離
により得て、これに２０ｇの陰イオン交換樹脂、ＤＥ５
２−セルロース（ワットマン社製）を加え、１時間４℃
で撹拌した。樹脂を沈降させたのち上清を捨て、残った
樹脂を５００ｍｌの２．５ｍＭの塩化カルシウムを含む
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で３回洗浄し、これ
をガラスカラムにつめ、１Ｍ ＮａＣｌを用いた直線勾
配でタンパク質を溶出分画した。各分画の酵素活性はヨ
ウ素デンプン反応で測定した。この活性画分１６ｍｌに
硫酸アンモニウムを８０％飽和になるまで加え、遠心分
離で沈殿を回収した。これを１ｍｌの５０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．５）に溶解し、４０％硫酸アンモニウム飽
和の５０ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化した疎水性クロマトカ
ラムブチルトヨパール６５０（東ソー社製）にかけ、４
０％から０％までの直線的硫酸アンモニウム勾配で溶出
分画した。この活性画分１０ｍｌをＹＭ３０膜（アシコ
ン社製）を用いた限外ろ過で０．２ｍｌに濃縮し、これ
を５０ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化したSuperose１２カラム
（ファルマシア社製）（φ１０×８００ｍｍ）に添加し
ゲルろ過し、野生型ならびに変異型酵素標品を得た。こ
れら酵素標品はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で単一蛋白質バンドを示し、その泳動度は野生型酵素
と変異型酵素は同一であり、その抗原性も一致すること
が野生型酵素に対するマウス腹水抗体と125 Ｉ−プロテ
インＡを用いたウエスタインイムノブロッティングで確
認された。したがって以上のような操作で野生型及び変
異型α−アミラーゼは完全に精製された。
泌と酵素の精製は以下のようにして行った。野生型、変
異型Sfamy 遺伝子を保持する上記５種の形質転換パン酵
母を前述のＹＰＤ液体培地（１リットル）に接種し、３
０℃で５日間振盪培養した。この後培養上清を遠心分離
により得て、これに２０ｇの陰イオン交換樹脂、ＤＥ５
２−セルロース（ワットマン社製）を加え、１時間４℃
で撹拌した。樹脂を沈降させたのち上清を捨て、残った
樹脂を５００ｍｌの２．５ｍＭの塩化カルシウムを含む
５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）で３回洗浄し、これ
をガラスカラムにつめ、１Ｍ ＮａＣｌを用いた直線勾
配でタンパク質を溶出分画した。各分画の酵素活性はヨ
ウ素デンプン反応で測定した。この活性画分１６ｍｌに
硫酸アンモニウムを８０％飽和になるまで加え、遠心分
離で沈殿を回収した。これを１ｍｌの５０ｍＭ酢酸緩衝
液（ｐＨ５．５）に溶解し、４０％硫酸アンモニウム飽
和の５０ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化した疎水性クロマトカ
ラムブチルトヨパール６５０（東ソー社製）にかけ、４
０％から０％までの直線的硫酸アンモニウム勾配で溶出
分画した。この活性画分１０ｍｌをＹＭ３０膜（アシコ
ン社製）を用いた限外ろ過で０．２ｍｌに濃縮し、これ
を５０ｍＭ酢酸緩衝液で平衡化したSuperose１２カラム
（ファルマシア社製）（φ１０×８００ｍｍ）に添加し
ゲルろ過し、野生型ならびに変異型酵素標品を得た。こ
れら酵素標品はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で単一蛋白質バンドを示し、その泳動度は野生型酵素
と変異型酵素は同一であり、その抗原性も一致すること
が野生型酵素に対するマウス腹水抗体と125 Ｉ−プロテ
インＡを用いたウエスタインイムノブロッティングで確
認された。したがって以上のような操作で野生型及び変
異型α−アミラーゼは完全に精製された。
【００２３】また上記により得た変異型酵素が、前記の
各理化学的性質を有することが確認された。
各理化学的性質を有することが確認された。
【００２４】実施例２ 変異型ＣＧＴａｓｅ酵素の作成
法 まず、ＣＧＴａｓｅ遺伝子クローニングを行った。B. m
acerans ＩＡＭ １２４３株の染色体ＤＮＡをＳａｕ３
ＡＩ及びＨｉｎｄ IIIで処理した後、ｐＢＲ３２２に連
結し、大腸菌ＨＢ１０１に導入した。ＣＧＴａｓｅ遺伝
子を持つクローニング株の検出は、デンプンを含む寒天
培地上でのヨードデンプン反応により行った。その結
果、ＣＧＴａｓｅ遺伝子を含む４ｋｂのＤＮＡが挿入さ
れた組換えプラスミドｐＭＡＣ１を得た。ｐＭＡＣ１を
Ｓａｕ３ＡＩで部分消化し、プラスミドｐＨＹ３００Ｐ
ＬＫのＢａｍＨＩ部位に挿入連結し、ｐＭＡＡ１を得
た。これをα−アミラーゼの欠損した枯草菌 B. Subtil
is ２０７−２５株に導入し、テトラサイクリン耐性で
デンプン寒天培地上でヨードデンプン反応のハロー形成
能を持つ形質転換株２０７−２５：ｐＭＡＡ１を得た。
B.maceransＩＡＭ １２４３株と B. Subtilis ２０７
−２５：ｐＭＡＡ１培養上清より得られた精製ＣＧＴａ
ｓｅを可溶性デンプンと反応させ、酵素反応産物をペー
パークロマトグラフィーで分析した。両酵素反応とも主
生産物はα−シクロデキストリンであり、その他の酵素
学的諸性質においても両者は区別できなかった。さらに
は、プラスミドｐＭＡＡ１の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列
を決定したところ２１４２ｂｐからなるＣＧＴａｓｅの
構造遺伝子部分の塩基配列が明らかになった。
法 まず、ＣＧＴａｓｅ遺伝子クローニングを行った。B. m
acerans ＩＡＭ １２４３株の染色体ＤＮＡをＳａｕ３
ＡＩ及びＨｉｎｄ IIIで処理した後、ｐＢＲ３２２に連
結し、大腸菌ＨＢ１０１に導入した。ＣＧＴａｓｅ遺伝
子を持つクローニング株の検出は、デンプンを含む寒天
培地上でのヨードデンプン反応により行った。その結
果、ＣＧＴａｓｅ遺伝子を含む４ｋｂのＤＮＡが挿入さ
れた組換えプラスミドｐＭＡＣ１を得た。ｐＭＡＣ１を
Ｓａｕ３ＡＩで部分消化し、プラスミドｐＨＹ３００Ｐ
ＬＫのＢａｍＨＩ部位に挿入連結し、ｐＭＡＡ１を得
た。これをα−アミラーゼの欠損した枯草菌 B. Subtil
is ２０７−２５株に導入し、テトラサイクリン耐性で
デンプン寒天培地上でヨードデンプン反応のハロー形成
能を持つ形質転換株２０７−２５：ｐＭＡＡ１を得た。
B.maceransＩＡＭ １２４３株と B. Subtilis ２０７
−２５：ｐＭＡＡ１培養上清より得られた精製ＣＧＴａ
ｓｅを可溶性デンプンと反応させ、酵素反応産物をペー
パークロマトグラフィーで分析した。両酵素反応とも主
生産物はα−シクロデキストリンであり、その他の酵素
学的諸性質においても両者は区別できなかった。さらに
は、プラスミドｐＭＡＡ１の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列
を決定したところ２１４２ｂｐからなるＣＧＴａｓｅの
構造遺伝子部分の塩基配列が明らかになった。
【００２５】得られたＣＧＴａｓｅの構造遺伝子を部位
特異的変位法により変異せしめた変異遺伝子を作製し
た。変異遺伝子作成はＫｕｎｋｅｌ法を用いた。ＣＧＴ
ａｓｅ遺伝子を含む前記プラスミドｐＭＡＡ１よりＣＧ
Ｔａｓｅ構造遺伝子を含むＸbaＩ−EcoRＩ断片（２．５
ｋｂ）をＭ１３ファージｍｐ１８のマルチクローニング
サイトに挿入連結した。この目的ＤＮＡ断片を含むＭ１
３ファージＲＦ ＤＮＡをｕｎｇ- の大腸菌ＣＪ２３６
に感染させ、この感染菌をＬＢ培地で培養し、この培養
上清よりファージ粒子を回収し、これをフェノール抽出
することにより、ウラシル含有１本鎖ＤＮＡ（マイナス
鎖）を得た。次にＹ１００残基（遺伝子暗号：ＴＡＣ）
をトリプトファン（遺伝子暗号：ＴＧＧ）に変換するた
めに、５′ＴＡＴ ＣＡＣ ＧＧＴ ＴＡＣ ＴＧＧ
ＧＣＧ ＡＧＧ ３′というオリゴヌクレオチドの配列
のうち下線を付したＴＡＣコドンがＴＧＧコドンに変化
した２１量体のオリゴヌクレオチドを合成した。この合
成オリゴヌクレオチドとウラシル含有１本鎖ＤＮＡをア
ニーリングさせ、これにＴ4 ＤＮＡポリメラーゼとＴ4
ＤＮＡリガーゼを作用させ、１本鎖部分（プラス鎖）を
修復し、２本鎖ＤＮＡ（Ｕ−ＲＦ ＤＮＡ）を形成させ
た。このＵ−ＲＦ ＤＮＡをｕｎｇ+ の大腸菌（ＭＶ１
１９０）に取り込ませるとウラシルの含まれた側のＤＮ
Ａにｕｎｇにより分解され、変異の導入された側のＤＮ
Ａから複製されたファージ粒子あるいはＲＦ ＤＮＡが
得られる。具体的には塩化カルシウム法でＭＶ１１９０
株をＵ−ＲＦ ＤＮＡで形質転換し、指示菌（ＭＶ１１
９０）と共にＬＢ固体培地上にまき、３７℃で一夜保温
の後、でてきたプラークをよりファージ粒子をＴＥ液に
移し、４℃で保存するとともに、そのうちの４クローン
を別々に２ｍｌのＬＢ液体培地中でＭＶ１１９０株に感
染させ、３７℃で７時間培養した。この培養液よりファ
ージ粒子をポリエチレングリコール沈殿として回収し、
これをフェノール処理することにより１本鎖ＤＮＡの単
離を行った。そしてその塩基配列を確認し、ＴＡＣコド
ンがＴＧＧコドンに変異したファージクローンを選択し
た。
特異的変位法により変異せしめた変異遺伝子を作製し
た。変異遺伝子作成はＫｕｎｋｅｌ法を用いた。ＣＧＴ
ａｓｅ遺伝子を含む前記プラスミドｐＭＡＡ１よりＣＧ
Ｔａｓｅ構造遺伝子を含むＸbaＩ−EcoRＩ断片（２．５
ｋｂ）をＭ１３ファージｍｐ１８のマルチクローニング
サイトに挿入連結した。この目的ＤＮＡ断片を含むＭ１
３ファージＲＦ ＤＮＡをｕｎｇ- の大腸菌ＣＪ２３６
に感染させ、この感染菌をＬＢ培地で培養し、この培養
上清よりファージ粒子を回収し、これをフェノール抽出
することにより、ウラシル含有１本鎖ＤＮＡ（マイナス
鎖）を得た。次にＹ１００残基（遺伝子暗号：ＴＡＣ）
をトリプトファン（遺伝子暗号：ＴＧＧ）に変換するた
めに、５′ＴＡＴ ＣＡＣ ＧＧＴ ＴＡＣ ＴＧＧ
ＧＣＧ ＡＧＧ ３′というオリゴヌクレオチドの配列
のうち下線を付したＴＡＣコドンがＴＧＧコドンに変化
した２１量体のオリゴヌクレオチドを合成した。この合
成オリゴヌクレオチドとウラシル含有１本鎖ＤＮＡをア
ニーリングさせ、これにＴ4 ＤＮＡポリメラーゼとＴ4
ＤＮＡリガーゼを作用させ、１本鎖部分（プラス鎖）を
修復し、２本鎖ＤＮＡ（Ｕ−ＲＦ ＤＮＡ）を形成させ
た。このＵ−ＲＦ ＤＮＡをｕｎｇ+ の大腸菌（ＭＶ１
１９０）に取り込ませるとウラシルの含まれた側のＤＮ
Ａにｕｎｇにより分解され、変異の導入された側のＤＮ
Ａから複製されたファージ粒子あるいはＲＦ ＤＮＡが
得られる。具体的には塩化カルシウム法でＭＶ１１９０
株をＵ−ＲＦ ＤＮＡで形質転換し、指示菌（ＭＶ１１
９０）と共にＬＢ固体培地上にまき、３７℃で一夜保温
の後、でてきたプラークをよりファージ粒子をＴＥ液に
移し、４℃で保存するとともに、そのうちの４クローン
を別々に２ｍｌのＬＢ液体培地中でＭＶ１１９０株に感
染させ、３７℃で７時間培養した。この培養液よりファ
ージ粒子をポリエチレングリコール沈殿として回収し、
これをフェノール処理することにより１本鎖ＤＮＡの単
離を行った。そしてその塩基配列を確認し、ＴＡＣコド
ンがＴＧＧコドンに変異したファージクローンを選択し
た。
【００２６】変異遺伝子の塩基配列の決定は、ダイデオ
キシ法を用いた。まず構造遺伝子のマイナス鎖に相補性
を示し、全構造遺伝子部分をカバーできる１７量体のオ
リゴヌクレオチド１４種（Ｑ1 からＱ14）を合成した。
このうち変異させた部位（構造遺伝子部分の塩基配列の
３８０番目から３８１番目）の５′末端側に位置し、３
０１番目から３１７番目に相当するオリゴヌクレオチド
Ｑ3 を先に単離した１本鎖ＤＮＡ（マイナス鎖）と加温
徐冷でアニーリングさせた。これに［α−32Ｐ］ｄＣＴ
Ｐと市販のシークエンシングキットを用い、７℃でプラ
ス鎖伸長、ラベル化反応、ターミネーション反応を行わ
せた。この試料を１００℃、２分間保温後、氷中急冷
し、８．３Ｍ尿素を含む８％アクリルアミドゲルに添加
し、ＴＢＥ液で２時間電気泳動後、ゲルをろ紙に移しと
り乾燥させ、オートラジオグラムを得て塩基配列の決定
を行った。この操作で３７９番目から３８１番目のチロ
シンコドン（ＴＡＣ）がトリプトファンコドン（ＴＧ
Ｇ）に変異したファージクローンが得られた。このクロ
ーンに関し、他の合成オリゴヌクレオチド１３種を用
い、全構造遺伝子の塩基配列確認を行い、目的とする変
異以外は全く変異が存在しないことを明らかにし、この
ファージクローンをＭ１３ＣＧＴａｓｅＹ１００Ｗと命
名した。配列番号５に前記変異型酵素ＣＧＴａｓｅＹ１
００Ｗの構造遺伝子部分について塩基配列をアミノ酸配
列とともに示す。配列中、Ｙ１００残基を置換せしめた
Ｗ残基をコードする塩基配列には下線を付して示した。
キシ法を用いた。まず構造遺伝子のマイナス鎖に相補性
を示し、全構造遺伝子部分をカバーできる１７量体のオ
リゴヌクレオチド１４種（Ｑ1 からＱ14）を合成した。
このうち変異させた部位（構造遺伝子部分の塩基配列の
３８０番目から３８１番目）の５′末端側に位置し、３
０１番目から３１７番目に相当するオリゴヌクレオチド
Ｑ3 を先に単離した１本鎖ＤＮＡ（マイナス鎖）と加温
徐冷でアニーリングさせた。これに［α−32Ｐ］ｄＣＴ
Ｐと市販のシークエンシングキットを用い、７℃でプラ
ス鎖伸長、ラベル化反応、ターミネーション反応を行わ
せた。この試料を１００℃、２分間保温後、氷中急冷
し、８．３Ｍ尿素を含む８％アクリルアミドゲルに添加
し、ＴＢＥ液で２時間電気泳動後、ゲルをろ紙に移しと
り乾燥させ、オートラジオグラムを得て塩基配列の決定
を行った。この操作で３７９番目から３８１番目のチロ
シンコドン（ＴＡＣ）がトリプトファンコドン（ＴＧ
Ｇ）に変異したファージクローンが得られた。このクロ
ーンに関し、他の合成オリゴヌクレオチド１３種を用
い、全構造遺伝子の塩基配列確認を行い、目的とする変
異以外は全く変異が存在しないことを明らかにし、この
ファージクローンをＭ１３ＣＧＴａｓｅＹ１００Ｗと命
名した。配列番号５に前記変異型酵素ＣＧＴａｓｅＹ１
００Ｗの構造遺伝子部分について塩基配列をアミノ酸配
列とともに示す。配列中、Ｙ１００残基を置換せしめた
Ｗ残基をコードする塩基配列には下線を付して示した。
【００２７】次にＭ１３ＣＧＴａｓｅＹ１００Ｗを大腸
菌ＭＶ１１９０に感染させ、この感染菌体内よりアルカ
リ溶菌法よりＲＦ ＤＮＡを単離し、これを制限酵素Ｘ
ｂａＩとEcoRＩ処理し、アガロース電気泳動にかけ、変
異したＣＧＴａｓｅ遺伝子を含む２．５ｋｂ ＤＮＡ断
片を得た。この断片中にはＣＧＴａｓｅの発現に必要な
プロモーター、ターミネーター領域がもともと含まれて
いるので、これを同じ２種の制限酵素で切り開いた枯草
菌用ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＰＬＫ部位に挿入連
結し、ｐＭＡＡ１Ｙ１００Ｗを得た。このプラスミドｐ
ＭＡＡ１Ｙ１００Ｗと野生型ＣＧＴａｓｅ遺伝子を保持
するｐＭＡＡ１でα−アミラーゼ欠損株である枯草菌バ
チルス サブチリス２０７−２５株を形質転換すること
により形質転換体２０７−２５：ｐＭＡＡ１と２０７−
２５：ｐＭＡＡ１Ｙ１００Ｗを得た。ここで宿種菌バチ
ルス サブチリス（Bacillus subtilis ）207-25株は公
知菌であり、遺伝子マーカー（ｍ168 -, hsrM,recE4, am
yEO7, aroI906, leuA8, lys-21 ）がついている。枯草
菌ベクターpMMA1 は枯草菌ベクター pHY300PLK［ジーン
（Gene），1984, 32, 129-135 ］のマルチクローニング
サイトに枯草菌バチルス マセランス（Bacillus macer
ans ）CGTase遺伝子が挿入されている。
菌ＭＶ１１９０に感染させ、この感染菌体内よりアルカ
リ溶菌法よりＲＦ ＤＮＡを単離し、これを制限酵素Ｘ
ｂａＩとEcoRＩ処理し、アガロース電気泳動にかけ、変
異したＣＧＴａｓｅ遺伝子を含む２．５ｋｂ ＤＮＡ断
片を得た。この断片中にはＣＧＴａｓｅの発現に必要な
プロモーター、ターミネーター領域がもともと含まれて
いるので、これを同じ２種の制限酵素で切り開いた枯草
菌用ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＰＬＫ部位に挿入連
結し、ｐＭＡＡ１Ｙ１００Ｗを得た。このプラスミドｐ
ＭＡＡ１Ｙ１００Ｗと野生型ＣＧＴａｓｅ遺伝子を保持
するｐＭＡＡ１でα−アミラーゼ欠損株である枯草菌バ
チルス サブチリス２０７−２５株を形質転換すること
により形質転換体２０７−２５：ｐＭＡＡ１と２０７−
２５：ｐＭＡＡ１Ｙ１００Ｗを得た。ここで宿種菌バチ
ルス サブチリス（Bacillus subtilis ）207-25株は公
知菌であり、遺伝子マーカー（ｍ168 -, hsrM,recE4, am
yEO7, aroI906, leuA8, lys-21 ）がついている。枯草
菌ベクターpMMA1 は枯草菌ベクター pHY300PLK［ジーン
（Gene），1984, 32, 129-135 ］のマルチクローニング
サイトに枯草菌バチルス マセランス（Bacillus macer
ans ）CGTase遺伝子が挿入されている。
【００２８】枯草菌の形質転換は以下のように行った。
バチルス サブチリス２０７−２５株をグルコースを
０．５％含むTryptose Blood寒天ベース（ＴＡＢＡ、デ
イフコ社製）のプレート培地に接種し、３０℃で一晩培
養する。若い菌体をかき取り、１０ｍｌのＣＩ培地（Ｋ
2 ＨＰＯ4 １．４％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．６％、クエ
ン酸ナトリウム・２Ｈ2 Ｏ ０．１％、ＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ ５ｍＭ、グルコース０．５％、カザミノ酸（デ
イフコ社製）０．０２％、Ｌ−トリプトファン５０μｇ
／ｍｌ、要求アミノ酸５０μｇ／ｍｌ、要求塩基１００
μｇ／ｍｌ）に吸光度（６６０ｎｍ）が０．１程度にな
るように植菌し、３６０℃で振とう培養する。対数増殖
期に達したら菌を遠心分離し、２倍溶のＣII培地（Ｌ−
トリプトファン、要求アミノ酸、要求塩基がＣＩ培地の
１０分の１になっており、他の成分はＣＩ培地と同じ）
に懸濁し、再び振とう培養を４０分続け、これに組換え
プラスミドＤＮＡを１０μｇ加えさらに４０分間培養を
続ける。次に遠心分離により菌体を集め、ＬＢ培地１ｍ
ｌに懸濁し、これをテトラサイクリン（２０μｇ／ｍ
ｌ）と１％可溶性デンプンを含むＴＢＡＢ培地にまき、
３６０℃で一夜保温しテトラサイクリンに耐性を持つ形
質転換体（207-25：pMMA1 Y100W ）を得た。形質転換体
（207-25：pMMA1 Y100W ）は、CGTaseのY100残基をＷに
置換せしめる遺伝子を含むベクター（pMMA1 Y100W ）を
保持している前記207-25株である。
バチルス サブチリス２０７−２５株をグルコースを
０．５％含むTryptose Blood寒天ベース（ＴＡＢＡ、デ
イフコ社製）のプレート培地に接種し、３０℃で一晩培
養する。若い菌体をかき取り、１０ｍｌのＣＩ培地（Ｋ
2 ＨＰＯ4 １．４％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．６％、クエ
ン酸ナトリウム・２Ｈ2 Ｏ ０．１％、ＭｇＳＯ4 ・７
Ｈ2 Ｏ ５ｍＭ、グルコース０．５％、カザミノ酸（デ
イフコ社製）０．０２％、Ｌ−トリプトファン５０μｇ
／ｍｌ、要求アミノ酸５０μｇ／ｍｌ、要求塩基１００
μｇ／ｍｌ）に吸光度（６６０ｎｍ）が０．１程度にな
るように植菌し、３６０℃で振とう培養する。対数増殖
期に達したら菌を遠心分離し、２倍溶のＣII培地（Ｌ−
トリプトファン、要求アミノ酸、要求塩基がＣＩ培地の
１０分の１になっており、他の成分はＣＩ培地と同じ）
に懸濁し、再び振とう培養を４０分続け、これに組換え
プラスミドＤＮＡを１０μｇ加えさらに４０分間培養を
続ける。次に遠心分離により菌体を集め、ＬＢ培地１ｍ
ｌに懸濁し、これをテトラサイクリン（２０μｇ／ｍ
ｌ）と１％可溶性デンプンを含むＴＢＡＢ培地にまき、
３６０℃で一夜保温しテトラサイクリンに耐性を持つ形
質転換体（207-25：pMMA1 Y100W ）を得た。形質転換体
（207-25：pMMA1 Y100W ）は、CGTaseのY100残基をＷに
置換せしめる遺伝子を含むベクター（pMMA1 Y100W ）を
保持している前記207-25株である。
【００２９】野生型および変異型ＣＧＴａｓｅの発現分
泌と酵素の精製は以下のようにして行った。野生型およ
び変異型ＣＧＴａｓｅ遺伝子を保持する２種の形質転換
体（２０７−２５：ｐＭＡＡ１、２０７−２５：ｐＭＡ
Ａ１Ｙ１００Ｗ）を１％可溶性デンプンを含むＮＢ培地
（Nutrient broth（デイフコ社製）０．８％、グルコー
ス０．５％、Ｃａ（ＮＯ3 ）2 ５ｍＭ）１リットルに接
種し、３６℃で５日間振とう培養した。その後、遠心分
離により培養上清を得て、これに硫酸アンモニウムを２
５％飽和になるまで加え、水酸化ナトリウム水溶液でｐ
Ｈを６．５とした。この溶液から遠心分離で沈殿を除い
たのち、１５％硫酸アンモニウム存在下（ｐＨ７．８）
で７０℃、３０分間加熱処理、急冷したとうもろこし殿
粉の懸濁液を加え、４℃で一夜撹拌し、とうもろこし澱
粉粒にＣＧＴａｓｅを吸着した。そして、４℃での遠心
分離でＣＧＴａｓｅ−澱粉粒複合体を回収した。この複
合体からのＣＧＴａｓｅの遊離は２．５ｍＭの塩化カル
シウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中で４
０℃、１時間保温することで行なった。遊離したＣＧＴ
ａｓｅは２５ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．５）に透析した。この溶液を同緩衝液で
平衡化したＤＥ−５２セルロースカラムにかけ、同緩衝
液中でのナトリウムの直線勾配（Ｏ−１Ｍ）で溶出させ
た。各画分の酵素活性はヨウ素デンプン反応で測定し
た。この活性画分１０ｍｌをＹＭ３０膜（アミコン社
製）を用いた限外ろ過で０．２ｍｌに濃縮した。これを
同緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（フ
アルマシア社製）（φ１０×８００ｍｍ）に添加し、ゲ
ルろ過することにより、野生型ならびに変異型ＣＧＴａ
ｓｅを得た。これらの酵素標品はＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で単一蛋白質バンドを示し、その泳
動度は野生型酵素と変異型酵素は同一であり、その抗原
性も一致することが確認された。
泌と酵素の精製は以下のようにして行った。野生型およ
び変異型ＣＧＴａｓｅ遺伝子を保持する２種の形質転換
体（２０７−２５：ｐＭＡＡ１、２０７−２５：ｐＭＡ
Ａ１Ｙ１００Ｗ）を１％可溶性デンプンを含むＮＢ培地
（Nutrient broth（デイフコ社製）０．８％、グルコー
ス０．５％、Ｃａ（ＮＯ3 ）2 ５ｍＭ）１リットルに接
種し、３６℃で５日間振とう培養した。その後、遠心分
離により培養上清を得て、これに硫酸アンモニウムを２
５％飽和になるまで加え、水酸化ナトリウム水溶液でｐ
Ｈを６．５とした。この溶液から遠心分離で沈殿を除い
たのち、１５％硫酸アンモニウム存在下（ｐＨ７．８）
で７０℃、３０分間加熱処理、急冷したとうもろこし殿
粉の懸濁液を加え、４℃で一夜撹拌し、とうもろこし澱
粉粒にＣＧＴａｓｅを吸着した。そして、４℃での遠心
分離でＣＧＴａｓｅ−澱粉粒複合体を回収した。この複
合体からのＣＧＴａｓｅの遊離は２．５ｍＭの塩化カル
シウムを含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中で４
０℃、１時間保温することで行なった。遊離したＣＧＴ
ａｓｅは２５ｍＭ塩化カルシウムを含む５０ｍＭ酢酸緩
衝液（ｐＨ５．５）に透析した。この溶液を同緩衝液で
平衡化したＤＥ−５２セルロースカラムにかけ、同緩衝
液中でのナトリウムの直線勾配（Ｏ−１Ｍ）で溶出させ
た。各画分の酵素活性はヨウ素デンプン反応で測定し
た。この活性画分１０ｍｌをＹＭ３０膜（アミコン社
製）を用いた限外ろ過で０．２ｍｌに濃縮した。これを
同緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（フ
アルマシア社製）（φ１０×８００ｍｍ）に添加し、ゲ
ルろ過することにより、野生型ならびに変異型ＣＧＴａ
ｓｅを得た。これらの酵素標品はＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で単一蛋白質バンドを示し、その泳
動度は野生型酵素と変異型酵素は同一であり、その抗原
性も一致することが確認された。
【００３０】また上記により得た変異型酵素が、前記の
各理化学的性質を有することが確認された。
各理化学的性質を有することが確認された。
【００３１】実施例３ ＳｆａｍｙＹ８３残基置換の加
水分解活性、糖転移活性に与える影響 基質マルトヘプタオース（Ｇ7 、２×１０-3Ｍ）と酵素
を２．５ｍＭ塩化カルシウム含有５０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．５）４００μｌ中において３０℃で６０分間
反応させた。この時の酵素濃度は野生型酵素（４×１０
-7Ｍ）、Ｙ８３Ｆ酵素（８×１０-7Ｍ），Ｙ８３Ｗ酵素
（８×１０-7Ｍ），Ｙ８３Ｌ酵素（８×１０-6Ｍ），Ｙ
８３Ｎ酵素（８×１０-6Ｍ）であった。この混合液から
１０分間おきに１００μｌずつ取り出し、３０μｌの氷
酢酸で反応を停止させ、１００℃で５分間加熱すること
で酵素を失活させ、そして試料を濃縮乾固した。次にこ
れを５μｌの蒸留水に溶解し、その２．５μｌを２５×
４０ｃｍのペーパークロマトグラフィーろ紙（ワットマ
ン社製、３ＭＭ）にスポットし、展開溶媒（酢酸エチ
ル：メタノール：水＝３７：４０：２３）を入れた耐圧
性容器内で５５℃で２時間の展開を２回くり返した。そ
ののちろ紙を乾燥させ、これに２００単位のくものすカ
ビ（リゾープス）グルコアミラービを含む５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．５）１０ｍｌを噴霧し、密閉容器内で
５５℃、３０分間保温した。次にろ紙上でグルコアミラ
ーゼ処理されたスポットの検出を硝酸銀発色法で行っ
た。硝酸銀発色はグルコアミラーゼ処理後のろ紙を硝酸
銀のアセトン溶液、アルコール性水酸化ナトリウム液、
定着液の順序で浸漬、乾燥を繰り返すことで行った。基
質と酵素反応生成物の定量はペーパークロマトグラム上
での硝酸銀発色スポットの発色の強度をデンシトメータ
ーを用いて測定することで求めた。その結果、すべての
変異酵素で基質Ｇ7 から長鎖の糖転移産物Ｇ10，Ｇ11，
Ｇ 12が生ずることが明らかになった。各酵素反応におい
て、基質Ｇ7 の４０％が消化される時点での、基質減少
量に対するマルトデカオース（Ｇ10）よりも長鎖の糖転
移反応産物（Ｇ≧10）の割合（変換率（％））を表１に
示した。またＧ≧10の全量に対するＧ10，Ｇ11，Ｇ12の
組成比（％）も表１に示した。
水分解活性、糖転移活性に与える影響 基質マルトヘプタオース（Ｇ7 、２×１０-3Ｍ）と酵素
を２．５ｍＭ塩化カルシウム含有５０ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ５．５）４００μｌ中において３０℃で６０分間
反応させた。この時の酵素濃度は野生型酵素（４×１０
-7Ｍ）、Ｙ８３Ｆ酵素（８×１０-7Ｍ），Ｙ８３Ｗ酵素
（８×１０-7Ｍ），Ｙ８３Ｌ酵素（８×１０-6Ｍ），Ｙ
８３Ｎ酵素（８×１０-6Ｍ）であった。この混合液から
１０分間おきに１００μｌずつ取り出し、３０μｌの氷
酢酸で反応を停止させ、１００℃で５分間加熱すること
で酵素を失活させ、そして試料を濃縮乾固した。次にこ
れを５μｌの蒸留水に溶解し、その２．５μｌを２５×
４０ｃｍのペーパークロマトグラフィーろ紙（ワットマ
ン社製、３ＭＭ）にスポットし、展開溶媒（酢酸エチ
ル：メタノール：水＝３７：４０：２３）を入れた耐圧
性容器内で５５℃で２時間の展開を２回くり返した。そ
ののちろ紙を乾燥させ、これに２００単位のくものすカ
ビ（リゾープス）グルコアミラービを含む５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ５．５）１０ｍｌを噴霧し、密閉容器内で
５５℃、３０分間保温した。次にろ紙上でグルコアミラ
ーゼ処理されたスポットの検出を硝酸銀発色法で行っ
た。硝酸銀発色はグルコアミラーゼ処理後のろ紙を硝酸
銀のアセトン溶液、アルコール性水酸化ナトリウム液、
定着液の順序で浸漬、乾燥を繰り返すことで行った。基
質と酵素反応生成物の定量はペーパークロマトグラム上
での硝酸銀発色スポットの発色の強度をデンシトメータ
ーを用いて測定することで求めた。その結果、すべての
変異酵素で基質Ｇ7 から長鎖の糖転移産物Ｇ10，Ｇ11，
Ｇ 12が生ずることが明らかになった。各酵素反応におい
て、基質Ｇ7 の４０％が消化される時点での、基質減少
量に対するマルトデカオース（Ｇ10）よりも長鎖の糖転
移反応産物（Ｇ≧10）の割合（変換率（％））を表１に
示した。またＧ≧10の全量に対するＧ10，Ｇ11，Ｇ12の
組成比（％）も表１に示した。
【００３２】
【表１】
【００３３】実施例４ ＳｆａｍｙＹ８３残基置換酵素
の糖転移活性 変異酵素の糖転移反応を解析するために、還元性末端に
ｐ−ニトロフェニル基が導入されたマルトペンタオース
（Ｇ5 −ＰＮＰ）を基質にし、酵素反応産物を高速液体
クロマトグラフィーで定量的に分析した。Ｇ5 −ＰＮＰ
の５０％消化点における反応産物の溶出パターンを野生
型酵素と変異酵素で比較した。野生型酵素は主にＧ5 −
ＰＮＰをＧ3 とＧ2 −ＰＮＰに加水分解し、Ｇ5 −ＰＮ
Ｐより大きい糖転移反応産物はほとんど生成しない。一
方、変異酵素はすべて、Ｐ−ニトロフェニル α−Ｄ−
マルトオクタオサイド（Ｇ8 −ＰＮＰ）を生産し、それ
は全反応産物の５０％を占めた。なお、分解反応産物で
あるＧ3 とＧ2 −ＰＮＰは野生型酵素に比べ、おのおの
３０％と５５％まで減少していた。Ｇ3 がとくに減少し
ているという事実は、分解反応により生じたＧ3 が未反
応の基質（Ｇ5 −ＰＮＰ）の非還元性末端に転移し、Ｇ
8 −ＰＮＰが生成することを示す。加水分解反応と糖転
移反応は酵素反応中間体であるカルボニウムイオン中間
体を水分子と基質分子のいずれが求核攻撃するかで決ま
る。これら変異酵素における糖転移活性の上昇もカルボ
ニウムイオン中間体を含む反応メカニズムで説明でき
る。上述の実験事実より、ＳｆａｍｙのＹ８３残基のフ
ェノール性ＯＨ基はこのカルボニウムイオン中間体への
水分子の付与に決定的に重要な役割を担っており、変異
酵素においてはＹ８３残基が他のアミノ酸残基に置換さ
れることにより、フエノール性ＯＨ基の水分子付与の機
能がそこなわれ、カルボニウムイオン中間体への未反応
の基質の求核攻撃の機会が増し、長鎖糖転移反応産物が
生成することが明らかになった。
の糖転移活性 変異酵素の糖転移反応を解析するために、還元性末端に
ｐ−ニトロフェニル基が導入されたマルトペンタオース
（Ｇ5 −ＰＮＰ）を基質にし、酵素反応産物を高速液体
クロマトグラフィーで定量的に分析した。Ｇ5 −ＰＮＰ
の５０％消化点における反応産物の溶出パターンを野生
型酵素と変異酵素で比較した。野生型酵素は主にＧ5 −
ＰＮＰをＧ3 とＧ2 −ＰＮＰに加水分解し、Ｇ5 −ＰＮ
Ｐより大きい糖転移反応産物はほとんど生成しない。一
方、変異酵素はすべて、Ｐ−ニトロフェニル α−Ｄ−
マルトオクタオサイド（Ｇ8 −ＰＮＰ）を生産し、それ
は全反応産物の５０％を占めた。なお、分解反応産物で
あるＧ3 とＧ2 −ＰＮＰは野生型酵素に比べ、おのおの
３０％と５５％まで減少していた。Ｇ3 がとくに減少し
ているという事実は、分解反応により生じたＧ3 が未反
応の基質（Ｇ5 −ＰＮＰ）の非還元性末端に転移し、Ｇ
8 −ＰＮＰが生成することを示す。加水分解反応と糖転
移反応は酵素反応中間体であるカルボニウムイオン中間
体を水分子と基質分子のいずれが求核攻撃するかで決ま
る。これら変異酵素における糖転移活性の上昇もカルボ
ニウムイオン中間体を含む反応メカニズムで説明でき
る。上述の実験事実より、ＳｆａｍｙのＹ８３残基のフ
ェノール性ＯＨ基はこのカルボニウムイオン中間体への
水分子の付与に決定的に重要な役割を担っており、変異
酵素においてはＹ８３残基が他のアミノ酸残基に置換さ
れることにより、フエノール性ＯＨ基の水分子付与の機
能がそこなわれ、カルボニウムイオン中間体への未反応
の基質の求核攻撃の機会が増し、長鎖糖転移反応産物が
生成することが明らかになった。
【００３４】実施例５ ＳｆａｍｙＹ８３残基置換酵素
の加水分解活性 さらに非還元性末端も還元性末端もともに修飾された基
質３ＫＢ−Ｇ5 −ＣＮＰ（非還元性末端グルコース残基
の３位の水酸基がケトブチル化されたクロロニトロフェ
ニル マルトペンタオース）（小野薬品社製）を用い
て、野生型酵素と変異型酵素の加水分解活性を測定し、
その結果を表２に比較して示した。３ＫＢ−Ｇ5 −ＣＮ
Ｐは両末端が修飾されているので糖転移反応の基質には
なりえず、加水分解活性のみを測定することができる。
の加水分解活性 さらに非還元性末端も還元性末端もともに修飾された基
質３ＫＢ−Ｇ5 −ＣＮＰ（非還元性末端グルコース残基
の３位の水酸基がケトブチル化されたクロロニトロフェ
ニル マルトペンタオース）（小野薬品社製）を用い
て、野生型酵素と変異型酵素の加水分解活性を測定し、
その結果を表２に比較して示した。３ＫＢ−Ｇ5 −ＣＮ
Ｐは両末端が修飾されているので糖転移反応の基質には
なりえず、加水分解活性のみを測定することができる。
【００３５】
【表２】
【００３６】表２の結果よりＹ８３残基のフェノール性
ＯＨ基がなくなった変異酵素Ｙ８３Ｆでは加水分解活性
（ｋｃａｔ／Ｋｍ値）が野生型酵素の１０分の１に低下
しており、変異酵素Ｙ８３ＬやＹ８３Ｎでは１００分の
１にまで低下していることがわかる。これらの結果から
Ｙ８３残基のフェノール性ＯＨ基はカルボニウムイオン
中間体への水分子の付与に決定的に重要な役割をはたす
残基であると考えられる。
ＯＨ基がなくなった変異酵素Ｙ８３Ｆでは加水分解活性
（ｋｃａｔ／Ｋｍ値）が野生型酵素の１０分の１に低下
しており、変異酵素Ｙ８３ＬやＹ８３Ｎでは１００分の
１にまで低下していることがわかる。これらの結果から
Ｙ８３残基のフェノール性ＯＨ基はカルボニウムイオン
中間体への水分子の付与に決定的に重要な役割をはたす
残基であると考えられる。
【００３７】実施例６ ＣＧＴａｓｅＹ１００残基置換
の糖転移活性に与える影響 まず、５％可溶性澱粉と５％ショ糖を含む５０ｍＭ酢酸
緩衝液１００ｍｌ（ｐＨ５．５）に７００ＴＨＵ（Ｔｉ
ｌｄｅｎ−Ｈｕｄｓｏｎ単位）の野生型ＣＧＴａｓｅあ
るいはＣＧＴａｓｅＹ１００Ｗを加え、５０℃で１０時
間反応させた。その後、１００℃で１０分間保温するこ
とで酵素を失活させ、反応産物は凍結乾燥機を用い、濃
縮乾固させた。この乾固物を１０ｍｌの蒸留水に溶解
し、この試料をペーパークロマトグラフィーと高速液体
クロマトグラフィーで分析することにより、反応産物の
分子種と糖組成を調べた。ペーパークロマトグラフィー
は以下のように行なった。分析用試料溶液２．５μｌを
２５×４０ｃｍのペーパークロマトグラフィーろ紙（ワ
ットマン社製、３ＭＭ）にスポットし、展開溶媒（酢酸
エチル：メタノール：水＝３７：４０：２３）を入れた
耐圧性容器内で５５℃で２時間の展開を２回繰り返し
た。その後ろ紙を乾燥させ、これに２００単位のくもの
すカビグルコアミラーゼを含む酢酸緩衝液１０ｍｌを噴
霧し、密閉容器内で５５℃、３０分間保温した。次にろ
紙上でグルコアミラーゼ処理されたスポットの検出を硝
酸銀発色法で行なった。反応産物の定量はペーパークロ
マトグラム上での硝酸銀発色スポットの発色強度をデン
シトメーターを用いて測定することで求めた。その結
果、両酵素反応産物において５種のオリゴ糖のスポット
を検出することができた。
の糖転移活性に与える影響 まず、５％可溶性澱粉と５％ショ糖を含む５０ｍＭ酢酸
緩衝液１００ｍｌ（ｐＨ５．５）に７００ＴＨＵ（Ｔｉ
ｌｄｅｎ−Ｈｕｄｓｏｎ単位）の野生型ＣＧＴａｓｅあ
るいはＣＧＴａｓｅＹ１００Ｗを加え、５０℃で１０時
間反応させた。その後、１００℃で１０分間保温するこ
とで酵素を失活させ、反応産物は凍結乾燥機を用い、濃
縮乾固させた。この乾固物を１０ｍｌの蒸留水に溶解
し、この試料をペーパークロマトグラフィーと高速液体
クロマトグラフィーで分析することにより、反応産物の
分子種と糖組成を調べた。ペーパークロマトグラフィー
は以下のように行なった。分析用試料溶液２．５μｌを
２５×４０ｃｍのペーパークロマトグラフィーろ紙（ワ
ットマン社製、３ＭＭ）にスポットし、展開溶媒（酢酸
エチル：メタノール：水＝３７：４０：２３）を入れた
耐圧性容器内で５５℃で２時間の展開を２回繰り返し
た。その後ろ紙を乾燥させ、これに２００単位のくもの
すカビグルコアミラーゼを含む酢酸緩衝液１０ｍｌを噴
霧し、密閉容器内で５５℃、３０分間保温した。次にろ
紙上でグルコアミラーゼ処理されたスポットの検出を硝
酸銀発色法で行なった。反応産物の定量はペーパークロ
マトグラム上での硝酸銀発色スポットの発色強度をデン
シトメーターを用いて測定することで求めた。その結
果、両酵素反応産物において５種のオリゴ糖のスポット
を検出することができた。
【００３８】次に上述と同様の方法を用い、調整用のペ
ーパークロマトグラムを行ない、この５種のオリゴ糖の
調整を行なった。得られた精製オリゴ糖２００μｇを２
０μｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、
これに１０単位のグルコアミラーゼを加え５０℃で２０
分間保温し、これをＭＩＣゲルカラム（三菱化成社製）
を装備した液体クロマトグラムにかけ、６５℃で糖組成
の分析を行なった。野生型酵素とＣＧＴａｓｅＹ１００
Ｗの酵素反応による糖転移反応産物の種類と組成比を表
３にまとめた。表３をみると、ＣＧＴａｓｅＹ１００Ｗ
酵素反応では使用したショ糖の５０％が転移作用におけ
る受容体として利用され、生成した糖転移反応産物中に
はＧ2Ｆ（α−マルトピラノシル−β−Ｄ−フラクトフ
ラノシド）、Ｇ3 Ｆ（α−マルトトリピラノシル−β−
Ｄ−フラクトフラノシド）及びＧ≧4 Ｆ（さらに長鎖の
生成物）がそれぞれ２１％、１２％及び１０％含まれる
ことがわかる。一方、野生型酵素ではショ糖の２５％が
転移作用における受容体として利用され、反応産物中に
はＧ2 Ｆ、Ｇ3 Ｆ及びＧ≧4 Ｆが各々９％、６％及び５
％含まれていた。これらの結果から、ＣＧＴａｓｅＹ１
００Ｗは野生型酵素に比べ糖転移活性が高まっているこ
とが明らかになった。
ーパークロマトグラムを行ない、この５種のオリゴ糖の
調整を行なった。得られた精製オリゴ糖２００μｇを２
０μｌの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、
これに１０単位のグルコアミラーゼを加え５０℃で２０
分間保温し、これをＭＩＣゲルカラム（三菱化成社製）
を装備した液体クロマトグラムにかけ、６５℃で糖組成
の分析を行なった。野生型酵素とＣＧＴａｓｅＹ１００
Ｗの酵素反応による糖転移反応産物の種類と組成比を表
３にまとめた。表３をみると、ＣＧＴａｓｅＹ１００Ｗ
酵素反応では使用したショ糖の５０％が転移作用におけ
る受容体として利用され、生成した糖転移反応産物中に
はＧ2Ｆ（α−マルトピラノシル−β−Ｄ−フラクトフ
ラノシド）、Ｇ3 Ｆ（α−マルトトリピラノシル−β−
Ｄ−フラクトフラノシド）及びＧ≧4 Ｆ（さらに長鎖の
生成物）がそれぞれ２１％、１２％及び１０％含まれる
ことがわかる。一方、野生型酵素ではショ糖の２５％が
転移作用における受容体として利用され、反応産物中に
はＧ2 Ｆ、Ｇ3 Ｆ及びＧ≧4 Ｆが各々９％、６％及び５
％含まれていた。これらの結果から、ＣＧＴａｓｅＹ１
００Ｗは野生型酵素に比べ糖転移活性が高まっているこ
とが明らかになった。
【００３９】
【表３】
【００４０】
１．配列番号：１ （１）配列の長さ：１４０４ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：２本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） （６）ハイポセティカル配列：Ｎｏ （７）アンチセンス：Ｎｏ （８）起源 （ａ）生物名：なし（合成ＤＮＡ） （ｂ）株名：なし （９）直接の起源 ライブラリー名又はクローン名：プラスミド pSfα1
［アグリク バイオル ケム（Agric. Biol. Chem.）19
85, 49, 3089-3092 ］由来 （１０）配列の特徴 （ａ）特徴を表わす記号：ＣＤＳ （ｂ）存在位置：７８．．１４８２ （ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ （ｄ）他の情報：変異型α−アミラーゼＳｆａｍｙＹ８
３Ｆをコードする構造遺伝子配列 （１１）配列
［アグリク バイオル ケム（Agric. Biol. Chem.）19
85, 49, 3089-3092 ］由来 （１０）配列の特徴 （ａ）特徴を表わす記号：ＣＤＳ （ｂ）存在位置：７８．．１４８２ （ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ （ｄ）他の情報：変異型α−アミラーゼＳｆａｍｙＹ８
３Ｆをコードする構造遺伝子配列 （１１）配列
【００４１】 126 GAA ACT AAT GCT GAT AAA TGG AGA TCA CAG TCT ATT TAT CAA ATT GTC Glu Thr Asn Ala Asp Lys Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr Gln Ile Val 16 174 ACT GAC AGA TTT GCT AGA ACC GAT GGT GAT ACA AGT GCT TCC TGT AAC Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Asp Thr Ser Ala Ser Cys Asn 32 222 ACA GAA GAT AGA CTT TAC TGT GGT GGT TCT TTC CAA GGC ATC ATA AAG Thr Glu Asp Arg Leu Tyr Cys Gly Gly Ser Phe Gln Gly Ile Ile Lys 48 270 AAG TTG GAT TAC ATC AAA GAT ATG GGC TTT ACT GCT ATT TGG ATT TCT Lys Leu Asp Tyr Ile Lys Asp Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser 64 318 CCA GTT GTT GAA AAC ATT CCC GAT AAC ACA GCA TAT GGT TAT GCT TAT Pro Val Val Glu Asn Ile Pro Asp Asn Thr Ala Tyr Gly Tyr Ala Tyr 80 366 CAT GGT TTC TGG ATG AAG AAC ATA TAC AAA ATT AAT GAA AAC TTT GGT His Gly Phe Trp Met Lys Asn Ile Tyr Lys Ile Asn Glu Asn Phe Gly 96 414 ACT GCT GAT GAT TTG AAG TCT TTG GCA CAA GAA TTG CAC GAT CGT GAT Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ser Leu Ala Gln Glu Leu His Asp Arg Asp 112 462 ATG TTG TTA ATG GTG GAT ATC GTT ACC AAC CAT TAC GGC AGT GAT GGC Met Leu Leu Met Val Asp Ile Val Thr Asn His Tyr Gly Ser Asp Gly 128 510 AGT GGA GAT AGT ATC GAT TAC TCA GAG TAC ACC CCG TTC AAC GAC CAA Ser Gly Asp Ser Ile Asp Tyr Ser Glu Tyr Thr Pro Phe Asn Asp Gln 144 558 AAG TAC TTC CAT AAC TAC TGT CTT ATT TCA AAC TAT GAT GAC CAA GCT Lys Tyr Phe His Asn Tyr Cys Leu Ile Ser Asn Tyr Asp Asp Gln Ala 160 606 CAG GTT CAA AGT TGC TGG GAA GGT GAC TCT TCA GTT GCA TTA CCA GAT Gln Val Gln Ser Cys Trp Glu Gly Asp Ser Ser Val Ala Leu Pro Asp 176 654 TTG AGA ACG GAA GAT AGC GAC GTG GCC TCA GTT TTC AAT TCT TGG GTT Leu Arg Thr Glu Asp Ser Asp Val Ala Ser Val Phe Asn Ser Trp Val 192 702 AAA GAT TTT GTT GGC AAT TAC TCA ATT GAT GGT TTA AGA ATT GAT AGT Lys Asp Phe Val Gly Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser 208 750 GCT AAA CAT GTG GAC CAA GGC TTT TTC CCG GAT TTT GTT AGT GCA TCT Ala Lys His Val Asp Gln Gly Phe Phe Pro Asp Phe Val Ser Ala Ser 224 798 GGA GTT TAC TCA GTA GGC GAA GTT TTC CAA GGA GAC CCA GCT TAT ACA Gly Val Tyr Ser Val Gly Glu Val Phe Gln Gly Asp Pro Ala Tyr Thr 240 846 TGC CCA TAC CAA AAT TAC ATT CCA GGG GTT AGT AAT TAT CCA TTG TAC 256 894 TAC CCA ACC ACG AGA TTT TTT AAA ACT ACT GAT TCA AGT TCC AGT GAG Tyr Pro Thr Thr Arg Phe Phe Lys Thr Thr Asp Ser Ser Ser Ser Glu 272 942 TTG ACT CAA ATG ATT TCA AGC GTT GCT TCC AGT TGT TCG GAT CCA ACT Leu Thr Gln Met Ile Ser Ser Val Ala Ser Ser Cys Ser Asp Pro Thr 288 990 TTG TTG ACA AAC TTT GTA GAA AAT CAC GAT AAT GAA AGG TTC GCT TCA Leu Leu Thr Asn Phe Val Glu Asn His Asp Asn Glu Arg Phe Ala Ser 304 1038 ATG ACC AGC GAC CAA AGT TTG ATT TCT AAT GCT ATT GCA TTT GTC CTT Met Thr Ser Asp Gln Ser Leu Ile Ser Asn Ala Ile Ala Phe Val Leu 320 1086 TTG GGT GAT GGT ATT CCT GTC ATT TAC TAT GGA CAA GAA CAA GGC TTG Leu Gly Asp Gly Ile Pro Val Ile Tyr Tyr Gly Gln Glu Gln Gly Leu 336 1134 AGC GGA AAA AGT GAC CCA AAC AAC AGA GAG GCC TTG TGG TTA TCC GGC Ser Gly Lys Ser Asp Pro Asn Asn Arg Glu Ala Leu Trp Leu Ser Gly 352 1182 TAC AAC AAA GAG AGT GAC TAT TAC AAG CTC ATT GCC AAA GCT AAT GCT Tyr Asn Lys Glu Ser Asp Tyr Tyr Lys Leu Ile Ala Lys Ala Asn Ala 368 1230 GCC AGA AAC GCC GCC GTT TAT CAA GAC TCA AGC TAT GCC ACC TCG CAG Ala Arg Asn Ala Ala Val Tyr Gln Asp Ser Ser Tyr Ala Thr Ser Gln 384 1278 CTT TCT GTG ATC TTT TCA AAT GAC CAT GTT ATT GCA ACA AAA AGA GGC Leu Ser Val Ile Phe Ser Asn Asp His Val Ile Ala Thr Lys Arg Gly 400 1326 AGC GTT GTT TCT GTT TTC AAC AAC CTT GGT TCC AGC GGT TCT TCT GAT Ser Val Val Ser Val Phe Asn Asn Leu Gly Ser Ser Gly Ser Ser Asp 416 1374 GTG ACT ATT TCC AAC ACA GGT TAC AGT TCC GGT GAG GAT TTG GTA GAA Val Thr Ile Ser Asn Thr Gly Tyr Ser Ser Gly Glu Asp Leu Val Glu 432 1422 GTT TTG ACA TGC AGT ACT GTT AGC GGC AGC TCT GAC TTA CAA GTT TCT Val Leu Thr Cys Ser Thr Val Ser Gly Ser Ser Asp Leu Gln Val Ser 448 1470 ATC CAA GGT GGT CAA CCA CAA ATC TTT GTT CCT GCT AAA TAT GCT TCT Ile Gln Gly Gly Gln Pro Gln Ile Phe Val Pro Ala Lys Tyr Ala Ser 464 1482 GAC ATT TGT TCA Asp Ile Cys Ser 468
【００４２】２．配列番号：２ （１）配列の長さ：１４０４ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：２本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） （６）ハイポセティカル配列：Ｎｏ （７）アンチセンス：Ｎｏ （８）起源 （ａ）生物名：なし（合成ＤＮＡ） （ｂ）株名：なし （９）直接の起源 ライブラリー名又はクローン名：プラスミド pSfα1
［アグリク バイオル ケム（Agric. Biol. Chem.）19
85, 49, 3089-3092 ］由来 （１０）配列の特徴 （ａ）特徴を表わす記号：ＣＤＳ （ｂ）存在位置：７８．．１４８２ （ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ （ｄ）他の情報：変異型α−アミラーゼＳｆａｍｙＹ８
３Ｗをコードする構造遺伝子配列 （１１）配列
［アグリク バイオル ケム（Agric. Biol. Chem.）19
85, 49, 3089-3092 ］由来 （１０）配列の特徴 （ａ）特徴を表わす記号：ＣＤＳ （ｂ）存在位置：７８．．１４８２ （ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ （ｄ）他の情報：変異型α−アミラーゼＳｆａｍｙＹ８
３Ｗをコードする構造遺伝子配列 （１１）配列
【００４３】 126 GAA ACT AAT GCT GAT AAA TGG AGA TCA CAG TCT ATT TAT CAA ATT GTC Glu Thr Asn Ala Asp Lys Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr Gln Ile Val 16 174 ACT GAC AGA TTT GCT AGA ACC GAT GGT GAT ACA AGT GCT TCC TGT AAC Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Asp Thr Ser Ala Ser Cys Asn 32 222 ACA GAA GAT AGA CTT TAC TGT GGT GGT TCT TTC CAA GGC ATC ATA AAG Thr Glu Asp Arg Leu Tyr Cys Gly Gly Ser Phe Gln Gly Ile Ile Lys 48 270 AAG TTG GAT TAC ATC AAA GAT ATG GGC TTT ACT GCT ATT TGG ATT TCT Lys Leu Asp Tyr Ile Lys Asp Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser 64 318 CCA GTT GTT GAA AAC ATT CCC GAT AAC ACA GCA TAT GGT TAT GCT TAT Pro Val Val Glu Asn Ile Pro Asp Asn Thr Ala Tyr Gly Tyr Ala Tyr 80 366 CAT GGT TGG TGG ATG AAG AAC ATA TAC AAA ATT AAT GAA AAC TTT GGT His Gly Trp Trp Met Lys Asn Ile Tyr Lys Ile Asn Glu Asn Phe Gly 96 414 ACT GCT GAT GAT TTG AAG TCT TTG GCA CAA GAA TTG CAC GAT CGT GAT Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ser Leu Ala Gln Glu Leu His Asp Arg Asp 112 462 ATG TTG TTA ATG GTG GAT ATC GTT ACC AAC CAT TAC GGC AGT GAT GGC Met Leu Leu Met Val Asp Ile Val Thr Asn His Tyr Gly Ser Asp Gly 128 510 AGT GGA GAT AGT ATC GAT TAC TCA GAG TAC ACC CCG TTC AAC GAC CAA Ser Gly Asp Ser Ile Asp Tyr Ser Glu Tyr Thr Pro Phe Asn Asp Gln 144 558 AAG TAC TTC CAT AAC TAC TGT CTT ATT TCA AAC TAT GAT GAC CAA GCT Lys Tyr Phe His Asn Tyr Cys Leu Ile Ser Asn Tyr Asp Asp Gln Ala 160 606 CAG GTT CAA AGT TGC TGG GAA GGT GAC TCT TCA GTT GCA TTA CCA GAT Gln Val Gln Ser Cys Trp Glu Gly Asp Ser Ser Val Ala Leu Pro Asp 176 654 TTG AGA ACG GAA GAT AGC GAC GTG GCC TCA GTT TTC AAT TCT TGG GTT Leu Arg Thr Glu Asp Ser Asp Val Ala Ser Val Phe Asn Ser Trp Val 192 702 AAA GAT TTT GTT GGC AAT TAC TCA ATT GAT GGT TTA AGA ATT GAT AGT Lys Asp Phe Val Gly Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser 208 750 GCT AAA CAT GTG GAC CAA GGC TTT TTC CCG GAT TTT GTT AGT GCA TCT Ala Lys His Val Asp Gln Gly Phe Phe Pro Asp Phe Val Ser Ala Ser 224 798 GGA GTT TAC TCA GTA GGC GAA GTT TTC CAA GGA GAC CCA GCT TAT ACA Gly Val Tyr Ser Val Gly Glu Val Phe Gln Gly Asp Pro Ala Tyr Thr 240 846 TGC CCA TAC CAA AAT TAC ATT CCA GGG GTT AGT AAT TAT CCA TTG TAC Cys Pro Tyr Gln Asn Tyr Ile Pro Gly Val Ser Asn Tyr Pro Leu Tyr 256 TAC CCA ACC ACG AGA TTT TTT AAA ACT ACT GAT TCA AGT TCC AGT GAG Tyr Pro Thr Thr Arg Phe Phe Lys Thr Thr Asp Ser Ser Ser Ser Glu 272 942 TTG ACT CAA ATG ATT TCA AGC GTT GCT TCC AGT TGT TCG GAT CCA ACT Leu Thr Gln Met Ile Ser Ser Val Ala Ser Ser Cys Ser Asp Pro Thr 288 990 TTG TTG ACA AAC TTT GTA GAA AAT CAC GAT AAT GAA AGG TTC GCT TCA Leu Leu Thr Asn Phe Val Glu Asn His Asp Asn Glu Arg Phe Ala Ser 304 1038 ATG ACC AGC GAC CAA AGT TTG ATT TCT AAT GCT ATT GCA TTT GTC CTT Met Thr Ser Asp Gln Ser Leu Ile Ser Asn Ala Ile Ala Phe Val Leu 320 1086 TTG GGT GAT GGT ATT CCT GTC ATT TAC TAT GGA CAA GAA CAA GGC TTG Leu Gly Asp Gly Ile Pro Val Ile Tyr Tyr Gly Gln Glu Gln Gly Leu 336 1134 AGC GGA AAA AGT GAC CCA AAC AAC AGA GAG GCC TTG TGG TTA TCC GGC Ser Gly Lys Ser Asp Pro Asn Asn Arg Glu Ala Leu Trp Leu Ser Gly 352 1182 TAC AAC AAA GAG AGT GAC TAT TAC AAG CTC ATT GCC AAA GCT AAT GCT Tyr Asn Lys Glu Ser Asp Tyr Tyr Lys Leu Ile Ala Lys Ala Asn Ala 368 1230 GCC AGA AAC GCC GCC GTT TAT CAA GAC TCA AGC TAT GCC ACC TCG CAG Ala Arg Asn Ala Ala Val Tyr Gln Asp Ser Ser Tyr Ala Thr Ser Gln 384 1278 CTT TCT GTG ATC TTT TCA AAT GAC CAT GTT ATT GCA ACA AAA AGA GGC Leu Ser Val Ile Phe Ser Asn Asp His Val Ile Ala Thr Lys Arg Gly 400 1326 AGC GTT GTT TCT GTT TTC AAC AAC CTT GGT TCC AGC GGT TCT TCT GAT Ser Val Val Ser Val Phe Asn Asn Leu Gly Ser Ser Gly Ser Ser Asp 416 1374 GTG ACT ATT TCC AAC ACA GGT TAC AGT TCC GGT GAG GAT TTG GTA GAA Val Thr Ile Ser Asn Thr Gly Tyr Ser Ser Gly Glu Asp Leu Val Glu 432 1422 GTT TTG ACA TGC AGT ACT GTT AGC GGC AGC TCT GAC TTA CAA GTT TCT Val Leu Thr Cys Ser Thr Val Ser Gly Ser Ser Asp Leu Gln Val Ser 448 1470 ATC CAA GGT GGT CAA CCA CAA ATC TTT GTT CCT GCT AAA TAT GCT TCT Ile Gln Gly Gly Gln Pro Gln Ile Phe Val Pro Ala Lys Tyr Ala Ser 464 1482 GAC ATT TGT TCA Asp Ile Cys Ser 468
【００４４】３．配列番号：３ （１）配列の長さ：１４０４ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：２本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） （６）ハイポセティカル配列：Ｎｏ （７）アンチセンス：Ｎｏ （８）起源 （ａ）生物名：なし（合成ＤＮＡ） （ｂ）株名：なし （９）直接の起源 ライブラリー名又はクローン名：プラスミド pSfα1
［アグリク バイオル ケム（Agric. Biol. Chem.）19
85, 49, 3089-3092 ］由来 （１０）配列の特徴 （ａ）特徴を表わす記号：ＣＤＳ （ｂ）存在位置：７８．．１４８２ （ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ （ｄ）他の情報：変異型α−アミラーゼＳｆａｍｙＹ８
３Ｌをコードする構造遺伝子配列 （１１）配列
［アグリク バイオル ケム（Agric. Biol. Chem.）19
85, 49, 3089-3092 ］由来 （１０）配列の特徴 （ａ）特徴を表わす記号：ＣＤＳ （ｂ）存在位置：７８．．１４８２ （ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ （ｄ）他の情報：変異型α−アミラーゼＳｆａｍｙＹ８
３Ｌをコードする構造遺伝子配列 （１１）配列
【００４５】 126 GAA ACT AAT GCT GAT AAA TGG AGA TCA CAG TCT ATT TAT CAA ATT GTC Glu Thr Asn Ala Asp Lys Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr Gln Ile Val 16 174 ACT GAC AGA TTT GCT AGA ACC GAT GGT GAT ACA AGT GCT TCC TGT AAC Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Asp Thr Ser Ala Ser Cys Asn 32 222 ACA GAA GAT AGA CTT TAC TGT GGT GGT TCT TTC CAA GGC ATC ATA AAG Thr Glu Asp Arg Leu Tyr Cys Gly Gly Ser Phe Gln Gly Ile Ile Lys 48 270 AAG TTG GAT TAC ATC AAA GAT ATG GGC TTT ACT GCT ATT TGG ATT TCT Lys Leu Asp Tyr Ile Lys Asp Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser 64 318 CCA GTT GTT GAA AAC ATT CCC GAT AAC ACA GCA TAT GGT TAT GCT TAT Pro Val Val Glu Asn Ile Pro Asp Asn Thr Ala Tyr Gly Tyr Ala Tyr 80 366 CAT GGT CTC TGG ATG AAG AAC ATA TAC AAA ATT AAT GAA AAC TTT GGT His Gly Leu Trp Met Lys Asn Ile Tyr Lys Ile Asn Glu Asn Phe Gly 96 414 ACT GCT GAT GAT TTG AAG TCT TTG GCA CAA GAA TTG CAC GAT CGT GAT Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ser Leu Ala Gln Glu Leu His Asp Arg Asp 112 462 ATG TTG TTA ATG GTG GAT ATC GTT ACC AAC CAT TAC GGC AGT GAT GGC Met Leu Leu Met Val Asp Ile Val Thr Asn His Tyr Gly Ser Asp Gly 128 510 AGT GGA GAT AGT ATC GAT TAC TCA GAG TAC ACC CCG TTC AAC GAC CAA Ser Gly Asp Ser Ile Asp Tyr Ser Glu Tyr Thr Pro Phe Asn Asp Gln 144 558 AAG TAC TTC CAT AAC TAC TGT CTT ATT TCA AAC TAT GAT GAC CAA GCT Lys Tyr Phe His Asn Tyr Cys Leu Ile Ser Asn Tyr Asp Asp Gln Ala 160 606 CAG GTT CAA AGT TGC TGG GAA GGT GAC TCT TCA GTT GCA TTA CCA GAT Gln Val Gln Ser Cys Trp Glu Gly Asp Ser Ser Val Ala Leu Pro Asp 176 654 TTG AGA ACG GAA GAT AGC GAC GTG GCC TCA GTT TTC AAT TCT TGG GTT Leu Arg Thr Glu Asp Ser Asp Val Ala Ser Val Phe Asn Ser Trp Val 192 702 AAA GAT TTT GTT GGC AAT TAC TCA ATT GAT GGT TTA AGA ATT GAT AGT Lys Asp Phe Val Gly Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser 208 750 GCT AAA CAT GTG GAC CAA GGC TTT TTC CCG GAT TTT GTT AGT GCA TCT Ala Lys His Val Asp Gln Gly Phe Phe Pro Asp Phe Val Ser Ala Ser 224 798 GGA GTT TAC TCA GTA GGC GAA GTT TTC CAA GGA GAC CCA GCT TAT ACA Gly Val Tyr Ser Val Gly Glu Val Phe Gln Gly Asp Pro Ala Tyr Thr 240 846 TGC CCA TAC CAA AAT TAC ATT CCA GGG GTT AGT AAT TAT CCA TTG TAC Cys Pro Tyr Gln Asn Tyr Ile Pro Gly Val Ser Asn Tyr Pro Leu Tyr 256 894 TAC CCA ACC ACG AGA TTT TTT AAA ACT ACT GAT TCA AGT TCC AGT GAG 272 942 TTG ACT CAA ATG ATT TCA AGC GTT GCT TCC AGT TGT TCG GAT CCA ACT Leu Thr Gln Met Ile Ser Ser Val Ala Ser Ser Cys Ser Asp Pro Thr 288 990 TTG TTG ACA AAC TTT GTA GAA AAT CAC GAT AAT GAA AGG TTC GCT TCA Leu Leu Thr Asn Phe Val Glu Asn His Asp Asn Glu Arg Phe Ala Ser 304 1038 ATG ACC AGC GAC CAA AGT TTG ATT TCT AAT GCT ATT GCA TTT GTC CTT Met Thr Ser Asp Gln Ser Leu Ile Ser Asn Ala Ile Ala Phe Val Leu 320 1086 TTG GGT GAT GGT ATT CCT GTC ATT TAC TAT GGA CAA GAA CAA GGC TTG Leu Gly Asp Gly Ile Pro Val Ile Tyr Tyr Gly Gln Glu Gln Gly Leu 336 1134 AGC GGA AAA AGT GAC CCA AAC AAC AGA GAG GCC TTG TGG TTA TCC GGC Ser Gly Lys Ser Asp Pro Asn Asn Arg Glu Ala Leu Trp Leu Ser Gly 352 1182 TAC AAC AAA GAG AGT GAC TAT TAC AAG CTC ATT GCC AAA GCT AAT GCT Tyr Asn Lys Glu Ser Asp Tyr Tyr Lys Leu Ile Ala Lys Ala Asn Ala 368 1230 GCC AGA AAC GCC GCC GTT TAT CAA GAC TCA AGC TAT GCC ACC TCG CAG Ala Arg Asn Ala Ala Val Tyr Gln Asp Ser Ser Tyr Ala Thr Ser Gln 384 1278 CTT TCT GTG ATC TTT TCA AAT GAC CAT GTT ATT GCA ACA AAA AGA GGC Leu Ser Val Ile Phe Ser Asn Asp His Val Ile Ala Thr Lys Arg Gly 400 1326 AGC GTT GTT TCT GTT TTC AAC AAC CTT GGT TCC AGC GGT TCT TCT GAT Ser Val Val Ser Val Phe Asn Asn Leu Gly Ser Ser Gly Ser Ser Asp 416 1374 GTG ACT ATT TCC AAC ACA GGT TAC AGT TCC GGT GAG GAT TTG GTA GAA Val Thr Ile Ser Asn Thr Gly Tyr Ser Ser Gly Glu Asp Leu Val Glu 432 1422 GTT TTG ACA TGC AGT ACT GTT AGC GGC AGC TCT GAC TTA CAA GTT TCT Val Leu Thr Cys Ser Thr Val Ser Gly Ser Ser Asp Leu Gln Val Ser 448 1470 ATC CAA GGT GGT CAA CCA CAA ATC TTT GTT CCT GCT AAA TAT GCT TCT Ile Gln Gly Gly Gln Pro Gln Ile Phe Val Pro Ala Lys Tyr Ala Ser 464 1482 GAC ATT TGT TCA Asp Ile Cys Ser 468
【００４６】４．配列番号：４ （１）配列の長さ：１４０４ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：２本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） （６）ハイポセティカル配列：Ｎｏ （７）アンチセンス：Ｎｏ （８）起源 （ａ）生物名：なし（合成ＤＮＡ） （ｂ）株名：なし （９）直接の起源 ライブラリー名又はクローン名：プラスミド pSfα1
［アグリク バイオル ケム（Agric. Biol. Chem.）19
85, 49, 3089-3092 ］由来 （１０）配列の特徴 （ａ）特徴を表わす記号：ＣＤＳ （ｂ）存在位置：７８．．１４８２ （ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ （ｄ）他の情報：変異型α−アミラーゼＳｆａｍｙＹ８
３Ｎをコードする構造遺伝子配列 （１１）配列
［アグリク バイオル ケム（Agric. Biol. Chem.）19
85, 49, 3089-3092 ］由来 （１０）配列の特徴 （ａ）特徴を表わす記号：ＣＤＳ （ｂ）存在位置：７８．．１４８２ （ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ （ｄ）他の情報：変異型α−アミラーゼＳｆａｍｙＹ８
３Ｎをコードする構造遺伝子配列 （１１）配列
【００４７】 126 GAA ACT AAT GCT GAT AAA TGG AGA TCA CAG TCT ATT TAT CAA ATT GTC Glu Thr Asn Ala Asp Lys Trp Arg Ser Gln Ser Ile Tyr Gln Ile Val 16 174 ACT GAC AGA TTT GCT AGA ACC GAT GGT GAT ACA AGT GCT TCC TGT AAC Thr Asp Arg Phe Ala Arg Thr Asp Gly Asp Thr Ser Ala Ser Cys Asn 32 222 ACA GAA GAT AGA CTT TAC TGT GGT GGT TCT TTC CAA GGC ATC ATA AAG Thr Glu Asp Arg Leu Tyr Cys Gly Gly Ser Phe Gln Gly Ile Ile Lys 48 270 AAG TTG GAT TAC ATC AAA GAT ATG GGC TTT ACT GCT ATT TGG ATT TCT Lys Leu Asp Tyr Ile Lys Asp Met Gly Phe Thr Ala Ile Trp Ile Ser 64 318 CCA GTT GTT GAA AAC ATT CCC GAT AAC ACA GCA TAT GGT TAT GCT TAT Pro Val Val Glu Asn Ile Pro Asp Asn Thr Ala Tyr Gly Tyr Ala Tyr 80 366 CAT GGT AAC TGG ATG AAG AAC ATA TAC AAA ATT AAT GAA AAC TTT GGT His Gly Asn Trp Met Lys Asn Ile Tyr Lys Ile Asn Glu Asn Phe Gly 96 414 ACT GCT GAT GAT TTG AAG TCT TTG GCA CAA GAA TTG CAC GAT CGT GAT Thr Ala Asp Asp Leu Lys Ser Leu Ala Gln Glu Leu His Asp Arg Asp 112 462 ATG TTG TTA ATG GTG GAT ATC GTT ACC AAC CAT TAC GGC AGT GAT GGC Met Leu Leu Met Val Asp Ile Val Thr Asn His Tyr Gly Ser Asp Gly 128 510 AGT GGA GAT AGT ATC GAT TAC TCA GAG TAC ACC CCG TTC AAC GAC CAA Ser Gly Asp Ser Ile Asp Tyr Ser Glu Tyr Thr Pro Phe Asn Asp Gln 144 558 AAG TAC TTC CAT AAC TAC TGT CTT ATT TCA AAC TAT GAT GAC CAA GCT Lys Tyr Phe His Asn Tyr Cys Leu Ile Ser Asn Tyr Asp Asp Gln Ala 160 606 CAG GTT CAA AGT TGC TGG GAA GGT GAC TCT TCA GTT GCA TTA CCA GAT Gln Val Gln Ser Cys Trp Glu Gly Asp Ser Ser Val Ala Leu Pro Asp 176 654 TTG AGA ACG GAA GAT AGC GAC GTG GCC TCA GTT TTC AAT TCT TGG GTT Leu Arg Thr Glu Asp Ser Asp Val Ala Ser Val Phe Asn Ser Trp Val 192 702 AAA GAT TTT GTT GGC AAT TAC TCA ATT GAT GGT TTA AGA ATT GAT AGT Lys Asp Phe Val Gly Asn Tyr Ser Ile Asp Gly Leu Arg Ile Asp Ser 208 750 GCT AAA CAT GTG GAC CAA GGC TTT TTC CCG GAT TTT GTT AGT GCA TCT Ala Lys His Val Asp Gln Gly Phe Phe Pro Asp Phe Val Ser Ala Ser 224 798 GGA GTT TAC TCA GTA GGC GAA GTT TTC CAA GGA GAC CCA GCT TAT ACA Gly Val Tyr Ser Val Gly Glu Val Phe Gln Gly Asp Pro Ala Tyr Thr 240 846 TGC CCA TAC CAA AAT TAC ATT CCA GGG GTT AGT AAT TAT CCA TTG TAC Cys Pro Tyr Gln Asn Tyr Ile Pro Gly Val Ser Asn Tyr Pro Leu Tyr 256 894 TAC CCA ACC ACG AGA TTT TTT AAA ACT ACT GAT TCA AGT TCC AGT GAG Tyr Pro Thr Thr Arg Phe Phe Lys Thr Thr Asp Ser Ser Ser Ser Glu 272 TTG ACT CAA ATG ATT TCA AGC GTT GCT TCC AGT TGT TCG GAT CCA ACT Leu Thr Gln Met Ile Ser Ser Val Ala Ser Ser Cys Ser Asp Pro Thr 288 990 TTG TTG ACA AAC TTT GTA GAA AAT CAC GAT AAT GAA AGG TTC GCT TCA Leu Leu Thr Asn Phe Val Glu Asn His Asp Asn Glu Arg Phe Ala Ser 304 1038 ATG ACC AGC GAC CAA AGT TTG ATT TCT AAT GCT ATT GCA TTT GTC CTT Met Thr Ser Asp Gln Ser Leu Ile Ser Asn Ala Ile Ala Phe Val Leu 320 1086 TTG GGT GAT GGT ATT CCT GTC ATT TAC TAT GGA CAA GAA CAA GGC TTG Leu Gly Asp Gly Ile Pro Val Ile Tyr Tyr Gly Gln Glu Gln Gly Leu 336 1134 AGC GGA AAA AGT GAC CCA AAC AAC AGA GAG GCC TTG TGG TTA TCC GGC Ser Gly Lys Ser Asp Pro Asn Asn Arg Glu Ala Leu Trp Leu Ser Gly 352 1182 TAC AAC AAA GAG AGT GAC TAT TAC AAG CTC ATT GCC AAA GCT AAT GCT Tyr Asn Lys Glu Ser Asp Tyr Tyr Lys Leu Ile Ala Lys Ala Asn Ala 368 1230 GCC AGA AAC GCC GCC GTT TAT CAA GAC TCA AGC TAT GCC ACC TCG CAG Ala Arg Asn Ala Ala Val Tyr Gln Asp Ser Ser Tyr Ala Thr Ser Gln 384 1278 CTT TCT GTG ATC TTT TCA AAT GAC CAT GTT ATT GCA ACA AAA AGA GGC Leu Ser Val Ile Phe Ser Asn Asp His Val Ile Ala Thr Lys Arg Gly 400 1326 AGC GTT GTT TCT GTT TTC AAC AAC CTT GGT TCC AGC GGT TCT TCT GAT Ser Val Val Ser Val Phe Asn Asn Leu Gly Ser Ser Gly Ser Ser Asp 416 1374 GTG ACT ATT TCC AAC ACA GGT TAC AGT TCC GGT GAG GAT TTG GTA GAA Val Thr Ile Ser Asn Thr Gly Tyr Ser Ser Gly Glu Asp Leu Val Glu 432 1422 GTT TTG ACA TGC AGT ACT GTT AGC GGC AGC TCT GAC TTA CAA GTT TCT Val Leu Thr Cys Ser Thr Val Ser Gly Ser Ser Asp Leu Gln Val Ser 448 1470 ATC CAA GGT GGT CAA CCA CAA ATC TTT GTT CCT GCT AAA TAT GCT TCT Ile Gln Gly Gly Gln Pro Gln Ile Phe Val Pro Ala Lys Tyr Ala Ser 464 1482 GAC ATT TGT TCA Asp Ile Cys Ser 468
【００４８】５．配列番号：５ （１）配列の長さ：２０６１ （２）配列の型：核酸 （３）鎖の数：２本鎖 （４）トポロジー：直鎖状 （５）配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） （６）ハイポセティカル配列：Ｎｏ （７）アンチセンス：Ｎｏ （８）起源 （ａ）生物名：なし（合成ＤＮＡ） （ｂ）株名：なし （９）直接の起源 ライブラリー名又はクローン名：枯草菌バチルス マセ
ランス（Bacillusmacerans ）IAMl243 株の染色体ＤＮ
Ａを制限酵素処理後、プラスミドベクターpBR322に挿入
連結して作製した、枯草菌バチルス マセランスの染色
体ＤＮＡライブラリー、pMAC。 （１０）配列の特徴 （ａ）特徴を表わす記号：ＣＤＳ （ｂ）存在位置：８１．．２１４２ （ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ （ｄ）他の情報：変異型シクロマルトデキストリングル
カノトランスフェラーゼＣＧＴａｓｅＹ１００Ｗをコー
ドする構造遺伝子配列 （１１）配列
ランス（Bacillusmacerans ）IAMl243 株の染色体ＤＮ
Ａを制限酵素処理後、プラスミドベクターpBR322に挿入
連結して作製した、枯草菌バチルス マセランスの染色
体ＤＮＡライブラリー、pMAC。 （１０）配列の特徴 （ａ）特徴を表わす記号：ＣＤＳ （ｂ）存在位置：８１．．２１４２ （ｃ）特徴を決定した方法：Ｅ （ｄ）他の情報：変異型シクロマルトデキストリングル
カノトランスフェラーゼＣＧＴａｓｅＹ１００Ｗをコー
ドする構造遺伝子配列 （１１）配列
【００４９】 16 Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val TCA CCC GAT ACG AGC GTG GAC AAC AAG GTC AAT TTC AGT ACG GAC GTC 129 32 Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn ATC TAT CAG ATT GTG ACC GAC CGC TTC GCG GAC GGG GAC AGG ACG AAC 177 48 Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu AAT CCG GCG GGG GAT GCG TTC AGC GGC GAC CGA TCC AAT TTG AAG CTC 225 64 Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly TAT TTC GGG GGA GAC TGG CAG GGG ATT ATC GAC AAG ATT AAC GAC GGT 273 80 Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Ser His Pro Val TAT TTG ACC GGC ATG GGC GTC ACC GCC CTC TGG ATA TCC CAA CCT GTG 321 96 Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser GAA AAT ATC ACC TCC GTC ATC AAG TAT TCC GGC GTT AAC AAT ACG TCT 369 112 Tyr His Gly Trp Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe TAT CAC GGT TGG TGG GCG AGG GAT TTT AAG CAA ACC AAC GAC GCT TTC 417 128 Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Leu Thr Leu Ile GGG GAT TTT GCC GAT TTT CAA AAT CTG ATT GAT ACG CTC ACG CTC ATA 465 144 Thr Ser Arg Ser Asp Arg Leu Arg Pro Gln Pro His Val Ser Gly Arg ACA TCA AGG TCG GAT CGA CTT CGC CCC CAA CCA CAC GTC TCC GGC CGA 513 160 Ala Gly Thr Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asp Asn GCA GGG ACG AAC CCC GGC TTC GCC GAG AAC GGT GCG CTG TAT GAT AAC 561 176 Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His GGT TCG CTG CTC GGC GCC TAC AGC AAT GAT ACG GCC GGC CTT TTC CAT 609 192 His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys CAT AAC GGG GGG ACC GAT TTT TCC ACG ATT GAA GAC GGT ATT TAC AAG 657 208 Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp AAC CTC TAC GAC CTG GCG GAC ATC AAC CAT AAC AAC AAC GCT ATG GAC 705 224 Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp GCT TAT TTT AAA AGC GCT ATC GAC CTT TGG CTC GGC ATG GGT GTG GAC 753 240 Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys Gln Tyr Pro Phe Gly Trp Gln Lys GGG ATT CGT TTT GAC GGG GTG AAG CAG TAT CCT TTC GGC TGG CAA AAA 801 256 Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe AGC TTC GTT TCC TCG ATT TAC GGC GGC GAT CAT CCG GTA TTT ACG TTC Hind III 849 272 Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys GGG GAA TGG TAT CTT GGC GCG GAT CAA ACC GAC GGA GAC AAC ATT AAA 897 288 Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln TTC GCC AAC GAA AGC GGG ATG AAC CTG CTG GAC TTT GAA TAC GCG CAG 945 304 Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu GAA GTG CGC GAA GTG TTC CGG GAC AAA ACG GAA ACG ATG AAG GAT CTC 993 320 Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn TAT GAG GTG CTG GCC AGC ACG GAG TCG CAA TAC GAC TAC ATC AAC AAT 1041 336 Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala ATG GTG ACC TTC ATC GAC AAC CAT GAT ATG GAC CGG TTC CAG GTT GCC 1089 352 Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr GGT TCC GGT ACG CGG GCG ACC GAG CAA GCG TTG GCG CTG ACG CTG ACT 1137 368 Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr TCC CGC GGC GTG CCA GCC ATC TAC TAC GGC ACG GAG CAG TAC ATG ACC 1185 384 Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr GGC GAT GGC GAC CCC AAC AAC CGG GCG ATG ATG ACC TCG TTT AAT ACC 1233 400 Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys GGG ACG ACG GCT TAT AAA GTG ATT CAG GCA TTG GCG CCG CTG CGT AAA 1281 416 Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn TCC AAT CCG GCC ATC GCT TAT GGG ACG ACG ACA GAG CGC TGG GTT AAC Hinc II 1329 432 Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu AAC GAT GTG TTG ATT ATT GAA CGC AAA TTC GGC AGC AGC GCC GCT TTG 1377 448 Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu GTG GCG ATT AAT CGA AAC TCG TCC GCC GCT TAT CCG ATT TCG GGT CTG 1425 464 Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu TTG AGT TCG CTG CCG GCG GGC ACT TAT TCG GAT GTA TTG AAC GGA CTC 1473 480 Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn TTA AAC GGC AAC TCC ATT ACC GTG GGC AGC GGC GGC GCC GTC ACC AAC 1521 496 Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro TTT ACG CTG GCG GCC GGC GGC ACG GCG GTA TGG CAG TAC ACA GCG CCG 1569 512 Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Gln Pro GAA ACG TCG CCG GCG ATC GGC AAT GTG GGT CCC ACC ATG GGC CAG CCG 1617 528 Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly GGG AAT ATA GTG ACG ATT GAC GGC CGC GGC TTT GGC GGC ACG GCG GGC 1665 544 Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Ser ACG GTT TAT TTC GGG ACG ACG GCG GTG ACC GGC TCC GGC ATC GTA AGC 1713 560 Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro Lys Val Ala Ala Gly TGG GAG GAC ACG CAG ATT AAG GCG GTC ATA CCG AAG GTC GCG GCG GGC 1761 576 Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr AAA ACG GGC GTA TCG GTC AAA ACG TCG TCC GGC ACC GCC AGC AAT ACA 1809 592 Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe TTC AAA AGC TTC AAT GTA CTG ACG GGG GAT CAG GTC ACG GTG CGT TTC Hind III 1857 608 Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val CTG GTC AAT CAA GCC AAT ACC AAT TAC GGA ACA AAT GTT TAT CTT GTC 1905 624 Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly Thr Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly GGC AAC GCC GCC GAG CTC GGC ACC TGG GAC CCG AAC AAA GCG ATT GGG 1953 640 Pro Met Tyr Asn Gln Val Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp CCG ATG TAC AAT CAG GTG ATC GCC AAG TAC CCG TCC TGG TAT TAC GAT 2001 656 Val Ser Val Pro Ala Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys GTC AGC GTG CCG GCG GGG ACA AAG CTG GAT TTT AAA TTT ATT AAA AAG 2049 672 Gly Gly Gly Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr GGC GGC GGT ACG GTG ACT TGG GAA GGC GGG GGC AAC CAT ACG TAC ACG 2097 687 Thr Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn ACG CCG GCC AGC GGC GTA GGG ACG GTG ACG GTG GAC TGG CAA AAT 2142
【図面の簡単な説明】
【図１】 野生型Sfamy 及び野生型シクロマルトデキス
トリングルカノトランスフェラーゼの保存性領域におけ
るアミノ酸配列を比較した図である。
トリングルカノトランスフェラーゼの保存性領域におけ
るアミノ酸配列を比較した図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 19/14 Ｚ 7432−4Ｂ 19/18 7432−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 9/30 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ Ａ Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (8)
- 【請求項１】 α−アミラーゼ及びシクロマルトデキス
トリングルカノトランスフェラーゼからなる群から選ば
れる糖質加水分解酵素において、酵素の活性中心に存在
し、反応中間体に水分子を付与する機能を有するチロシ
ン残基を他のアミノ酸残基に置換せしめたことを特徴と
する変異型の糖質加水分解酵素。 - 【請求項２】 前記チロシン残基が、３個の直接の触媒
残基である酸性アミノ酸残基の５Å以内に存在し、反応
中間体に水分子を付与する機能を有するチロシン残基で
あることを特徴とする請求項１記載の変異型の糖質加水
分解酵素。 - 【請求項３】 請求項１記載の変異型の糖質加水分解酵
素であって、サッカロミコプスイス フィブリゲラ（Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇｅｒ
ａ）のα−アミラーゼにおいて、酵素の活性中心に存在
し、反応中間体に水分子を付与する機能を有する、アミ
ノ酸配列の８３番目のチロシン残基をフェニルアラニ
ン、トリプトファン、ロイシン又はアスパラギン残基に
置換せしめたことを特徴とする変異α−アミラーゼ。 - 【請求項４】 サッカロミコプスイス フィブリゲラ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｆｉｂｕｌｉｇ
ｅｒａ）のα−アミラーゼ遺伝子において、酵素の活性
中心に存在して反応中間体に水分子を付与する機能を有
するチロシン残基をコードする、構造遺伝子部分の３２
５〜３２７番目の塩基配列（ＴＡＣ）をＴＴＣ、ＴＧ
Ｇ、ＣＴＣ又はＡＡＣに変異せしめたことを特徴とする
請求項１記載の変異型の糖質加水分解酵素を生産する形
質転換体の変異α−アミラーゼ遺伝子。 - 【請求項５】 マルトオリゴ糖を基質とし、請求項３記
載の変異α−アミラーゼを用いて糖転移反応を行うこと
を特徴とする重合度７以上のマルトオリゴ糖の製造方
法。 - 【請求項６】 請求項１記載の変異型の糖質加水分解酵
素であって、バチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｍａｃｅｒａｍｓ）のシクロマルトデキストリングル
カノトランスフェラーゼにおいて、酵素の活性中心に存
在し、反応中間体に水分子を付与する機能を有する、ア
ミノ酸配列の１００番目のチロシン残基をトリプトファ
ン残基に置換せしめたことを特徴とする変異シクロマル
トデキストリングルカノトランスフェラーゼ。 - 【請求項７】 バチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）のシクロマルトデキストリング
ルカノトランスフェラーゼ遺伝子において、酵素の活性
中心に存在して反応中間体に水分子を付与する機能を有
するチロシン残基をコードする、構造遺伝子部分３７９
〜３８１番目の塩基配列（ＴＡＣ）をＴＧＧに変異せし
めたことを特徴とする請求項１記載の変異型の糖質加水
分解酵素を生産する形質転換体の変異シクロマルトデキ
ストリングルカノトランスフェラーゼ遺伝子。 - 【請求項８】 デンプン及びショ糖を基質とし、請求項
６記載の変異シクロマルトデキストリングルカノトラン
スフェラーゼを用いて糖転移反応を行うことを特徴とす
るα−マルトピラノシル−β−Ｄ−フラクトフラノシド
及びα−マルトトリピラノシル−β−Ｄ−フラクトフラ
ノシドを高濃度に含むオリゴ糖の製造方法。
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|---|---|---|---|
| JP5069303A JPH0740938B2 (ja) | 1993-03-04 | 1993-03-04 | 変異型の糖質加水分解酵素、該酵素の変異遺伝子及び該酵素を用いたオリゴ糖の製造方法 |
| US08/204,656 US5538882A (en) | 1993-03-04 | 1994-03-02 | Variant-type carbohydrate hydrolase, variant gene of the enzyme and method for producing oligosaccharide using the enzyme |
| US08/470,702 US5631149A (en) | 1993-03-04 | 1995-06-06 | Variant-type carbohydrate hydrolase, variant gene of the enzyme and method for producing oligosaccharide using the enzyme |
| US08/467,831 US5635378A (en) | 1993-03-04 | 1995-06-06 | Variant-type carbohydrate hydrolase, variant gene of the enzyme and method for producing oligosaccharide using the enzyme |
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| JP5069303A JPH0740938B2 (ja) | 1993-03-04 | 1993-03-04 | 変異型の糖質加水分解酵素、該酵素の変異遺伝子及び該酵素を用いたオリゴ糖の製造方法 |
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| JPH0740938B2 true JPH0740938B2 (ja) | 1995-05-10 |
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Family Cites Families (2)
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