JPH07306202A - 細胞核ｄｎａの損傷検出方法 - Google Patents
細胞核ｄｎａの損傷検出方法Info
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- JPH07306202A JPH07306202A JP9484593A JP9484593A JPH07306202A JP H07306202 A JPH07306202 A JP H07306202A JP 9484593 A JP9484593 A JP 9484593A JP 9484593 A JP9484593 A JP 9484593A JP H07306202 A JPH07306202 A JP H07306202A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 病理組織標品を酸処理して、この病理組織中
の損傷ＤＮＡを選択的に加水分解して単鎖ＤＮＡを生成
させ、この病理組織標品を抗単鎖ＤＮＡに対する抗体で
処理し、この抗体の有無を形態学的に観察することを特
徴とする細胞核ＤＮＡの損傷検出方法。抗体を予め標識
するか、又は標識第２抗体を使用することにより、この
抗体の結合を判定できる。 【効果】 特殊な設備を要せず容易に、かつ通常の病理
染色用に固定した標品上においても偽陽性を生じること
なく単鎖ＤＮＡを容易に検出して、細胞核ＤＮＡの損傷
を検出できる。
の損傷ＤＮＡを選択的に加水分解して単鎖ＤＮＡを生成
させ、この病理組織標品を抗単鎖ＤＮＡに対する抗体で
処理し、この抗体の有無を形態学的に観察することを特
徴とする細胞核ＤＮＡの損傷検出方法。抗体を予め標識
するか、又は標識第２抗体を使用することにより、この
抗体の結合を判定できる。 【効果】 特殊な設備を要せず容易に、かつ通常の病理
染色用に固定した標品上においても偽陽性を生じること
なく単鎖ＤＮＡを容易に検出して、細胞核ＤＮＡの損傷
を検出できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞核ＤＮＡの損傷検
出方法に関するものである。詳しくは、癌化などに伴う
細胞核ＤＮＡの質的変化を検知するものであって、癌細
胞のスクリーニングや癌の病理診断に用いたり、化学的
発癌物質の確認試験に使用したりすることができる。
出方法に関するものである。詳しくは、癌化などに伴う
細胞核ＤＮＡの質的変化を検知するものであって、癌細
胞のスクリーニングや癌の病理診断に用いたり、化学的
発癌物質の確認試験に使用したりすることができる。
【０００２】
【従来の技術】老化や癌化によって細胞核ＤＮＡが量的
に変化することは周知であり、その検出方法も、既に確
立されている。しかし、細胞核ＤＮＡがこのような明確
な量的変化を起こす前にも、以下のような質的変化を起
こすことが分かっている。例えば、 １）ＤＮＡ塩基のアルキル化による微小なひずみ、 ２）ＤＮＡ塩基の水和や脱落による小さいひずみ、 ３）分子量の大きい化学物質がＤＮＡに共有結合で働き
（付加物）、ＤＮＡ塩基配列の間に挿入される大きなひ
ずみ、 ４）２つの塩基が結合してできる２本鎖ＤＮＡ２量体の
形成や、２本鎖ＤＮＡ同士の交叉結合或いはＤＮＡ鎖と
タンパク質との交叉結合によってＤＮＡ一本鎖部分に生
じた切断、及び、 ５）二本の鎖の切断などの細胞ＤＮＡの損傷、 などが知られている。
に変化することは周知であり、その検出方法も、既に確
立されている。しかし、細胞核ＤＮＡがこのような明確
な量的変化を起こす前にも、以下のような質的変化を起
こすことが分かっている。例えば、 １）ＤＮＡ塩基のアルキル化による微小なひずみ、 ２）ＤＮＡ塩基の水和や脱落による小さいひずみ、 ３）分子量の大きい化学物質がＤＮＡに共有結合で働き
（付加物）、ＤＮＡ塩基配列の間に挿入される大きなひ
ずみ、 ４）２つの塩基が結合してできる２本鎖ＤＮＡ２量体の
形成や、２本鎖ＤＮＡ同士の交叉結合或いはＤＮＡ鎖と
タンパク質との交叉結合によってＤＮＡ一本鎖部分に生
じた切断、及び、 ５）二本の鎖の切断などの細胞ＤＮＡの損傷、 などが知られている。
【０００３】かかる細胞核ＤＮＡの損傷の検出方法の開
発が当然のことながら強く望まれ、種々の方法が提案さ
れている。例えば、細胞核内で損傷ＤＮＡが自己修復さ
れるＤＮＡ修復現象を利用して、放射性同位元素で標識
したヌクレオチドを修復ＤＮＡ中に取り込ませこれを検
出する方法が知られている。しかし、この方法は、放射
性同位元素を使用するため特殊な設備が必要となった
り、その処理量にも限界があるといった問題がある。
発が当然のことながら強く望まれ、種々の方法が提案さ
れている。例えば、細胞核内で損傷ＤＮＡが自己修復さ
れるＤＮＡ修復現象を利用して、放射性同位元素で標識
したヌクレオチドを修復ＤＮＡ中に取り込ませこれを検
出する方法が知られている。しかし、この方法は、放射
性同位元素を使用するため特殊な設備が必要となった
り、その処理量にも限界があるといった問題がある。
【０００４】本発明者が特開昭６２−８０５３号におい
て提案した方法は、細胞検体を液中に浮遊状態のまま、
又は適当な方法でプレパラート上に付着せしめた塗抹標
本状態で固定した被検組織から、単鎖ＤＮＡを調製し、
アクリジン色素による染色性によって判別する方法であ
る。この方法は、損傷のある核内ＤＮＡが適当な条件下
で酸処理することにより選択的に加水分解してＤＮＡ単
鎖を生成するという知見に基づき、アクリジン色素がＤ
ＮＡ二重鎖とインターカレーション形式で結合した場合
には緑色蛍光を発するのに対し、ＤＮＡ単鎖はアクリジ
ン色素とスタック結合して赤色螢光を発することを利用
したものである。
て提案した方法は、細胞検体を液中に浮遊状態のまま、
又は適当な方法でプレパラート上に付着せしめた塗抹標
本状態で固定した被検組織から、単鎖ＤＮＡを調製し、
アクリジン色素による染色性によって判別する方法であ
る。この方法は、損傷のある核内ＤＮＡが適当な条件下
で酸処理することにより選択的に加水分解してＤＮＡ単
鎖を生成するという知見に基づき、アクリジン色素がＤ
ＮＡ二重鎖とインターカレーション形式で結合した場合
には緑色蛍光を発するのに対し、ＤＮＡ単鎖はアクリジ
ン色素とスタック結合して赤色螢光を発することを利用
したものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】通常、病理診断用に調
製される組織標品は、ホルマリンで固定した標品であ
る。このホルマリン固定の際にも、ＤＮＡ鎖は小さな損
傷を受けることがあり、部分的に鎖がほどけたＤＮＡ鎖
が生じる。特開昭６２−８０５３号で提案されている方
法では、このように部分的に単鎖となったＤＮＡ鎖の単
鎖部分にもアクリジン色素とのスタック結合が生じるこ
とになる。このため、病理診断用に調製されたホルマリ
ン固定標品では偽陽性が生じるという問題が新たに生
じ、被検体は新鮮組織を摩砕して調製した塗抹標本を用
いなければならなかった。
製される組織標品は、ホルマリンで固定した標品であ
る。このホルマリン固定の際にも、ＤＮＡ鎖は小さな損
傷を受けることがあり、部分的に鎖がほどけたＤＮＡ鎖
が生じる。特開昭６２−８０５３号で提案されている方
法では、このように部分的に単鎖となったＤＮＡ鎖の単
鎖部分にもアクリジン色素とのスタック結合が生じるこ
とになる。このため、病理診断用に調製されたホルマリ
ン固定標品では偽陽性が生じるという問題が新たに生
じ、被検体は新鮮組織を摩砕して調製した塗抹標本を用
いなければならなかった。
【０００６】本発明はこのような事情に鑑みなされたも
のであり、特殊な設備を要せず容易に、かつ通常の病理
染色用にホルマリン固定した標品上においても偽陽性を
生じることなく単鎖ＤＮＡを容易に検出できる細胞核Ｄ
ＮＡの損傷検出方法を提供することを目的とする。
のであり、特殊な設備を要せず容易に、かつ通常の病理
染色用にホルマリン固定した標品上においても偽陽性を
生じることなく単鎖ＤＮＡを容易に検出できる細胞核Ｄ
ＮＡの損傷検出方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【問題を解決するための手段およびその作用効果】この
ような本発明の目的は、病理組織標品を酸処理して、こ
の病理組織中の損傷ＤＮＡを選択的に加水分解して単鎖
ＤＮＡを生成させ、この病理組織標品を単鎖ＤＮＡに対
する抗体で処理し、この抗体結合の有無を形態学的に観
察することを特徴とする細胞核ＤＮＡの損傷検出方法、
により達成される。
ような本発明の目的は、病理組織標品を酸処理して、こ
の病理組織中の損傷ＤＮＡを選択的に加水分解して単鎖
ＤＮＡを生成させ、この病理組織標品を単鎖ＤＮＡに対
する抗体で処理し、この抗体結合の有無を形態学的に観
察することを特徴とする細胞核ＤＮＡの損傷検出方法、
により達成される。
【０００８】すなわち本発明は、ＤＮＡの加水分解の動
態はその存在様式（即ち、核蛋白との関係やＤＮＡ分子
の傷害の有無等）によって微妙に影響され、細胞核ＤＮ
Ａを酸を用いて加水分解した場合に、正常な細胞核ＤＮ
Ａと損傷のある細胞核ＤＮＡとで加水分解に対する挙動
が異なり、適当な条件を選べば損傷のある細胞核ＤＮＡ
を選択的に加水分解してＤＮＡの二重鎖を単鎖にするこ
とができることに着目して、この単鎖になった細胞核Ｄ
ＮＡを抗単鎖ＤＮＡ抗体で免疫化学的に検出するもので
ある。
態はその存在様式（即ち、核蛋白との関係やＤＮＡ分子
の傷害の有無等）によって微妙に影響され、細胞核ＤＮ
Ａを酸を用いて加水分解した場合に、正常な細胞核ＤＮ
Ａと損傷のある細胞核ＤＮＡとで加水分解に対する挙動
が異なり、適当な条件を選べば損傷のある細胞核ＤＮＡ
を選択的に加水分解してＤＮＡの二重鎖を単鎖にするこ
とができることに着目して、この単鎖になった細胞核Ｄ
ＮＡを抗単鎖ＤＮＡ抗体で免疫化学的に検出するもので
ある。
【０００９】抗単鎖ＤＮＡ抗体は抗原として認識できる
程度に大きな構造として分離したＤＮＡ単鎖とのみ結合
するものであり、ホルマリン固定処理などによる小さな
損傷による部分的単鎖部分（これは、分子スケールでは
抗原決定基として機能しない程度の大きさである）とは
結合しない。このため、組織標本作製時の操作に起因す
る損傷による偽陽性が生じることがない。
程度に大きな構造として分離したＤＮＡ単鎖とのみ結合
するものであり、ホルマリン固定処理などによる小さな
損傷による部分的単鎖部分（これは、分子スケールでは
抗原決定基として機能しない程度の大きさである）とは
結合しない。このため、組織標本作製時の操作に起因す
る損傷による偽陽性が生じることがない。
【００１０】従って、本発明では、通常のホルマリン固
定パラフィン切片とした病理組織標品を検体として使用
することができる。ただし、本発明の検体はこれに限ら
れず、組織細胞を液中に浮遊させた細胞懸濁液、又は適
当な方法でプレパラート上に付着せしめた塗抹細胞標品
なども検体として使用できる。
定パラフィン切片とした病理組織標品を検体として使用
することができる。ただし、本発明の検体はこれに限ら
れず、組織細胞を液中に浮遊させた細胞懸濁液、又は適
当な方法でプレパラート上に付着せしめた塗抹細胞標品
なども検体として使用できる。
【００１１】検体は（通常のホルマリン固定パラフィン
切片とした病理組織標品の場合は、リン酸緩衝液でこれ
をリンスした後）、損傷ＤＮＡを選択的に加水分解する
ような緩やかな条件下に酸を用いて加水分解する。かか
る加水分解条件は当業者であればあらかじめ予備実験に
よって容易に定めることができる。一般的に述べれば、
例えば塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、過塩素酸などの酸を
希薄状態で使用し（例えば塩酸の場合には１〜５Ｎ塩酸
の使用が適当である）、温度４０℃以下で５〜１２０分
間、好ましくは２０〜３５℃で１５〜３０分間程度の範
囲内で加水分解することにより、損傷のある細胞核ＤＮ
Ａを優先的に加水分解させることができる。好ましくは
切片試料については２Ｎ塩酸で３０℃で２０分間、懸濁
（塗抹）試料については２Ｎ塩酸で３０℃で８．５分間
の加水分解を行う。
切片とした病理組織標品の場合は、リン酸緩衝液でこれ
をリンスした後）、損傷ＤＮＡを選択的に加水分解する
ような緩やかな条件下に酸を用いて加水分解する。かか
る加水分解条件は当業者であればあらかじめ予備実験に
よって容易に定めることができる。一般的に述べれば、
例えば塩酸、硫酸、リン酸、硝酸、過塩素酸などの酸を
希薄状態で使用し（例えば塩酸の場合には１〜５Ｎ塩酸
の使用が適当である）、温度４０℃以下で５〜１２０分
間、好ましくは２０〜３５℃で１５〜３０分間程度の範
囲内で加水分解することにより、損傷のある細胞核ＤＮ
Ａを優先的に加水分解させることができる。好ましくは
切片試料については２Ｎ塩酸で３０℃で２０分間、懸濁
（塗抹）試料については２Ｎ塩酸で３０℃で８．５分間
の加水分解を行う。
【００１２】生成物である単鎖ＤＮＡを抗単鎖ＤＮＡ抗
体で処理し、鏡検により組織標本中の抗体結合の有無、
その分布を観察することにより、腫瘍細胞の検出を行な
うことができる。この際、ローダミンやテキサスレッド
などの色素やＦＩＴＣなどの螢光色素で標識した抗体を
用いれば、形態学的観察は容易となる。或いは、ペルオ
キシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素やビオ
チンなどで標識した抗体を用い、抗体処理後にその酵素
反応を利用した特殊染色を行なってもよい。又、このよ
うな標識抗単鎖ＤＮＡ抗体を使用しない場合には、抗単
鎖ＤＮＡ抗体処理後に標識２次抗体（抗ＩｇＧ抗体）で
処理して染色する免疫組織化学的染色処理により観察を
行なってもよい。形態学的観察を容易にするため、ヘマ
トキシリンやケルンエヒトロートなどを用いて、核染色
を行ってもよい。この核染色は、抗単鎖ＤＮＡ抗体処理
の前でも後でもよい。
体で処理し、鏡検により組織標本中の抗体結合の有無、
その分布を観察することにより、腫瘍細胞の検出を行な
うことができる。この際、ローダミンやテキサスレッド
などの色素やＦＩＴＣなどの螢光色素で標識した抗体を
用いれば、形態学的観察は容易となる。或いは、ペルオ
キシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素やビオ
チンなどで標識した抗体を用い、抗体処理後にその酵素
反応を利用した特殊染色を行なってもよい。又、このよ
うな標識抗単鎖ＤＮＡ抗体を使用しない場合には、抗単
鎖ＤＮＡ抗体処理後に標識２次抗体（抗ＩｇＧ抗体）で
処理して染色する免疫組織化学的染色処理により観察を
行なってもよい。形態学的観察を容易にするため、ヘマ
トキシリンやケルンエヒトロートなどを用いて、核染色
を行ってもよい。この核染色は、抗単鎖ＤＮＡ抗体処理
の前でも後でもよい。
【００１３】抗単鎖ＤＮＡ抗体は、二重鎖ＤＮＡとの交
差反応を示さないものであればよく、常法により単鎖Ｄ
ＮＡを動物に免疫して得られる抗血清を使用することが
できる。モノルローナル抗体を使用してもよい。或いは
抗シチジン抗体などのデオキシリボヌクレオチドに対す
る抗体を使用してもよい。
差反応を示さないものであればよく、常法により単鎖Ｄ
ＮＡを動物に免疫して得られる抗血清を使用することが
できる。モノルローナル抗体を使用してもよい。或いは
抗シチジン抗体などのデオキシリボヌクレオチドに対す
る抗体を使用してもよい。
【００１４】このように本発明に従えば、単に希酸を用
いる緩やかな加水分解と、標識抗単鎖ＤＮＡ抗体との結
合によって、病理診断のために常時調製される通常のホ
ルマリン固定パラフィン切片標品を用いても、偽陽性を
生じる問題もなく損傷ＤＮＡを正常ＤＮＡから識別する
ことができ、腫瘍細胞の検出を行うことが可能となる。
いる緩やかな加水分解と、標識抗単鎖ＤＮＡ抗体との結
合によって、病理診断のために常時調製される通常のホ
ルマリン固定パラフィン切片標品を用いても、偽陽性を
生じる問題もなく損傷ＤＮＡを正常ＤＮＡから識別する
ことができ、腫瘍細胞の検出を行うことが可能となる。
【００１５】なおＤＮＡの酸加水分解の前には、試料を
予めリボヌクレオチダーゼ（ＲＮase)で処理し、試料中
のＲＮＡを分解・消化しておくことが好ましい。これに
より抗単鎖ＤＮＡ抗体がＲＮＡと結合して偽陽性染色を
生じることを防止できる。
予めリボヌクレオチダーゼ（ＲＮase)で処理し、試料中
のＲＮＡを分解・消化しておくことが好ましい。これに
より抗単鎖ＤＮＡ抗体がＲＮＡと結合して偽陽性染色を
生じることを防止できる。
【００１６】
【実施例１】ウシ血清アルブミン(bovine serum albumi
n; BSA) をメチルアルコールにて１％(w/v) 濃度となる
ように溶解し、これに12規定塩酸を0.84％(v/v) になる
ように添加した。この懸濁液を、時々撹拌しながら３日
間以上冷暗所に放置する。次いでメチルアルコールにて
２度、さらに無水エーテルで２度遠心洗浄を行う。得ら
れた沈渣について、大気中でエーテルを蒸発させた後、
真空にてＫＯＨ上で乾燥し、粉末状にしてＫＯＨ上で保
存した。得られたメチル化ＢＳＡ（ＭＢＳＡ）をハプテ
ン担体として抗原の修飾に用いた。
n; BSA) をメチルアルコールにて１％(w/v) 濃度となる
ように溶解し、これに12規定塩酸を0.84％(v/v) になる
ように添加した。この懸濁液を、時々撹拌しながら３日
間以上冷暗所に放置する。次いでメチルアルコールにて
２度、さらに無水エーテルで２度遠心洗浄を行う。得ら
れた沈渣について、大気中でエーテルを蒸発させた後、
真空にてＫＯＨ上で乾燥し、粉末状にしてＫＯＨ上で保
存した。得られたメチル化ＢＳＡ（ＭＢＳＡ）をハプテ
ン担体として抗原の修飾に用いた。
【００１７】抗原としては、ウシ胸腺ＤＮＡを0.15モル
のNaClに500 μg/mlの濃度に溶かし、これを沸湯中（10
0 ℃）にて10分間保持した後、氷水中で急冷する。この
ようにして得られた単鎖ＤＮＡ（single-stranded ＤＮ
Ａ；ssＤＮＡ) 水溶液と１％ＭＢＳＡ水溶液を撹拌しな
がら、最終重量比が１になるまで加えた。得られた単鎖
ＤＮＡ−ＭＢＳＡ結合物の懸濁液を、等量のフロインド
の完全アジュバントと混合して乳状化し、免疫に使用し
た。
のNaClに500 μg/mlの濃度に溶かし、これを沸湯中（10
0 ℃）にて10分間保持した後、氷水中で急冷する。この
ようにして得られた単鎖ＤＮＡ（single-stranded ＤＮ
Ａ；ssＤＮＡ) 水溶液と１％ＭＢＳＡ水溶液を撹拌しな
がら、最終重量比が１になるまで加えた。得られた単鎖
ＤＮＡ−ＭＢＳＡ結合物の懸濁液を、等量のフロインド
の完全アジュバントと混合して乳状化し、免疫に使用し
た。
【００１８】抗血清の作製に際しては、0.24mgDNA/mlの
濃度の乳状化した単鎖ＤＮＡ（抗原）を、ウサギの足蹠
部および後大腿部筋肉内に、毎週１回３週間投与した。
投与後１週間ほどで採血して血清を得、これを抗ssＤＮ
Ａ血清とした。
濃度の乳状化した単鎖ＤＮＡ（抗原）を、ウサギの足蹠
部および後大腿部筋肉内に、毎週１回３週間投与した。
投与後１週間ほどで採血して血清を得、これを抗ssＤＮ
Ａ血清とした。
【００１９】常法に従ってホルマリン固定、パラフィン
抱埋された子宮頸部癌組織および同じ子宮頸部の組織切
片を、脱パラフィンした後、ＲＮase Ａにて30分、２規
定塩酸にて30分間処理し、次いでウサギ抗ssＤＮＡ血清
を４℃にて12時間反応させた。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）
にて洗浄後、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体（２次抗
体）を37℃にて１時間反応させ、同様にＰＢＳにて洗浄
後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを反応さ
せた。さらにＰＢＳにて洗浄後、ＤＡＢ発色液（0.01％
3,3'-ジアミノベンジジン−50ｍＭトリス塩酸（pH7.
6)）にて発色させて、顕微鏡下で観察した。
抱埋された子宮頸部癌組織および同じ子宮頸部の組織切
片を、脱パラフィンした後、ＲＮase Ａにて30分、２規
定塩酸にて30分間処理し、次いでウサギ抗ssＤＮＡ血清
を４℃にて12時間反応させた。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）
にて洗浄後、ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体（２次抗
体）を37℃にて１時間反応させ、同様にＰＢＳにて洗浄
後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンを反応さ
せた。さらにＰＢＳにて洗浄後、ＤＡＢ発色液（0.01％
3,3'-ジアミノベンジジン−50ｍＭトリス塩酸（pH7.
6)）にて発色させて、顕微鏡下で観察した。
【００２０】図１に示した如く腫瘍部（図中上半部）で
は、塩酸処理によってＤＮＡが単鎖化され、これに対す
るウサギＩｇＧ（抗ssＤＮＡ）が結合して、さらにその
ウサギＩｇＧに対するビオチン化抗ウサギＩｇＧとアビ
ジンとの結合が観察された。この図は癌細胞が密集した
子宮頸部組織の写真図であり、癌細胞核（図中上半部）
のみが、特異的かつ選択的に茶褐色に染色されていた。
図中下半部は、正常な粘膜下組織であり、抗単鎖ＤＮＡ
抗体陰性であった。一方、同一患者の子宮頸部正常組織
についても実施例と同様に処理した、図２の鏡検写真図
に示すように、正常組織には茶褐色に染色される核は認
められなかった。
は、塩酸処理によってＤＮＡが単鎖化され、これに対す
るウサギＩｇＧ（抗ssＤＮＡ）が結合して、さらにその
ウサギＩｇＧに対するビオチン化抗ウサギＩｇＧとアビ
ジンとの結合が観察された。この図は癌細胞が密集した
子宮頸部組織の写真図であり、癌細胞核（図中上半部）
のみが、特異的かつ選択的に茶褐色に染色されていた。
図中下半部は、正常な粘膜下組織であり、抗単鎖ＤＮＡ
抗体陰性であった。一方、同一患者の子宮頸部正常組織
についても実施例と同様に処理した、図２の鏡検写真図
に示すように、正常組織には茶褐色に染色される核は認
められなかった。
【００２１】
【実施例２】図３は実施例１と同様に処理した前立腺癌
組織の鏡検像である。図面中央上半部の空腔部分の周囲
及びその下方では、比較的核が大きく茶褐色に染色され
ている細胞が密集した部分が存在していた。この部分は
周囲の細胞に比べ比較的核が大きいことから癌組織と認
められる。このように、抗ssＤＮＡ抗体による染色によ
り正常細胞と癌組織とを判別できることが確認できた。
組織の鏡検像である。図面中央上半部の空腔部分の周囲
及びその下方では、比較的核が大きく茶褐色に染色され
ている細胞が密集した部分が存在していた。この部分は
周囲の細胞に比べ比較的核が大きいことから癌組織と認
められる。このように、抗ssＤＮＡ抗体による染色によ
り正常細胞と癌組織とを判別できることが確認できた。
【００２２】
【実施例３】モノクローナルの抗単鎖ＤＮＡ抗体を調製
して、これによる細胞核ＤＮＡの免疫組織化学的染色を
行った。モノクローナル抗単鎖ＤＮＡ抗体は以下のよう
に調製した。
して、これによる細胞核ＤＮＡの免疫組織化学的染色を
行った。モノクローナル抗単鎖ＤＮＡ抗体は以下のよう
に調製した。
【００２３】実施例１と同様にして得られた単鎖ＤＮＡ
−ＭＢＳＡ懸濁液を、等量のフロインド完全アジュバン
トで乳状化し、50μg 単鎖ＤＮＡ／200 μL の乳液を調
製した。これを200 μL 、Balb/Cマウス（8 weeks-fema
le) の腹腔内に投与して１次免疫（1st prime)とした。
追加免疫（immuno-booster) は単鎖ＤＮＡ−ＭＢＳＡ懸
濁液（100 μg 単鎖ＤＮＡ／200 μL ）を２週間ごとに
２回、腹腔内投与で行った。
−ＭＢＳＡ懸濁液を、等量のフロインド完全アジュバン
トで乳状化し、50μg 単鎖ＤＮＡ／200 μL の乳液を調
製した。これを200 μL 、Balb/Cマウス（8 weeks-fema
le) の腹腔内に投与して１次免疫（1st prime)とした。
追加免疫（immuno-booster) は単鎖ＤＮＡ−ＭＢＳＡ懸
濁液（100 μg 単鎖ＤＮＡ／200 μL ）を２週間ごとに
２回、腹腔内投与で行った。
【００２４】最終免疫の４日後に、免疫マウスの脾臓を
取り出し、この脾臓細胞とマウス・ミエローマ細胞（SP
-2、Sp-2/O-Ag14)とを、ポリエチレングリコールを用い
る常法に従って細胞融合させた。培養上清中に抗ssＤＮ
Ａ活性の認められるクローンを、ＥＬＩＳＡ法により選
別し、限界希釈法を３回繰り返すことにより、モノクロ
ーン性を確立した。
取り出し、この脾臓細胞とマウス・ミエローマ細胞（SP
-2、Sp-2/O-Ag14)とを、ポリエチレングリコールを用い
る常法に従って細胞融合させた。培養上清中に抗ssＤＮ
Ａ活性の認められるクローンを、ＥＬＩＳＡ法により選
別し、限界希釈法を３回繰り返すことにより、モノクロ
ーン性を確立した。
【００２５】得られた抗体産生細胞を生理食塩水(Salin
e)にて１×107 cells/mLに調製し、この細胞浮遊液をBa
lb/Cマウス（15 weeks; female）腹腔内に投与した。マ
ウスは予めプリスタン（Pristane; 2,6,10,14-Tetramet
hylpentadecane, 和光純薬）0.5 mLを７日間おきに２回
腹腔内投与したものを用い、２回目の投与後４日目に、
前述のように抗体産生細胞浮遊液を投与した。
e)にて１×107 cells/mLに調製し、この細胞浮遊液をBa
lb/Cマウス（15 weeks; female）腹腔内に投与した。マ
ウスは予めプリスタン（Pristane; 2,6,10,14-Tetramet
hylpentadecane, 和光純薬）0.5 mLを７日間おきに２回
腹腔内投与したものを用い、２回目の投与後４日目に、
前述のように抗体産生細胞浮遊液を投与した。
【００２６】投与後７日目に、マウス腹腔内で生産され
た抗体含有腹水を集め、遠心により細胞を除去した後、
硫酸アンモニウム沈澱法によりＩｇＧ分画を集め、さら
にプロテインＡ−セファロース・アフィニティ・クロマ
トグラフィにより抗体の精製を行った。こうして得られ
たモノクローナル抗体を用いて、以下の染色を行った。
た抗体含有腹水を集め、遠心により細胞を除去した後、
硫酸アンモニウム沈澱法によりＩｇＧ分画を集め、さら
にプロテインＡ−セファロース・アフィニティ・クロマ
トグラフィにより抗体の精製を行った。こうして得られ
たモノクローナル抗体を用いて、以下の染色を行った。
【００２７】染色に際しては、外科切除組織、バイオプ
シー（生検）で採取された組織、あるいは剖検で採取さ
れた組織を１０％ホルマリン緩衝液に一晩から二晩浸し
て固定し、エタノール、さらにキシレンをそれぞれ約２
４時間かけて通して脱水した。これを６０℃に暖めたパ
ラフィンに２時間ほど浸してから型に組織を載せパラフ
ィンで包埋し、パラフィン包埋ブロックとした。パラフ
ィン包埋ブロックは、ミクロトームで薄切して組織切片
とし、スライドグラスに載せた。この組織切片をキシレ
ンの入った４つの槽に４分間づつ浸して脱パラフィンし
た。続けてエタノールの入った４つの槽に４分間づつ浸
し、さらにＰＢＳの入った槽にてＰＢＳに馴染ませた。
シー（生検）で採取された組織、あるいは剖検で採取さ
れた組織を１０％ホルマリン緩衝液に一晩から二晩浸し
て固定し、エタノール、さらにキシレンをそれぞれ約２
４時間かけて通して脱水した。これを６０℃に暖めたパ
ラフィンに２時間ほど浸してから型に組織を載せパラフ
ィンで包埋し、パラフィン包埋ブロックとした。パラフ
ィン包埋ブロックは、ミクロトームで薄切して組織切片
とし、スライドグラスに載せた。この組織切片をキシレ
ンの入った４つの槽に４分間づつ浸して脱パラフィンし
た。続けてエタノールの入った４つの槽に４分間づつ浸
し、さらにＰＢＳの入った槽にてＰＢＳに馴染ませた。
【００２８】次に、スライドグラス上の組織切片にＲＮ
ase (Ribonucleotidase A, Type-AS, Bovine pancreas,
Sigma, USA ）溶液（0.1mg/mL in PBS ）を重層し、３
７℃インキュベータ中で３０分間反応させて、抗ssＤＮ
Ａ抗体が認識し得る単鎖状態で存在するＲＮＡを分解除
去した。反応後、ＰＢＳの入った槽で５分間づつ３回洗
浄した。この組織切片を載せたスライドグラスを、予め
３０℃に暖めておいた２Ｎ塩酸に浸して、３０℃インキ
ュベータ中で２０分間、加水分解を行った。反応後速や
かにＰＢＳの入った槽で５分間づつ４回洗浄し、次いで
１％スキムミルク−ＰＢＳを重層して１０分間反応（ブ
ロッキング）した。
ase (Ribonucleotidase A, Type-AS, Bovine pancreas,
Sigma, USA ）溶液（0.1mg/mL in PBS ）を重層し、３
７℃インキュベータ中で３０分間反応させて、抗ssＤＮ
Ａ抗体が認識し得る単鎖状態で存在するＲＮＡを分解除
去した。反応後、ＰＢＳの入った槽で５分間づつ３回洗
浄した。この組織切片を載せたスライドグラスを、予め
３０℃に暖めておいた２Ｎ塩酸に浸して、３０℃インキ
ュベータ中で２０分間、加水分解を行った。反応後速や
かにＰＢＳの入った槽で５分間づつ４回洗浄し、次いで
１％スキムミルク−ＰＢＳを重層して１０分間反応（ブ
ロッキング）した。
【００２９】反応液を除去した後、抗単鎖ＤＮＡモノク
ローナル抗体を０．１％スキムミルク−ＰＢＳにて５０
倍希釈して重層し、４℃にて一晩反応させた。反応後速
やかにＰＢＳの入った槽で５分間づつ３回洗浄し、さら
にImmu-Mark ユニバーサルキット（ＩＣＮ，ImmunoBiol
ogicals ）のビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体を２時
間、次いでImmu-Mark ユニバーサルキットのペルオキシ
ダーゼ標識ストレプトアビジンを１時間、それぞれ標本
に重層し、３７℃のインキュベータ中で反応させた。反
応後、ＰＢＳの入った槽で５分間づつ３回洗浄し、以下
の組成のＤＡＢ−cobalt液の入った槽に５分間浸してか
ら、さらに10μL の３％Ｈ2 Ｏ2 を加えて１５〜３０分
発色させた（ＤＡＢ−cobalt発色）。
ローナル抗体を０．１％スキムミルク−ＰＢＳにて５０
倍希釈して重層し、４℃にて一晩反応させた。反応後速
やかにＰＢＳの入った槽で５分間づつ３回洗浄し、さら
にImmu-Mark ユニバーサルキット（ＩＣＮ，ImmunoBiol
ogicals ）のビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体を２時
間、次いでImmu-Mark ユニバーサルキットのペルオキシ
ダーゼ標識ストレプトアビジンを１時間、それぞれ標本
に重層し、３７℃のインキュベータ中で反応させた。反
応後、ＰＢＳの入った槽で５分間づつ３回洗浄し、以下
の組成のＤＡＢ−cobalt液の入った槽に５分間浸してか
ら、さらに10μL の３％Ｈ2 Ｏ2 を加えて１５〜３０分
発色させた（ＤＡＢ−cobalt発色）。
【００３０】
【表１】 ＤＡＢ−cobalt液 ─────────────────────────── ＤＡＢ（ 3,3'-diaminobenzidine・5HCl・2H2O ) 50 mg 0.05 M Tris-HCl 緩衝液, pH 7.6 100 mL CoCl2・6H2O (1 ％水溶液） 2 mL ───────────────────────────
【００３１】次いで、これを流水で水洗し、ケルンエヒ
トロート染色液に３０秒間浸し、流水にて十分に水洗し
て組織形態を観察し易くした後に、透過型顕微鏡ににて
観察した。
トロート染色液に３０秒間浸し、流水にて十分に水洗し
て組織形態を観察し易くした後に、透過型顕微鏡ににて
観察した。
【００３２】図４に示した如く写真図全領域に広がる腫
瘍部は、塩酸処理によってＤＮＡが単鎖化され、これに
対する抗ssＤＮＡモノクローナル抗体が結合して、さら
にそのマウスＩｇＧに対するビオチン化抗マウスＩｇＧ
とアビジンとの結合が、特異的に褐色に染色される。こ
の図は癌細胞が密集した大腸癌組織の写真図であり、ほ
ぼすべての細胞が癌細胞であり、すべての核が、特異的
かつ選択的に茶褐色に染色されていた。
瘍部は、塩酸処理によってＤＮＡが単鎖化され、これに
対する抗ssＤＮＡモノクローナル抗体が結合して、さら
にそのマウスＩｇＧに対するビオチン化抗マウスＩｇＧ
とアビジンとの結合が、特異的に褐色に染色される。こ
の図は癌細胞が密集した大腸癌組織の写真図であり、ほ
ぼすべての細胞が癌細胞であり、すべての核が、特異的
かつ選択的に茶褐色に染色されていた。
【００３３】図５に示した組織は、同一条件で染色した
同一患者の大腸正常組織であり、図４に認められる茶褐
色に染色される核は認められなかった。このように、抗
ssＤＮＡモノクローナル抗体による染色によっても正常
細胞と癌組織とが判別できることが確認できた。
同一患者の大腸正常組織であり、図４に認められる茶褐
色に染色される核は認められなかった。このように、抗
ssＤＮＡモノクローナル抗体による染色によっても正常
細胞と癌組織とが判別できることが確認できた。
【図１】本発明の方法により処理した子宮頸部組織（子
宮頸部粘膜上皮内癌）の鏡検写真図である（実施例
１）。図中上半部では、細胞核が濃く染色され抗単鎖Ｄ
ＮＡ抗体陽性の腫瘍組織であることを示している。図中
下半部は、抗単鎖ＤＮＡ抗体陰性であり、正常な粘膜下
組織であることを示している。
宮頸部粘膜上皮内癌）の鏡検写真図である（実施例
１）。図中上半部では、細胞核が濃く染色され抗単鎖Ｄ
ＮＡ抗体陽性の腫瘍組織であることを示している。図中
下半部は、抗単鎖ＤＮＡ抗体陰性であり、正常な粘膜下
組織であることを示している。
【図２】図１と同じ患者の正常子宮頸部組織を本発明の
方法で同様に処理した結果の鏡検写真図である（実施例
１）。その視野は図１に対応する。図中中央に広がる粘
膜上皮には抗単鎖ＤＮＡ抗体による染色は認められな
い。
方法で同様に処理した結果の鏡検写真図である（実施例
１）。その視野は図１に対応する。図中中央に広がる粘
膜上皮には抗単鎖ＤＮＡ抗体による染色は認められな
い。
【図３】同様に処理した前立腺癌組織の鏡検像である
（実施例２）。図面中央上半部の空腔部分の周囲及びそ
の下方に存在する、比較的核が大きく茶褐色に染色され
ている細胞が密集した部分が癌組織である。
（実施例２）。図面中央上半部の空腔部分の周囲及びそ
の下方に存在する、比較的核が大きく茶褐色に染色され
ている細胞が密集した部分が癌組織である。
【図４】本発明の方法により、マウス・モノクローナル
抗ssＤＮＡ抗体で処理し、ケルンエヒトロート核染色と
ＤＡＢ−cobalt発色を行った大腸癌組織の鏡検写真図で
ある（実施例３）。視野全体が大腸癌の腺管組織であ
り、腺管を形成している癌組織の細胞核は、すべてＤＡ
Ｂ−cobalt発色陽性を示し、茶褐色に発色した部位が腫
瘍組織であることを示している。
抗ssＤＮＡ抗体で処理し、ケルンエヒトロート核染色と
ＤＡＢ−cobalt発色を行った大腸癌組織の鏡検写真図で
ある（実施例３）。視野全体が大腸癌の腺管組織であ
り、腺管を形成している癌組織の細胞核は、すべてＤＡ
Ｂ−cobalt発色陽性を示し、茶褐色に発色した部位が腫
瘍組織であることを示している。
【図５】図４と同じ患者の正常大腸粘膜組織を本発明の
方法で同様に処理した結果の鏡検写真図である（実施例
３）。視野全体が大腸癌の腺管組織であるが、図中に広
がる粘膜上皮細胞には図４に認められるような抗単鎖Ｄ
ＮＡ抗体により茶褐色に染色される細胞核は認められな
い。
方法で同様に処理した結果の鏡検写真図である（実施例
３）。視野全体が大腸癌の腺管組織であるが、図中に広
がる粘膜上皮細胞には図４に認められるような抗単鎖Ｄ
ＮＡ抗体により茶褐色に染色される細胞核は認められな
い。
Claims (5)
- 【請求項１】 病理組織標品を酸処理して、この病理組
織中の損傷ＤＮＡを選択的に加水分解して単鎖ＤＮＡを
生成させ、この病理組織標品を単鎖ＤＮＡに対する抗体
で処理し、この抗体結合の有無を形態学的に観察するこ
とを特徴とする細胞核ＤＮＡの損傷検出方法。 - 【請求項２】 前記抗体結合の有無を、２次抗体を使用
して免疫組織化学的染色処理により観察することを特徴
とする請求項１記載の細胞核ＤＮＡの損傷検出方法。 - 【請求項３】 前記酸処理の前に、病理組織標品を予め
リボヌクレアーゼ処理しておくことを特徴とする請求項
１または２記載の細胞核ＤＮＡの損傷検出方法。 - 【請求項４】 前記病理組織標品を単鎖ＤＮＡに対する
抗体で処理する前後に、核染色を行うことを特徴とする
請求項１〜３記載の細胞核ＤＮＡの損傷検出方法。 - 【請求項５】 前記抗体はモノクローナル抗体であるこ
とを特徴とする請求項１〜４記載の細胞核ＤＮＡの損傷
検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9484593A JPH07306202A (ja) | 1992-04-01 | 1993-03-31 | 細胞核ｄｎａの損傷検出方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4-105221 | 1992-04-01 | ||
| JP10522192 | 1992-04-01 | ||
| JP9484593A JPH07306202A (ja) | 1992-04-01 | 1993-03-31 | 細胞核ｄｎａの損傷検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07306202A true JPH07306202A (ja) | 1995-11-21 |
Family
ID=26436086
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9484593A Withdrawn JPH07306202A (ja) | 1992-04-01 | 1993-03-31 | 細胞核ｄｎａの損傷検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07306202A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004023141A1 (ja) * | 2002-09-06 | 2004-03-18 | Eiji Matsuura | 生体内の酸化LDL−β２−グリコプロテインⅠ複合体の測定方法 |
| WO2004106537A1 (ja) * | 2003-05-29 | 2004-12-09 | Sakura Seiki Co., Ltd. | 癌細胞の検出方法 |
| JP2010530524A (ja) * | 2007-06-13 | 2010-09-09 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 腫瘍増殖を阻害する方法および薬剤 |
| JP5613044B2 (ja) * | 2008-03-31 | 2014-10-22 | シスメックス株式会社 | 細胞処理装置、試料調製装置および細胞分析装置 |
-
1993
- 1993-03-31 JP JP9484593A patent/JPH07306202A/ja not_active Withdrawn
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004023141A1 (ja) * | 2002-09-06 | 2004-03-18 | Eiji Matsuura | 生体内の酸化LDL−β２−グリコプロテインⅠ複合体の測定方法 |
| US7455976B2 (en) | 2002-09-06 | 2008-11-25 | Eiji Matsuura | Method of measuring oxidized LDL/β2-glycoprotein I complex occurring in the living body |
| WO2004106537A1 (ja) * | 2003-05-29 | 2004-12-09 | Sakura Seiki Co., Ltd. | 癌細胞の検出方法 |
| JP2010530524A (ja) * | 2007-06-13 | 2010-09-09 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 腫瘍増殖を阻害する方法および薬剤 |
| JP5613044B2 (ja) * | 2008-03-31 | 2014-10-22 | シスメックス株式会社 | 細胞処理装置、試料調製装置および細胞分析装置 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20000704 |