JPH07258288A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg 【効果】 このペプチドは米の蛋白質から得られるかあ
るいは化学合成によって得られる。抗オピオイド活性、
ファゴサイトーシス活性、及びインターロイキン−１産
生促進活性を有し、その性質を利用して免疫増強物質と
して医薬品あるいは生化学試薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-
Pro-Leu-Pro-Arg のアミノ酸配列を有する新規ペプチド
に関する。本発明のペプチドは抗オピオイド活性、ファ
ゴサイトーシス活性、インターロイキン−１産生促進活
性を有し、免疫増強物質として医薬品あるいは生化学試
薬として有用である。

【０００２】

【従来の技術】近年、内因性の神経ホルモンの中に免疫
修飾活性を持つものがあるなど、神経系と免疫系の相互
調節機構が明らかになってきており、このような神経系
と免疫系の両方に影響するような物質が食品から得られ
れば、非常にユニークであるばかりではなく、食品によ
る生体調節という観点からも極めて興味深い。元来、米
は我々日本人の主食であり、この米中に生体機能を調節
する生理活性物質の存在が証明されれば、日常摂取して
いる米の新しい生理的意義を解明することにつながる。
従来、米に含まれる生理活性物質として、米糠のアルカ
リ油等から得られるオリザノールが知られており、この
一成分であるシクロアルテノールフェルラ酸エステルを
用いた性腺刺激による動物の繁殖能力を上げるもの（特
開昭 57-149248号）や、オリザノールを含む栄養組成物
（特開昭61-58536号）などが知られている。また、米糠
を特定濃度の蔗糖溶液に浸漬後、熱水処理して得た抽出
液に極性溶媒を加え、生じた沈殿を分離精製し得られる
抗腫瘍活性、免疫調節活性、感染防御活性を有する生理
活性多糖ＲＯＮ（特開平2-208301号）等も開示されてい
る。また、米に含まれる生理活性蛋白質として、システ
インプロテアーゼ阻害活性を有するオリザシスタチンが
あり、抗ウイルス作用を示すことが報告されている（Ｆ
ＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ，Ｖｏｌ．２９９，Ｎｏ．１，
ｐｐ４８−５０（１９９２））。本発明者らは神経ホル
モンの一つとして特にオピオイド関連物質に注目し、米
中に含まれる成分と生理活性との関係を研究する過程に
おいて、新たに米の蛋白質の加水分解物中に抗オピオイ
ド活性、ファゴサイトーシス活性、及びインターロイキ
ン−１産生促進活性を有するペプチドを見出し、本発明
を完成するに至った。本発明ペプチドをオリザテンシン
と命名した。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、米の蛋白質
のなかから、生理活性物質を得ることを目的とする。さ
らに具体的には、本発明はGly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Le
u-Pro-Arg のアミノ酸配列を有し、抗オピオイド活性、
ファゴサイトーシス活性、並びにインターロイキン−１
産生促進活性を有し免疫増強物質として利用可能なペプ
チドを提供することを課題とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、Gly-Tyr-Pro-
Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg のアミノ酸配列を有するペプ
チドである。本発明のペプチドは、新規なペプチドであ
り、抗オピオイド活性、ファゴサイトーシス活性及びイ
ンターロイキン−１産生促進活性を有し、免疫増強作用
を利用して医薬品あるいは生化学試薬として有用に利用
される。本発明のペプチドは、米粉に食塩水を加え透析
して得られた可溶性蛋白質をトリプシン処理し、高速液
体クロマトグラフで分画を行い得ることができる。又、
市販のペプチドシンセサイザーを用いることにより容易
に合成が可能である。例えば、合成装置としてＳａｍ
Ｔｗｏペプチド合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ社製）を
用いてペプチドの合成を行う。即ち、樹脂に活性基を保
護したアミノ酸を吸着させ、これにデブロッキング液を
注入して保護基を除去し、活性基を保護したアミノ酸を
注入し、両者を反応させ、ジペプチドを合成する。この
操作を繰り返すことにより、目的とする配列を有するペ
プチドを合成する。ペプチドの担体としての樹脂からの
脱離と保護基の除去は、１０％アニソールを含む無水フ
ッ化水素中で０°Ｃの温度条件下に１時間攪拌すること
により行う。フッ化水素を留去した後樹脂をエーテルで
洗浄し、３０％酢酸により抽出し、凍結乾燥により粗ペ
プチドが得られる。この粗ペプチドを０．１％トリフル
オロ酢酸に溶解した後、オクタデシルシラン（ＯＤＳ）
カラムを接続した高速液体クロマトグラフにより、０．
１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的
濃度勾配にて展開、精製する。目的とするペプチドは、
ペプチド特有の溶出位置を示す。このようにして得られ
たペプチドのアミノ酸配列は、プロテインシーケンサー
による配列分析及びアミノ酸分析計によるアミノ酸分析
により特定できる。

【０００５】本発明ペプチドは、オピオイド活性、ファ
ゴサイトーシス活性並びにインターロイキン−１（ＩＬ
−１）産生促進活性作用を有し、ヒト及び動物に対する
免疫増強剤として使用される。本発明ペプチドは生体防
御機構、即ち免疫機構に働く細胞の活性化促進を適用と
し、具体的にはアレルギー症、感染症、免疫不全症、自
己免疫強化による腫瘍に対する生体防御及び移植に伴う
生体拒絶反応、その他各種免疫疾患等に使用できる。

【０００６】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明する。しかしこれらは単に例示するのみであり、
本発明はこれらにより限定されるものではない。

【実施例１】酵素分解による本発明ペプチドの製造方法 米粉を７倍量の１Ｍ食塩水にて抽出し、その遠心上清を
０．１Ｍ食塩水に対して透析し可溶性蛋白質を得た。透
析は、Ｖｉｓｋａｓｅ Ｓａｌｅｓ社製の透析膜を用い
て透析した。この蛋白質をｐＨ７．６に調整した後、蛋
白質の１／１００に相当するトリプシンを加え３７°Ｃ
にて５時間の消化を行い、沸騰水上で１０分間加熱して
酵素を失活させ、トリプシン消化物とした。２１ｍｇの
トリプシン消化物をオクタデシルシランカラム（Ｃｏｓ
ｍｏｓｉｌ ５Ｃ₁₈−ＡＲ、２０φ×２５０ｍｍ、ナカ
ライテスク社製）を装着した高速液体クロマトグラフ
（Ｍ６００、ミリポア社製）にて、０．１％トリフルオ
ロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配（０〜５
０％／分、１０ｍｌ／分）により分画した。溶出パター
ンを図１に示す。アセトニトリル濃度約３１％で溶出さ
れた活性画分をフェネチルシリカカラム（Ｄｅｖｅｌｏ
ｓｉｌ ＰＨ−Ａ−Ｔ−５、４．６φ×２５０ｍｍ、野
村科学社製）にて０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセ
トニトリルの直線的濃度勾配（０〜４０％／分、１ｍｌ
／分）により分画した。溶出パターンを図２に示した。
アセトニトリル濃度約３６％で溶出された活性画分をさ
らにオクタデシルシランカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５
Ｃ₁₈−ＡＲ、４．６φ×１５０ｍｍ、ナカライテスク社
製）にて１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を含むア
セトニトリルの直線的濃度勾配（０〜４０％／分、１ｍ
ｌ／分）により分画した。溶出パターンを図３に示す。
アセトニトリル濃度約２８％で溶出された活性画分をプ
ロテインシーケンサー（４７７Ａ、アプライドバイオシ
ステムズ社製）にて解析し、Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-
Leu-Pro-Arg のアミノ酸配列を有する９残基からなるペ
プチドを確認した。このペプチドのＲｆ値は、次の条件
で測定して０．５６であった。 薄層プレート；メルク社製 ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６
０Ｆ₂₅₄ 展開溶媒；ｎ−ブタノール：酢酸：ピリジン：水＝１
５：３：１０：１２

【０００７】

【実施例２】合成による本発明ペプチドの製造方法 Ｓａｍ Ｔｗｏペプチド合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ
社製）により、同装置の標準プロトコールに従って合成
した。即ち、１ｇ当たり０．５ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏｃ−
Ａｒｇ（Ｔｏｓ）を結合したアシルオキシメチル樹脂２
ｇをペプチド合成装置の反応容器にセットし、４５ｖ／
ｖ％トリフルオロ酢酸、２．５ｖ／ｖ％アニソール、５
２．５ｖ／ｖ％ジクロロメタンを含むデブロック液と２
０分間接触させｔ−Ｂｏｃ基を除いた。ジクロロメタン
による洗浄の後、１０ｖ／ｖ％ジイソプロピルエチルア
ミンを含むジクロロメタンにて樹脂中和し、ジクロロメ
タンにより洗浄した。その後６．７ｍｍｏｌのｔ−Ｂｏ
ｃ−Ｐｒｏ及び６．７ｍｍｏｌのジイソプロピルカルボ
ジイミド（それぞれ理論当量の６．７倍）を含む３４ｍ
ｌのジクロロメタン、ジメチルフォルムアミド混合液中
で２時間室温にて反応せしめた。ジメチルフォルムアミ
ド及びジクロロメタンにて順次洗浄した後、上記と同様
にデブロッキングを行い、以下同様にＣ末端側からｔ−
Ｂｏｃ−Ｌｅｕ、ｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ、ｔ−Ｂｏｃ−Ｔ
ｙｒ（Ｃｌ₂ Ｂｚｌ）、ｔ−Ｂｏｃ−Ｍｅｔ、ｔ−Ｂｏ
ｃ−Ｐｒｏ、ｔ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（Ｃｌ₂ Ｂｚｌ）、ｔ
−Ｂｏｃ−Ｇｌｙを順次結合せしめ、ｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌ
ｙ−Ｔｙｒ（Ｃｌ₂ Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ
（Ｃｌ₂ Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
（Ｔｏｓ）−樹脂を得た。この樹脂を１０％アニソール
を含む無水フッ化水素中で１時間０°Ｃで反応させた
後、フッ化水素の留去及びエーテルによる洗浄を行っ
た。得られたペプチド及び樹脂の混合物から３０％酢酸
にてペプチドを抽出し凍結乾燥することによって約８０
０ｍｇの粗ペプチドを得た。粗ペプチドを０．１％トリ
フルオロ酢酸に溶解した後、オクタデシルシランカラム
（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ₁₈−ＡＲ、２０φ×２５０ｍ
ｍ、ナカライテスク社製）を接続した高速液体クロマト
グラフ（Ｍ６００型、日本ウォータース社製）により、
０．１％のトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直
線的濃度勾配（０〜５０％／５０分、１０ｍｌ／分）に
て展開した。目的とするペプチドはアセトニトリル濃度
約３９％にて溶出された。このようにして得られた物質
がGly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg であることは
アミノ酸分析（Ｐｒｏ：Ｇｌｙ：Ｍｅｔ：Ｌｅｕ：Ｔｙ
ｒ＝２．９０：１．００：０．９５：０．９７：１．９
０）及びプロテインシーケンサー（４７７Ａ、アプライ
ドバイオシステムズ社製）により確認された。このＲｆ
値を実施例１と同様の方法で測定したところ実施例１と
同様に０．５６であった。

【０００８】

【試験例１】抗オピオイド活性の測定 モルモット回腸縦走筋神経叢標本のオピオイド作用薬に
よる収縮抑制を解除する作用により測定した。体重３０
０〜３５０ｇのモルモットより抽出した回腸から縦走筋
神経叢標本を調製し、該標本の一端を糸を介して等長性
トランスジューサに接続し、他端を内容積２ｍｌのマグ
ナス管の底に固定した。マグナス管にはクレブス−リン
ゲル液を満たし、３７°Ｃの温度に保ち、Ｏ₂ ／Ｃ０₂
混合ガス（９５：５）を通気した。マグナス管内の電極
には１０秒に１回の割合で電気刺激（１０Ｖ、０．５ｍ
ｓｅｃ）を与え、筋収縮の張力を電気的に記録した。
尚、収縮はオピオイドアゴニストによって抑制される。
検体のオピオイドアンタゴニストの活性の強さは、〔Ｄ
−Ａｌａ² 、Ｎ−Ｍｅ−Ｐｈｅ⁴ 、Ｇｌｙｏｌ⁵ 〕エン
ケファリンのオピオイドアゴニスト活性を１／２にする
のに必要なアンタゴニストの濃度ＥＣ₅₀値により表し
た。このようにして測定した本発明ペプチドのＥＣ₅₀値
は、０．２μＭであった。

【０００９】

【試験例２】モルモット回腸収縮作用 体重３００〜５００ｇのモルモットより摘出した回腸縦
走筋切片を高木らの方法（高木他編、９４〜９９頁、南
山堂、１９７２年発行）に従って処理をし、上述のオピ
オイドアンタゴニスト活性測定と同様に測定をした。但
し、本測定においては、回腸収縮反応を最大値の５０％
誘起する値を求めた。本発明ペプチドは回腸収縮作用と
してのＥＤ₅₀値は、０．２μＭであった。

【００１０】

【試験例３】ファゴサイトーシス活性の測定方法 ヒト末梢血にＰＢＳを加え１０００ｒｐｍ×５分の遠心
分離で血球を洗浄した後、ＰＢＳにて４×１０⁶ 個／ｍ
ｌの血球の懸濁液を調製した。この溶液１００μｌを採
り、ＰＢＳに溶解させたペプチド溶液１０μｌを加え３
７°Ｃで１０分インキュベートを行い、次いでヒト末梢
血でオプソニン化した４×１０⁸ 個／ｍｌの蛍光標識ラ
テックスビーズ液１０μｌを加え、さらに５分インキュ
ベートを行った。ＥＤＴＡを含むＰＢＳで反応を停止さ
せ、遠心により血球を分離し、これに塩化アンモニウム
溶血剤を加えて溶血させ白血球を得た。これをＥＤＴＡ
を含むＰＢＳに懸濁後、フローサイトメトリーにて測定
した。結果を表１及び図４に示した。

【００１１】

【表１】 本発明ペプチドのファゴサイトーシス促進活性 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ペプチド濃度（μＭ） ファゴサイトーシス（相対値） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ０ １．０ ０．１ １．２ １ １．７ １０ ２．０ １００ ２．２ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００１２】

【試験例４】インターロイキン−１産生促進能の測定 デンプンを腹腔内投与したＣ３Ｈ／ＪｅＮマウスから４
日後に腹腔マクロファージを調製し、５％ウシ胎児血清
を含むＲＰＭＩ１６４０培地にて培養して得られた付着
細胞にペプチドを添加後２４時間培養する。その培養上
清をＣｏｎ Ａによって刺激されたＣ３Ｈ／ＨｅＪマウ
ス胸腺細胞培養系に添加し、１０％ウシ胎児血清を含む
ＲＰＭＩ１６４０培地にて６６時間培養する。〔 ³Ｈ〕
チミジンを添加後さらに６時間培養し、細胞への取り込
みを測定した。細胞へのチミジンの取り込みはマクロフ
ァージによって生産されたインターロイキン−１量を反
映している。結果を表２及び図５に示した。

【００１３】

【表２】 インターロイキン−１に対する本発明ペプチドの効果 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ペプチド濃度 チミジン取り込み（相対値） ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 無添加 １．００ １μＭ 本発明ペプチド添加 １．６２ ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００１４】

【発明の効果】本発明により、抗オピオイド活性、ファ
ゴサイトーシス活性、インターロイキン−１産生促進活
性を有し、免疫増強物質として利用可能なペプチドが提
供される。本発明のペプチドは医薬品あるいは生化学試
薬として有用である。

【００１５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１による本発明ペプチドのオクタデシル
シランカラム（pH2)からの溶出パターンを示す。

【符号の説明】

矢印が本発明ペプチドの溶出を示す。

【図２】実施例２による本発明ペプチドのフェネチルシ
リカカラム（pH2)からの溶出パターンを示す。

【符号の説明】 矢印が本発明ペプチドの溶出を示す。

【図３】実施例１による本発明ペプチドのオクタデシル
シランカラム（pH7.4)からの溶出パターンを示す。

【符号の説明】

矢印が本発明ペプチドの溶出を示す。

【図４】試験例３による本発明ペプチドのファゴサイト
ーシス促進活性を示す。

【図５】試験例４による本発明ペプチドのインターロイ
キン−１産生促進活性を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＥＤ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次のアミノ酸配列を有するペプチド。 Gly-Tyr-Pro-Met-Tyr-Pro-Leu-Pro-Arg