JPH07184641A - ６ホスホグルコン酸脱水素酵素を産生する細菌株と、その大量増殖方法 - Google Patents
６ホスホグルコン酸脱水素酵素を産生する細菌株と、その大量増殖方法Info
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- JPH07184641A JPH07184641A JP32933193A JP32933193A JPH07184641A JP H07184641 A JPH07184641 A JP H07184641A JP 32933193 A JP32933193 A JP 32933193A JP 32933193 A JP32933193 A JP 32933193A JP H07184641 A JPH07184641 A JP H07184641A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチド
（ＮＡＤ）に特異的に作用する６ホスホグルコン酸脱水
素酵素（６ＰＧＤＨ）を産生するロイコノストック・ラ
クティスＳＨＯ４７とロイコノストック・ラクティスＳ
ＨＯ５４、およびこれら細菌株の大量増殖方法。 【効果】 ＮＡＤに特異性が高く、かつ安定性にも優
れ、各種測定用試薬に利用可能な６ＰＧＤＨを効率よく
得ることができる。
（ＮＡＤ）に特異的に作用する６ホスホグルコン酸脱水
素酵素（６ＰＧＤＨ）を産生するロイコノストック・ラ
クティスＳＨＯ４７とロイコノストック・ラクティスＳ
ＨＯ５４、およびこれら細菌株の大量増殖方法。 【効果】 ＮＡＤに特異性が高く、かつ安定性にも優
れ、各種測定用試薬に利用可能な６ＰＧＤＨを効率よく
得ることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略記する）に特
異的に作用する６ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下６
ＰＧＤＨと略記する）を産生する新規な細菌株と、これ
ら細菌株の大量増殖方法に関するものである。
デニン・ジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略記する）に特
異的に作用する６ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下６
ＰＧＤＨと略記する）を産生する新規な細菌株と、これ
ら細菌株の大量増殖方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、酵素は、その反応の安定性、基質
との特異的結合性、および光学的定量化の容易性などの
優れた特性が注目され、医療分野や食品の成分分析など
に広く触媒として利用されている。なかでも６ＰＧＤＨ
は、とくにグルコース６リン酸脱水素酵素（以下Ｇ６Ｐ
ＤＨと略記する）との共存下でグルコース６リン酸（以
下Ｇ６Ｐと略記する）を定量する場合に、高い測定感度
が得られるという点においてその有用性が指摘されてい
る。すなわち、そのようなＧ６Ｐ測定の場合、一般的に
はＧ６ＰＤＨまたは６ＰＧＤＨの反応により生成した還
元型ＮＡＤ（以下ＮＡＤＨと略記する）または還元型ニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以
下、ＮＡＤＰＨと略記する）の３４０ｎｍにおける吸光
度を分光学的に測定するが、さらにジアホラーゼやフェ
ナジンメトサルフェート（以下ＰＭＳと略記する）およ
びその誘導体により、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈを基質と
してニトロブルーテトラゾリウム（以下ＮＢＴと略記す
る）などのテトラゾリウム塩や２，６−ジクロロフェノ
ールインドフェノール（以下ＤＣＰＩＰと略記する）な
どを還元発色させ、可視部で測定することもできる。
との特異的結合性、および光学的定量化の容易性などの
優れた特性が注目され、医療分野や食品の成分分析など
に広く触媒として利用されている。なかでも６ＰＧＤＨ
は、とくにグルコース６リン酸脱水素酵素（以下Ｇ６Ｐ
ＤＨと略記する）との共存下でグルコース６リン酸（以
下Ｇ６Ｐと略記する）を定量する場合に、高い測定感度
が得られるという点においてその有用性が指摘されてい
る。すなわち、そのようなＧ６Ｐ測定の場合、一般的に
はＧ６ＰＤＨまたは６ＰＧＤＨの反応により生成した還
元型ＮＡＤ（以下ＮＡＤＨと略記する）または還元型ニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以
下、ＮＡＤＰＨと略記する）の３４０ｎｍにおける吸光
度を分光学的に測定するが、さらにジアホラーゼやフェ
ナジンメトサルフェート（以下ＰＭＳと略記する）およ
びその誘導体により、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈを基質と
してニトロブルーテトラゾリウム（以下ＮＢＴと略記す
る）などのテトラゾリウム塩や２，６−ジクロロフェノ
ールインドフェノール（以下ＤＣＰＩＰと略記する）な
どを還元発色させ、可視部で測定することもできる。
【０００３】この様なＧ６Ｐまたは６ＰＧを経由する各
種分析対象を可視部域で測定する場合、ジアホラーゼは
ＮＡＤＨに特異性が高く、またＰＭＳにも適用できるた
め、ＮＡＤに対して特異的に作用する６ＰＧＤＨを利用
することが望ましい。６ＰＧＤＨには、補酵素として、
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以
下、ＮＡＤＰと略記する）に特異的に反応するもの（ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（European Journal of Biochemistry）、１３０巻、３
９１頁（１９８３年））、ＮＡＤとＮＡＤＰ両方に作用
するもの（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chem
istry ）、５１巻、１２５７頁（１９８３年））、ＮＡ
Ｄのみに作用するもの（エフエムビーエス・マイクロバ
イオロジー・レターズ（FMBS Microbiology Letters
）、５２巻、１９９頁（１９８８年））が知られてい
る。このＮＡＤのみに作用する６ＰＧＤＨはメタノール
資化性菌であるメチロバチルス・フラゲラタム（Methyr
obacillus flagellatum ）由来のものである。
種分析対象を可視部域で測定する場合、ジアホラーゼは
ＮＡＤＨに特異性が高く、またＰＭＳにも適用できるた
め、ＮＡＤに対して特異的に作用する６ＰＧＤＨを利用
することが望ましい。６ＰＧＤＨには、補酵素として、
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以
下、ＮＡＤＰと略記する）に特異的に反応するもの（ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（European Journal of Biochemistry）、１３０巻、３
９１頁（１９８３年））、ＮＡＤとＮＡＤＰ両方に作用
するもの（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカ
ル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chem
istry ）、５１巻、１２５７頁（１９８３年））、ＮＡ
Ｄのみに作用するもの（エフエムビーエス・マイクロバ
イオロジー・レターズ（FMBS Microbiology Letters
）、５２巻、１９９頁（１９８８年））が知られてい
る。このＮＡＤのみに作用する６ＰＧＤＨはメタノール
資化性菌であるメチロバチルス・フラゲラタム（Methyr
obacillus flagellatum ）由来のものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】メタノール資化性菌で
あるメチロバチルス・フラゲラタム（Methyrobacillus f
lagellatum ）ＫＴ１株はＮＡＤに特異性の高い６ＰＧ
ＤＨを微量生産することが知られているが、その６ＰＧ
ＤＨは、４℃で３日間保存しただけで９０％失活するよ
うな非常に不安定なものであり実用的でなかった。その
ため、この酵素を実際に各種測定用試薬中へ適用するこ
とは不可能であった。また、菌体中の酵素含有量も非常
に微量であるため、酵素を効率よく得ることはできなか
った。
あるメチロバチルス・フラゲラタム（Methyrobacillus f
lagellatum ）ＫＴ１株はＮＡＤに特異性の高い６ＰＧ
ＤＨを微量生産することが知られているが、その６ＰＧ
ＤＨは、４℃で３日間保存しただけで９０％失活するよ
うな非常に不安定なものであり実用的でなかった。その
ため、この酵素を実際に各種測定用試薬中へ適用するこ
とは不可能であった。また、菌体中の酵素含有量も非常
に微量であるため、酵素を効率よく得ることはできなか
った。
【０００５】このような理由から、ＮＡＤに特異的に作
用し、安定性に優れた６ＰＧＤＨを効率よく得るための
手段が強く要望されていた。この発明は、以上の通りの
事情に鑑みてなされたものであり、ＮＡＤに特異的に作
用し、安定性にも優れた６ＰＧＤＨを産生する新しい細
菌株と、これら細菌株の大量増殖方法を提供することを
目的としている。
用し、安定性に優れた６ＰＧＤＨを効率よく得るための
手段が強く要望されていた。この発明は、以上の通りの
事情に鑑みてなされたものであり、ＮＡＤに特異的に作
用し、安定性にも優れた６ＰＧＤＨを産生する新しい細
菌株と、これら細菌株の大量増殖方法を提供することを
目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、ＮＡＤに特異的に反応する６Ｐ
ＧＤＨを産生するストレプトコッカス・ラフィノラクテ
ィスＳＨＯ４７（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０）と、スト
レプトコッカス・ラクティスＳＨＯ５４（ＦＥＲＭ Ｐ
−１３９７１）を提供する。
を解決するものとして、ＮＡＤに特異的に反応する６Ｐ
ＧＤＨを産生するストレプトコッカス・ラフィノラクテ
ィスＳＨＯ４７（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０）と、スト
レプトコッカス・ラクティスＳＨＯ５４（ＦＥＲＭ Ｐ
−１３９７１）を提供する。
【０００７】またこの発明は、上記細菌株を、酵母エキ
ス１重量％以上含有の栄養培地にて培養することを特徴
とする上記細菌株の大量増殖方法をも提供する。以下、
この発明について詳しく説明する。まず、この発明の細
菌株ストレプトコッカス・ラフィノラクティスＳＨＯ４
７（以下、ＳＨＯ４７株と記載することがある）と、同
じくストレプトコッカス・ラクティスＳＨＯ５４株（以
下、ＳＨＯ５４株と記載することがある）について、そ
れぞれの菌学的性質を表１〜表４に示す。
ス１重量％以上含有の栄養培地にて培養することを特徴
とする上記細菌株の大量増殖方法をも提供する。以下、
この発明について詳しく説明する。まず、この発明の細
菌株ストレプトコッカス・ラフィノラクティスＳＨＯ４
７（以下、ＳＨＯ４７株と記載することがある）と、同
じくストレプトコッカス・ラクティスＳＨＯ５４株（以
下、ＳＨＯ５４株と記載することがある）について、そ
れぞれの菌学的性質を表１〜表４に示す。
【０００８】
【表１】
【０００９】
【表２】
【００１０】
【表３】
【００１１】
【表４】
【００１２】表１に示した菌学的性質から、バージィの
マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジ
ー（Bargey's Mannual of Systematic Bacteriology ）
に基づき検索した結果、ＳＨＯ４７株はストレプトコッ
カス・ラフィノラクティス（Streptococcus raffinol
actis ）に属する細菌と判明したが、既存菌株とは異な
っており、新菌株と判断できるので、ストレプトコッカ
ス・ラフィノラクティスＳＨＯ４７と命名し、平成５年
１１月１７日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託してＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０なる受託番号
を得た。
マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジ
ー（Bargey's Mannual of Systematic Bacteriology ）
に基づき検索した結果、ＳＨＯ４７株はストレプトコッ
カス・ラフィノラクティス（Streptococcus raffinol
actis ）に属する細菌と判明したが、既存菌株とは異な
っており、新菌株と判断できるので、ストレプトコッカ
ス・ラフィノラクティスＳＨＯ４７と命名し、平成５年
１１月１７日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託してＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０なる受託番号
を得た。
【００１３】また同様に検索した結果、ＳＨＯ５４株は
ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus la
ctis）に属する新菌株と判明したため、ストレプトコッ
カス・ラクティスＳＨＯ５４と命名し、平成５年１１月
１７日付で上記寄託機関に寄託し、ＦＥＲＭ Ｐ−１３
９７１なる受託番号を得た。ＳＨＯ４７株およびＳＨＯ
５４株を各々培養する際の栄養培地に添加する窒素源と
しては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキスなどの無機物または有機物が
使用できる。
ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus la
ctis）に属する新菌株と判明したため、ストレプトコッ
カス・ラクティスＳＨＯ５４と命名し、平成５年１１月
１７日付で上記寄託機関に寄託し、ＦＥＲＭ Ｐ−１３
９７１なる受託番号を得た。ＳＨＯ４７株およびＳＨＯ
５４株を各々培養する際の栄養培地に添加する窒素源と
しては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキスなどの無機物または有機物が
使用できる。
【００１４】また、炭素源としては、グルコース、シュ
ークロース、ラクトース、ガラクトースなどが使用でき
る。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウ
ム、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガンなどの各塩類、
ビタミン類などを使用してもよい。ただし、これらの細
菌株を短時間に効率よく大量増殖させる場合には、後記
試験例にも示した通り、培地中に酵母エキスを１重量％
以上添加する。
ークロース、ラクトース、ガラクトースなどが使用でき
る。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウ
ム、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガンなどの各塩類、
ビタミン類などを使用してもよい。ただし、これらの細
菌株を短時間に効率よく大量増殖させる場合には、後記
試験例にも示した通り、培地中に酵母エキスを１重量％
以上添加する。
【００１５】培養は、嫌気的あるいは微好気的な条件で
行う。培養温度は２０℃から４２℃、好ましくは３０℃
〜４２℃、最適には３５℃〜４２℃で行う。培地のｐＨ
は５．８〜７．２、好ましくは６．０〜７．０、最適に
は６．４〜６．７である。このような条件下で３〜２０
時間、好ましくは６〜１２時間培養することにより、６
ＰＧＤＨ産生能を有する菌体を得ることができる。
行う。培養温度は２０℃から４２℃、好ましくは３０℃
〜４２℃、最適には３５℃〜４２℃で行う。培地のｐＨ
は５．８〜７．２、好ましくは６．０〜７．０、最適に
は６．４〜６．７である。このような条件下で３〜２０
時間、好ましくは６〜１２時間培養することにより、６
ＰＧＤＨ産生能を有する菌体を得ることができる。
【００１６】実際に６ＰＧＤＨを単離・精製するには、
例えば上記のごとくＳＨＯ４７株またはＳＨＯ５４株を
培養し、培養終了後、遠心分離や濾過などの操作で培養
液から菌体を回収し、菌体から粗酵素液を抽出し、精製
すればよい。抽出法には、超音波破砕、フレンチプレ
ス、界面活性剤処理、リゾチーム処理などいずれを用い
てもよく、こうした処理後、遠心分離により細胞片を除
去し、粗酵素液を得る。粗酵素液については、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることによ
り、目的とする６ＰＧＤＨを単離、精製することができ
る。イオン交換クロマトグラフィーにはＱ−セファロー
スＦＦ（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セファロース
カラム（ファルマシア社製）など、アフィニティークロ
マトグラフィーには、プロシオンブルーＨ−ＥＲＤ（Ｉ
ＣＩ製）、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂカラム（ファ
ルマシア社製）など、疎水クロマトグラフィーには、オ
クチル−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（ファルマシア
社製）など、ゲル濾過クロマトグラフィーには、セファ
デックスカラムなどが挙げられる。また、これらのカラ
ムクロマトグラフィーに加え、硫酸ストレプトマイシン
や硫酸プロタミン処理による除核酸、硫酸アンモニウム
処理によるタンパク質の塩析を行ってもよい。
例えば上記のごとくＳＨＯ４７株またはＳＨＯ５４株を
培養し、培養終了後、遠心分離や濾過などの操作で培養
液から菌体を回収し、菌体から粗酵素液を抽出し、精製
すればよい。抽出法には、超音波破砕、フレンチプレ
ス、界面活性剤処理、リゾチーム処理などいずれを用い
てもよく、こうした処理後、遠心分離により細胞片を除
去し、粗酵素液を得る。粗酵素液については、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることによ
り、目的とする６ＰＧＤＨを単離、精製することができ
る。イオン交換クロマトグラフィーにはＱ−セファロー
スＦＦ（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セファロース
カラム（ファルマシア社製）など、アフィニティークロ
マトグラフィーには、プロシオンブルーＨ−ＥＲＤ（Ｉ
ＣＩ製）、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂカラム（ファ
ルマシア社製）など、疎水クロマトグラフィーには、オ
クチル−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（ファルマシア
社製）など、ゲル濾過クロマトグラフィーには、セファ
デックスカラムなどが挙げられる。また、これらのカラ
ムクロマトグラフィーに加え、硫酸ストレプトマイシン
や硫酸プロタミン処理による除核酸、硫酸アンモニウム
処理によるタンパク質の塩析を行ってもよい。
【００１７】次にこの発明のＳＨＯ４７株およびＳＨＯ
５４株から得られる６ＰＧＤＨの理化学的性質を以下に
示す。 （１）作用：下記の反応式の反応を触媒する。
５４株から得られる６ＰＧＤＨの理化学的性質を以下に
示す。 （１）作用：下記の反応式の反応を触媒する。
【００１８】
【化１】
【００１９】（２）基質特異性：ＮＡＤを補酵素とした
ときの活性値を１００とすると、ＮＡＤＰを用いた場合
は、１以下である。 （３）至適ｐＨ：６．５〜８．５（温度３０℃） （４）安定ｐＨ：５〜９ （５）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲。
（ＭＥＳ緩衝液ｐＨ７．２） （６）安定性：５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）
中、２ｍＭのエチレン
ときの活性値を１００とすると、ＮＡＤＰを用いた場合
は、１以下である。 （３）至適ｐＨ：６．５〜８．５（温度３０℃） （４）安定ｐＨ：５〜９ （５）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲。
（ＭＥＳ緩衝液ｐＨ７．２） （６）安定性：５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）
中、２ｍＭのエチレン
【００２０】ジアミン４酢酸（以下ＥＤＴＡと略記す
る。）の存在下、室温で３０日放置後９０％以上の残存
活性を有する。 （７）分子量：約１３万〜２６万（セファクリルＳ−３
００ゲルクロマトグラフィー法による測定において、ｐ
Ｈ６．０で行った場合約１３万。ｐＨ８．０で行った場
合約２６万） （８）活性の測定法：１．７ｍＭの６ＰＧ、２．０ｍＭ
のＮＡＤおよび８．０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣ
ｌ2 ）を含むグリシル・グリシン緩衝液（ｐＨ７．５）
に酵素溶液を加え、緩やかに混和した後、分光光度計で
３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。なお測定
は、３０℃で行った。１分間に１マイクロモルのＮＡＤ
Ｈを生成させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。
る。）の存在下、室温で３０日放置後９０％以上の残存
活性を有する。 （７）分子量：約１３万〜２６万（セファクリルＳ−３
００ゲルクロマトグラフィー法による測定において、ｐ
Ｈ６．０で行った場合約１３万。ｐＨ８．０で行った場
合約２６万） （８）活性の測定法：１．７ｍＭの６ＰＧ、２．０ｍＭ
のＮＡＤおよび８．０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣ
ｌ2 ）を含むグリシル・グリシン緩衝液（ｐＨ７．５）
に酵素溶液を加え、緩やかに混和した後、分光光度計で
３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。なお測定
は、３０℃で行った。１分間に１マイクロモルのＮＡＤ
Ｈを生成させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００２１】次に試験例を示して、この発明の大量増殖
方法における酵母エキスの効果について詳しく説明す
る。 試験例 ＤＩＦＣＯ社製ＭＲＳ培地４００ｍｌ（５００ｍｌ三角
フラスコ中）にＳＨＯ４７株およびＳＨＯ５４株を各々
接種し、４０℃で１２時間培養した。
方法における酵母エキスの効果について詳しく説明す
る。 試験例 ＤＩＦＣＯ社製ＭＲＳ培地４００ｍｌ（５００ｍｌ三角
フラスコ中）にＳＨＯ４７株およびＳＨＯ５４株を各々
接種し、４０℃で１２時間培養した。
【００２２】一方、酵母エキス含量を０．５％、１％ま
たは２％とした以外は実施例１と同一の組成からなる培
地１〜３を各々６００ｍｌ調製し、これらの培地に上記
ＳＨＯ４７株およびＳＨＯ５４株の培養液３０ｍｌずつ
を接種し、４０℃で１０時間、２００ｒｐｍで攪拌しな
がら非通気条件下、４ＮのＮａＯＨでｐＨを６．４に調
整しながら培養した。培養終了後、各培養液２００ｍｌ
を実施例１と同様に遠心分離し、菌体収量を算出した。
また、集めた菌体から粗抽出液を調製し、６ＰＧＤＨ活
性を測定した。結果を表５に示す。
たは２％とした以外は実施例１と同一の組成からなる培
地１〜３を各々６００ｍｌ調製し、これらの培地に上記
ＳＨＯ４７株およびＳＨＯ５４株の培養液３０ｍｌずつ
を接種し、４０℃で１０時間、２００ｒｐｍで攪拌しな
がら非通気条件下、４ＮのＮａＯＨでｐＨを６．４に調
整しながら培養した。培養終了後、各培養液２００ｍｌ
を実施例１と同様に遠心分離し、菌体収量を算出した。
また、集めた菌体から粗抽出液を調製し、６ＰＧＤＨ活
性を測定した。結果を表５に示す。
【００２３】
【表５】
【００２４】表５の結果から明らかなように、いずれの
培養菌体もその湿菌体１ｋｇ当たりの６ＰＧＤＨ活性は
同程度であったが、酵母エキスが１％以上の培地を用い
た場合では、酵母エキスが０．５％の培地の場合の約４
〜８倍の菌体収量を示した。このことから、６ＰＧＤＨ
を大量に得る場合、すなわち、細菌株を大量増殖させる
場合には、ＳＨＯ４７株またはＳＨＯ５４株の培養培地
中の酵母エキス含量は１％以上とすることが確認され
た。
培養菌体もその湿菌体１ｋｇ当たりの６ＰＧＤＨ活性は
同程度であったが、酵母エキスが１％以上の培地を用い
た場合では、酵母エキスが０．５％の培地の場合の約４
〜８倍の菌体収量を示した。このことから、６ＰＧＤＨ
を大量に得る場合、すなわち、細菌株を大量増殖させる
場合には、ＳＨＯ４７株またはＳＨＯ５４株の培養培地
中の酵母エキス含量は１％以上とすることが確認され
た。
【００２５】
【実施例】次に、実施例を示してこの発明の細菌株をさ
らに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例
に限定されるものではない。 実施例１ グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リ
ットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で
１５分間オートクレーブ滅菌した後、ストレプトコッカ
ス・ラフィノラクティス（Streptococcus raffinolac
tis ）ＳＨＯ４７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０）を接
種し、４０℃で７時間、１００ｒｐｍで攪拌し、通気し
ない条件下、４ＮのＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しな
がら培養した。遠心分離により菌体を採取して約１６０
ｇの菌体を得た。得られた菌体を凍結状態で保存した。
らに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例
に限定されるものではない。 実施例１ グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リ
ットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で
１５分間オートクレーブ滅菌した後、ストレプトコッカ
ス・ラフィノラクティス（Streptococcus raffinolac
tis ）ＳＨＯ４７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０）を接
種し、４０℃で７時間、１００ｒｐｍで攪拌し、通気し
ない条件下、４ＮのＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しな
がら培養した。遠心分離により菌体を採取して約１６０
ｇの菌体を得た。得られた菌体を凍結状態で保存した。
【００２６】次に、凍結菌体約１００ｇをＥＤＴＡおよ
び２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１リットルに懸濁し、これ
にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．０１％、リゾチーム
を０．２ｍｇ／ｍｌ、ＤＮａｓｅ Ｉを０．２ｍｇ／ｍ
ｌになるように添加し、２時間室温で攪拌後、遠心分離
により細胞片を除去し、６ＰＧＤＨを含む粗酵素液を
得、菌体中の６ＰＧＤＨ含量を測定したところ１８万Ｕ
／ｋｇ湿菌体の値を示した。
び２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１リットルに懸濁し、これ
にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．０１％、リゾチーム
を０．２ｍｇ／ｍｌ、ＤＮａｓｅ Ｉを０．２ｍｇ／ｍ
ｌになるように添加し、２時間室温で攪拌後、遠心分離
により細胞片を除去し、６ＰＧＤＨを含む粗酵素液を
得、菌体中の６ＰＧＤＨ含量を測定したところ１８万Ｕ
／ｋｇ湿菌体の値を示した。
【００２７】この粗酵素液に酢酸を加えｐＨ５．８に調
整し、予め２０ｍＭリン酸同緩衝液（ｐＨ５．７５）で
平衡化したプロシオンブルーＨ−ＢＲＤカラム（プロシ
オンブルーＨ−ＢＲＤはＩＣＩ社より購入）に通じ、１
００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。濃
縮後、予め２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（ファル
マシア社製）に通じ、ＫＣｌを平衡液に加えた溶液で溶
出させたところ、ＫＣｌ濃度０．４０〜０．４５Ｍの近
くに活性画分が溶出した。この溶出画分を濃縮後、硫酸
アンモニウムを０．５Ｍになるように加え、予め１Ｍの
硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
５．５）で平衡化されたオクチルセファロースカラムＣ
Ｌ−４Ｂ（ファルマシア社製）に通じ、同緩衝液で溶出
した。活性画分を集めて濃縮後、脱塩した。このように
して得られた６ＰＧＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動において単一なバンドとして検出され、精製酵素
標品を得ることができた。また、活性の収率は約５５％
で、酵素１ｍｇ当たり約１１０単位の比活性を示し、そ
の精製度は粗酵素液を１とすると約３３倍であった。 実施例２ 実施例１と同様の培地、条件により、ストレプトコッカ
ス・ラクティスＳＨＯ５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７
１）を培養し、約１８０ｇの菌体を得た。得られた菌体
は同様に凍結状態で保存した。
整し、予め２０ｍＭリン酸同緩衝液（ｐＨ５．７５）で
平衡化したプロシオンブルーＨ−ＢＲＤカラム（プロシ
オンブルーＨ−ＢＲＤはＩＣＩ社より購入）に通じ、１
００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。濃
縮後、予め２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（ファル
マシア社製）に通じ、ＫＣｌを平衡液に加えた溶液で溶
出させたところ、ＫＣｌ濃度０．４０〜０．４５Ｍの近
くに活性画分が溶出した。この溶出画分を濃縮後、硫酸
アンモニウムを０．５Ｍになるように加え、予め１Ｍの
硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
５．５）で平衡化されたオクチルセファロースカラムＣ
Ｌ−４Ｂ（ファルマシア社製）に通じ、同緩衝液で溶出
した。活性画分を集めて濃縮後、脱塩した。このように
して得られた６ＰＧＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動において単一なバンドとして検出され、精製酵素
標品を得ることができた。また、活性の収率は約５５％
で、酵素１ｍｇ当たり約１１０単位の比活性を示し、そ
の精製度は粗酵素液を１とすると約３３倍であった。 実施例２ 実施例１と同様の培地、条件により、ストレプトコッカ
ス・ラクティスＳＨＯ５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７
１）を培養し、約１８０ｇの菌体を得た。得られた菌体
は同様に凍結状態で保存した。
【００２８】次に、これらの菌体から実施例１と同様に
して粗抽出液を得、菌体中の６ＰＧＤＨ含量を測定した
ところ、１５万Ｕ／ｋｇ湿菌体の値を示した。さらに、
実施例１と同様にして粗抽出液から精製酵素標品を得
た。活性の収率は約５５％で、酵素１ｍｇ当り約１３０
単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素液を１とする
と約２５倍であった。
して粗抽出液を得、菌体中の６ＰＧＤＨ含量を測定した
ところ、１５万Ｕ／ｋｇ湿菌体の値を示した。さらに、
実施例１と同様にして粗抽出液から精製酵素標品を得
た。活性の収率は約５５％で、酵素１ｍｇ当り約１３０
単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素液を１とする
と約２５倍であった。
【００２９】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明の新
規な細菌株およびその大量増殖方法により、ＮＡＤに対
して特異的に作用し、かつ安定性に優れた６ＰＧＤＨを
効率よく得ることが可能となる。このようにして得られ
た６ＰＧＤＨは、その優れた安定性により各種測定用試
薬に広く利用することができる。
規な細菌株およびその大量増殖方法により、ＮＡＤに対
して特異的に作用し、かつ安定性に優れた６ＰＧＤＨを
効率よく得ることが可能となる。このようにして得られ
た６ＰＧＤＨは、その優れた安定性により各種測定用試
薬に広く利用することができる。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成７年３月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 ６ホスホグルコン酸脱水素酵素を産生
する細菌株と、その大量増殖方法
する細菌株と、その大量増殖方法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、ニコチンアミド・ア
デニン・ジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略記する）に特
異的に作用する６ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下６
ＰＧＤＨと略記する）を産生する新規な細菌株と、これ
ら細菌株の大量増殖方法に関するものである。
デニン・ジヌクレオチド（以下ＮＡＤと略記する）に特
異的に作用する６ホスホグルコン酸脱水素酵素（以下６
ＰＧＤＨと略記する）を産生する新規な細菌株と、これ
ら細菌株の大量増殖方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年、酵素は、その反応の安定性、基質
との特異的結合性、および光学的定量化の容易性などの
優れた特性が注目され、医療分野や食品の成分分析など
に広く触媒として利用されている。なかでも６ＰＧＤＨ
は、とくにグルコース６リン酸脱水素酵素（以下Ｇ６Ｐ
ＤＨと略記する）との共存下でグルコース６リン酸（以
下Ｇ６Ｐと略記する）を定量する場合に、高い測定感度
が得られるという点においてその有用性が指摘されてい
る。すなわち、そのようなＧ６Ｐ測定の場合、一般的に
はＧ６ＰＤＨまたは６ＰＧＤＨの反応により生成した還
元型ＮＡＤ（以下ＮＡＤＨと略記する）または還元型ニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以
下、ＮＡＤＰＨと略記する）の３４０ｎｍにおける吸光
度を分光学的に測定するが、さらにジアホラーゼやフェ
ナジンメトサルフェート（以下ＰＭＳと略記する）およ
びその誘導体により、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈを基質と
してニトロブルーテトラゾリウム（以下ＮＢＴと略記す
る）などのテトラゾリウム塩や２，６−ジクロロフェノ
ールインドフェノール（以下ＤＣＰＩＰと略記する）な
どを還元発色させ、可視部で測定することもできる。
との特異的結合性、および光学的定量化の容易性などの
優れた特性が注目され、医療分野や食品の成分分析など
に広く触媒として利用されている。なかでも６ＰＧＤＨ
は、とくにグルコース６リン酸脱水素酵素（以下Ｇ６Ｐ
ＤＨと略記する）との共存下でグルコース６リン酸（以
下Ｇ６Ｐと略記する）を定量する場合に、高い測定感度
が得られるという点においてその有用性が指摘されてい
る。すなわち、そのようなＧ６Ｐ測定の場合、一般的に
はＧ６ＰＤＨまたは６ＰＧＤＨの反応により生成した還
元型ＮＡＤ（以下ＮＡＤＨと略記する）または還元型ニ
コチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以
下、ＮＡＤＰＨと略記する）の３４０ｎｍにおける吸光
度を分光学的に測定するが、さらにジアホラーゼやフェ
ナジンメトサルフェート（以下ＰＭＳと略記する）およ
びその誘導体により、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈを基質と
してニトロブルーテトラゾリウム（以下ＮＢＴと略記す
る）などのテトラゾリウム塩や２，６−ジクロロフェノ
ールインドフェノール（以下ＤＣＰＩＰと略記する）な
どを還元発色させ、可視部で測定することもできる。
【０００３】この様なＧ６Ｐまたは６ＰＧを経由する各
種分析対象を可視部域で測定する場合、ジアホラーゼは
ＮＡＤＨに特異性が高く、またＰＭＳにも適用できるた
め、ＮＡＤに対して特異的に作用する６ＰＧＤＨを利用
することが望ましい。６ＰＧＤＨには、補酵素として、
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以
下、ＮＡＤＰと略記する）に特異的に反応するもの（ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（European Journal of Biochemistry）、１巻、１７０
頁（１９６７年））、ＮＡＤとＮＡＤＰ両方に作用する
もの（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・
ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistr
y ）、４６巻、３９１頁（１９８２年））、ＮＡＤのみ
に作用するもの（エフエムビーエス・マイクロバイオロ
ジー・レターズ（FMBS Microbiology Letters ）、５２
巻、１９９頁（１９８８年））が知られている。このＮ
ＡＤのみに作用する６ＰＧＤＨはメタノール資化性菌で
あるメチロバチルス・フラゲラタム（Methyrobacillus
flagellatum ）由来のものである。
種分析対象を可視部域で測定する場合、ジアホラーゼは
ＮＡＤＨに特異性が高く、またＰＭＳにも適用できるた
め、ＮＡＤに対して特異的に作用する６ＰＧＤＨを利用
することが望ましい。６ＰＧＤＨには、補酵素として、
ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオチドリン酸（以
下、ＮＡＤＰと略記する）に特異的に反応するもの（ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
（European Journal of Biochemistry）、１巻、１７０
頁（１９６７年））、ＮＡＤとＮＡＤＰ両方に作用する
もの（アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・
ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistr
y ）、４６巻、３９１頁（１９８２年））、ＮＡＤのみ
に作用するもの（エフエムビーエス・マイクロバイオロ
ジー・レターズ（FMBS Microbiology Letters ）、５２
巻、１９９頁（１９８８年））が知られている。このＮ
ＡＤのみに作用する６ＰＧＤＨはメタノール資化性菌で
あるメチロバチルス・フラゲラタム（Methyrobacillus
flagellatum ）由来のものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】メタノール資化性菌で
あるメチロバチルス・フラゲラタム（Methyrobacillus f
lagellatum ）ＫＴ１株はＮＡＤに特異性の高い６ＰＧ
ＤＨを微量生産することが知られているが、その６ＰＧ
ＤＨは、４℃で３日間保存しただけで９０％失活するよ
うな非常に不安定なものであり実用的でなかった。その
ため、この酵素を実際に各種測定用試薬中へ適用するこ
とは不可能であった。また、菌体中の酵素含有量も非常
に微量であるため、酵素を効率よく得ることはできなか
った。
あるメチロバチルス・フラゲラタム（Methyrobacillus f
lagellatum ）ＫＴ１株はＮＡＤに特異性の高い６ＰＧ
ＤＨを微量生産することが知られているが、その６ＰＧ
ＤＨは、４℃で３日間保存しただけで９０％失活するよ
うな非常に不安定なものであり実用的でなかった。その
ため、この酵素を実際に各種測定用試薬中へ適用するこ
とは不可能であった。また、菌体中の酵素含有量も非常
に微量であるため、酵素を効率よく得ることはできなか
った。
【０００５】このような理由から、ＮＡＤに特異的に作
用し、安定性に優れた６ＰＧＤＨを効率よく得るための
手段が強く要望されていた。この発明は、以上の通りの
事情に鑑みてなされたものであり、ＮＡＤに特異的に作
用し、安定性にも優れた６ＰＧＤＨを産生する新しい細
菌株と、これら細菌株の大量増殖方法を提供することを
目的としている。
用し、安定性に優れた６ＰＧＤＨを効率よく得るための
手段が強く要望されていた。この発明は、以上の通りの
事情に鑑みてなされたものであり、ＮＡＤに特異的に作
用し、安定性にも優れた６ＰＧＤＨを産生する新しい細
菌株と、これら細菌株の大量増殖方法を提供することを
目的としている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、ＮＡＤに特異的に反応する６Ｐ
ＧＤＨを産生するロイコノストック・ラクティスＳＨＯ
４７（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０）と、ロイコノストッ
ク・ラクティスＳＨＯ５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７
１）を提供する。
を解決するものとして、ＮＡＤに特異的に反応する６Ｐ
ＧＤＨを産生するロイコノストック・ラクティスＳＨＯ
４７（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０）と、ロイコノストッ
ク・ラクティスＳＨＯ５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７
１）を提供する。
【０００７】またこの発明は、上記細菌株を、酵母エキ
ス１重量％以上含有の栄養培地にて培養することを特徴
とする上記細菌株の大量増殖方法をも提供する。以下、
この発明について詳しく説明する。まず、この発明の細
菌株ロイコノストック・ラクティスＳＨＯ４７（以下、
ＳＨＯ４７株と記載することがある）と、同じくロイコ
ノストック・ラクティスＳＨＯ５４株（以下、ＳＨＯ５
４株と記載することがある）について、それぞれの菌学
的性質を表１〜表４に示す。
ス１重量％以上含有の栄養培地にて培養することを特徴
とする上記細菌株の大量増殖方法をも提供する。以下、
この発明について詳しく説明する。まず、この発明の細
菌株ロイコノストック・ラクティスＳＨＯ４７（以下、
ＳＨＯ４７株と記載することがある）と、同じくロイコ
ノストック・ラクティスＳＨＯ５４株（以下、ＳＨＯ５
４株と記載することがある）について、それぞれの菌学
的性質を表１〜表４に示す。
【０００８】
【表１】
【０００９】
【表２】
【００１０】
【表３】
【００１１】
【表４】
【００１２】表１に示した菌学的性質から、バージィの
マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジ
ー（Bargey's Mannual of Systematic Bacteriology ）
およびメソッズ・イン・マイクロバイオロジー(METHODS
IN MICROBIOLOGY) 第１６巻、第１４７〜１７８頁に基
づき検索した結果、ＳＨＯ４７株はロイコノストック・
ラクティス( Leuconostoc lactis ）に属する細菌と
判明したが、既存菌株とは異なっており、新菌株と判断
できるので、ロイコノストック・ラクティスＳＨＯ４７
と命名し、平成５年１１月１７日付で通産省工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託してＦＥＲＭ Ｐ−１３
９７０なる受託番号を得た。
マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジ
ー（Bargey's Mannual of Systematic Bacteriology ）
およびメソッズ・イン・マイクロバイオロジー(METHODS
IN MICROBIOLOGY) 第１６巻、第１４７〜１７８頁に基
づき検索した結果、ＳＨＯ４７株はロイコノストック・
ラクティス( Leuconostoc lactis ）に属する細菌と
判明したが、既存菌株とは異なっており、新菌株と判断
できるので、ロイコノストック・ラクティスＳＨＯ４７
と命名し、平成５年１１月１７日付で通産省工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託してＦＥＲＭ Ｐ−１３
９７０なる受託番号を得た。
【００１３】また同様に検索した結果、ＳＨＯ５４株は
ロイコノストック・ラクティス（Leuconostoc lacti
s）に属する新菌株と判明したため、ロイコノストック
・ラクティスＳＨＯ５４と命名し、平成５年１１月１７
日付で上記寄託機関に寄託し、ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７
１なる受託番号を得た。このＳＨＯ４７株およびＳＨＯ
５４株を各々培養する際の栄養培地に添加する窒素源と
しては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキスなどの無機物または有機物が
使用できる。
ロイコノストック・ラクティス（Leuconostoc lacti
s）に属する新菌株と判明したため、ロイコノストック
・ラクティスＳＨＯ５４と命名し、平成５年１１月１７
日付で上記寄託機関に寄託し、ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７
１なる受託番号を得た。このＳＨＯ４７株およびＳＨＯ
５４株を各々培養する際の栄養培地に添加する窒素源と
しては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキスなどの無機物または有機物が
使用できる。
【００１４】また、炭素源としては、グルコース、シュ
ークロース、ラクトース、ガラクトースなどが使用でき
る。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウ
ム、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガンなどの各塩類、
ビタミン類などを使用してもよい。ただし、これらの細
菌株を短時間に効率よく大量増殖させる場合には、後記
試験例にも示した通り、培地中に酵母エキスを１重量％
以上添加する。
ークロース、ラクトース、ガラクトースなどが使用でき
る。さらに、無機塩類としては、カリウム、ナトリウ
ム、亜鉛、鉄、マグネシウム、マンガンなどの各塩類、
ビタミン類などを使用してもよい。ただし、これらの細
菌株を短時間に効率よく大量増殖させる場合には、後記
試験例にも示した通り、培地中に酵母エキスを１重量％
以上添加する。
【００１５】培養は、嫌気的あるいは微好気的な条件で
行う。培養温度は２０℃から４２℃、好ましくは３０℃
〜４２℃、最適には３５℃〜４２℃で行う。培地のｐＨ
は５．８〜７．２、好ましくは６．０〜７．０、最適に
は６．４〜６．７である。このような条件下で３〜２０
時間、好ましくは６〜１２時間培養することにより、６
ＰＧＤＨ産生能を有する菌体を得ることができる。
行う。培養温度は２０℃から４２℃、好ましくは３０℃
〜４２℃、最適には３５℃〜４２℃で行う。培地のｐＨ
は５．８〜７．２、好ましくは６．０〜７．０、最適に
は６．４〜６．７である。このような条件下で３〜２０
時間、好ましくは６〜１２時間培養することにより、６
ＰＧＤＨ産生能を有する菌体を得ることができる。
【００１６】実際に６ＰＧＤＨを単離・精製するには、
例えば上記のごとくＳＨＯ４７株またはＳＨＯ５４株を
培養し、培養終了後、遠心分離や濾過などの操作で培養
液から菌体を回収し、菌体から粗酵素液を抽出し、精製
すればよい。抽出法には、超音波破砕、フレンチプレ
ス、界面活性剤処理、リゾチーム処理などいずれを用い
てもよく、こうした処理後、遠心分離により細胞片を除
去し、粗酵素液を得る。粗酵素液については、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることによ
り、目的とする６ＰＧＤＨを単離、精製することができ
る。イオン交換クロマトグラフィーにはＱ−セファロー
スＦＦ（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セファロース
カラム（ファルマシア社製）など、アフィニティークロ
マトグラフィーには、プロシオンブルーＨ−ＥＲＤ（Ｉ
ＣＩ製）、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂカラム（ファ
ルマシア社製）など、疎水クロマトグラフィーには、オ
クチル−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（ファルマシア
社製）など、ゲル濾過クロマトグラフィーには、セファ
デックスカラムなどが挙げられる。また、これらのカラ
ムクロマトグラフィーに加え、硫酸ストレプトマイシン
や硫酸プロタミン処理による除核酸、硫酸アンモニウム
処理によるタンパク質の塩析を行ってもよい。
例えば上記のごとくＳＨＯ４７株またはＳＨＯ５４株を
培養し、培養終了後、遠心分離や濾過などの操作で培養
液から菌体を回収し、菌体から粗酵素液を抽出し、精製
すればよい。抽出法には、超音波破砕、フレンチプレ
ス、界面活性剤処理、リゾチーム処理などいずれを用い
てもよく、こうした処理後、遠心分離により細胞片を除
去し、粗酵素液を得る。粗酵素液については、イオン交
換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィー等のクロマトグラフィーを組み合わせることによ
り、目的とする６ＰＧＤＨを単離、精製することができ
る。イオン交換クロマトグラフィーにはＱ−セファロー
スＦＦ（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セファロース
カラム（ファルマシア社製）など、アフィニティークロ
マトグラフィーには、プロシオンブルーＨ−ＥＲＤ（Ｉ
ＣＩ製）、ブルーセファロースＣＬ−６Ｂカラム（ファ
ルマシア社製）など、疎水クロマトグラフィーには、オ
クチル−セファロースＣＬ−４Ｂカラム（ファルマシア
社製）など、ゲル濾過クロマトグラフィーには、セファ
デックスカラムなどが挙げられる。また、これらのカラ
ムクロマトグラフィーに加え、硫酸ストレプトマイシン
や硫酸プロタミン処理による除核酸、硫酸アンモニウム
処理によるタンパク質の塩析を行ってもよい。
【００１７】次にこの発明のＳＨＯ４７株およびＳＨＯ
５４株から得られる６ＰＧＤＨの理化学的性質を以下に
示す。 （１）作用：下記の反応式の反応を触媒する。
５４株から得られる６ＰＧＤＨの理化学的性質を以下に
示す。 （１）作用：下記の反応式の反応を触媒する。
【００１８】
【化１】
【００１９】（２）基質特異性：ＮＡＤを補酵素とした
ときの活性値を１００とすると、ＮＡＤＰを用いた場合
は、１以下である。 （３）至適ｐＨ：６．５〜８．５（温度３０℃） （４）安定ｐＨ：５〜９ （５）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲。
（ＭＥＳ緩衝液ｐＨ７．２） （６）安定性：５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）
中、２ｍＭのエチレン
ときの活性値を１００とすると、ＮＡＤＰを用いた場合
は、１以下である。 （３）至適ｐＨ：６．５〜８．５（温度３０℃） （４）安定ｐＨ：５〜９ （５）作用適温の範囲：２０℃から５０℃までの範囲。
（ＭＥＳ緩衝液ｐＨ７．２） （６）安定性：５０ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）
中、２ｍＭのエチレン
【００２０】ジアミン４酢酸（以下ＥＤＴＡと略記す
る。）の存在下、室温で３０日放置後９０％以上の残存
活性を有する。 （７）分子量：約１３万〜２６万（セファクリルＳ−３
００ゲルクロマトグラフィー法による測定において、ｐ
Ｈ６．０で行った場合約１３万。ｐＨ８．０で行った場
合約２６万） （８）活性の測定法：１．７ｍＭの６ＰＧ、２．０ｍＭ
のＮＡＤおよび８．０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣ
ｌ2 ）を含むグリシル・グリシン緩衝液（ｐＨ７．５）
に酵素溶液を加え、緩やかに混和した後、分光光度計で
３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。なお測定
は、３０℃で行った。１分間に１マイクロモルのＮＡＤ
Ｈを生成させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。
る。）の存在下、室温で３０日放置後９０％以上の残存
活性を有する。 （７）分子量：約１３万〜２６万（セファクリルＳ−３
００ゲルクロマトグラフィー法による測定において、ｐ
Ｈ６．０で行った場合約１３万。ｐＨ８．０で行った場
合約２６万） （８）活性の測定法：１．７ｍＭの６ＰＧ、２．０ｍＭ
のＮＡＤおよび８．０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣ
ｌ2 ）を含むグリシル・グリシン緩衝液（ｐＨ７．５）
に酵素溶液を加え、緩やかに混和した後、分光光度計で
３４０ｎｍにおける吸光度変化を測定した。なお測定
は、３０℃で行った。１分間に１マイクロモルのＮＡＤ
Ｈを生成させる酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００２１】次に試験例を示して、この発明の大量増殖
方法における酵母エキスの効果について詳しく説明す
る。 試験例 ＤＩＦＣＯ社製ＭＲＳ培地４００ｍｌ（５００ｍｌ三角
フラスコ中）にＳＨＯ４７株およびＳＨＯ５４株を各々
接種し、４０℃で１２時間培養した。
方法における酵母エキスの効果について詳しく説明す
る。 試験例 ＤＩＦＣＯ社製ＭＲＳ培地４００ｍｌ（５００ｍｌ三角
フラスコ中）にＳＨＯ４７株およびＳＨＯ５４株を各々
接種し、４０℃で１２時間培養した。
【００２２】一方、酵母エキス含量を０．５％、１％ま
たは２％とした以外は実施例１と同一の組成からなる培
地１〜３を各々６００ｍｌ調製し、これらの培地に上記
ＳＨＯ４７株およびＳＨＯ５４株の培養液３０ｍｌずつ
を接種し、４０℃で１０時間、２００ｒｐｍで攪拌しな
がら非通気条件下、４ＮのＮａＯＨでｐＨを６．４に調
整しながら培養した。培養終了後、各培養液２００ｍｌ
を実施例１と同様に遠心分離し、菌体収量を算出した。
また、集めた菌体から粗抽出液を調製し、６ＰＧＤＨ活
性を測定した。結果を表５に示す。
たは２％とした以外は実施例１と同一の組成からなる培
地１〜３を各々６００ｍｌ調製し、これらの培地に上記
ＳＨＯ４７株およびＳＨＯ５４株の培養液３０ｍｌずつ
を接種し、４０℃で１０時間、２００ｒｐｍで攪拌しな
がら非通気条件下、４ＮのＮａＯＨでｐＨを６．４に調
整しながら培養した。培養終了後、各培養液２００ｍｌ
を実施例１と同様に遠心分離し、菌体収量を算出した。
また、集めた菌体から粗抽出液を調製し、６ＰＧＤＨ活
性を測定した。結果を表５に示す。
【００２３】
【表５】
【００２４】表５の結果から明らかなように、いずれの
培養菌体もその湿菌体１ｋｇ当たりの６ＰＧＤＨ活性は
同程度であったが、酵母エキスが１％以上の培地を用い
た場合では、酵母エキスが０．５％の培地の場合の約４
〜８倍の菌体収量を示した。このことから、６ＰＧＤＨ
を大量に得る場合、すなわち、細菌株を大量増殖させる
場合には、ＳＨＯ４７株またはＳＨＯ５４株の培養培地
中の酵母エキス含量は１％以上とすることが確認され
た。
培養菌体もその湿菌体１ｋｇ当たりの６ＰＧＤＨ活性は
同程度であったが、酵母エキスが１％以上の培地を用い
た場合では、酵母エキスが０．５％の培地の場合の約４
〜８倍の菌体収量を示した。このことから、６ＰＧＤＨ
を大量に得る場合、すなわち、細菌株を大量増殖させる
場合には、ＳＨＯ４７株またはＳＨＯ５４株の培養培地
中の酵母エキス含量は１％以上とすることが確認され
た。
【００２５】
【実施例】次に、実施例を示してこの発明の細菌株をさ
らに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例
に限定されるものではない。実施例１ グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リ
ットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で
１５分間オートクレーブ滅菌した後、ロイコノストック
・ラクティス（Leuconostoc lactis）ＳＨＯ４７株
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０）を接種し、４０℃で７時
間、１００ｒｐｍで攪拌し、通気しない条件下、４Ｎの
ＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しながら培養した。遠心
分離により菌体を採取して約１６０ｇの菌体を得た。得
られた菌体を凍結状態で保存した。
らに詳細かつ具体的に説明するが、この発明は以下の例
に限定されるものではない。実施例１ グルコース３．０％（重量％を表す。以下同様）、酵母
エキス１．０％、ペプトン０．５％、クエン酸三ナトリ
ウム・二水和物０．５％、酢酸ナトリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・七水和物０．０２％、硫酸マンガン・
四〜五水和物０．００５％、ツイン８０ ０．１％（容
量％）、ｐＨ６．４よりなる培地２５リットルを３０リ
ットル容のジャーファーメンターに仕込み、１２１℃で
１５分間オートクレーブ滅菌した後、ロイコノストック
・ラクティス（Leuconostoc lactis）ＳＨＯ４７株
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０）を接種し、４０℃で７時
間、１００ｒｐｍで攪拌し、通気しない条件下、４Ｎの
ＮａＯＨでｐＨを６．４に調整しながら培養した。遠心
分離により菌体を採取して約１６０ｇの菌体を得た。得
られた菌体を凍結状態で保存した。
【００２６】次に、凍結菌体約１００ｇをＥＤＴＡおよ
び２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１リットルに懸濁し、これ
にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．０１％、リゾチーム
を０．２ｍｇ／ｍｌ、ＤＮａｓｅ Ｉを０．２ｍｇ／ｍ
ｌになるように添加し、２時間室温で攪拌後、遠心分離
により細胞片を除去し、６ＰＧＤＨを含む粗酵素液を
得、菌体中の６ＰＧＤＨ含量を測定したところ１８万Ｕ
／ｋｇ湿菌体の値を示した。
び２−メルカプトエタノールを２ｍＭずつ含む２０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１リットルに懸濁し、これ
にＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を０．０１％、リゾチーム
を０．２ｍｇ／ｍｌ、ＤＮａｓｅ Ｉを０．２ｍｇ／ｍ
ｌになるように添加し、２時間室温で攪拌後、遠心分離
により細胞片を除去し、６ＰＧＤＨを含む粗酵素液を
得、菌体中の６ＰＧＤＨ含量を測定したところ１８万Ｕ
／ｋｇ湿菌体の値を示した。
【００２７】この粗酵素液に酢酸を加えｐＨ５．８に調
整し、予め２０ｍＭリン酸同緩衝液（ｐＨ５．７５）で
平衡化したプロシオンブルーＨ−ＢＲＤカラム（プロシ
オンブルーＨ−ＢＲＤはＩＣＩ社より購入）に通じ、１
００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。濃
縮後、予め２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（ファル
マシア社製）に通じ、ＫＣｌを平衡液に加えた溶液で溶
出させたところ、ＫＣｌ濃度０．４０〜０．４５Ｍの近
くに活性画分が溶出した。この溶出画分を濃縮後、硫酸
アンモニウムを０．５Ｍになるように加え、予め１Ｍの
硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
５．５）で平衡化されたオクチルセファロースカラムＣ
Ｌ−４Ｂ（ファルマシア社製）に通じ、同緩衝液で溶出
した。活性画分を集めて濃縮後、脱塩した。このように
して得られた６ＰＧＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動において単一なバンドとして検出され、精製酵素
標品を得ることができた。また、活性の収率は約５５％
で、酵素１ｍｇ当たり約１１０単位の比活性を示し、そ
の精製度は粗酵素液を１とすると約３３倍であった。実施例２ 実施例１と同様の培地、条件により、ロイコノストック
・ラクティスＳＨＯ５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７１）
を培養し、約１８０ｇの菌体を得た。得られた菌体は同
様に凍結状態で保存した。
整し、予め２０ｍＭリン酸同緩衝液（ｐＨ５．７５）で
平衡化したプロシオンブルーＨ−ＢＲＤカラム（プロシ
オンブルーＨ−ＢＲＤはＩＣＩ社より購入）に通じ、１
００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で溶出した。濃
縮後、予め２０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したＱ−セファロースＦＦカラム（ファル
マシア社製）に通じ、ＫＣｌを平衡液に加えた溶液で溶
出させたところ、ＫＣｌ濃度０．４０〜０．４５Ｍの近
くに活性画分が溶出した。この溶出画分を濃縮後、硫酸
アンモニウムを０．５Ｍになるように加え、予め１Ｍの
硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
５．５）で平衡化されたオクチルセファロースカラムＣ
Ｌ−４Ｂ（ファルマシア社製）に通じ、同緩衝液で溶出
した。活性画分を集めて濃縮後、脱塩した。このように
して得られた６ＰＧＤＨは、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動において単一なバンドとして検出され、精製酵素
標品を得ることができた。また、活性の収率は約５５％
で、酵素１ｍｇ当たり約１１０単位の比活性を示し、そ
の精製度は粗酵素液を１とすると約３３倍であった。実施例２ 実施例１と同様の培地、条件により、ロイコノストック
・ラクティスＳＨＯ５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７１）
を培養し、約１８０ｇの菌体を得た。得られた菌体は同
様に凍結状態で保存した。
【００２８】次に、これらの菌体から実施例１と同様に
して粗抽出液を得、菌体中の６ＰＧＤＨ含量を測定した
ところ、１５万Ｕ／ｋｇ湿菌体の値を示した。さらに、
実施例１と同様にして粗抽出液から精製酵素標品を得
た。活性の収率は約５５％で、酵素１ｍｇ当り約１３０
単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素液を１とする
と約２５倍であった。
して粗抽出液を得、菌体中の６ＰＧＤＨ含量を測定した
ところ、１５万Ｕ／ｋｇ湿菌体の値を示した。さらに、
実施例１と同様にして粗抽出液から精製酵素標品を得
た。活性の収率は約５５％で、酵素１ｍｇ当り約１３０
単位の比活性を示し、その精製度は粗酵素液を１とする
と約２５倍であった。
【００２９】
【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明の新
規な細菌株およびその大量増殖方法により、ＮＡＤに対
して特異的に作用し、かつ安定性に優れた６ＰＧＤＨを
効率よく得ることが可能となる。このようにして得られ
た６ＰＧＤＨは、その優れた安定性により各種測定用試
薬に広く利用することができる。
規な細菌株およびその大量増殖方法により、ＮＡＤに対
して特異的に作用し、かつ安定性に優れた６ＰＧＤＨを
効率よく得ることが可能となる。このようにして得られ
た６ＰＧＤＨは、その優れた安定性により各種測定用試
薬に広く利用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 小原 仁実 京都府京都市中京区西ノ京桑原町１ 株式 会社島津製作所三条工場内 (72)発明者 矢幡 雅人 京都府京都市中京区西ノ京桑原町１ 株式 会社島津製作所三条工場内
Claims (3)
- 【請求項１】 ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオ
チドに特異的に作用する６ホスホグルコン酸脱水素酵素
を産生するストレプトコッカス・ラフィノラクティスＳ
ＨＯ４７（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０）。 - 【請求項２】 ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレオ
チドに特異的に作用する６ホスホグルコン酸脱水素酵素
を産生するストレプトコッカス・ラクティスＳＨＯ５４
（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７１）。 - 【請求項３】 請求項１のストレプトコッカス・ラフィ
ノラクティスＳＨＯ４７（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７０）
または請求項２のストレプトコッカス・ラクティスＳＨ
Ｏ５４（ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７１）を、酵母エキス１
重量％以上含有の栄養培地で培養することを特徴とする
上記細菌株の大量増殖方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32933193A JP3188576B2 (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | ６ホスホグルコン酸脱水素酵素を産生する細菌株と、その大量増殖方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32933193A JP3188576B2 (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | ６ホスホグルコン酸脱水素酵素を産生する細菌株と、その大量増殖方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07184641A true JPH07184641A (ja) | 1995-07-25 |
| JP3188576B2 JP3188576B2 (ja) | 2001-07-16 |
Family
ID=18220263
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32933193A Expired - Fee Related JP3188576B2 (ja) | 1993-12-27 | 1993-12-27 | ６ホスホグルコン酸脱水素酵素を産生する細菌株と、その大量増殖方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3188576B2 (ja) |
-
1993
- 1993-12-27 JP JP32933193A patent/JP3188576B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3188576B2 (ja) | 2001-07-16 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |