JPH07155182A - 修飾プロテアーゼの製造方法 - Google Patents
修飾プロテアーゼの製造方法Info
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Abstract
に有用に利用するうえで安定化、安全化、機能変換の目
的から酵素の化学的修飾が行われている。このなかで特
に安定性、安全性に優れる多糖類修飾プロテアーゼの製
造工程において煩雑であった活性化体の調製工程を改善
する。 【構成】トリアジン環総量のうち50%以上が多糖類に
導入されている活性化多糖類溶液に直接酵素溶液を混合
して反応させる。 【効果】製造工程において、活性化多糖類を固体状に分
離することなく、多糖類修飾プロテアーゼを製造するこ
とができる。従って、作業性、経済性や安全性を大幅に
改善することができると共に、安定性と安全性に優れた
修飾プロテアーゼを再現性よく得ることができる。
Description
されており、化粧料、洗浄剤、医薬品用途に好適に利用
される修飾プロテアーゼの製造方法に関する。
澱粉等の分解、食品加工、医薬品、臨床検査、バイオセ
ンサー、化粧品、更に有用物質の転換・製造など各種の
産業分野に広く用いられている。こうした利用を計る上
での一つの問題点は、酵素の安定性が一般的に低く、そ
の要求に対し満足でない場合が多いことである。即ち、
熱を加えられたり、極端に高いpH条件や逆に低いpH
条件下、界面活性剤や有機溶媒等の混合物の共存下、更
に長期保存によって殆どの酵素は容易に変性して失活す
る。特にプロテアーゼの場合、水分率の高い媒体や水溶
液等の剤形中では変性の他に自己消化分解が起こり、室
温で保存する間に速やかに失活するため安定な商品を供
給することが難しいという問題がある。また、利用され
る酵素は、人体にとって異種起源のものであるため、医
薬品、化粧品、洗剤等に応用する場合、その抗原性や皮
膚感作性、刺激性が問題となる。
の化学修飾が試みられている。例えば、治療用酵素とし
て用いられるウリカーゼ、アスパラギナーゼ、ストレプ
トキナーゼ等をポリエチレングリコールで修飾し、血中
でのクリアランスや抗原性を改善する方法(特公昭61
−42558号公報,特開昭57−118789号公
報)、スーパーオキシドジスムターゼを多糖類,ポリエ
チレングリコールで修飾し、抗原性抑制や熱安定性向上
を計る方法(特開昭58−16685号公報)、あるい
はキモトリプシンに分子内架橋を与えるような修飾を施
し、安定化を計る方法(Biochimica et Biophysica Act
a 522 ,277〜283 (1978),ibd 485, 1〜12(1977))等が
提案されている。
のがタンパク質という高分子であり修飾により一般に活
性が大幅に損なわれることに加え、皮膚感作性の抑制と
共に高度の安定化を付与し実用化を図った例は知られて
いなかったことから、本発明者らは高活性を維持しつつ
皮膚感作性抑制と水系安定化の双方の目的を同時に達成
する方法を検討した結果、トリアジン環を介して多糖類
で修飾したプロテアーゼ及びその製造法(特開平2−2
19572号公報,特開平4−27388号公報,特開
平4−88982号公報等)を提案し、適切な条件でプ
ロテアーゼに化学修飾を施すと活性、安定性、安全性及
び水溶性等の物性面で優れた修飾酵素が得られることを
報告している。
の多糖類の水溶液にアセトン等に溶解した塩化シアヌル
溶液を添加する方法で多糖類の活性化体を調製し、次い
で該活性化多糖類と酵素とを反応させて得られる。修飾
プロテアーゼの熱安定性は、活性化多糖類に対する活性
基導入密度、活性化多糖類と酵素との反応比等により影
響を受けるが、酵素との修飾反応系中に多糖類に未結合
の塩化シアヌル誘導体が多量に共存すると、該塩化シア
ヌル誘導体も活性残基を有するため酵素に結合し、これ
が活性化多糖類による修飾率を低下せしめ酵素の安定性
を損なう。本発明者らが提案した上述の修飾プロテアー
ゼは元来高い安定性をもっているため、安定性がやや低
いものでも用途によっては全く支障なく用いられるもの
であるが、流通上の保管形態が厳密に保証されない化粧
品やトイレタリー、洗剤等への利用については修飾プロ
テアーゼ自体の極めて高い安定性の確保が要求される。
この対策として、従来は、活性化多糖類を酸性化し反応
性を抑えた状態でアセトン等の貧溶媒から粉末状に析出
させ、次いでこれを洗浄して混在する塩化シアヌル誘導
体を除去した後、酵素と反応させる方法が採られてい
る。しかしながら、この方法では大量の溶媒を必要とす
ることから、実生産スケールでの実施に際しては作業が
煩雑であると共にコスト及び危険性等の問題があった。
情を踏まえ、鋭意研究を行った結果、本発明に到達した
ものであって、本発明の目的は、活性化多糖類を固体状
に分離し精製する工程を省略して、全工程の簡素化を計
ると共に、工業生産のためのスケールアップに対しても
対応できる、低コストで安全な、修飾プロテアーゼの製
造方法を提供するにある。
シアヌルにより活性化した後、該活性化多糖類とプロテ
アーゼとを反応させて修飾プロテアーゼを製造するに際
し、多糖類に導入されたトリアジン環量を、溶液中に存
在するトリアジン環総量の50モル%以上として、活性
化多糖類とプロテアーゼとを反応させることを特徴とす
る修飾プロテアーゼの製造方法であり、前述の目的を達
成するものである。
プシン、キモトリプシン等の動物由来のプロテアーゼ、
微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。中でも、バ
チルス族由来のプロテアーゼを用いることが安定性の点
で好ましい。
本的には本発明者らの提案した上述の特許(特開平2−
219572号公報,特開平4−27388号公報,特
開平4−88982号公報等)に述べた方法に準じて行
う。すなわち、例えば、まず、多糖類水溶液に塩化シア
ヌルのアセトン溶液を混合し、室温、pH8〜9で反応
させることにより反応性塩素を0.4〜1.2mmol
e/g含有する活性化多糖類を合成する。
ス、グアーガム、イヌリン、デンプン、デキストラン、
プルラン、ザンタンガム、カラギーナン、ペクチン、ア
ルギン酸等の天然多糖類及びその誘導体や、ヒドロキシ
プロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロース等が挙げられる。中
でも、デキストラン、プルランは、反応操作が容易であ
り、また、得られる修飾プロテアーゼの性能も均一、安
定である点で優れている。また、多糖類の分子量は、安
定性確保に加え、特に皮膚感作性抑制の点から好ましく
は10,000以上、より好ましくは40,000以上
である。
多糖類合成後の、下記の方法で算出した多糖類導入トリ
アジン環の、反応溶液中に存在するトリアジン環総量に
対する比率(以下「多糖類への導入率」と記す)を、5
0モル%以上、好ましくは70モル%以上とすることが
肝要である。これにより、次工程において、反応溶液か
ら活性化多糖類を一旦固体状に分離精製することなしに
活性化多糖類とプロテアーゼとを反応させても、良好な
性能の修飾プロテアーゼを安定して得ることができる。
多糖類に導入されたトリアジン環量が50モル%未満で
あると、遊離の塩化シアヌル誘導体の酵素に対する反応
率が増大し、活性化多糖類による酵素修飾率の低下を招
くため結果的に酵素安定性が低下する。
る多糖類導入トリアジン環の比率(「多糖類への導入
率」)の測定法:活性化多糖類溶液にグリシンを溶液に
対して8重量%となるように加え、pHを9に調整した
後、沸水中で30分間加熱処理を行う。水希釈した試料
についてゲル濾過型の高速液体クロマトグラフィー分析
(検出;240nmの吸光度)を行い、多糖類結合トリ
アジン環由来のピークと遊離トリアジン環のピークとの
面積比より成分比を求める。
方法としては、活性化多糖類製造時の多糖類濃度を上げ
多糖類に対するトリアジン環導入率を高める方法、活性
化多0類製造後に遊離の塩化シアヌル誘導体を除去する
方法等が挙げられる。
を4.5重量%以上とすると多糖類への導入率を50モ
ル%以上とすることができ、合成溶液に直接酵素溶液を
添加して修飾反応を進めることができる。但し、多糖類
濃度を高めた場合、微小ゲル化体が生成し易くなる傾向
にあるが、この除去が必要な用途に対しては該ゲル化体
を濾別して用いることができる。
の塩化シアヌル誘導体を除去する方法としては、活性化
反応終了後、直ちに塩酸等を加えてpHを2〜4程度と
し活性化多糖類を比較的安定な状態として、限外濾過ま
たは透析により精製を行い、多糖類への導入率を50モ
ル%以上とする方法が挙げられる。この方法によれば、
該多糖類への導入率を70%以上とすることも容易であ
る。この実施に当たっては、酸性溶液中であっても室温
下では活性化多糖類の安定性は十分ではないため、精製
操作はできるだけ速やかに行い、酵素との結合反応まで
の時間を短縮することが好ましい。従って、処理量が小
さい場合は限外濾過や透析バッグによる透析等の方法を
採用できるが、処理量が大きい場合はホローファイバー
型の透析チューブを用いる方法が好ましい。
透析チューブは、材質としてクプロファン、セルロース
アセテート、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロ
ニトリル、ポリスルホン、エチレン−ポリビニルアルコ
ール及びこれらの系列化合物から成るものが挙げられ
る。活性化多糖類は酸性条件下では比較的安定である
が、スケールアップによる処理時間の延長によって若干
失活の起こる場合もあることを考慮すると、こうしたト
ラブルを避けるため、収率面では不利になる場合もある
が精製効果、処理能力には優れる透析チューブを用いる
ことが好ましく、処理効率及び精製効果の点から後述の
方法で評価した場合の透水性が、好ましくは20ml/
(mmHg・m2 ・h)以上、更に好ましくは50ml
/(mmHg・m2 ・h)以上であり、かつ収率の点か
ら血清アルブミンの透過性が好ましくは2%以下、更に
好ましくは1%以下の透析性能をもつものが好適に用い
られる。
ーブ(中空糸内部)に、生理食塩水を37℃で通液し、
ホローファイバーを透過して透析液側(中空糸外側)に
出てくる液量を計測する。膜間圧を替えて透過液量を求
め、100mmHg付近の膜間圧に対する透過液量の関
係より、圧力1mmHg、膜面積1m2 、1時間当りの
透過液量を算出する。
ーブ(中空糸内部)に1%の血清アルブミンを含む生理
食塩水、透析液側(中空糸外側)に生理食塩水を各々充
填する。37℃で1時間放置後、透析液側に透過したア
ルブミン量を求め、最初に中空糸内側に存在したアルブ
ミン量に対する比率を算出する。
のほか通液流量、透析液流量、膜間圧、温度等の条件に
影響されるので、各々最適に設定ればよい。例えば、透
析処理による液量増加を抑制し修飾酵素の回収を容易に
すると共に必要な精製効果を得るため、通液流量を15
0ml/(min・m2 )以下とし、かつ膜間圧を与え
ることにより透析チューブへの通液量に対する流出量の
比を0.5〜1.2とすることが好ましい。この比が
0.5未満では収率面で不利となる場合があり、逆に、
1.2を超えると精製効果が低下する傾向にある。
して調製された活性化多糖類含有反応溶液に、直接、プ
ロテアーゼを含む緩衝液を加え、反応させることにより
実施する。但し、この修飾反応に際し、プロテアーゼの
アミノ基量に対する反応性塩素量を2倍以上、かつ酵素
に対し活性化多糖類を重量比で3倍以上とすることが好
ましい。
ンズらの方法(Haynes.R.etal.,Bio
chemistry,6,541(1967))により
トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)の反応によ
る発色を用いて測定する。但し、これには用いたプロテ
アーゼに混在する蛋白質等に由来するアミノ基も含む。
料100mgを水4mlに溶解し、0.5M−NaHC
O3 を1ml加えて100℃,30分間加熱処理を行
う。7%クロム酸水溶液0.5mlを加え、更に水希釈
した後、0.1N硝酸銀水溶液で滴定する(V1 m
l)。対照としてアルカリ分解処理を行わない場合につ
いても滴定を行う(V0 ml)。(V1 −V0 )の値か
ら相当する塩素量を算出し、反応性塩素量として求め
る。
限外濾過により精製した場合でも酸性であるため、pH
を修飾反応に適した領域に再調整することも有効であ
る。修飾反応終了後はグリシン等を加えて加熱し残存活
性基を失活させて修飾プロテアーゼ溶液を得る。修飾プ
ロテアーゼの精製は、限外濾過や透析により実施する。
特に、上述のホロファイバー型の透析チューブを用いて
精製を行うと、不純物として共存する結合剤及びその誘
導体、分解物、緩衝塩、その他の添加物等を容易に効率
良く除去でき、好適である。
アーゼの製造、特にスケールアップに関わる作業性、経
済性や安全性を大幅に改善できるばかりでなく、安定性
と安全性に優れた修飾プロテアーゼを収率よく、また、
再現性よく、簡便に製造することが可能となる。以下、
実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
4×104 )25 lに、室温下、pHを7.5〜9.5
に保ちながら塩化シアヌルを4.5%含有するアセトン
溶液7.5 lを添加し、活性化デキストランを合成し
た。この溶液についてデキストランに導入されたトリア
ジン環の、溶液中に存在するトリアジン環総量に対する
比率を測定したところ57モル%であった。この溶液に
ほう酸200gを加え、次いで好アルカリ性のバチルス
属菌由来のプロテアーゼ(ノボ・ノルディスク社製,エ
スペラーゼTM)150gを加えた後1N−NaOHによ
りpHを9.0に調整した。25℃で20時間反応させ
た後、グリシン250gを添加し、pHを8〜9に保ち
ながら更に60℃で35時間加熱処理を施し、デキスト
ランによるプロテアーゼ修飾を行った。該修飾酵素溶液
500mlについて分画分子量1万の限外濾過膜を用い
て限外濾過精製した後、溶媒を減圧溜去し粉末状として
採取した。得られた修飾プロテアーゼは皮膚感作性が全
く認められず、また保存安定性についても、0.1M−
りん酸緩衝液(pH7.0)中、40℃、6カ月経過後
も残存活性94%と良好な結果を示した。
子量4×104 )25mlに、室温下、pHを7.5〜
9.5に保ちながら塩化シアヌルを4.5%含有するア
セトン溶液5mlを添加し、活性化デキストランを合成
した。この溶液についてデキストランに導入されたトリ
アジン環の、溶液中に存在するトリアジン環総量に対す
る比率を測定したところ53モル%であった。この溶液
をクプロファン製の透析チューブに入れ、5 l蒸留水に
対して1.5時間ずつ2回透析した結果、同トリアジン
環比は73モル%となった。該溶液に好アルカリ性のバ
チルス属菌由来のプロテアーゼ(ノボ・ノルディスク社
製,エスペラーゼTM)0.1gを含む0.4M−ほう酸
緩衝液(pH9.1)5mlを加え、23℃で20時間
反応させた後、グリシン0.2gを添加し、pHを8.
5に調整して更に60℃で35時間加熱処理を施し、デ
キストランによるプロテアーゼ修飾を行った。該修飾酵
素溶液を分画分子量1万の限外濾過膜を用いて限外濾過
精製した後、溶媒を減圧溜去し粉末状として採取した。
得られた修飾プロテアーゼは皮膚感作性が全く認められ
ず、また保存安定性についても0.1M−りん酸緩衝液
(pH7.0)中、40℃、6カ月経過後も残存活性9
5%と良好な結果を示した。
4×104 )50 lに、室温下、pHを8〜9.5に保
ちながら塩化シアヌルを4%含有するアセトン溶液5 l
を添加し、活性化デキストランを合成した。この溶液に
ついてデキストランに導入されたトリアジン環の、溶液
中に存在するトリアジン環総量に対する比率を測定した
ところ48モル%であった。反応終了後の活性化デキス
トラン水溶液をポリスルホン製のダイアライザー
((株)クラレ製,PS−1.6UW,膜面積1.6m
2 )により透析精製した。処理条件として、透析液(イ
オン交換水を使用)流量1.5 l/min,反応液の通
液流量150ml/min,排出流量(流出量)100
ml/minで実施した。該処理溶液の同比率を測定し
たところ85モル%であった。該溶液(約34 l)に好
アルカリ性のバチルス属菌由来のプロテアーゼ(ノボ・
ノルディスク社製,エスペラーゼTM)170gを含む
0.5M−ほう酸緩衝液(pH9.1)8.5 lを加
え、25℃で18時間反応させた後、グリシン300g
を添加し、pHを8.5に調整して更に60℃で30時
間加熱処理を施し、デキストランによるプロテアーゼ修
飾を行った。該修飾酵素溶液を上述のダイアライザーを
用いて再度精製した。この処理条件は、透析液(イオン
交換水を使用)流量1 l/min,反応液の通液流量8
5ml/min,排出流量53ml/minで実施し
た。なお、本実施例で使用したダイアライザーの透水性
は105ml/(mmHg・m2 ・h)、血清アルブミ
ンの透過性は0.6%であった。得られた修飾プロテア
ーゼは皮膚感作性が全く認められず、また保存安定性に
ついても0.1M−りん酸緩衝液(pH7.0)中、4
0℃、6カ月経過後も残存活性96%と良好な結果を示
した。また、本実施例は、修飾酵素の精製をホローファ
イバー型の透析チューブを用いて行なったので、実施例
1、2に比して不純物の除去をより良好にかつ効率よく
行うことができた。
Claims (2)
- 【請求項1】 多糖類を塩化シアヌルにより活性化した
後、該活性化多糖類とプロテアーゼとを反応させて修飾
プロテアーゼを製造するに際し、多糖類に導入されたト
リアジン環量を、反応溶液中に存在するトリアジン環総
量の50モル%以上として、活性化多糖類とプロテアー
ゼとを反応させることを特徴とする修飾プロテアーゼの
製造方法。 - 【請求項2】 活性化多糖類を合成した後、反応溶液を
酸性化し、限外濾過または透析により未反応の塩化シア
ヌルを除去して、多糖類に導入されたトリアジン環量
を、反応溶液中に存在するトリアジン環総量の50モル
%以上とする請求項1の修飾プロテアーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP05339971A JP3081749B2 (ja) | 1993-12-06 | 1993-12-06 | 修飾プロテアーゼの製造方法 |
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JP05339971A JP3081749B2 (ja) | 1993-12-06 | 1993-12-06 | 修飾プロテアーゼの製造方法 |
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Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07155182A true JPH07155182A (ja) | 1995-06-20 |
JP3081749B2 JP3081749B2 (ja) | 2000-08-28 |
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JP (1) | JP3081749B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2000017299A (ja) * | 1998-07-01 | 2000-01-18 | San Contact Lens:Kk | 蛋白分解酵素含有洗浄液、および酵素洗浄液中の蛋白分解酵素を安定化する方法 |
-
1993
- 1993-12-06 JP JP05339971A patent/JP3081749B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2000017299A (ja) * | 1998-07-01 | 2000-01-18 | San Contact Lens:Kk | 蛋白分解酵素含有洗浄液、および酵素洗浄液中の蛋白分解酵素を安定化する方法 |
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