JPH07135988A - ２−アミノ−３−ヒドロキシ酸を製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 式： 【化１】 [ＲはＣ₃〜Ｃ₆アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₆アルデヒド、Ｃ₃〜
Ｃ₆アルキニル、フェニルまたはフリルを表すか、もし
くはエステル化されたカルボキシ、Ｃ₁〜Ｃ₆アルコキ
シ、ヒドロキシ、ハロまたはシアノで置換されたＣ₂〜
Ｃ₆アルキルを表す]で示される２-アミノ-３-ヒドロキ
シ酸を製造する方法であって、式：ＲＣＨＯで示される
アルデヒドおよびグリシンを大腸菌セリン-ヒドロキシ
メチルトランスフェラーゼと、ピリドキサール５'-リン
酸の存在下で混合することからなる方法。 【効果】 様々な２-アミノ-３-ヒドロキシ酸のエリス
ロ体を大規模に高収率で立体選択的に製造することがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、例えば抗生物質を製造
する際の中間体として機能するなど多くの用途を有する
２-アミノ-３-ヒドロキシ酸の製造法に関する。例えば
米国特許第４８５０８１５号、Mattinglyら,J.Org.Che
m.46:1557(1981)、Millerら,J.Am.Chem.Soc.102:7072(1
980)およびLotsら,J.Organic Chemistry 58:618(1993)
などを参照のこと。

【０００２】

【従来の技術】２-アミノ-３-ヒドロキシ酸を製造する
方法はいくつか知られているが、そのほとんどが１また
はそれ以上の不都合な点を持っている。これらの不都合
には普遍性の欠如と立体化学的制御が良好でない点が含
まれる。酵素法は化学法と比べていくつかの明確な利点
を持っている。例えば酵素法は温和な条件下の水性系で
行われ、しばしば立体選択的である。本発明の方法で使
用される酵素はＳＨＭＴである。１９９１年１２月１１
日に公開された欧州特許公開０４６０８８３Ａ２は、Ｓ
ＨＭＴが触媒するいくつかのアルデヒドとグリシンの縮
合によって２-アミノ-３-ヒドロキシ酸を得る方法につ
いて記述している。この方法はグリシンおよびアルデヒ
ドをｐＨが７.０ないし８.０の水性媒質中で約３０℃な
いし５５℃の温度でＳＨＭＴと共にインキュベーション
することからなる。米国特許第５１０２７９２号は、Ｓ
ＨＭＴが触媒するグリシンとアルデヒドのアルドール縮
合によってＬ-エリスロ-セリン誘導体を生産する方法に
ついて記述している。この方法では、ジアステレオマー
特異性を得るために上記のアルドール縮合反応と共に有
機溶媒による抽出工程を使用する。しかし、Saeedおよ
びYoung,Tetrahedron 48(12):2507-2514(1992)に記述さ
れているように、生成物の連続的な抽出工程を使用しな
いバッチ調製規模でＳＨＭＴが触媒する縮合反応を行う
と立体選択性は低くなった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の方法は、連続
的で共役した抽出を必要とすることなく、ＳＨＭＴの触
媒するアルドール縮合反応が高収率かつ高ジアステレオ
マー特異的に進行することを可能にする。抽出剤として
の水非混和性溶媒の除去は、この方法の環境的な安全性
を増大させ、単純なバッチ法またはフェド-バッチ法に
よる操作を可能にする。本発明の方法の条件は、Ｌ-エ
リスロ-２-アミノ-３-ヒドロキシ酸の安全で、実用的
で、経済的な大規模生産に適する。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、式：

【化２】 [ＲはＣ₃〜Ｃ₆アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₆アルデヒド、Ｃ₃〜
Ｃ₆アルキニル、フェニルまたはフリルを表すか、もし
くはエステル化されたカルボキシ、Ｃ₁〜Ｃ₆アルコキ
シ、ヒドロキシ、ハロまたはシアノで置換されたＣ₂〜
Ｃ₆アルキルを表す]で示される２-アミノ-３-ヒドロキ
シ酸を製造する方法であって、ｐＨが約６.０ないし約
８.０の水性溶液中で約０℃ないし約２５℃の温度で、
式：ＲＣＨＯ(ここにＲは上記と同意義である)で示され
るアルデヒドおよびグリシンを大腸菌セリン-ヒドロキ
シメチルトランスフェラーゼと、ピリドキサール５'-リ
ン酸の存在下で反応させることからなる方法を提供す
る。

【０００５】まず、本明細書で使用する次の用語を定義
しておく。ＡＨＨＡ＝２-アミノ-３-ヒドロキシ-ヘプタ
-６-エン酸。ａｍｐ＝アンピシリン耐性表現型およびそ
れを付与する遺伝子。バッチ法＝各反応物を一度に加
え、特定の時間後に生成物を単離することができる方
法。ｃＩ８５７＝バクテリオファージ・ラムダｐＬプロ
モーターの温度感受性リプレッサーをコード化する遺伝
子。コード配列＝ある遺伝子中のＤＮＡ配列であって、
その遺伝子から発現されるタンパク質のアミノ酸残基配
列をコード化するＤＮＡ配列。フェド-バッチ法＝少な
くとも１つの反応物を段階的に複数回加えるか、もしく
は連続的に加え、特定の時間後に生成物を単離すること
ができる方法。遺伝子＝プロモーター、翻訳活性化配
列、コード配列およびその遺伝子産物の発現を駆動する
位置にある３'調節配列からなるＤＮＡの区分。ｋａｎ
＝カナマイシン耐性表現型およびそれを付与する遺伝
子。Ｌ-エリスロ-ＡＨＨＡ＝

【化３】 。ｐＬ＝バクテリオファージ・ラムダ由来の左向きプロ
モーター。ＰＬＰ＝ピリドキサール５'-リン酸。プロモ
ーター＝ＤＮＡの転写を指示または開始するＤＮＡ配
列。ＳＨＭＴ＝大腸菌セリン-ヒドロキシメチルトラン
スフェラーゼ。ｔｅｔ＝テトラサイクリン耐性表現型お
よびそれを付与する遺伝子。

【０００６】本発明の方法は、適当なアルデヒドを、グ
リシンの該アルデヒドとのアルドール縮合を可能にする
条件下で、グリシン、ピリドキサール５'-リン酸および
ＳＨＭＴの緩衝溶液と混合することによって、対応する
Ｌ-エリスロ-２-アミノ-３-ヒドロキシ酸を高収率で、
かつ、高ジアステレオマー特異的に形成させることから
なる２-アミノ-３-ヒドロキシ酸の製造法を提供する。
ＳＨＭＴが触媒するアルドール縮合において、有機溶媒
による抽出を必要とすることなく、単純なバッチ法また
はフェド-バッチ法で高濃度のＬ-エリスロ-２-アミノ-
３-ヒドロキシ酸を高いジアステレオマー特異性で形成
させ得るので、本発明は大規模での操作にとりわけ有用
である。フェド-バッチ条件下で、本発明の方法は、ア
ルデヒドの対応する２-アミノ-３-ヒドロキシ酸への変
換率が７５％以上であり、その２-アミノ-３-ヒドロキ
シ酸の９０％以上がＬ-エリスロ・ジアステレオマー体
である。

【０００７】本発明の方法のｐＨは約６.０と８.０の間
に維持される。より好ましくは、反応液のｐＨを６.５
と７.５の間に維持する。最も好ましくは、反応液をｐ
Ｈ７．０に維持する。所望のｐＨ範囲を得るには、リン
酸塩緩衝剤あるいは酸および／または塩基による連続的
なｐＨ調節が適している。

【０００８】この酵素的に触媒されるアルドール縮合で
使用するグリシンとアルデヒドの相対的比率は様々であ
り得る。しかし、アルデヒドに対して高い比率のグリシ
ンを使用するほど、Ｌ−エリスロ・ジアステレオマー生
成物のアルデヒドからの収率が高くなる。好ましくはグ
リシン濃度を過剰にし、一方、遅い連続的添加によって
アルデヒドに対するグリシンの最終比が約１０：１ない
し約２：１になるようにアルデヒド濃度を最小に維持す
る。好ましくは、アルデヒドに対するグリシンの最終比
が約４：１である。好ましいグリシン濃度は約０.５Ｍ
ないし約３Ｍである。例えば１Ｍグリシンと２５０ｍＭ
アルデヒドを反応に使用することができる。この比率
は、反応混合物中の均一な溶液にアルデヒドを迅速に分
散させ得るように撹拌しながら、反応混合物にアルデヒ
ドを連続的または段階的に添加するフェド-バッチ法に
よって得ることが好ましい。反応混合物中の高濃度のア
ルデヒドはＳＨＭＴ酵素の不活化を促進するので、アル
デヒドの濃度を最小化する。

【０００９】反応の継続時間は、反応液に添加された全
アルデヒドの約７５％以上を対応する２-アミノ-３-ヒ
ドロキシ酸に変換するのに必要な最小時間である。反応
時間を延長することによってこれらの変換率を越えよう
という試みは収率の低下と望ましくないスレオ-２-アミ
ノ-３-ヒドロキシ酸生成物のレベルの増大をもたらし得
る。反応の継続時間を、添加するＳＨＭＴの量とインキ
ュベーションの温度に対して反比例的に変化させること
ができる。例えば１５℃で１００μＭ ＳＨＭＴ、１Ｍ
グリシンおよび２５０ｍＭアルデヒドの場合、反応の継
続時間は約４時間であるが、２０℃で１００μＭ ＳＨ
ＭＴの場合には３時間である。

【００１０】上述のように、本発明の方法はフェド-バ
ッチ法またはバッチ法で行うことができる。より好まし
いフェド-バッチ法を用いれば、反応液中のアルデヒド
濃度を最小化するように反応の継続時間中に予定の速度
でアルデヒドを添加することができる。アルデヒドの添
加速度は一定にすることができるし、あるいは経時的に
減少させることもできる。

【００１１】アルデヒドをバッチ法で加えることもでき
る。しかし、アルデヒド濃度が増大するにつれて加速す
るアルデヒドのＳＨＭＴとの望ましくない副反応ゆえ
に、反応の早期に高濃度のアルデヒドが存在するほど、
バッチ法においてＳＨＭＴ酵素が再生再利用され得る回
数が減少するであろう。バッチ法条件を用いる場合、ア
ルデヒドとグリシンの２-アミノ-３-ヒドロキシ酸への
収率はフェド-バッチ法の場合より低い。例えばバッチ
法条件下で２５０ｍＭ ４-ペンテナールを１Ｍグリシン
および１００μＭ ＳＨＭＴと１５℃で反応させると、
２-アミノ-３-ヒドロキシ-ヘプタ-６-エン酸への変換は
約５０％であった。

【００１２】反応に使用するＳＨＭＴの量は様々であり
得る。しかしＳＨＭＴ濃度は１０μＭと１ｍＭの間であ
ることが好ましい。より好ましくは、ＳＨＭＴ濃度が約
５０〜１５０μＭである。最も好ましくは、ＳＨＭＴ濃
度が約１００μＭである。ＳＨＭＴの濃度が低下するに
つれて、アルデヒドとグリシンの間の望ましくない非酵
素的化学反応が収率を低下させる。本明細書でＳＨＭＴ
濃度に言及する場合、それは実施例５の酵素検定法によ
って決定される活性なＳＨＭＴを意味する。

【００１３】いくつかの他の酵素反応と同様に、補因子
がＳＨＭＴの基質特異性、安定性および触媒効率に影響
を与える。本発明の方法で必須の補因子はピリドキサー
ル５'-リン酸(ＰＬＰ)である。本発明の方法では、ＳＨ
ＭＴに対して約２〜１５倍モル過剰のＰＬＰを反応液に
加える。好ましくはＳＨＭＴの約１０倍モル過剰のＰＬ
Ｐを加える。過剰のＰＬＰが存在すると、この酵素はよ
り安定であり、より多く再利用され得る。

【００１４】本発明の方法は約０℃と２５℃の間の温度
で行われる。ＳＨＭＴはそのような低温でより立体選択
的である。つまり温度が低いほどＬ-エリスロ-２-アミ
ノ-３-ヒドロキシ酸生成物がより多く生産される。１０
℃未満では、グリシンとアルデヒドの間のアルドール縮
合の速度を許容し得る程度に維持するのに、０℃で１ｍ
Ｍまでの、かなり大量のＳＨＭＴが必要である。約２０
℃以上では、アルデヒドからの収率の損失と２-アミノ-
３-ヒドロキシ酸生成物の立体選択性の減少が観測され
る。好ましくは、約１５℃で反応を行う。

【００１５】上述のように、広範囲にわたる様々なアル
デヒドを本発明の方法で使用することができる。式：Ｒ
ＣＨＯで示されるこれらのアルデヒドには、ＲがＣ₃〜
Ｃ₆アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₆アルデヒド、Ｃ₃〜Ｃ₆アルキ
ニル、フェニルまたはフリルを表すか、あるいはエステ
ル化されたカルボキシ、Ｃ₁〜Ｃ₆アルコキシ、ヒドロキ
シ、ハロまたはシアノで置換されたＣ₂〜Ｃ₆アルキルを
表す化合物が含まれる。

【００１６】本明細書で使用する場合、Ｃ₃〜Ｃ₆アルケ
ニルという用語は炭素-炭素二重結合がアルデヒド部分
に共役していない直鎖および分枝鎖不飽和炭化水素鎖を
意味し、例えばプロペニル、ブテニル、ペンテニルおよ
びヘキセニルなどである。Ｃ₃〜Ｃ₆アルキニルとは炭素
-炭素三重結合がアルデヒド部分と共役していない直鎖
および分枝鎖不飽和炭化水素鎖を意味し、例えばプロピ
ニル、分枝していてもよいブチニル、ペンチニルおよび
ヘキシニル基などである。エステル化されたカルボキシ
で置換されたＣ₂〜Ｃ₆アルキルとはエステル化されたカ
ルボキシ基(ここにエステル基はＣ₁〜Ｃ₄アルキル、フ
ェニル、ベンジル、あるいはｐ-メトキシベンジル、メ
チルベンジル、ｐ-ニトロベンジル、ジフェニルメチル
などの置換べンジルもしくはその他の従来のカルボキシ
保護基である)によって置換された直鎖および分子鎖ア
ルキル基を意味する。そのような基の例はエトキシカル
ボニルメチル、２-(メトキシカルボニル)エチル、３-
(ｔ-ブチルオキシカルボニル)プロピル、３-(ベンジル
オキシカルボニル)ブチル、５-(４-メトキシベンジルオ
キシカルボニル)ヘキシルのような、エステル化された
カルボキシ基で置換されたアルキル基である。Ｃ₁〜Ｃ₆
アルコキシで置換されたＣ₂〜Ｃ₆アルキルとは例えば２
-メトキシエチル、３-メトキシプロピル、４-エトキシ
ブチル、５-ペントキシヘキシル、６-プロポキシヘキシ
ルなどを意味する。ヒドロキシで置換されたＣ₂〜Ｃ₆ア
ルキルとは例えば２-ヒドロキシエチル、４-ヒドロキシ
ブチル、３-ヒドロキシヘキシルなどを意味する。ハロ
で置換されたＣ₂〜Ｃ₆アルキルとは例えば２-クロロエ
チル、３-フルオロプロピル、３-ヨードブチル、５-ブ
ロモヘキシルなどを意味する。シアノで置換されたＣ₂
〜Ｃ₆アルキルとは例えば２-シアノエチル、３-シアノ
プロピル、３-シアノブチル、５-シアノヘキシルなどを
意味する。Ｃ₂〜Ｃ₆アルデヒドとは３-ホルミルピロピ
ルなどの基を意味する。

【００１７】本発明での使用がとりわけ好ましいアルデ
ヒドは４-ペンテナールである。グリシンと４-ペンテナ
ールのアルドール縮合の生成物はＬ-エリスロ-２-アミ
ノ-３-ヒドロキシ-ヘプタ-６-エン酸である。

【００１８】本発明での使用が好ましいもう１つのアル
デヒドは３-シアノプロパナールである。グリシンと３-
シアノプロパナールのアルドール縮合の生成物は２-ア
ミノ-３-ヒドロキシ-５-シアノペンタン酸(ＡＨＣＰＡ)
である。

【００１９】本発明のもう１つの好ましい態様では、コ
ハク酸セミアルデヒドのエステル(例えばメチルエステ
ル、エチルエステルまたはブチルエステルの如きＣ₁〜
Ｃ₄アルキルエステルなど)を基本的に上述した通りの反
応混合物に加え、その反応混合物と共にインキュベート
することにより、対応するＬ-エリスロ-２-アミノ-３-
ヒドロキシアジピン酸を得る。酵素反応のモノエステル
生成物は自発的に、塩基の存在下または高温で容易にジ
カルボン酸塩に変わるラクトンになる。上述の反応条件
下では、ラクトン体が主要生成物である。

【００２０】本法で使用するアルデヒドはすべて既知化
合物であって、市販されているか、もしくは従来の方法
で製造することができる。アルデヒドの対応する２-ア
ミノ-３-ヒドロキシ酸への変換が起こるには、そのアル
デヒドが完全に溶液状態にある必要はない。水性反応媒
質に部分的にしか可溶性でないアルデヒドもＳＨＭＴの
基質として機能する。

【００２１】本法は、インキュベーション混合物から経
時的に一部を取り出し、ＨＰＬＣ分離と混合物中に存在
するすべての１級アミン化合物のＯ-フタルアルデヒド
誘導イソインドールの検出でその試料を検定することに
よって、２-アミノ-３-ヒドロキシ酸の生産について監
視することができる。この検定法はAswad,AnalyticalBi
ochemistry 137:405(1984)に記述されている。インキュ
ベーション混合物と酵素ブランクの両方を生成物標品の
Ｏ-フタルアルデヒド誘導体と比較してＨＰＬＣ分析す
ることによって、酵素反応生成物と同定し得るクロマト
グラフ上のピークを決定することができる。

【００２２】ＳＨＭＴ酵素の供給源は、例えばＳＨＭＴ
を含有する無傷の全細胞、そのような細胞の清澄化した
洗浄細胞溶解液、部分的に精製したＳＨＭＴまたは精製
ＳＨＭＴからなり得る。ＳＨＭＴを回収、精製するため
の複数段階の技術は当該技術分野でよく知られており、
例えばUlevitchら,Biochemistry 16(24) 5342-5350(197
7)やSchirchら,J.Bacteriol.163(1) 1-7(1985)に記述さ
れている。

【００２３】したがって本発明の１態様では、全水溶性
タンパク質の約４０％以上のレベルでＳＨＭＴを発現さ
せる組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換された大腸菌
細胞の清澄化した洗浄細胞溶解液の存在下でアルドール
縮合反応を行う。このレベルのＳＨＭＴ発現を得る方法
を本明細書の実施例に記述する。本発明の方法で清澄化
した洗浄細胞溶解液を直接使用することによって、費用
がかかる精製段階を避けることができる。

【００２４】本発明のもう１つの態様として、全水溶性
タンパク質の約４０％以上のレベルでＳＨＭＴを発現さ
せる組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換された大腸菌
細胞の存在下でアルドール縮合反応を行うことができ
る。

【００２５】本発明のさらなる態様として、１回のアニ
オン交換クロマトグラフィー段階から得られる部分的に
精製されたＳＨＭＴを用いてアルドール縮合を行うこと
ができる。この態様では全細胞から精製ＳＨＭＴを得る
のであるが、その場合、ＳＨＭＴは全水溶性タンパク質
の約４０％以上のレベルでＳＨＭＴを発現させる組換え
ＤＮＡ発現ベクターで形質転換された大腸菌細胞から得
られる。

【００２６】さらに、ＳＨＭＴ酵素またはＳＨＭＴ酵素
を含有する無傷の細胞を、当該技術分野でよく知られて
いる様々な支持体および固定化技術を用いて固定化する
ことができる。

【００２７】本発明の方法のもう１つの有用な特徴は、
ＳＨＭＴ酵素を以降の反応で再生利用し得るということ
である。十分な２-アミノ-３-ヒドロキシ酸生成物が形
成したら、その反応混合物を約３００００分子量の区分
点を持つ限外フィルターに通すことによって、ＳＨＭＴ
を再生する。ＳＨＭＴは再利用のためにそのフィルター
によって保持される。濾液は２-アミノ-３-ヒドロキシ
酸生成物、グリシン、ＰＬＰおよび未反応のアルデヒド
基質を含有する。２-アミノ-３-ヒドロキシ酸生成物は
ＳＰ２０７吸収カラム(三菱化成)上に保持され、水性メ
タノールで選択的に溶出させることができる。次に限外
濾過によって保持されたＳＨＭＴにグリシンとＰＬＰを
再添加し、その溶液をｐＨ約７.０に調節し、その混合
物にアルデヒドを供給することによって次のアルドール
縮合サイクルを開始する。その反応を、加えたアルデヒ
ドの総量の約７５％以上が対応する２-アミノ-３-ヒド
ロキシ酸に変換されるまで、生成物について監視し、そ
の工程を繰り返す。

【００２８】本発明の方法では高濃度のＳＨＭＴを使用
する。Staufferら,Gene 14:63-72(1981)は、大腸菌中で
ＳＨＭＴをコード化しているｇｌｙＡ遺伝子のクローニ
ングについて記述している。ｇｌｙＡ遺伝子のヌクレオ
チド配列は決定されており、ＳＨＭＴ酵素のアミノ酸配
列はPlamannら,Nucleic Acids Research 11:2065-2075
(1983)によって提案されている。ｇｌｙＡ遺伝子は大腸
菌宿主中で野生型の１７〜２６倍のレベルに過剰発現さ
れており、過剰生産された酵素が単離、精製されている
(Schirchら,J.Bacteriol.163(1):1-7(1985))。しかしこ
の発現レベルは２-アミノ-３-ヒドロキシ酸の大規模生
産にとっては実用的でない。本発明の方法を大規模に実
施する際に必要な大量のＳＨＭＴを得るために商業的に
実行し得る方法を提供するために、組換えＤＮＡ技術に
よるＳＨＭＴの不均質生産用の系をも後述の実施例に記
載する。本明細書に記述するＳＨＭＴの生産法は、本願
と同日出願の「セリン-ヒドロキシメチルトランスフェ
ラーゼを生産する方法」と題する特許出願(代理人整理
番号１４３３２１)に開示されている方法と同一であ
る。この特許出願(代理人整理番号１４３３２１)の全内
容は参考文献として本明細書の一部を構成する。

【００２９】実施例で後述するように、本発明のベクタ
ーを構築する際には、プラスミドｐＧＳ２９を大腸菌ｇ
ｌｙＡ遺伝子をコード化するＤＮＡの供給源とした。後
述するクローニング法の代替法として、本発明のベクタ
ーで使用するために、ＤＮＡ合成、ｃＤＮＡクローニン
グ、ゲノムクローニング、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣ
Ｒ)技術またはこれらの方法の組み合わせを含む他の様
々な方法によって大腸菌ｇｌｙＡをコード化するＤＮＡ
を調製することができる。これらの技術とその他の技術
はManiatisら,“Molecular Cloning：A Laboratory Man
ual”(コールド・スプリング・ハーバー・プレス、ニュ
ーヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、コールド
・スプリング・ハーバー・ラボラトリー)または“Curre
nt Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausbelら,1
989)に記述されている。これらの文献の内容は共に参考
文献として本明細書の一部を構成する。

【００３０】大腸菌ｇｌｙＡ読み取り枠のＤＮＡ配列は
市販の方法と装置を用いて合成することができる。例え
ば固相ホスホトリエステル法を用いて本発明のＤＮＡ配
列を製造することができる。完全に保護されたＤＮＡ構
築ブロックを用いる修飾ホスホトリエステル法によって
ＤＮＡ配列を合成することができる。このような合成法
は、実質的にItakuraら,Science 198:1056(1977)、Crea
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:575およびNarangら,M
ethods in Enzymology 68:90(1980)に従って行うことが
できる。手動法に加えて、ＡＢＳ ３８０Ａ ＤＮＡシン
セサイザー(Applied Biosystems,カリフォルニア州9440
4フォスター・シティー、リンカーン・センター・ドラ
イブ850番)のような自動合成装置を用いてＤＮＡ配列を
合成することもできる。またポリメラーゼ連鎖反応によ
ってＤＮＡ配列を作成することもできる。例えば米国特
許第４８００１５９号、同第４６８３２０２号、１９８
７年３月２日に公開された欧州特許公開第０２５８０１
７号を参照のこと。

【００３１】例えば大腸菌ｇｌｙＡ読み取り枠をコード
し、ＮｄｅＩとＢｃｌＩ適合末端を有する下記のＤＮＡ
配列を合成し、それをプラスミドｐＨＫＹ３９０の大き
いＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片中にクローン化する
ことにより、プラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡを作成する
ことができる。下記二本鎖ＤＮＡ断片の５'から３'への
鎖を配列番号１と命名する。下記二本鎖ＤＮＡ断片の
３'から５'への鎖を配列番号２と命名する。

【化４】

【化５】

【００３２】下記の実施例は本発明のさらなる理解を助
けるためのものである。使用する特定の物質、種および
条件は本発明をさらに例示するためのものであり、本発
明の妥当な範囲を制限するものではない。ＤＮＡの操作
と分析の手法は基本的にSambrookら,“Molecular Cloni
ng：A Laboratory Manual(1989)”(コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー・プレス,ニューヨーク州
コールド・スプリング・ハーバー)に記述されている通
りに行った。制限酵素反応の条件は製造者(Boehringer
Mannheim(BM),インディアナ州インディアナポリス；New
England Biolabs(NEB),マサチューセッツ州ベバリー；
Bethesda Research Labs(BRL),メリーランド州ガイサー
スブルグ)が推奨する条件とした。

【００３３】

【実施例】実施例１ ：プラスミドｐＧＳ２ ９で形質転換された大腸
菌宿主細胞の調製 大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子のヌクレオチド配列は既知である
(Plamannら,Nucleic Acid Research 11:2065-2075(198
3))。しかし便宜上、大腸菌ＧＳ２４５／ｐＧＳ２９か
ら単離されるプラスミドｐＧＳ２９を本発明のベクター
の出発物質として使用した。大腸菌ＧＳ２４５／ｐＧＳ
２９についてはPlamannおよびStauffer,Gene 22:9-18(1
983)が記述している。

【００３４】５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
Ｌ寒天上で生育させた大腸菌ＧＳ２４５／ｐＧＳ２９コ
ロニーの一部を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが入って
いるＬブロス１リットルに移し、空気振盪機中３７℃で
約１６時間インキュベートした。ベックマンＪＡ-１０
ローター(Beckman Insts.Inc.,カリフォルニア州92634
フラートン(Beckman))を用いて、４℃、８０００ｒｐｍ
で１０分間の遠心分離によって、細胞を５００ｍｌ管中
に収集した。細胞ペレットをＴＥ-８.０(１０ｍＭトリ
ス-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、１ｍＭエチレンジアミンテトラ
酢酸(ＥＤＴＡ))で洗浄し、収集し、５０ｍＭトリス-Ｈ
Ｃｌ(ｐＨ８.０)と２５％ショ糖に再懸濁して、総体積
を１０ｍｌにした。２５ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)
中の２０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム(Sigma Chemical Co.,
ミズーリ州63178セント・ルイス)１ｍｌを撹拌しながら
添加した後、その混合物を氷上で３０分間インキュベー
トした。２００ｍＭ ＥＤＴＡ ４ｍｌを加えた後、氷上
で１０分間インキュベートし、次いでブリージ／ＤＯＣ
溶解溶液(１％ブリージ５８；０.４％デオキシコレー
ト；５０ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)；６０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ)１５ｍｌを加えた。チューブを穏やかに反転さ
せることによって混合し、氷上で１５〜３０分間インキ
ュベートした。ベックマンＪＡ-２０ローターを用い
て、１８０００ｒｐｍで１時間の遠心分離によって細胞
残渣を除去した。上清をデカントすることにより約３０
ｍｌを得、それに１０ｍｇ／ｍｌ ＲＮＡｓｅ Ａ(Sigm
a)１５０μｌを加えた。３７℃で１時間インキュベート
した後、１０ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ(Boehringer
Mannheim)１５０μｌを加え、３７℃でさらに１時間イ
ンキュベートした。１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウム
(ｐＨ７.０)の添加とそれに続く３体積の氷冷無水エタ
ノールの添加によってＤＮＡを沈殿させた。ベックマン
ＪＡ-１４ローターを用いる８０００ｒｐｍで３０分間
の遠心分離によってＤＮＡを回収した。風乾したペレッ
トをＴＥ-８.０に再懸濁して総体積を９ｍｌにし、それ
に塩化セシウム(Boehringer Mannheim)９ｇと１０ｍｇ
／ｍｌ臭化エチジウム０.５ｍｌを加えた。得られた溶
液を５.１ｍｌのクイック・シール(Quik-seal)管(Becka
man)に充填し、ベックマンＶＴｉ６５.２超遠心ロータ
ーを用いて６５０００ｒｐｍで６時間遠心分離した。紫
外光下でプラスミドバンドを可視化し、シリンジで取り
出した。得られたＤＮＡ溶液を塩飽和イソプロパノール
で抽出することによって臭化エチジウムを除去し、１０
００体積のＴＥ-８.０に対して１６時間透析した。ＤＮ
Ａ溶液は使用するまで−２０℃で保存した。

【００３５】形質転換感応大腸菌ＤＨ５α細胞をGibco
BRL(メリーランド州ガイサースブルグ)から得て、それ
を製造者の操作法に従ってプラスミドｐＧＳ２９で形質
転換した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ
寒天上で形質転換体を選択した。水平ゲル電気泳動での
プラスミドサイズ分類によってプラスミドｐＧＳ２９を
含有する形質転換体を確認した。プラスミドｐＧＳ２９
を保持する代表的な大腸菌ＤＨ５α形質転換体をＤ.１
と命名した。

【００３６】別法として、プラスミドｐＧＳ２９を用い
て大腸菌ＲＶ３０８を形質転換した。大腸菌ＲＶ３０８
の培養は１９８３年９月２８日に、イリノイ州６１６０
４ペオリアの米国農務省、Northern Regional Research
Laboratory(NRRL)の永久培養収集物に寄託されてお
り、受託番号Ｂ-１５６２４の下に入手できる。

【００３７】形質転換のために大腸菌ＲＶ３０８細胞を
次のように調製した。大腸菌ＲＶ３０８細胞の試料をＬ
ブロス(１リットルあたりトリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ
１０ｇ、酵母エキス５ｇ)中でＯ.Ｄ.₅₉₀が約０.５吸光
度単位になるまで生育させ、遠心分離によって細胞を収
集した。細胞ペレットを冷たい１００ｍＭ ＣａＣｌ₂２
５ｍｌに再懸濁し、氷上で２５分間インキュベートし
た。再び細胞を遠心分離によって集め、そのペレットを
冷たい１００ｍＭ ＣａＣｌ₂ ２.５ｍｌに再懸濁し、終
夜インキュベートした。感応細胞を形質転換するか、あ
るいは形質転換で使用する準備が整うまで−７０℃で直
接保存した。

【００３８】感応大腸菌ＲＶ３０８細胞をプラスミドｐ
ＧＳ２９で形質転換するために、ポリプロピレンチュー
ブ中の感応細胞懸濁液１００μｌを−７０℃の保存分か
ら取り出し、氷上で融解させた。細胞を穏やかに混合
し、プラスミドｐＧＳ２９の溶液(１ｎｇ／μｌ)５μｌ
を加え、得られた溶液を氷上で３０分間インキュベート
した。そのチューブを４２℃の水槽に移し、振盪しない
で４５秒間インキュベートした。この熱ショック処理
後、チューブを２分間氷上に置いた。チューブを氷から
取り出し、室温のＳ.Ｏ.Ｃ.培地(２％バクトトリプト
ン；０.５％酵母エキス；１０ｍＭ ＮａＣｌ；２.５ｍ
Ｍ ＫＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂；１０ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ₄；２０ｍＭグルコース；蒸留水中)０.９ｍｌを加え
た。その溶液を毎分２２５回転(ｒｐｍ)の速度で振盪し
ながら３７℃で１時間インキュベートした。その細胞混
合物の一部を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが入ってい
るＬ寒天(Ｌブロスと１５ｇ／Ｌの寒天)プレート上に接
種し、そのプレートを３７℃でインキュベートした。ア
ンピシリン耐性に関する選択と水平ゲル電気泳動でのプ
ラスミドサイズ分類によって形質転換体を確認した。そ
のクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分
析によって確認した。プラスミドｐＧＳ２９を保持する
大腸菌ＲＶ３０８の代表的な形質転換体をＲ.１と命名
した。

【００３９】実施例２：プラスミドｐＶ -ｐｃｒＢの構
築 Ａ．ＰＣＲ修飾／増幅断片の構築 ＡＴＧ開始コドンにあるＮｄｅＩ部位とｇｌｙＡ遺伝子
のＢｓｔＥＩＩ部位を含むｇｌｙＡコード化ＤＮＡを有
するように改変された大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子の５'末端
を含有するＰＣＲ修飾／増幅断片を構築した。増幅に使
用したＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーは次の通り
である。前向きプライマーは、

【化６】 という配列からなる２６塩基のオリゴヌクレオチドであ
る。配列番号３は大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子のＡＴＧ転写開
始コドンを横切ってハイブリッド形成するように設計し
た。太字はＮｄｅＩ認識配列を表し、下線を付した塩基
は元来の大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子配列とは異なる塩基であ
る。逆向きオリゴヌクレオチドプライマーは、５'-ＣＣ
ＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＧＡＧ-３'(配列番号４)という配
列からなる１５塩基対のＤＮＡオリゴヌクレオチドであ
る。配列番号４は大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子配列内の唯一の
ＢｓｔＥＩＩ部位のすぐ下流にハイブリッド形成するよ
うに設計した。両オリゴヌクレオチオドは共にＡＢＩ
３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置で合成し、Oligonucleotide P
urification Cartridge^R(Applied Biosystems Inc.,カ
リフォルニア州フォスター・シティー)で精製した。こ
れらのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うために必要
な物質はGeneAmp^TM DNA Amplification ReagentKit(Per
kin Elmer Cetus,コネティカット州ノルウォーク)とし
て入手した。

【００４０】反応条件は次の通りである：鋳型ＤＮＡ
(プラスミドｐＧＳ２９)１ｎｇ；１.０ｍＭ配列番号
３；１.０ｍＭ配列番号４；各２００ｍＭ ｄＡＴＰ(デ
オキシアデノシン５'-トリリン酸)、ｄＣＴＰ(デオキシ
シトシン５'-トリリン酸)、ｄＧＴＰ(デオキシグアノシ
ン５'-トリリン酸)およびＴＴＰ(チミジル５'-トリリン
酸)；１×反応緩衝液(１０ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ８.
３)；５０ｍＭ ＫＣｌ；１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０.０１
％(ｗ／ｖ)ゼラチン)；Ｔａｑポリメラーゼ２.５単位；
最終体積１００μｌ。蒸発を防ぐために０.５ｍｌポリ
プロピレンチューブ中の反応混合物に鉱油１００μｌを
重層し、ＤＮＡ Thermal Cycler(Perkin Elmer Cetus)
中に設置した。サーモサイクラーの設定は次の通りであ
る；９４℃で２分間を１サイクル；ａ）９４℃で１分
間，ｂ）５０℃で２分間，ｃ）７２℃で３分間を３０サ
イクル；７２℃で７分間を１サイクル；４℃で最終サイ
クル(貯蔵)。

【００４１】この４０３塩基対のＰＣＲ修飾／増幅ＤＮ
Ａ断片を、１×ＢａｍＨＩ／ＢｓｔＥＩＩ緩衝液(１０
ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)；５ｍＭ塩化マグネシウ
ム；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ２-メルカプトエタ
ノール)を含有する反応液中でＢｓｔＥＩＩ酵素５０単
位を用いて６０℃で２時間消化することにより、３８０
塩基対のＢｓｔＥＩＩ-ＮｄｅＩ ＤＮＡ断片に変換し
た。この断片を次のようにゲル単離した。消化したＤＮ
Ａを１×ＴＡＥ緩衝液(４０ｍＭトリス-酢酸；１ｍＭ
ＥＤＴＡ)中の１.５％アガロースゲルで電気泳動した。
そのゲルを臭化エチジウム溶液の希釈液(１ｍｇ／ｍｌ)
で染色し、長波長紫外(ＵＶ)光下でＤＮＡバンドを可視
化した。３８０塩基対のＢｓｔＥＩＩ消化したＰＣＲ修
飾／増幅ＤＮＡ断片の位置を特定し、それを新しい外科
用ナイフでゲルから切り出した。Maniatisらの操作法
(T.Maniatis,J.SambrookおよびE.F.Fritsch,1989,Molec
ular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Springs Har
bor Laboratory Press,6.28頁)に若干の調節を加えて、
そのゲル切片からＤＮＡ断片を溶出させた。簡単に述べ
ると、ゲル切片を１／５×ＴＡＥ緩衝液約２００μｌと
共に透析バッグに入れ、クリップで密封し、１／５×Ｔ
ＡＥ緩衝液中で約３時間電気泳動した。透析バッグの内
容物と１／５×ＴＡＥによる洗浄液４００μｌを低塩緩
衝液(０.２Ｍ ＮａＣｌ；２０ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ
７.５)；１.０ｍＭ ＥＤＴＡ)２.４ｍｌと混合し、与え
られた操作法に従って調製済エルーチップ-ｄ(ELUTIP-
d)カラム(Schleicher & Schuell,ニューハンプシャー州
キーン)に充填した。低塩緩衝液で洗浄した後、高塩緩
衝液(１.０Ｍ ＮａＣｌ；２０ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ
７.５)；１.０ｍＭ ＥＤＴＡ)４００μｌを２回用い
て、ＤＮＡをカラムから溶出させ、氷冷無水エタノール
８００μｌの添加とそれに続く遠心分離(エッペンドル
フ5415C微量遠心機中１４０００ｒｐｍで４０分間)によ
って沈殿させた。ＴＥ(ｐＨ７.５)２０μｌに溶解する
ことによって２つの風乾ペレットを混合し、その溶液を
連結まで−２０℃で保存した。この断片は、ＡＴＧ翻訳
開始出発部位にＮｄｅＩ部位を有するようにＰＣＲで修
飾した大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子のアミノ末端領域を含有す
る。

【００４２】Ｂ．Ｓａｕ３ＡＩ-ＨｐｈＩリンカーＤＮ
Ａ断片の構築 Ｓａｕ３ＡＩ-ＨｐｈＩリンカー断片を単離するため
に、２つの別個の消化と単離を行った。まず１×Ｈｐｈ
Ｉ緩衝液(２０ｍＭトリス-酢酸(ｐＨ７.９)；５０ｍＭ
酢酸カリウム；１０ｍＭ酢酸マグネシウム；１ｍＭジチ
オスレイトール)を含有する反応液中でＨｐｈＩ制限酵
素(ＮＥＢ)５０単位を用いてプラスミドｐＵＣ１９(Ｂ
ＲＬから入手可能)約２０μｇを３７℃で２時間消化し
た。適当な４１６塩基対のＨｐｈＩ制限断片を実施例２
Ａに記載の如くゲル単離した。次にその断片を、１×Ｓ
ａｕ３ＡＩ緩衝液(３３ｍＭトリス-酢酸(ｐＨ７.９)；
１０ｍＭ酢酸マグネシウム；６６ｍＭ酢酸カリウム；
０.５ｍＭジチオスレイトール)を含有する反応液中でＳ
ａｕ３ＡＩ制限酵素(ＢＭ)５０単位を用いて３７℃で２
時間消化した。２３４塩基対のＳａｕ３ＡＩ-ＨｐｈＩ
ＤＮＡ断片を実施例２Ａに記述の如くゲル単離した。

【００４３】Ｃ．プラスミドｐＶ-ｐｃｒＡの構築 １×ＡｃｃＩ緩衝液(３３ｍＭトリス-酢酸(ｐＨ７.
９)；１０ｍＭ酢酸マグネシウム；６６ｍＭ酢酸カリウ
ム；０.５ｍＭ ＤＴＴ)を含有する反応液中で制限酵素
ＡｃｃＩ ５０単位を用いてプラスミドｐＵＣ１９ ＤＮ
Ａ約５μｇを３７℃で２時間消化した。直線化したプラ
スミドｐＵＣ１９を実施例２Ａに記述した方法でゲル単
離した。

【００４４】１×ＡｈａＩＩ緩衝液(１０ｍＭトリス-Ｈ
Ｃｌ(ｐＨ７.９)；５０ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂；１ｍＭ ＤＴＴ；１００ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブ
ミン)を含有する反応液中でＡｈａＩＩ酵素(ＮＥＢ)５
０単位を用いてプラスミドｐＧＳ２９約１０μｇを３７
℃で２時間消化した。２.０ｋｂのＡｈａＩＩ断片を実
施例２Ａに記述した方法で単離した。

【００４５】プラスミドｐＧＳ２９から得た２.０ｋｂ
のＡｈａＩＩ断片３μｌとＡｃｃＩで直線化したプラス
ミドｐＵＣ１９(２.８ｋｂ)１μｌを、１×リガーゼ緩
衝液とＴ４リガーゼ(ＢＭ)約５単位を含有する反応液１
５μｌに加えた。その反応混合物を１４℃で１６時間イ
ンキュベートした。その反応生成物を実施例１に記述の
如く大腸菌ＤＨ５α細胞に導入した。形質転換体から得
られるプラスミドをそのプラスミド中のＡｈａＩＩ断片
の向きについてスクリーニングした。プラスミドｐＵＣ
１９のＰｓｔＩ部位に近く、かつ、ＢａｍＨＩ部位に遠
いＢｓｔＥＩＩ部位を含有するプラスミドをプラスミド
ｐＶ-ｐｃｒＡとして選択した。このクローンから得ら
れるプラスミドを実施例１に記述の如く単離した。

【００４６】所望のＢｓｔＥＩＩ-ＢａｍＨＩベクター
骨格断片を得るために、１×ＢａｍＨＩ／ＢｓｔＥＩＩ
緩衝液を含有する反応液中でＢａｍＨＩ酵素(ＢＭ)５０
単位を用いてプラスミドｐＶ-ｐｃｒＡ約１０μｇを３
７℃で２時間消化した。その反応液にＢｓｔＥＩＩ(５
０単位)を加え、温度を６０℃に上げて２時間維持し
た。実施例２Ａの方法に従ってＢｓｔＥＩＩ-ＢａｍＨ
Ｉベクター骨格断片をゲル単離した。

【００４７】Ｄ．中間体プラスミドｐＶ-ｐｃｒＢの最
終的な構築 実施例２Ａで調製したＢｓｔＥＩＩ消化３８０塩基対Ｐ
ＣＲ修飾／増幅ＤＮＡ断片を、実施例２Ｂで調製したリ
ンカー断片および実施例２Ｃで調製したベクター骨格断
片と連結することにより、中間体プラスミドｐＶ-ｐｃ
ｒＢを得た。

【００４８】ベクター骨格断片１μｌ(約５０ｎｇ)、Ｓ
ａｕ３ＡＩ-ＨｐｈＩ ＤＮＡ断片２μｌ(約１００ｎｇ)
およびＢｓｔＥＩＩ消化ＰＣＲ修飾／増幅ＤＮＡ断片６
μｌ(約１００ｎｇ)を、１×連結緩衝液とＴ４リガーゼ
約５単位とを含有する反応液に加えた。その混合物を１
４℃で１６時間インキュベートし、得られたＤＮＡを実
施例１に記述の方法で大腸菌ＤＨ５αに導入した。制限
酵素分析で形質転換体をスクリーニングすることによ
り、プラスミドｐＶ-ｐｃｒＢを保持する形質転換体を
選択した。実施例１に記述の方法でその形質転換体から
プラスミドｐＶ-ｐｃｒＢを抽出し、精製した。

【００４９】実施例３：プラスミドｐＸ ４の構築 プラスミドｐＨＫＹ３９０の制限酵素部位と機能地図を
図２に示す。下記の手法でプラスミドｐＨＫＹ３９０か
らカナマイシン耐性遺伝子の読み取り枠を除去した。１
×ＮｄｅＩ緩衝液を含有する反応混合物中でＮｄｅＩ制
限酵素５０単位を用いてプラスミドｐＨＫＹ３９０ １
０μｇを３７℃で２時間消化した。消化したＤＮＡを上
述の如く沈殿させ、得られたＤＮＡペレットを１×Ｂａ
ｍＨＩ緩衝液に再懸濁した。ＢａｍＨＩ制限酵素５０単
位を加え、その混合物を３７℃で２時間インキュベート
した。プラスミドｐＨＫＹ３９０の２つのＮｄｅＩ-Ｂ
ａｍＨＩ ＤＮＡ断片のうちの大きい方を実施例２Ａに
記述した手法に従ってゲル単離した。

【００５０】大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子と上流配列を含有す
るＮｄｅＩ-ＢｃｌＩ ＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＳ２
９から次のようにして得た。１×ＮｄｅＩ緩衝液を含有
する反応液中でＮｄｅＩ ５０単位を用いてプラスミド
ｐＧＳ２９約１０μｇを３７℃で２時間消化した。１／
１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウム(ｐＨ７.０)と２.５体積
の氷冷無水エタノールの添加によって、消化したＤＮＡ
を沈殿させた。３０分間の遠心分離によってＤＮＡを集
めた。ＤＮＡのペレットを１×ＢｃｌＩ緩衝液(１０ｍ
Ｍトリス-ＨＣｌ(ｐＨ７.５)；１０ｍＭ塩化マグネシウ
ム；５０ｍＭ塩化ナトリウム；１ｍＭジチオエリスリト
ール)に再懸濁、溶解し、ＢｃｌＩ制限酵素５０単位を
加え、その反応混合物を５０℃で２時間インキュベート
した。プラスミドｐＨＫＹ３９０由来のゲル単離したＮ
ｄｅＩ-ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を含有する連結混合物に
１.７３ｋｂのＮｄｅＩ-ＢｃｌＩ ＤＮＡ断片を直接加
えた。

【００５１】ｇｌｙＡ読み取り枠と上流配列を含有する
プラスミドｐＧＳ２９の１.７３ｋｂのＮｄｅＩ-Ｂｃｌ
Ｉ ＤＮＡ断片を、プラスミドｐＨＫＹ３９０から得ら
れる大きいＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片に次のよう
に連結した。プラスミドｐＨＫＹ３９０から得られる大
きいＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片５μｌ(約５０ｎ
ｇ)とＮｄｅＩ-ＢｃｌＩ消化したプラスミドｐＧＳ２９
ＤＮＡ５μｌ(約５００ｎｇ)を、１×リガーゼ緩衝液
とＴ４リガーゼ５単位とを含む反応液に加えた。得られ
た混合物を１４℃で１６時間インキュベートし、得られ
たＤＮＡ生成物を実施例１に記述の如く大腸菌ＤＨ５α
細胞に導入した(ただし形質転換とインキュベーション
は３０℃で行った)。テトラサイクリン耐性について形
質転換体を選択した。得られたテトラサイクリン耐性形
質転換体のプラスミドを制限酵素分析でスクリーニング
したところ、所望のプラスミドｐＸ４の構造を持つプラ
スミドを保持する形質転換体が見つかった。選択した形
質転換体から実施例１に記述した方法でプラスミドｐＸ
４ ＤＮＡを精製した。

【００５２】実施例４：プラスミドｐＺ Ｐ１-ｇｌｙＡ
の構築 プラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡを構築するために、プラ
スミドｐＸ４の小さいＮｄｅＩ-ＢｓｔＥＩＩ ＤＮＡ断
片をプラスミドｐＶ-ｐｃｒＢから得られる小さいＮｄ
ｅＩ-ＢｓｔＥＩＩ ＤＮＡ断片で置換した。これは次の
ように行った。１×ＮｄｅＩ緩衝液中でＮｄｅＩ(５０
単位)を用いてプラスミドｐＸ４(１０μｇ)を３７℃で
２時間消化した。ＤＮＡを実施例３に記載の如く沈殿さ
せ、沈殿したＤＮＡをＢｓｔＥＩＩ ５０単位が入って
いる１×ＢｓｔＥＩＩ緩衝液に再懸濁した。この反応混
合物を６０℃で２時間インキュベートし、大きいＤＮＡ
断片を実施例２Ａに従ってゲル単離した。プラスミドｐ
Ｘ４の消化と同様にｐＶ-ｐｃｒＢ約２０μｇをも消化
し、３７３塩基対のＮｄｅＩ-ＢｓｔＥＩＩ ＤＮＡ断片
をゲル単離した。

【００５３】プラスミドｐＸ４から得た大きいＮｄｅＩ
-ＢｓｔＥＩＩ ＤＮＡ断片とプラスミドｐＶ-ｐｃｒＢ
から得た３７３塩基対のＮｄｅＩ-ＢｓｔＥＩＩ ＤＮＡ
断片を次のように連結して、プラスミドｐＺＰ１-ｇｌ
ｙＡを形成させた。ベクターｐＸ４から得た断片２μｌ
(約５０ｎｇ)とプラスミドｐＶ-ｐｃｒＢから得た３７
３塩基対の断片１μｌ(約１５０ｎｇ)を、１×リガーゼ
緩衝液とＴ４リガーゼ５単位が入っている反応混合物に
加えた。得られた反応混合物を１４℃で１６時間インキ
ュベートした。

【００５４】滅菌ＴＥで５倍に希釈することにより連結
反応混合物を形質転換のために調製した。希釈したＤＮ
Ａを用い、基本的に実施例３に記載の如く、感応大腸菌
ＤＨ５α細胞を形質転換した。テトラサイクリン耐性コ
ロニーを選択し、これらのコロニーから得られるプラス
ミドを水平アガロースゲル電気泳動によってサイズ分類
した。プラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡについて予期され
るサイズに対応するサイズのプラスミドを含有する形質
転換体を選択した。制限酵素分析によって、これらの形
質転換体のプラスミドがプラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡ
について予期される構造を有することを確認した。代表
的な大腸菌ＤＨ５α／ｐＺＰ１-ｇｌｙＡ形質転換体を
選択して、それをＤｇｌｙと命名した。

【００５５】プラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡを大腸菌Ｄ
Ｈ５α／ｐＺＰ１-ｇｌｙＡから単離し、それを用いて
実施例３に記述の如く大腸菌ＲＶ３０８を形質転換し
た。制限酵素分析によって、これらの形質転換体から得
られるプラスミドがプラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡにつ
いて予期される構造を有することを確認した。代表的な
大腸菌ＲＶ３０８／ｐＺＰ１-ｇｌｙＡ形質転換体を選
択し、それをＲｇｌｙと命名した。

【００５６】上述の大腸菌組換え体の活性分析を容易に
するために、３'-フェニルセリンをＳＨＭＴの基質とし
て用いる高性能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)検定
法を開発した。３'-フェニルセリンのベンズアルデヒド
への変換を監視することによってＳＨＭＴ活性を決定し
た。総体積１ｍｌのこの反応混合物は２０ｍＭの３'-フ
ェニルセリンと２０ｍＭ Ｎ,Ｎ-ビス［２-ヒドロキシエ
チル］-２-アミノエタンスルホン酸緩衝液(ＢＥＳ，ｐ
Ｈ７.２５)中の適当量の酵素とを含む。この反応混合物
を穏やかに振盪しながら３０℃でインキュベートし、５
分後に１０％Ｈ₃ＰＯ₄２５μｌを添加することによって
反応を停止させた。遠心分離によってあらゆる粒子を除
去し、上清画分の少量(通常１０μｌ)をＨＰＬＣで分析
した。アペックスＯＤＳ ３μ Ｃ１８カラム(Jones Chr
omatography,コロラド州リトルトン)、水／アセトニト
リル(７２／２５，ｖ／ｖ)による流速１ｍｌ／分の無勾
配溶出および２７９ｎｍにおける検出を用いることによ
って、ベンズアルデヒドを定量した。酵素活性１単位を
上記反応条件下で毎分１μモルのベンズアルデヒドの生
成をもたらすのに必要なＳＨＭＴの量と定義する。比活
性をタンパク質１ｍｇあたりの単位と定義する。タンパ
ク質含量は牛血清アルブミンを標品として用いるブラッ
ドフォードの標準的な方法によって決定した。

【００５７】実施例５：酵素検定 ４-ペンテナールとグリシンの縮合反応から生成するＡ
ＨＨＡを高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を用い
て監視することによってＳＨＭＴの活性を決定した。総
体積１ｍｌの反応混合物は、５０ｍＭリン酸塩(ｐＨ７.
０)中に４５ｍＭペンテナール、１００ｍＭグリシン、
酵素の一部(０.００３ｍＭまで)および０.１ｍＭピリド
キサール５'-リン酸を含有する。この酵素反応液を穏や
かに振盪しながら１５℃で約２０〜１５０分間インキュ
ベートした。生成物の形成は酵素濃度と反応時間に対し
て１次であった。混合物の一部(通常２５μｌ)を０℃の
水で２０倍希釈し、直ちに塩化ダブシルで処理すること
によって酵素反応を停止した。ベックマンＯＤＳ-ＤＡ
ＢＳ ５μ Ｃ１８カラム(４.６ｍｍ×２５ｃｍ；Beckma
n Instruments,カリフォルニア州フラートン)を用い、
１.５ｍｌ／分の勾配溶出と４３６ｎｍにおける検出を
使って、ＡＨＨＡの塩化ダブシル誘導体をＨＰＬＣによ
って定量した。代表的な勾配溶出のために、緩衝液Ａ
(４.５％ジメチルホルムアミドおよび１４.５ｍＭクエ
ン酸ナトリウム(ｐＨ６.５))と緩衝液Ｂ(４.５％ジメチ
ルホルムアミド、４.５ｍＭクエン酸ナトリウムおよび
７０％アセトニトリル(ｐＨ６.５))から次の時間に従っ
て移動相を構築した：４３-５７％Ｂで７分間、５７％
Ｂで１分間、５７-１００％Ｂで４分間。酵素活性１単
位を、上記反応条件下で毎分１μｍｏｌのＡＨＨＡを形
成させるのに必要なＳＨＭＴの量と定義する。比活性は
１μＭのＳＨＭＴあたりの単位と定義する。タンパク質
含量は血清アルブミンを標品として用いるブラッドフォ
ード法によって決定した。上述の条件下で純粋なＳＨＭ
Ｔの比活性は約１０単位／μＭ ＳＨＭＴであった。

【００５８】実施例６：大腸菌ＳＨＭＴ の生産 ５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを加えたＬブロス中３０
℃で、所望の細胞密度に達するまで大腸菌ＲＶ３０８／
ｐＺＰ１-ｇｌｙＡ(Ｒｇｌｙ)を生育させることによっ
て、種ロットを調製した。滅菌条件下で１ｍｌをスクリ
ューキャップ凍結バイアルに移し、液体窒素の蒸気相で
保存した。この種ロットのバイアルを貯蔵器から取り出
し、５μｇ／ｍｌテトラサイクリンが入っているＬブロ
ス５０ｍｌを含む２つのフラスコにその内容物を等しく
移し、３０℃でインキュベートした。これらのフラスコ
の内容物を、改良Ｍ-９グルコース-塩培地を含有する５
０リットルの撹拌反応器に植菌した。この種容器を３０
℃、ｐＨ７.０に制御し、オフガス分析(off gas analys
is)が応分の細胞質量に達したことを示すまで５０％以
上のＯ₂を溶解した。次にこのブロスの一部を１５０リ
ットルのバイオリアクターに移した。細胞質量の蓄積相
の間、温度を３０℃に維持し、ｐＨをｐＨ７.０に制御
した。発酵変数が予定の設定値(各バイオリアクターの
気体移動特性によって決まる)に達した時に、発酵器の
温度を４１℃まで傾斜させた。この時点で組換えタンパ
ク質の合成が細菌細胞内で始まった。最終温度に到達す
る直前に、複合アミノ酸のスラリー(加水分解したカゼ
インなど)を大量に添加した。残りの発酵のために、グ
ルコースと複合アミノ酸スラリーを一定の速度で反応器
に添加した。添加レベルは生産相の間一貫して個々のア
ミノ酸のプールが与えられ、それが維持されるに足るレ
ベルとした。生産相の間一貫して温度とｐＨを制御し
た。溶存酸素や二酸化炭素発生速度などの発酵変数が溶
存酸素残量や二酸化炭素発生低下などの発酵目標が達成
されたことを示した時に、正しく折り畳まれた可溶性の
生成物を含有する細胞を収集した。１５０リットル発酵
器では、ＲｇｌｙがＤｇｌｙより良好に生育した(即ち
Ｒｇｌｙの方が総酵素活性が高かった)。

【００５９】実施例７：ＳＨＭＴの調製 Ａ．清澄化した洗浄細胞溶解液の調製 ＳＨＭＴ発酵で得た全細胞をシャープレス(Sharples)遠
心機を用いて収集し、等量のリン酸緩衝液(１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム(ｐＨ７.８)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ
ＰＬＰ)に再懸濁した。その細胞スラリーをガウリン・
プレス(gaulinpress)を用いてホモジナイズした。細胞
残渣を遠心分離によって除去した。上清を０.４５μｍ
フィルターを用いるミクロ濾過によってさらに清澄化し
た。３０キロダルトン分子量区分の限外フィルターを用
いてその溶液を約３０〜４０ｍｇ／ｍｌのＳＨＭＴ濃度
になるまで濃縮した。次に濃縮したＳＨＭＴ溶液を３ｍ
ＭＰＬＰの入った１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７.４)
５体積に対してダイアフィルトレーションした。この洗
浄細胞溶解液を０.４５μｍ濾過し、−２０℃で保存し
た。

【００６０】Ｂ．ＳＨＭＴのアニオン交換精製 細胞ペースト約１７キログラムをトリス緩衝液(５０ｍ
Ｍトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１ｍＬ ＰＬＰ(ｐＨ
７.８))に懸濁し、ガウリン・プレスを通して細胞を破
壊した。細胞残渣をシャープレス遠心機を用いる遠心分
離によって除去し、得られた上清をクノ・ゼタ・プラス
(Cuno Zeta Plus)フィルター(Cuno)を通して濾過した。
次にファスト・フロウ(Fast Flow)Ｑアニオン交換基盤
(Pharmacia Inc.)を詰めた４５×４６ｃｍカラムに清澄
化した溶液を充填した。次にこのカラムを６カラム体積
のトリス緩衝液で洗浄した。そのカラムをトリス緩衝液
中で９カラム体積の間に０から０.５Ｍ ＫＣｌに変化す
る直線的な塩勾配で溶出させた。分画を集め、ＳＤＳゲ
ル電気泳動、ＢＣＡ検定法(ビシンコニン酸，Pearce Ch
emicals,Inc.)による総タンパク質、活性を用いて特徴
づけた。適当な分画を合わせ、その本体を３０キロダル
トン分子量区分膜を用いて濃縮した。次にリン酸塩とＰ
ＬＰを含有する緩衝液５体積に対して濃縮したＳＨＭＴ
溶液をダイフィルトレーションした。そのＳＨＭＴ溶液
を０.４５μｍフィルターを通して濾過し、−２０℃で
保存した。

【００６１】実施例８：Ｌ-エリスロ-ＡＨＨＡの製造 １Ｍグリシン、１ｍＭピリドキサール５'-リン酸および
０.１ｍＭ ＳＨＭＴ(１０ｇ／リットル)を１５℃、ｐＨ
７.０の水中で混合した。グリシンに対して０.２７等量
の４-ペンテナールを５〜８時間かけて加えた。ＳＨＭ
Ｔは、全細胞(実施例６に記述の如く調製したもの)、清
澄化した洗浄細胞溶解液(実施例７Ａに記述の如く調製
したもの)もしくは実施例７Ｂに記述の如く１アニオン
交換精製段階によって精製したものの形態で反応液に加
えた。

【００６２】４-ペンテナールの添加が完了した１〜２
時間後に、反応収率は最大値に達した。この時点でｐＨ
を６.０に調節した。清澄化した洗浄細胞溶解液または
１段階クロマトグラフィー精製ＳＨＭＴを反応に使用し
た場合、３０キロダルトン分子量区分限外濾過膜でその
混合物を１／３〜１／４に濃縮し、次いで１ｍＭ ＰＬ
Ｐを含有する１０ｍＭリン酸塩(ｐＨ６.０)１体積で洗
浄した。生成物は限外濾過液中にあった。限外濾過膜に
よって保持される酵素は再生再利用することができる。
この製造法で全細胞を使用した場合には、遠心分離(３
５００ｒｐｍ，１０℃，１５分間)によって反応混合物
から細胞を分離した。細胞ペレットを再利用のために緩
衝液(典型的には２００〜１０００μＭ ＰＬＰ，１Ｍグ
リシン、５０ｍＭ ＫＰｉ(ｐＨ７))に再懸濁した。

【００６３】反応の生成物と過剰の基質を濾液または上
清から取り出し、全２-アミノ-３-ヒドロキシ酸定量の
ためのＤＡＢＳＹＬ法(Beckman Dabsylation Kit, 取り
扱い説明書,Beckman Instruments,Altex Division)によ
って分析した。Ｌ-エリスロ-ＡＨＨＡの４-ペンテナー
ルからの収率は７８〜８０％であり、異性体比は９３：
７〜９０：１０(エリスロ：スレオ)であった。５〜７％
の４-ペンテナールが未反応のままであった。スレオ体
の形成を最小化するために濃縮段階の間にｐＨを６.０
に調節した。ｐＨ６.０未満のｐＨは酵素を沈殿させ
た。

【００６４】実施例９：Ｌ-エリスロ-ＡＨＨＡの収率に
対するｐ Ｈ、温度およびＳＨＭＴ濃度の効果 ２００ｍＭグリシン、４０μＭ ＰＬＰ、５０ｍＭ ４-
ペンテナールを用いて、様々な温度、ｐＨおよびＳＨＭ
Ｔ濃度で縮合反応を行った。これらの反応はバッチ法で
行った。その結果を表１に示す。収率(％)は反応時間の
経過中に観測された最大値を表し、スレオ体率(％)は最
大収率時点におけるスレオ異性体のレベルを表す。表１
のデータは比較的中性のｐＨと低温が収率と立体選択性
を改善し、高いＳＨＭＴ濃度が収率を改善することを立
証している。

【表１】 [ＳＨＭＴ](μＭ) ｐＨ ℃ 収率(％) スレオ体率(％) １． １００ ８ １５ ７５ ４ ２． ２０ ８ １５ ６４ ４ ３． ２０ ７ １５ ８０ ４.５ ４． ２０ ７ ３５ ６２ １２

【００６５】実施例１０：Ｌ-エリス ロ-ＡＨＣＰＡの製
造 グリシン(２００ｍＭ)、ピリドキサール５'-リン酸(１
ｍＭ)およびＳＨＭＴ(０.０２ｍＭ)を水中で混合して１
７５ｍｌの体積にした。１Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを
７.０に調節した。その混合物を１５℃に冷却した。グ
リシンに対して０.２７等量の３-シアノプロパノールを
その混合物に加え、その一方でｐＨを７.０に、温度を
１５℃に維持した。反応を約３時間進行させた。実施例
８に記述したように生成物を取り出し、分析した。Ｌ-
エリスロ-ＡＨＣＰＡの３-シアノプロパノールからの収
率は５８％であり、異性体比は９８：２(エリスロ：ス
レオ)であった。

【００６６】

【配列表】

【００６７】配列番号：１ 配列の長さ：１４０６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 T ATG TTA AAG CGT GAA ATG AAC ATT GCC GAT TAT GAT GCC 40 GAA CTG TGG CAG GCT ATG GAG CAG GAA AAA GTA CGT CAG GAA 82 GAG CAC ATC GAA CTG ATC GCC TCC GAA AAC TAC ACC AGC CCC 124 CGC GTA ATG CAG GCG CAG GGT TCT CAG CTG ACC AAC AAA TAT 166 GCT GAA GGT TAT CCG GGC AAA CGC TAC TAC GGC GGT TGC GAG 208 TAT GTT GAT ATC GTT GAA CAA CTG GCG ATC GAT CGT GCG AAA 250 GAA CTG TTC GGC GCT GAC TAC GCT AAC GTC CAG CCG CAC TCC 292 GGC TCC CAG GCT AAC TTT GCG GTC TAC ACC GCG CTG CTG GAA 334 CCA GGT GAT ACC GTT CTG GGT ATG AAC CTG GCG CAT GGC GGT 376 CAC CTG ACT CAC GGT TCT CCG GTT AAC TTC TCC GGT AAA CTG 418 TAC AAC ATC GTT CCT TAC GGT ATC GAT GCT ACC GGT CAT ATC 460 GAC TAC GCC GAT CTG GAA AAA CAA GCC AAA GAA CAC AAG CCG 502 AAA ATG ATT ATC GGT GGT TTC TCT GCA TAT TCC GGC GTG GTG 544 GAC TGG GCG AAA ATG CGT GAA ATC GCT GAC AGC ATC GGT GCT 586 TAC CTG TTC GTT GAT ATG GCG CAC GTT GCG GGC CTG GTT GCT 628 GCT GGC GTC TAC CCG AAC CCG GTT CCT CAT GCT CAC GTT GTT 670 ACT ACC ACC ACT CAC AAA ACC CTG GCG GGT CCG CGC GGC GGC 712 CTG ATC CTG GCG AAA GGT GGT AGC GAA GAG CTG TAC AAA AAA 754 CTG AAC TCT GCC GTT TTC CCT GGT GGT CAG GGC GGT CCG TTG 796 ATG CAC GTA ATC GCC GGT AAA GCG GTT GCT CTG AAA GAA GCG 838 ATG GAG CCT GAG TTC AAA ACT TAC CAG CAG CAG GTC GCT AAA 880 AAC GCT AAA GCG ATG GTA GAA GTG TTC CTC GAG CGC GGC TAC 922 AAA GTG GTT TCC GGC GGC ACT GAT AAC CAC CTG TTC CTG GTT 964 GAT CTG GTT GAT AAA AAC CTG ACC GTT AAA GAA GCA GAC GCC 1006 GCT CTG GGC CGT GCT AAC ATC ACC GTC AAC AAA AAC AGC GTA 1048 CCG AAC GAT CCG AAG AGC CCG TTT GTG ACC TCC GGT ATT CGT 1090 GTA GGT ACT CCG GCG ATT ACC CGT CGC GGC TTT AAA GAA GCC 1132 GAA GCG AAA GAA CTG GCT GGC TGG ATG TGT GAC GTG CTG GAC 1174 AGC ATC AAT GAT GAA GCC GTT ATC GAG CGC ATC AAA GGT AAA 1216 GTT CTC GAC ATC TGC GCA CGT TAC CCG GTT TAC GCA 1252 TAAGCGAAAC GGTGATTTGC TGTCAATGTG CTCGTTGTTC ATGCCGGATG 1302 CGGCGTGAAC GCCTTATCCG GCCTACAAAA CTTTGCAAAT TCAATATATT 1352 GCAATCTCCG TGTAGGCCTG ATAAGCGTAG CGCATCAGGC AATTTTTCGT 1402 TTAT 1406

【００６８】配列番号：２ 配列の長さ：１４０８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GATCATAAAC GAAAAATTGC CTGATGCGCT ACGCTTATCA GGCCTACACG 50 GAGATTGCAA TATATTGAAT TTGCAAAGTT TTGTAGGCCG GATAAGGCAT 100 TCACGCCGCA TCCGGCATGA ACAACGAGCA CATTGACAGC AAATCACCGT 150 TTCGCTTATG CGTAAACCGG GTAACGTGCG CAGATGTCGA GAACTTTACC 200 TTTGATGCGC TCGATAACGG CTTCATCATT GATGCTGTCC AGCTCGTCAC 250 ACATCCAGCC AGCCAGTTCT TTCGCTTCGG CTTCTTTAAA GCCGCGACGG 300 GTAATCGCCG GAGTACCTAC ACGAATACCG GAGGTCACAA ACGGGCTCTT 350 CGGATCGTTC GGTGCGCTGT TTTTGTTGAC GGTGATGTTA GCACGGCCCA 400 GAGCGGCGTC TGCTTCTTTA ACAATCAGGT TTTTATCAAC CAGATCAACC 450 AGGAACAGGT GGTTATCAGT GCCGCCGGAA ACCACTTTGT AGCCGCGCTC 500 GAGGAACACT TCTACCATCG CTTTAGCGTT TTTAGCGACC TGCTGCTGGT 550 AAGTTTTGAA CTCAGGCTCC ATCGCTTCTT TCAGAGCAAC CGCTTTACCG 600 GCGATTACGT GCATCAACGG ACCGCCCTGA CCACCAGGGA AAACGGCAGA 650 GTTCAGTTTT TTGTACAGCT CTTCGCTACC ACCTTTCGCC AGGATCAGGC 700 CGCCGCGCGG ACCCGCCAGG GTTTTGTGAG TGGTGGTAGT AACAACGTGA 750 GCATGAGGAA CCGGGTTCGG GTAGACGCCA GCAGCAACCA GGCCCGCAAC 800 GTGCGCCATA TCAACGAACA GGTAAGCACC GATGCTGTCA GCGATTTCAC 850 GCATTTTCGC CCAGTCCACC ACGCCGGAAT ATGCAGAGAA ACCACCGATA 900 ATCATTTTCG GCTTGTGTTC TTTGGCTTGT TTTTCCAGAT CGGCGTAGTC 950 GATATGACCG GTAGCATCGA TACCGTAAGG AACGATGTTG TACAGTTTAC 1000 CGGAGAAGTT AACCGGAGAA CCGTGAGTCA GGTGTCCGCC ATGCGCCAGG 1050 TTCATACCCA GAACGGTATC ACCTGGTTCC AGCAGCGCGG TGTAGACCGC 1100 AAAGTTAGCC TGGGAGCCGG AGTGCGGCTG GACGTTAGCG TAGTCAGCGC 1150 CGAACAGTTC TTTCGCACGA TCGATCGCCA GTTGTTCAAC GATATCAACA 1200 TACTCGCAAC CGCCGTAGTA GCGTTTGCCC GGATAACCTT CAGCATATTT 1250 GTTGGTCAGC TGAGAACCCT GCGCCTGCAT TACGCGGGGG CTGGTGTAGT 1300 TTTCGGAGGC GATCAGTTCG ATGTGCTCTT CCTGACGTAC TTTTTCCTGC 1350 TCCATAGCCT GCCAGACTTC GGCATCATAA TCGGCAATGT TCATTTCACG 1400 CTTTAACA 1408

【００６９】配列番号：３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GATGCATATGTTAAAGCGTGAAATGA 26

【００７０】配列番号：４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＣＣＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＧＡＧ １５

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドｐＧＳ２９の制限酵素部位および
機能地図である（図面に記載の制限酵素部位と機能地図
は各組換えＤＮＡベクターの模式図である。制限部位の
情報は総括的なものではなく、ある型の制限酵素部位は
地図上に実際に記載されている以上に存在し得る。以下
同様)。

【図２】 プラスミドｐＨＫＹ３９０の制限酵素部位お
よび機能地図である。

【図３】 プラスミドｐＶ-ｐｃｒＢの制限酵素部位お
よび機能地図である。

【図４】 プラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡの制限酵素部
位および機能地図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ロバート・ジェイムズ・ガザック アメリカ合衆国46201インディアナ州イン ディアナポリス、イースト・ロブソン・ス トリート2821番 (72)発明者 アダム・ジョゼフ・クロイツマン アメリカ合衆国46142インディアナ州グリ ーンウッド、ウィロー・ウィンド・ドライ ブ4183番 (72)発明者 ユージーン・ポール・クレフ アメリカ合衆国46033インディアナ州カー メル、オクスフォード・プレイス4772番 (72)発明者 スティーブン・ワイアット・クイーナー アメリカ合衆国46208インディアナ州イン ディアナポリス、メルボルン・ロード・イ ースト・ドライブ4270番 (72)発明者 ジェフリー・トーマス・ビチェンツィ アメリカ合衆国46220インディアナ州イン ディアナポリス、ブロークンハースト・ロ ード6407番 (72)発明者 ウ−クァン・イェ アメリカ合衆国46142インディアナ州グリ ーンウッド、プリムローズ・コート720番 (72)発明者 ジョゼフ・マーティン・ゾック アメリカ合衆国46143インディアナ州グリ ーンウッド、ウエスト・スモーキー・ロ ウ・ロード5755番

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式： 【化１】 [ＲはＣ₃〜Ｃ₆アルケニル、Ｃ₂〜Ｃ₆アルデヒド、Ｃ₃〜
   Ｃ₆アルキニル、フェニルまたはフリルを表すか、もし
   くはエステル化されたカルボキシ、Ｃ₁〜Ｃ₆アルコキ
   シ、ヒドロキシ、ハロまたはシアノで置換されたＣ₂〜
   Ｃ₆アルキルを表す]で示される２-アミノ-３-ヒドロキ
   シ酸を製造する方法であって、ｐＨが約６.０ないし約
   ８.０の水性溶液中で約０℃ないし約２５℃の温度で、
   式：ＲＣＨＯ(ここにＲは上記と同意義である)で示され
   るアルデヒドおよびグリシンを大腸菌セリン-ヒドロキ
   シメチルトランスフェラーゼと、ピリドキサール５'-リ
   ン酸の存在下で反応させることからなる方法。
2. 【請求項２】 ＲＣＨＯで示されるアルデヒドのＲが、
   エステル化されたカルボキシ、Ｃ₁〜Ｃ₆アルコキシ、ヒ
   ドロキシ、ハロまたはシアノで置換されたＣ₂〜Ｃ₆アル
   キルおよびＣ₃〜Ｃ₆アルケニルからなる群から選択され
   る請求項１の方法。
3. 【請求項３】 ＲＣＨＯで示されるアルデヒドがコハク
   酸セミアルデヒドメチルエステル、コハク酸セミアルデ
   ヒドエチルエステル、３-シアノプロパナールおよび４-
   ペンテナールからなる群から選択される請求項１の方
   法。