JPH10229881A - コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させる配列を有するｄｎａ - Google Patents
コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させる配列を有するｄｎａInfo
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- JPH10229881A JPH10229881A JP9035338A JP3533897A JPH10229881A JP H10229881 A JPH10229881 A JP H10229881A JP 9035338 A JP9035338 A JP 9035338A JP 3533897 A JP3533897 A JP 3533897A JP H10229881 A JPH10229881 A JP H10229881A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させ
る。 【解決手段】コリネ型細菌由来の１６ＳリボソームＲＮ
Ａの３’末端の１〜１２番目の塩基配列と少なくとも６
塩基が相補的である６〜１２塩基のｒＲＮＡ相補的塩基
配列を、翻訳させるべき蛋白質の翻訳開始コドンの４〜
１６塩基上流に置く。
る。 【解決手段】コリネ型細菌由来の１６ＳリボソームＲＮ
Ａの３’末端の１〜１２番目の塩基配列と少なくとも６
塩基が相補的である６〜１２塩基のｒＲＮＡ相補的塩基
配列を、翻訳させるべき蛋白質の翻訳開始コドンの４〜
１６塩基上流に置く。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、コリネ型細菌にお
いて、蛋白質の翻訳を効率よく行わせるＤＮＡ配列に関
する。さらに詳しくは、細胞の中でｍＲＮＡが転写され
た後、リボソームが結合し、蛋白質の翻訳が開始される
が、このリボソームの認識、結合をより効率的に行わ
せ、その結果、蛋白質の発現量を増大させるＤＮＡ配列
に関するものである。また、該ＤＮＡ配列を有するプラ
スミドにも関する。
いて、蛋白質の翻訳を効率よく行わせるＤＮＡ配列に関
する。さらに詳しくは、細胞の中でｍＲＮＡが転写され
た後、リボソームが結合し、蛋白質の翻訳が開始される
が、このリボソームの認識、結合をより効率的に行わ
せ、その結果、蛋白質の発現量を増大させるＤＮＡ配列
に関するものである。また、該ＤＮＡ配列を有するプラ
スミドにも関する。
【０００２】
【従来の技術】これまで、種々の有用蛋白質が微生物を
用いて生産されてきており、その一般的手法については
既に確立されている。しかし、個々の微生物（属）にお
ける、特定の蛋白質の効率的生産方法については改良の
余地が残されている。
用いて生産されてきており、その一般的手法については
既に確立されている。しかし、個々の微生物（属）にお
ける、特定の蛋白質の効率的生産方法については改良の
余地が残されている。
【０００３】組み換えＤＮＡ技術を用いて、有用蛋白質
を生産させる場合、様々の要因が、その生産性に影響を
及ばす。中でも、有用蛋白質をコードする遺伝子の転写
促進に関与するプロモーターと、ｍＲＮＡの、１６Ｓリ
ボソームＲＮＡの３’末端配列と相補的に結合して翻訳
促進に関与するＳＤ配列が大きな要因となる。
を生産させる場合、様々の要因が、その生産性に影響を
及ばす。中でも、有用蛋白質をコードする遺伝子の転写
促進に関与するプロモーターと、ｍＲＮＡの、１６Ｓリ
ボソームＲＮＡの３’末端配列と相補的に結合して翻訳
促進に関与するＳＤ配列が大きな要因となる。
【０００４】蛋白質の翻訳においては、翻訳開始コドン
の上流に存在するＳＤ配列と１６ＳリボソームＲＮＡの
３’末端との相補性［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7
1, p1342 (1974), Nucleic Acid Research, 22, p1287
(1994)］、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離［Molecu
lar Microbiology, 6, p1219 (1992), Nucleic AcidRes
earch, 22, p4953 (1994)］、ＳＤ配列上流の配列［Nuc
leic Acid Research,14, p5481 (1986), GENE, 73, p22
7 (1988)］、及び、翻訳開始コドン下流の配列［EMBO
J., 6, p2489 (1987)］が影響を与えることが知られて
いる。
の上流に存在するＳＤ配列と１６ＳリボソームＲＮＡの
３’末端との相補性［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7
1, p1342 (1974), Nucleic Acid Research, 22, p1287
(1994)］、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離［Molecu
lar Microbiology, 6, p1219 (1992), Nucleic AcidRes
earch, 22, p4953 (1994)］、ＳＤ配列上流の配列［Nuc
leic Acid Research,14, p5481 (1986), GENE, 73, p22
7 (1988)］、及び、翻訳開始コドン下流の配列［EMBO
J., 6, p2489 (1987)］が影響を与えることが知られて
いる。
【０００５】しかしながら、産業上重要なコリネ型細菌
における、蛋白質の効率的な翻訳に関する配列について
は、本発明者等の知る限り従来の報告例はない。
における、蛋白質の効率的な翻訳に関する配列について
は、本発明者等の知る限り従来の報告例はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、有用蛋
白質を細胞内で効率的に翻訳させ、大量に発現させるた
めには、翻訳開始コドン周辺の配列、特に、ＳＤ配列の
塩基配列、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離、ＳＤ上
流の塩基配列が重要である。ところが、コリネ型細菌に
ついての知見はなく、工業的に重要なコリネ型細菌での
検討はされていない。
白質を細胞内で効率的に翻訳させ、大量に発現させるた
めには、翻訳開始コドン周辺の配列、特に、ＳＤ配列の
塩基配列、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離、ＳＤ上
流の塩基配列が重要である。ところが、コリネ型細菌に
ついての知見はなく、工業的に重要なコリネ型細菌での
検討はされていない。
【０００７】本発明は、コリネ型細菌内において、有用
蛋白質の翻訳を効率的に行わせ、該蛋白質を細胞内で大
量に発現させるために必要な配列の提供を目的とする。
蛋白質の翻訳を効率的に行わせ、該蛋白質を細胞内で大
量に発現させるために必要な配列の提供を目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌内
で蛋白質の翻訳を効率的に行わせる配列を見いだした。
すなわち、ＳＤ配列の改変、ＳＤ配列上流配列の改変、
ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離の改変により、蛋白
質の翻訳を効率的に行わせる配列を見い出し、本発明を
完成するに至った。
を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌内
で蛋白質の翻訳を効率的に行わせる配列を見いだした。
すなわち、ＳＤ配列の改変、ＳＤ配列上流配列の改変、
ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離の改変により、蛋白
質の翻訳を効率的に行わせる配列を見い出し、本発明を
完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明は、コリネ型細菌由来の
１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端の１〜１２番目の塩
基配列と少なくとも６塩基が相補的である６〜１２塩基
のｒＲＮＡ相補的塩基配列を有する、コリネ型細菌内で
蛋白質を効率よく翻訳させるための組換えＤＮＡ（以
下、本発明ＤＮＡともいう）を提供する。
１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端の１〜１２番目の塩
基配列と少なくとも６塩基が相補的である６〜１２塩基
のｒＲＮＡ相補的塩基配列を有する、コリネ型細菌内で
蛋白質を効率よく翻訳させるための組換えＤＮＡ（以
下、本発明ＤＮＡともいう）を提供する。
【００１０】好ましくは、本発明ＤＮＡは前記ｒＲＮＡ
相補的塩基配列の上流側に連結されたＡＴ含量が７５％
以上である１〜３０塩基の高ＡＴ含量塩基配列をさらに
有する。高ＡＴ含量塩基配列としては、配列番号３７に
示される塩基配列が挙げられる。
相補的塩基配列の上流側に連結されたＡＴ含量が７５％
以上である１〜３０塩基の高ＡＴ含量塩基配列をさらに
有する。高ＡＴ含量塩基配列としては、配列番号３７に
示される塩基配列が挙げられる。
【００１１】また、好ましくは、本発明ＤＮＡは、以下
の工程から成る測定法で測定したときのベータガラクト
シダーゼ活性が、配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡ
と同等またはそれ以上である。 (1) 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子と、前
記遺伝子に連結したｔａｃプロモーターと、前記ベータ
ガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンとｔａｃプロモー
ターの間に配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡまたは
測定対象のＤＮＡとを有するプラスミドを調製する。 (2) 前記プラスミドをブレビバクテリウム・フラバム(B
revibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７）に導入する。 (3) 導入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３を培養する。 (4) 得られた培養液について、ベータガラクトシダーゼ
活性を測定する。
の工程から成る測定法で測定したときのベータガラクト
シダーゼ活性が、配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡ
と同等またはそれ以上である。 (1) 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子と、前
記遺伝子に連結したｔａｃプロモーターと、前記ベータ
ガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンとｔａｃプロモー
ターの間に配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡまたは
測定対象のＤＮＡとを有するプラスミドを調製する。 (2) 前記プラスミドをブレビバクテリウム・フラバム(B
revibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７）に導入する。 (3) 導入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３を培養する。 (4) 得られた培養液について、ベータガラクトシダーゼ
活性を測定する。
【００１２】このようなＤＮＡの例としては、配列番号
２９〜３６及び３８〜４５に示される塩基配列が挙げら
れる。本発明ＤＮＡを用いるのに好ましいコリネ型細菌
は、ブレビバクテリウム・フラバム (Brevibacterium f
lavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）であ
る。
２９〜３６及び３８〜４５に示される塩基配列が挙げら
れる。本発明ＤＮＡを用いるのに好ましいコリネ型細菌
は、ブレビバクテリウム・フラバム (Brevibacterium f
lavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）であ
る。
【００１３】また、本発明は、本発明ＤＮＡを含み、ｒ
ＲＮＡ相補的塩基配列が、発現されるべき蛋白質の翻訳
開始コドンの４〜１６塩基上流に置かれているコリネ型
細菌内で複製可能なプラスミドを提供する。
ＲＮＡ相補的塩基配列が、発現されるべき蛋白質の翻訳
開始コドンの４〜１６塩基上流に置かれているコリネ型
細菌内で複製可能なプラスミドを提供する。
【００１４】かくして本発明によれば、コリネ型細菌内
において、有用蛋白質の翻訳を効率的に行わせ、該蛋白
質を大量に発現させるために必要なＤＮＡ及び該ＤＮＡ
を有するプラスミドが提供される。
において、有用蛋白質の翻訳を効率的に行わせ、該蛋白
質を大量に発現させるために必要なＤＮＡ及び該ＤＮＡ
を有するプラスミドが提供される。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明についてさらに詳細
に説明する。 ＜１＞本発明ＤＮＡ 本発明ＤＮＡは、コリネ型細菌由来の１６Ｓリボソーム
ＲＮＡの３’末端の１〜１２番目の塩基配列と少なくと
も６塩基が相補的である６〜１２塩基のｒＲＮＡ相補的
塩基配列を有する、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく
翻訳させるための組換えＤＮＡである。本明細書におい
て上記のｒＲＮＡ相補的塩基配列を有するＤＮＡとは、
そのＤＮＡが転写されて生じたＲＮＡの塩基配列が１６
ＳリボゾームＲＮＡの３’末端の塩基配列と相補的であ
る塩基配列を有するＤＮＡを意味するものである。ま
た、相補的な塩基は、その５つ以上が連続していること
が好ましい。
に説明する。 ＜１＞本発明ＤＮＡ 本発明ＤＮＡは、コリネ型細菌由来の１６Ｓリボソーム
ＲＮＡの３’末端の１〜１２番目の塩基配列と少なくと
も６塩基が相補的である６〜１２塩基のｒＲＮＡ相補的
塩基配列を有する、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく
翻訳させるための組換えＤＮＡである。本明細書におい
て上記のｒＲＮＡ相補的塩基配列を有するＤＮＡとは、
そのＤＮＡが転写されて生じたＲＮＡの塩基配列が１６
ＳリボゾームＲＮＡの３’末端の塩基配列と相補的であ
る塩基配列を有するＤＮＡを意味するものである。ま
た、相補的な塩基は、その５つ以上が連続していること
が好ましい。
【００１６】ｒＲＮＡ相補的塩基配列の具体例として
は、配列番号２９〜３６に示される塩基配列が挙げられ
る。好ましくは、本発明ＤＮＡは前記ｒＲＮＡ相補的塩
基配列の上流側に連結されたＡＴ含量が７５％以上、好
ましくは８５％以上である１〜３０塩基、好ましくは２
０〜３０塩基の高ＡＴ含量塩基配列をさらに有する。高
ＡＴ含量塩基配列の具体例としては、配列番号３７に示
される塩基配列が挙げられる。
は、配列番号２９〜３６に示される塩基配列が挙げられ
る。好ましくは、本発明ＤＮＡは前記ｒＲＮＡ相補的塩
基配列の上流側に連結されたＡＴ含量が７５％以上、好
ましくは８５％以上である１〜３０塩基、好ましくは２
０〜３０塩基の高ＡＴ含量塩基配列をさらに有する。高
ＡＴ含量塩基配列の具体例としては、配列番号３７に示
される塩基配列が挙げられる。
【００１７】本発明ＤＮＡは、配列が上記の条件を満た
すように決定されれば、通常用いられるＤＮＡ合成装
置、例えば、アプライド・バイオシステムズ(Applied B
iosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを
用いて合成することができる。
すように決定されれば、通常用いられるＤＮＡ合成装
置、例えば、アプライド・バイオシステムズ(Applied B
iosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを
用いて合成することができる。
【００１８】あるいは、コリネ型細菌由来の１６Ｓリボ
ソームＲＮＡあるいは、細胞内で比較的発現量の多い種
々の遺伝子上流、例えば、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｄｎ
ａＡ、ａｓｐａｒｔａｓｅ、ｓｅｃＡ等の遺伝子上流か
らクローニングすることもできる。その供給源となる微
生物として、コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウ
ム・フラバム（Brevibacterium flavum) ＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、ブレビバクテリウム・
アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、
ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ
１３７４６、ブレビバクテリウム・デバリカタム（Brev
ibacterium devaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium
lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテ
リウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
ＡＴＣＣ３１８３１等を用いることができる。
ソームＲＮＡあるいは、細胞内で比較的発現量の多い種
々の遺伝子上流、例えば、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｄｎ
ａＡ、ａｓｐａｒｔａｓｅ、ｓｅｃＡ等の遺伝子上流か
らクローニングすることもできる。その供給源となる微
生物として、コリネ型細菌、例えば、ブレビバクテリウ
ム・フラバム（Brevibacterium flavum) ＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）、ブレビバクテリウム・
アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、
ＡＴＣＣ６８７１、同ＡＴＣＣ１３７４５、同ＡＴＣＣ
１３７４６、ブレビバクテリウム・デバリカタム（Brev
ibacterium devaricatum）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビ
バクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium
lactofermentum）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテ
リウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）
ＡＴＣＣ３１８３１等を用いることができる。
【００１９】これらの供給源微生物から本発明ＤＮＡを
調製するための基本操作の一例を述べれば次のとおりで
ある。まず、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｄｎａＡ、ａｓｐ
ａｒｔａｓｅ、ｓｅｃＡ等の遺伝子を、上記コリネ型細
菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibac
terium flavum）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）株の染色体の中から、通常遺伝子を単離する方
法、すなわち、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、相
補、等の方法で分離・取得し、目的遺伝子を含む断片を
単離し、単離した断片の塩基配列を決定し、翻訳開始コ
ドンを同定することにより、その翻訳開始コドンの上流
の配列が判明する。この判明した配列に基づいて本発明
ＤＮＡを合成するか、または、単離した断片から、適切
な制限酵素を用いて本発明ＤＮＡを切り出すことができ
る。
調製するための基本操作の一例を述べれば次のとおりで
ある。まず、ｄｎａＫ、ｇｒｏＥＬ、ｄｎａＡ、ａｓｐ
ａｒｔａｓｅ、ｓｅｃＡ等の遺伝子を、上記コリネ型細
菌、例えば、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibac
terium flavum）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４
９７）株の染色体の中から、通常遺伝子を単離する方
法、すなわち、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、相
補、等の方法で分離・取得し、目的遺伝子を含む断片を
単離し、単離した断片の塩基配列を決定し、翻訳開始コ
ドンを同定することにより、その翻訳開始コドンの上流
の配列が判明する。この判明した配列に基づいて本発明
ＤＮＡを合成するか、または、単離した断片から、適切
な制限酵素を用いて本発明ＤＮＡを切り出すことができ
る。
【００２０】本発明ＤＮＡは、発現されるべき蛋白質の
翻訳開始コドンの所定塩基上流に置かれたとき、その蛋
白質の翻訳を効率的に行わせる。すなわち、本発明ＤＮ
Ａは、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させる機
能が高いものである。本発明ＤＮＡの機能の評価は、該
ＤＮＡにより発現される下流に位置する蛋白質が活性等
を有する場合には、その活性等を測定することにより行
うことができる。
翻訳開始コドンの所定塩基上流に置かれたとき、その蛋
白質の翻訳を効率的に行わせる。すなわち、本発明ＤＮ
Ａは、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させる機
能が高いものである。本発明ＤＮＡの機能の評価は、該
ＤＮＡにより発現される下流に位置する蛋白質が活性等
を有する場合には、その活性等を測定することにより行
うことができる。
【００２１】下流に位置する蛋白質としては、例えば、
ベータガラクトシダーゼ遺伝子が挙げられ、該遺伝子を
Ａ断片の下流に連結することにより、ベータガラクトシ
ダーゼ活性を指標にしてその翻訳効率を測定することが
できる。
ベータガラクトシダーゼ遺伝子が挙げられ、該遺伝子を
Ａ断片の下流に連結することにより、ベータガラクトシ
ダーゼ活性を指標にしてその翻訳効率を測定することが
できる。
【００２２】例えば、本発明ＤＮＡは、以下の工程から
成る測定法で測定したときのベータガラクトシダーゼ活
性が、配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡと同等また
はそれ以上となるものである。 (1) 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子と、前
記遺伝子に連結したｔａｃプロモーターと、前記ベータ
ガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンとｔａｃプロモー
ターの間に配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡまたは
測定対象のＤＮＡとを有するプラスミドを調製する。 (2) 前記プラスミドをブレビバクテリウム・フラバム(B
revibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７）に導入する。 (3) 導入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３を培養する。 (4) 得られた培養液について、ベータガラクトシダーゼ
活性を測定する。
成る測定法で測定したときのベータガラクトシダーゼ活
性が、配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡと同等また
はそれ以上となるものである。 (1) 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子と、前
記遺伝子に連結したｔａｃプロモーターと、前記ベータ
ガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンとｔａｃプロモー
ターの間に配列番号３４に示す塩基配列のＤＮＡまたは
測定対象のＤＮＡとを有するプラスミドを調製する。 (2) 前記プラスミドをブレビバクテリウム・フラバム(B
revibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７）に導入する。 (3) 導入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３を培養する。 (4) 得られた培養液について、ベータガラクトシダーゼ
活性を測定する。
【００２３】より具体的には、本発明ＤＮＡは、以下の
工程から成る測定法で測定したときに、ベータガラクト
シダーゼ活性が３５０Ｕ以上となるものである。 (1) 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子、前記
遺伝子に連結したｔａｃプロモーター、及び、プラスミ
ドｐｇａｌの前記ベータガラクトシダーゼ遺伝子の開始
コドンとｔａｃプロモーターの間であって、開始コドン
から１０塩基上流に上記ＤＮＡを有するプラスミドを調
製する。 (2) 調製したプラスミドをブレビバクテリウム・フラバ
ム(Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）に導入する。 (3) 導入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３を、１０ｍｌの半合成培地〔組成：尿素２ｇ、（Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０. ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4
０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス
２. ５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸
チアミン２００μｇ、及び、グルコース２０ｇを蒸留水
１Ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６
時間前培養を行い、この前培養の培養液を同半合成培地
に２％植菌して３１℃で５時間培養する。 (4) この培養液について、ベータガラクトシダーゼ活性
を、Experiments in Molecular Genetics, ed. by J.H.
Miller (1977), chapter 48, p. 352-355に記載の方法
により測定する。すなわち、培養液のＯＤを波長６００
ｎｍで測定した後、培養液を１０〜１００μｌサンプリ
ングし、ベータガラクトシダーゼ活性測定用バッファ
〔６０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４０ｍＭリン酸二
水素ナトリウム、１０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ硫酸マ
グネシウム、５０ｍＭベータメルカプトエタノール、ｐ
Ｈ７．０〕を添加し、全体を１ｍｌにする。トルエンを
０．１％添加し、３０秒間激しく攪拌した後、３７℃で
４５分間放置し、トルエンを蒸発させる。次いで、２８
℃の恒温槽に移し、５分間放置することにより、液温を
反応温度に合わせる。基質であるＯＮＰＧ〔オルトニト
ロフェノールベータガラクトシド）溶液（ＯＮＰＧ４ｍ
ｇを１ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．
０）に溶解させたもの〕を０．２ｍｌ添加し、反応を開
始させる。１〜１０分経過し、反応液に着色が認められ
たら、０．５ｍｌの１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を添加し、
反応を終了させる。吸光度計にて波長４２０ｎｍおよび
５５０ｎｍのおける吸光度（ＯＤ）を測定し、活性を下
記式により算出する。
工程から成る測定法で測定したときに、ベータガラクト
シダーゼ活性が３５０Ｕ以上となるものである。 (1) 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子、前記
遺伝子に連結したｔａｃプロモーター、及び、プラスミ
ドｐｇａｌの前記ベータガラクトシダーゼ遺伝子の開始
コドンとｔａｃプロモーターの間であって、開始コドン
から１０塩基上流に上記ＤＮＡを有するプラスミドを調
製する。 (2) 調製したプラスミドをブレビバクテリウム・フラバ
ム(Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ
ＢＰ−１４９７）に導入する。 (3) 導入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３を、１０ｍｌの半合成培地〔組成：尿素２ｇ、（Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4 ７ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ０. ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4
０．５ｇ、ＭｇＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ
６ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス
２. ５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸
チアミン２００μｇ、及び、グルコース２０ｇを蒸留水
１Ｌに溶解した〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６
時間前培養を行い、この前培養の培養液を同半合成培地
に２％植菌して３１℃で５時間培養する。 (4) この培養液について、ベータガラクトシダーゼ活性
を、Experiments in Molecular Genetics, ed. by J.H.
Miller (1977), chapter 48, p. 352-355に記載の方法
により測定する。すなわち、培養液のＯＤを波長６００
ｎｍで測定した後、培養液を１０〜１００μｌサンプリ
ングし、ベータガラクトシダーゼ活性測定用バッファ
〔６０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、４０ｍＭリン酸二
水素ナトリウム、１０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ硫酸マ
グネシウム、５０ｍＭベータメルカプトエタノール、ｐ
Ｈ７．０〕を添加し、全体を１ｍｌにする。トルエンを
０．１％添加し、３０秒間激しく攪拌した後、３７℃で
４５分間放置し、トルエンを蒸発させる。次いで、２８
℃の恒温槽に移し、５分間放置することにより、液温を
反応温度に合わせる。基質であるＯＮＰＧ〔オルトニト
ロフェノールベータガラクトシド）溶液（ＯＮＰＧ４ｍ
ｇを１ｍｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．
０）に溶解させたもの〕を０．２ｍｌ添加し、反応を開
始させる。１〜１０分経過し、反応液に着色が認められ
たら、０．５ｍｌの１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を添加し、
反応を終了させる。吸光度計にて波長４２０ｎｍおよび
５５０ｎｍのおける吸光度（ＯＤ）を測定し、活性を下
記式により算出する。
【００２４】
【数１】活性（Ｕ）＝（ＯＤ420−１．７５×ＯＤ550）
／（測定時間（分）×ＯＤ600）×１０００
／（測定時間（分）×ＯＤ600）×１０００
【００２５】このようなＤＮＡの例としては、配列番号
２９〜３６及び３８〜４５に示される塩基配列が挙げら
れる。なお、本発明ＤＮＡは、蛋白質を効率よく翻訳す
なわち発現させるために、染色体上の発現されるべき蛋
白質の翻訳開始コドンの所定塩基上流に置いてもよい
し、また、プラスミド上の発現されるべき蛋白質の翻訳
開始コドンの所定塩基上流に置いてもよい。本発明ＤＮ
Ａを所定位置に置くことすなわち組み込むことは、ＤＮ
Ａ断片を染色体またはプラスミドの所望の位置に組み込
むための公知の方法によって行うことができる。
２９〜３６及び３８〜４５に示される塩基配列が挙げら
れる。なお、本発明ＤＮＡは、蛋白質を効率よく翻訳す
なわち発現させるために、染色体上の発現されるべき蛋
白質の翻訳開始コドンの所定塩基上流に置いてもよい
し、また、プラスミド上の発現されるべき蛋白質の翻訳
開始コドンの所定塩基上流に置いてもよい。本発明ＤＮ
Ａを所定位置に置くことすなわち組み込むことは、ＤＮ
Ａ断片を染色体またはプラスミドの所望の位置に組み込
むための公知の方法によって行うことができる。
【００２６】本発明ＤＮＡは、特に、ブレビバクテリウ
ム・フラバム (Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）において、蛋白質を効率
よく翻訳させることができる。
ム・フラバム (Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４９７）において、蛋白質を効率
よく翻訳させることができる。
【００２７】本発明ＤＮＡは、二本鎖および一本鎖のい
ずれの形態であってもよい。
ずれの形態であってもよい。
【００２８】＜２＞本発明プラスミド また、本発明は、本発明ＤＮＡを含み、ｒＲＮＡ相補的
塩基配列が、発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの
４〜１６塩基上流に置かれているコリネ型細菌内で複製
可能なプラスミドを提供する。なお、４〜１６塩基上流
とは、本発明ＤＮＡのｒＲＮＡ相補的配列と翻訳開始コ
ドンの間に４〜１６塩基のスペーサー塩基配列があるこ
とを意味する。
塩基配列が、発現されるべき蛋白質の翻訳開始コドンの
４〜１６塩基上流に置かれているコリネ型細菌内で複製
可能なプラスミドを提供する。なお、４〜１６塩基上流
とは、本発明ＤＮＡのｒＲＮＡ相補的配列と翻訳開始コ
ドンの間に４〜１６塩基のスペーサー塩基配列があるこ
とを意味する。
【００２９】ＤＮＡ断片をプラスミドの所望の位置に組
み込む方法は公知であり、公知の方法に従って、コリネ
型細菌内で複製可能なプラスミドに、発現されるべき蛋
白質の翻訳開始コドンの所定塩基対上流に本発明ＤＮＡ
を組み込むことによって本発明プラスミドを得ることが
できる。
み込む方法は公知であり、公知の方法に従って、コリネ
型細菌内で複製可能なプラスミドに、発現されるべき蛋
白質の翻訳開始コドンの所定塩基対上流に本発明ＤＮＡ
を組み込むことによって本発明プラスミドを得ることが
できる。
【００３０】コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドに
は、特に制限はなく、公知のもの（例えばｐＢＹ５０１
（特開昭６０−２４８１８２号公報）、ｐＢＹ５０３
（特開昭６２−２５２３７９号公報）、ｐＢＬ１００
（特開昭６０−１２０９９２号公報）、ｐＡＭ３３０
（特開昭５８−６７６９９号公報）、ｐＢＬ１（J. Ge
n. Microbiol., 1984, 130, p. 2237-2246）等）を使用
してもよいし、任意のプラスミドにコリネ型細菌内での
プラスミドの安定化及び複製に必要な配列を組み込むこ
とにより作製してもよい。
は、特に制限はなく、公知のもの（例えばｐＢＹ５０１
（特開昭６０−２４８１８２号公報）、ｐＢＹ５０３
（特開昭６２−２５２３７９号公報）、ｐＢＬ１００
（特開昭６０−１２０９９２号公報）、ｐＡＭ３３０
（特開昭５８−６７６９９号公報）、ｐＢＬ１（J. Ge
n. Microbiol., 1984, 130, p. 2237-2246）等）を使用
してもよいし、任意のプラスミドにコリネ型細菌内での
プラスミドの安定化及び複製に必要な配列を組み込むこ
とにより作製してもよい。
【００３１】本発明プラスミドは、コリネ型細菌に導入
され、コリネ型細菌内において蛋白質が効率的に翻訳さ
れる。
され、コリネ型細菌内において蛋白質が効率的に翻訳さ
れる。
【００３２】
【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。
に説明する。
【００３３】
【実施例１】 評価用プラスミドの作製 （Ａ）シャトルベクターの構築 米国特許５，１８５，２６２号明細書記載のプラスミド
ｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌内でのプラス
ミドの安定化に必要な領域の配列をもとに、下記の１対
のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Appl
ied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセ
サイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
ｐＣＲＹ３１内に存在する、コリネ型細菌内でのプラス
ミドの安定化に必要な領域の配列をもとに、下記の１対
のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Appl
ied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセ
サイザー（synthesizer ）」を用いて合成した。
【００３４】
【化１】 （ａ−１）5'-TTT CTC GAG CGC ATT ACC TCC TTG CTA C
TG-3'（配列番号２１） （ｂ−１）5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT C
AA-3'（配列番号２２）
TG-3'（配列番号２１） （ｂ−１）5'-TTT GAA TTC GAT ATC AAG CTT GCA CAT C
AA-3'（配列番号２２）
【００３５】実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータ
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
【００３６】
【表１】 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ ＭｇＣｌ2 １０μｌ（DNA含有量１μＭ以下） 上記記載のａ−１，ｂ−１プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６２．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００３７】上記で生成した反応液１０μｌを０．８％
アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．１ｋｂの
ＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認できた
反応終了液１０μｌ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＩＩＳＫ＋ １μｌを各々制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸ
ｈｏＩで完全に切断し、７０℃で１０分間処理すること
により制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これ
に、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０×）緩衝液１μｌ、Ｔ4
ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１
０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．１ｋｂの
ＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認できた
反応終了液１０μｌ、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＩＩＳＫ＋ １μｌを各々制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸ
ｈｏＩで完全に切断し、７０℃で１０分間処理すること
により制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これ
に、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ（１０×）緩衝液１μｌ、Ｔ4
ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１
０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００３８】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology，５３，１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含
む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶
解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology，５３，１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含
む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶
解〕に塗抹した。
【００３９】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制
限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ）により切断し、挿入断
片を確認した。この結果、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＩＩＳＫ＋の長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加
え、長さ１．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本
プラスミドをｐＢＳｐａｒと命名した。
し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制
限酵素（ＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩ）により切断し、挿入断
片を確認した。この結果、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔＩＩＳＫ＋の長さ３．０ｋｂのＤＮＡ断片に加
え、長さ１．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。本
プラスミドをｐＢＳｐａｒと命名した。
【００４０】さらに、米国特許５，１８５，２６２号明
細書記載のプラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コリ
ネ型細菌内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列を
もとに、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイ
オシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用い
て合成した。
細書記載のプラスミドｐＣＲＹ３１内に存在する、コリ
ネ型細菌内でのプラスミドの複製に必要な領域の配列を
もとに、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイ
オシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４ Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer）」を用い
て合成した。
【００４１】
【化２】 （ａ−２）5'-TTT GGT ACC GAC TTA GAT AAA GGT CTA-
3'（配列番号２３） （ｂ−２）5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-
3'（配列番号２４）
3'（配列番号２３） （ｂ−２）5'-TTT CTC GAG TGC TGG TAA AAC AAC TTT-
3'（配列番号２４）
【００４２】実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータ
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
【００４３】
【表２】 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ ＭｇＣｌ2 １０μｌ（DNA 含有量１μＭ以下） 上記記載のａ−２，ｂ−２プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６２．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００４４】上記で生成した反応液１０μｌを０．８％
アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．８ｋｂの
ＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認できた
反応終了液１０μｌ、プラスミドｐＢＳｐａｒ１μｌを
各々制限酵素ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで完全に切断し、７
０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた
後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ(１０×）緩衝
液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、
滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応さ
せ、結合させた。
アガロースゲルにより電気泳動を行い、約１．８ｋｂの
ＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認できた
反応終了液１０μｌ、プラスミドｐＢＳｐａｒ１μｌを
各々制限酵素ＸｈｏＩ及びＫｐｎＩで完全に切断し、７
０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた
後、両者を混合し、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ(１０×）緩衝
液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、
滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応さ
せ、結合させた。
【００４５】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology，５３，１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含
む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶
解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology，５３，１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０ｍｇを含
む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶
解〕に塗抹した。
【００４６】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制
限酵素（ＸｈｏＩ，ＫｐｎＩ）により切断し、挿入断片
を確認した。この結果、プラスミドｐＢＳｐａｒの長さ
４．１ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．８ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒ
−ｒｅｐと命名した。
し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制
限酵素（ＸｈｏＩ，ＫｐｎＩ）により切断し、挿入断片
を確認した。この結果、プラスミドｐＢＳｐａｒの長さ
４．１ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ１．８ｋｂの挿入
ＤＮＡ断片が認められた。本プラスミドをｐＢＳｐａｒ
−ｒｅｐと命名した。
【００４７】上記で作製したプラスミドｐＢＳｐａｒ−
ｒｅｐ １μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）１μｌ
を各々制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで完全に切断
し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失
活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガー
ゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成
分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３
時間反応させ、結合させた。
ｒｅｐ １μｌ、ｐＨＳＧ２９８（宝酒造社製）１μｌ
を各々制限酵素ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩで完全に切断
し、７０℃で１０分処理させることにより制限酵素を失
活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガー
ゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成
分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３
時間反応させ、結合させた。
【００４８】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology，５３，１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含
む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶
解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology，５３，１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含
む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶
解〕に塗抹した。
【００４９】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制
限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、
プラスミドｐＨＳＧ２９８の長さ２．６ｋｂのＤＮＡ断
片に加え、長さ２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められ
た。本プラスミドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐと命
名した。
し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制
限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、
プラスミドｐＨＳＧ２９８の長さ２．６ｋｂのＤＮＡ断
片に加え、長さ２．９ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められ
た。本プラスミドをｐＨＳＧ２９８ｐａｒ−ｒｅｐと命
名した。
【００５０】（Ｂ）ｔａｃプロモーターの挿入 ｔａｃプロモーターを含有するプラスミドｐＴｒｃ９９
Ａ（ファルマシア社製）を鋳型としたＰＣＲ法により、
ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の１対
のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Appl
ied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセ
サイザー（synthesizer）」を用いて合成した。
Ａ（ファルマシア社製）を鋳型としたＰＣＲ法により、
ｔａｃプロモーター断片を増幅させるべく、下記の１対
のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（Appl
ied Biosystems）社製「３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡシンセ
サイザー（synthesizer）」を用いて合成した。
【００５１】
【化３】 （ａ−３）5'-TTT GGT ACC GAT AGC TTA CTC CCC ATC C
CC-3'（配列番号２５） （ｂ−３）5'-TTT GGA TCC AAA TTA ATT AAC ACA GAT C
TT ATC CGC TCACAA TTC CAC ACA T-3'（配列番号２６）
CC-3'（配列番号２５） （ｂ−３）5'-TTT GGA TCC AAA TTA ATT AAC ACA GAT C
TT ATC CGC TCACAA TTC CAC ACA T-3'（配列番号２６）
【００５２】実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータ
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
【００５３】
【表３】 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ ＭｇＣｌ2 １０μｌ（DNA含有量１μＭ以下） 上記記載のａ−３，ｂ−３プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６２．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００５４】上記で生成した反応液１０μｌを３％アガ
ロースゲルにより電気泳動を行い、約１００ｂｐのＤＮ
Ａ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認できた反応
液１０μｌ、上記（Ａ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ
２９８ｐａｒ−ｒｅｐ ５μｌを各々制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ及びＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理す
ることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、
これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4
ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１
０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
ロースゲルにより電気泳動を行い、約１００ｂｐのＤＮ
Ａ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認できた反応
液１０μｌ、上記（Ａ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ
２９８ｐａｒ−ｒｅｐ ５μｌを各々制限酵素ＢａｍＨ
Ｉ及びＫｐｎＩで完全に切断し、７０℃で１０分処理す
ることにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、
これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4
ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１
０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。
【００５５】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology，５３，１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含
む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶
解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology，５３，１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含
む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶
解〕に塗抹した。
【００５６】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制
限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、
上記（Ａ）で作製したプラスミドの長さ５．５ｋｂのＤ
ＮＡ断片に加え、長さ０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認
められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと命
名した。
し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制
限酵素により切断し、挿入断片を確認した。この結果、
上記（Ａ）で作製したプラスミドの長さ５．５ｋｂのＤ
ＮＡ断片に加え、長さ０．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認
められた。このプラスミドをｐＨＳＧ２９８ｔａｃと命
名した。
【００５７】（Ｃ）ベータガラクトシダーゼ遺伝子の挿
入 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）の
配列は決定されており［EMBO Journal, 2, 593 (198
3)］、この遺伝子部分をＰＣＲ法により増幅させ、上記
（Ｂ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔａｃに挿
入し、評価用プラスミドを作製した。
入 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）の
配列は決定されており［EMBO Journal, 2, 593 (198
3)］、この遺伝子部分をＰＣＲ法により増幅させ、上記
（Ｂ）で作製したプラスミドｐＨＳＧ２９８ｔａｃに挿
入し、評価用プラスミドを作製した。
【００５８】下記の１対のプライマーを、アプライド・
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を
用いて合成した。
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製「３９４
ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（synthesizer ）」を
用いて合成した。
【００５９】
【化４】 （ａ−４）5'-TTT TTA ATT AAT GAC CAT GAT TAC GGA T
TC-3'（配列番号２７） （ｂ−４）5'-TTT GGA TCC TTA TTT TTG ACA CCA GAC C
A-3'（配列番号２８）
TC-3'（配列番号２７） （ｂ−４）5'-TTT GGA TCC TTA TTT TTG ACA CCA GAC C
A-3'（配列番号２８）
【００６０】実際のＰＣＲは、パーキンエルマーシータ
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
ス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試
薬として、レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラー
ゼ・タカラ・タック（Recombinant TaqDNA Polymerase
TaKaRa Taq）（宝酒造製）を用いて下記の条件で行っ
た。
【００６１】
【表４】 反応液： （１０×）ＰＣＲ緩衝液 １０μｌ １．２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液 １６μｌ 鋳型ＤＮＡ ＭｇＣｌ2 １０μｌ（DNA 含有量１μＭ以下） 上記記載のａ−４，ｂ−４プライマー 各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ） レコンビナント・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ ０．５μｌ 滅菌蒸留水 ６２．５μｌ 以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけ
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
た。 ＰＣＲサイクル： デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒 アニーリング過程 ：５２℃ ６０秒 エクステンション過程 ：７２℃ １２０秒 以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００６２】上記で生成した反応液１０μｌを０．８％
アガロースゲルにより電気泳動を行い、約３．１ｋｂの
ＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認できた
反応終了液１０μｌ、上記（Ｂ）で作製したプラスミド
溶液５μｌを各々制限酵素ＰａｃＩ及びＢａｍＨＩで完
全に切断し、７０℃で１０分処理することにより制限酵
素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡ
リガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕ
の各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５
℃で３時間反応させ、結合させた。
アガロースゲルにより電気泳動を行い、約３．１ｋｂの
ＤＮＡ断片が検出できた。上記で増幅産物を確認できた
反応終了液１０μｌ、上記（Ｂ）で作製したプラスミド
溶液５μｌを各々制限酵素ＰａｃＩ及びＢａｍＨＩで完
全に切断し、７０℃で１０分処理することにより制限酵
素を失活させた後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡ
リガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕ
の各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５
℃で３時間反応させ、結合させた。
【００６３】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含
む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶
解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology、５３、１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含
む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶
解〕に塗抹した。
【００６４】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制
限酵素（ＰａｃＩ，ＢａｍＨＩ）により切断し、挿入断
片を確認した。この結果、上記（Ｂ）で作製したプラス
ミドの長さ５．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ３．１
ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
し、培養液よりプラスミドを抽出し、該プラスミドを制
限酵素（ＰａｃＩ，ＢａｍＨＩ）により切断し、挿入断
片を確認した。この結果、上記（Ｂ）で作製したプラス
ミドの長さ５．６ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ３．１
ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
【００６５】このプラスミドをｐｇａｌと命名した。
【００６６】
【実施例２】 Ａ断片の評価 （Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来
のＡ断片の単離 微生物細胞内含量の多い蛋白質、または多いと考えられ
る蛋白質をコードする遺伝子を単離することにより、コ
リネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させるために必要
なＤＮＡ（Ａ断片）を単離することができる。
のＡ断片の単離 微生物細胞内含量の多い蛋白質、または多いと考えられ
る蛋白質をコードする遺伝子を単離することにより、コ
リネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させるために必要
なＤＮＡ（Ａ断片）を単離することができる。
【００６７】特開平５−３０９７７号公報、特開平７−
１０７９８１号公報等に記載の方法に従い、変異株を用
いた相補、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法等によ
り、ａｓｐＡ、ｓｅｃＡ等の遺伝子を単離し、目的の遺
伝子のＯＲＦの配列を決定した。さらに、該ＯＲＦの上
流の配列を決定することにより、Ａ断片の配列を決定し
た。配列決定した配列を配列番号２９〜３７に記載す
る。
１０７９８１号公報等に記載の方法に従い、変異株を用
いた相補、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法等によ
り、ａｓｐＡ、ｓｅｃＡ等の遺伝子を単離し、目的の遺
伝子のＯＲＦの配列を決定した。さらに、該ＯＲＦの上
流の配列を決定することにより、Ａ断片の配列を決定し
た。配列決定した配列を配列番号２９〜３７に記載す
る。
【００６８】（Ｂ） Ａ断片の合成 ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３から単離し
たＡ断片の配列に基づき、アプライド・バイオシステム
ズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシン
セサイザーを用いて合成した。
たＡ断片の配列に基づき、アプライド・バイオシステム
ズ(Applied Biosystems)社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシン
セサイザーを用いて合成した。
【００６９】また、人工的にデザインしたＡ断片、すな
わち、単離した以外の配列のＳＤ配列、ＳＤ配列と翻訳
開始コドンとの距離を変化させた配列、ＳＤ配列上流を
改変した配列を種々合成した。
わち、単離した以外の配列のＳＤ配列、ＳＤ配列と翻訳
開始コドンとの距離を変化させた配列、ＳＤ配列上流を
改変した配列を種々合成した。
【００７０】合成した配列は以下の（あ）〜（う）の通
りである（配列番号１〜２０）。 （あ）単離した遺伝子上流の配列に基づいて合成した配
列
りである（配列番号１〜２０）。 （あ）単離した遺伝子上流の配列に基づいて合成した配
列
【００７１】
【化５】 5'- TTT AGA TCT ACA GGA GGC ATT AAT TAA AAA -3' （配列番号１、下線部：配列番号２９） 5'- TTT AGA TCT AAA GGA GAT ATT AAT TAA AAA -3' （配列番号２、下線部：配列番号３０） 5'- TTT AGA TCT GTG AGA GGC ATT AAT TAA AAA -3' （配列番号３、下線部：配列番号３１） 5'- TTT AGA TCT TAA GGA CGA CTT AAT TAA AAA -3' （配列番号４、下線部：配列番号３２） 5'- TTT AGA TCT TCA GGA GCA CTT AAT TAA AAA -3' （配列番号５、下線部：配列番号３３） 5'- TTT AGA TCT CGA GGA GAA CTT AAT TAA AAA -3' （配列番号６、下線部：配列番号３４） 5'- TTT AGA TCT CAA GGA GGA ATT AAT TAA AAA -3' （配列番号７、下線部：配列番号３５） 5'- TTT AGA TCT GTA GGA GGC ATT AAT TAA AAA -3' （配列番号８、下線部：配列番号３６） 5'- TTT AGA TCT AAA TGA GTT ATT AAT TAA AAA -3' （配列番号９）
【００７２】（い）ＳＤ配列上流に新しい配列を付加し
て合成した配列
て合成した配列
【００７３】
【化６】 5'- TTT AGA TCT TAG AAA TAA TTT TGT TTA ACT TTA AAC AGG AGG CAT TAA TTA AAA A -3' （配列番号１０） 5'- TTT AGA TCT TAG AAA TAA TTT TGT TTA ACT TTA AAA AGG AGA TAT TAA TTA AAA A -3' （配列番号１１） 5'- TTT AGA TCT AAT AAA ATT ATT TTT CGA TAG TTT AAA CAG GAG GCA TTA ATT AAA AA -3' （配列番号１２、下線部：配列番号４３） 5'- TTT AGA TCT AAT AAA ATT ATT TTT CGA TAG TTT AAA AAG GAG ATA TTA ATT AAA AA -3' （配列番号１３、下線部：配列番号３９）
【００７４】（う）ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距離
を変化させて合成した配列
を変化させて合成した配列
【００７５】
【化７】 5'- TTT AGA TCT AAT AAA ATT ATT TTT CGA TAG TTT AAA AAG GAG ATT AAT TAA AAA -3' （配列番号１４、下線部：配列番号３８） 5'- TTT AGA TCT AAT AAA ATT ATT TTT CGA TAG TTT AAA AAG GAG ATA AAT TAA TTA AAA A -3' （配列番号１５、下線部：配列番号４０） 5'- TTT AGA TCT AAT AAA ATT ATT TTT CGA TAG TTT AAA AAG GAG ATA AAA ATT AAT TAA AAA -3' （配列番号１６、下線部：配列番号４１） 5'- TTT AGA TCT AAT AAA ATT ATT TTT CGA TAG TTT AAA AAG GAG ATA AAA AAA TTA ATT AAA AA -3' （配列番号１７） 5'- TTT AGA TCT AAT AAA ATT ATT TTT CGA TAG TTT AAA CAG GAG GTT AAT TAA AAA -3' （配列番号１８、下線部：配列番号４２） 5'- TTT AGA TCT AAT AAA ATT ATT TTT CGA TAG TTT AAA CAG GAG GCA AAT TAA TTA AAA A -3' （配列番号１９、下線部：配列番号４４） 5'- TTT AGA TCT AAT AAA ATT ATT TTT CGA TAG TTT AAA CAG GAG GCA AAA ATT AAT TAA AAA -3' （配列番号２０、下線部：配列番号４５）
【００７６】（Ｃ） Ａ断片のｐｇａｌへの挿入 合成した、配列番号１〜２０の配列と相補的なＤＮＡを
さらに合成し、各々アニーリングを行い２本鎖ＤＮＡを
作製した。
さらに合成し、各々アニーリングを行い２本鎖ＤＮＡを
作製した。
【００７７】２本鎖ＤＮＡ溶液１０μｌ、上記実施例２
（Ｃ）で作製したプラスミドｐｇａｌの溶液５μｌを各
々制限酵素ＰａｃＩ及びＢｇｌＩＩで完全に切断し、７
０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた
後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×
緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加
し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応
させ、結合させた。
（Ｃ）で作製したプラスミドｐｇａｌの溶液５μｌを各
々制限酵素ＰａｃＩ及びＢｇｌＩＩで完全に切断し、７
０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた
後、両者を混合し、これに、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１０×
緩衝液１μｌ、Ｔ4 ＤＮＡリガーゼ１Ｕの各成分を添加
し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応
させ、結合させた。
【００７８】得られたプラスミド混液を用い、塩化カル
シウム法〔Journal of MolecularBiology，５３，１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含
む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶
解〕に塗抹した。
シウム法〔Journal of MolecularBiology，５３，１５
９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９
（宝酒造製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含
む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５
ｇ、ＮａＣｌ ５ｇ及び寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶
解〕に塗抹した。
【００７９】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドを抽出し、通常の方法に従
い、ベータガラクトシダーゼ遺伝子上流の配列を確認す
ることにより、挿入断片を確認した。
し、培養液よりプラスミドを抽出し、通常の方法に従
い、ベータガラクトシダーゼ遺伝子上流の配列を確認す
ることにより、挿入断片を確認した。
【００８０】これらのプラスミドを順次ｐｇａｌ−１〜
ｐｇａｌ−２０と命名した。
ｐｇａｌ−２０と命名した。
【００８１】（Ｄ） Ａ断片の評価 実施例２（Ｃ）で作製したプラスミドを米国特許５，１
８５，２６２号明細書に記載の方法に従って、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１
４９７）に導入した。
８５，２６２号明細書に記載の方法に従って、ブレビバ
クテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１
４９７）に導入した。
【００８２】形質転換されたブレビバクテリウム・フラ
バムＭＪ−２３３菌体を、白金耳にて１０ｍｌの半合成
培地のＡ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７
ｇ、Ｋ 2ＨＰＯ4 ０. ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｍｇ
ＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳ
Ｏ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２. ５ｇ、カザ
ミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００
μｇ、及び、グルコース２０ｇを蒸留水１Ｌに溶解し
た〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６時間振とう培
養（前培養）した。次にＡ培地１００ｍｌに前培養液を
２％植菌し、３１℃で５時間振とうして対数増殖期中期
まで培養した。この培養液を用いて、ベータガラクトシ
ダーゼ活性の測定を行った。
バムＭＪ−２３３菌体を、白金耳にて１０ｍｌの半合成
培地のＡ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4 ７
ｇ、Ｋ 2ＨＰＯ4 ０. ５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ、Ｍｇ
ＳＯ4 ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、ＭｎＳ
Ｏ4・４〜６Ｈ2Ｏ ６ｍｇ、酵母エキス２. ５ｇ、カザ
ミノ酸５ｇ、ビオチン２００μｇ、塩酸チアミン２００
μｇ、及び、グルコース２０ｇを蒸留水１Ｌに溶解し
た〕に植菌し、３０〜３３℃で１２〜１６時間振とう培
養（前培養）した。次にＡ培地１００ｍｌに前培養液を
２％植菌し、３１℃で５時間振とうして対数増殖期中期
まで培養した。この培養液を用いて、ベータガラクトシ
ダーゼ活性の測定を行った。
【００８３】ベータガラクトシダーゼ活性の測定は通常
の方法［Experiments in MolecularGenetics, ed. by J
effrey H. Miller (1977), chapter 48, Assay of β-g
alactosidase］に従って行った。具体的には、以下のよ
うにして行った。
の方法［Experiments in MolecularGenetics, ed. by J
effrey H. Miller (1977), chapter 48, Assay of β-g
alactosidase］に従って行った。具体的には、以下のよ
うにして行った。
【００８４】培養液のＯＤを波長６００ｎｍで測定した
後、培養液を１０〜１００μｌサンプリングし、ベータ
ガラクトシダーゼ活性測定用バッファ〔６０ｍＭリン酸
水素二ナトリウム、４０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、
１０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、５０
ｍＭベータメルカプトエタノール、ｐＨ７．０〕を添加
し、全体を１ｍｌにした。
後、培養液を１０〜１００μｌサンプリングし、ベータ
ガラクトシダーゼ活性測定用バッファ〔６０ｍＭリン酸
水素二ナトリウム、４０ｍＭリン酸二水素ナトリウム、
１０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、５０
ｍＭベータメルカプトエタノール、ｐＨ７．０〕を添加
し、全体を１ｍｌにした。
【００８５】トルエンを０．１％添加し、３０秒間激し
く攪拌した後、３７℃で４５分間放置し、トルエンを蒸
発させた。次いで、２８℃の恒温槽に移し、５分間放置
することにより、液温を反応温度に合わせた。
く攪拌した後、３７℃で４５分間放置し、トルエンを蒸
発させた。次いで、２８℃の恒温槽に移し、５分間放置
することにより、液温を反応温度に合わせた。
【００８６】基質であるＯＮＰＧ（オルトニトロフェノ
ールベータガラクトシド）溶液〔ＯＮＰＧ４ｍｇを１ｍ
ｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解
させたもの〕を０．２ｍｌ添加し、反応を開始させた。
１〜１０分経過し、反応液に着色が認められた後、０．
５ｍｌの１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を添加し、反応を終了
させた。
ールベータガラクトシド）溶液〔ＯＮＰＧ４ｍｇを１ｍ
ｌの１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）に溶解
させたもの〕を０．２ｍｌ添加し、反応を開始させた。
１〜１０分経過し、反応液に着色が認められた後、０．
５ｍｌの１Ｍ炭酸ナトリウム溶液を添加し、反応を終了
させた。
【００８７】吸光度計にて波長４２０ｎｍおよび５５０
ｎｍのおける吸光度（ＯＤ）を測定し、活性を下記式に
より算出した。
ｎｍのおける吸光度（ＯＤ）を測定し、活性を下記式に
より算出した。
【００８８】
【数２】活性（Ｕ）＝（ＯＤ420−１．７５×ＯＤ550）
／（測定時間（分）×ＯＤ600）×１０００
／（測定時間（分）×ＯＤ600）×１０００
【００８９】下記表５に示したとおり、１６Ｓリボソー
ムＲＮＡの３’末端と相補的な配列に相当する領域の評
価を行ったところ、その中心部分ＧＧＡＧＧの保存性が
高いものは、配列番号９に比較して、活性の高いことが
判明した。
ムＲＮＡの３’末端と相補的な配列に相当する領域の評
価を行ったところ、その中心部分ＧＧＡＧＧの保存性が
高いものは、配列番号９に比較して、活性の高いことが
判明した。
【００９０】
【表５】 表５ ベータガラクトシダーゼ活性 ──────────────────────────────────── プラスミド 評価に用いた配列 ガラクトシダーゼ活性（Ｕ） ──────────────────────────────────── ｐｇａｌ−１ 配列番号１ １１００ ｐｇａｌ−２ 配列番号２ ４５０ ｐｇａｌ−３ 配列番号３ ５００ ｐｇａｌ−４ 配列番号４ ５００ ｐｇａｌ−５ 配列番号５ ４００ ｐｇａｌ−６ 配列番号６ ３５０ ｐｇａｌ−７ 配列番号７ ６５０ ｐｇａｌ−８ 配列番号８ ６００ ｐｇａｌ−９ 配列番号９ ３０ ────────────────────────────────────
【００９１】次に、１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端
と相補的な配列上流の配列の影響を調べたところ、表６
に示したとおり、ＡＴに富む配列を付加した場合に、活
性が上昇することが判明した。
と相補的な配列上流の配列の影響を調べたところ、表６
に示したとおり、ＡＴに富む配列を付加した場合に、活
性が上昇することが判明した。
【００９２】
【表６】 表６ ベータガラクトシダーゼ活性 ──────────────────────────────────── プラスミド 評価に用いた配列 ガラクトシダーゼ活性（Ｕ） ──────────────────────────────────── ｐｇａｌ−１ 配列番号１ １１００ ｐｇａｌ−２ 配列番号２ ４５０ ｐｇａｌ−１０ 配列番号１０ １７００ ｐｇａｌ−１１ 配列番号１１ １０００ ｐｇａｌ−１２ 配列番号１２ ２０００ ｐｇａｌ−１３ 配列番号１３ １３００ ────────────────────────────────────
【００９３】１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端と相補
的な配列と翻訳開始コドンとの距離を変化させたとこ
ろ、表７に示したとおり、８ｂｐから１４ｂｐの場合、
特に１２ｂｐの場合、活性の上昇が観察できた。
的な配列と翻訳開始コドンとの距離を変化させたとこ
ろ、表７に示したとおり、８ｂｐから１４ｂｐの場合、
特に１２ｂｐの場合、活性の上昇が観察できた。
【００９４】
【表７】 表７ ベータガラクトシダーゼ活性 ──────────────────────────────────── プラスミド 評価に用いた配列 ガラクトシダーゼ活性（Ｕ） ──────────────────────────────────── ｐｇａｌ−１４ 配列番号１４ １１００ ｐｇａｌ−１３ 配列番号１３ １３００ ｐｇａｌ−１５ 配列番号１５ １８００ ｐｇａｌ−１６ 配列番号１６ ９００ ｐｇａｌ−１７ 配列番号１７ ４００ ｐｇａｌ−１８ 配列番号１８ １８００ ｐｇａｌ−１２ 配列番号１２ ２０００ ｐｇａｌ−１９ 配列番号１９ ２５００ ｐｇａｌ−２０ 配列番号２０ １６００ ────────────────────────────────────
【００９５】
【発明の効果】本発明によれば、ＳＤ配列の改良、ＳＤ
配列上流配列の改良、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距
離の改良により、蛋白質の翻訳を効率的に行わせ、細胞
内で大量に発現させることが可能になる。
配列上流配列の改良、ＳＤ配列と翻訳開始コドンとの距
離の改良により、蛋白質の翻訳を効率的に行わせ、細胞
内で大量に発現させることが可能になる。
【００９６】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTA CAGGAGGCAT TAATTAAAAA 30
【００９７】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTA AAGGAGATAT TAATTAAAAA 30
【００９８】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTG TGAGAGGCAT TAATTAAAAA 30
【００９９】配列番号：４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTT AAGGACGACT TAATTAAAAA 30
【０１００】配列番号：５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ TTTAGATCTT CAGGAGCACT TAATTAAAAA 30
【０１０１】配列番号：６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTC GAGGAGAACT TAATTAAAAA 30
【０１０２】配列番号：７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTC AAGGAGGAAT TAATTAAAAA 30
【０１０３】配列番号：８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTG TAGGAGGCAT TAATTAAAAA 30
【０１０４】配列番号：９ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTA AATGAGTTAT TAATTAAAAA 30
【０１０５】配列番号：１０ 配列の長さ：５５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTT AGAAATAATT TTGTTTAACT TTAAACAGGA GGCATTAATT AAAAA 55
【０１０６】配列番号：１１ 配列の長さ：５５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTT AGAAATAATT TTGTTTAACT TTAAAAAGGA GATATTAATT AAAAA 55
【０１０７】配列番号：１２ 配列の長さ：５６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTA ATAAAATTAT TTTTCGATAG TTTAAACAGG AGGCATTAAT TAAAAA 56
【０１０８】配列番号：１３ 配列の長さ：５６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTA ATAAAATTAT TTTTCGATAG TTTAAAAAGG AGATATTAAT TAAAAA 56
【０１０９】配列番号：１４ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTA ATAAAATTAT TTTTCGATAG TTTAAAAAGG AGATTAATTA AAAA 54
【０１１０】配列番号：１５ 配列の長さ：５８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTAA TAAAATTAT TTTTCGATAG TTTAAAAAGG AGATAAATTA ATTAAAAA 58
【０１１１】配列番号：１６ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTA ATAAAATTAT TTTTCGATAG TTTAAAAAGG AGATAAAAAT TAATTAAAAA 60
【０１１２】配列番号：１７ 配列の長さ：６２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTA ATAAAATTAT TTTTCGATAG TTTAAAAAGG AGATAAAAAA ATTAATTAAA 60 AA 62
【０１１３】配列番号：１８ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTA ATAAAATTAT TTTTCGATAG TTTAAACAGG AGGTTAATTA AAAA 54
【０１１４】配列番号：１９ 配列の長さ：５８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTA ATAAAATTAT TTTTCGATAG TTTAAACAGG AGGCAAATTA ATTAAAAA 58
【０１１５】配列番号：２０ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTAGATCTA ATAAAATTAT TTTTCGATAG TTTAAACAGG AGGCAAAAAT TAATTAAAAA 60
【０１１６】配列番号：２１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTCTCGAGC GCATTACCTC CTTGCTACTG 30
【０１１７】配列番号：２２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTGAATTCG ATATCAAGCT TGCACATCAA 30
【０１１８】配列番号：２３ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTGGTACCG ACTTAGATAA AGGTCTA 27
【０１１９】配列番号：２４ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTCTCGAGT GCTGGTAAAA CAACTTT 27
【０１２０】配列番号：２５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTGGTACCG ATAGCTTACT CCCCATCCCC 30
【０１２１】配列番号：２６ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTGGATCCA AATTAATTAA CACAGATCTT ATCCGCTCAC AATTCCACAC AT 52
【０１２２】配列番号：２７ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTTTAATTA ATGACCATGA TTACGGATT C 31
【０１２３】配列番号：２８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTGGATCC TTATTTTTGA CACCAGACCA 30
【０１２４】配列番号：２９ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 ACAGGAGGCA 10
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 ACAGGAGGCA 10
【０１２５】配列番号：３０ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 AAAGGAGATA 10
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 AAAGGAGATA 10
【０１２６】配列番号：３１ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 GTGAGAGGCA 10
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 GTGAGAGGCA 10
【０１２７】配列番号：３２ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 TAAGGACGAC 10
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 TAAGGACGAC 10
【０１２８】配列番号：３３ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 TCAGGAGCAC 10
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 TCAGGAGCAC 10
【０１２９】配列番号：３４ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum ） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 CGAGGAGAAC 10
um flavum ） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 CGAGGAGAAC 10
【０１３０】配列番号：３５ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 CAAGGAGGAA 10
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 CAAGGAGGAA 10
【０１３１】配列番号：３６ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 GTAGGAGGCA 10
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 GTAGGAGGCA 10
【０１３２】配列番号：３７ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源： 生物名：ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacteri
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 AATAAAATTA TTTTTCGATA GTTTAA 26
um flavum） 株名：ＭＪ−２３３ 配列 AATAAAATTA TTTTTCGATA GTTTAA 26
【０１３３】配列番号：３８ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATAAAATTA TTTTTCGATA GTTTAAAAAG GAGA 34
【０１３４】配列番号：３９ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATAAAATTA TTTTTCGATA GTTTAAAAAG GAGATA 36
【０１３５】配列番号：４０ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATAAAATTA TTTTTCGATA GTTTAAAAAG GAGATAAA 38
【０１３６】配列番号：４１ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATAAAATTA TTTTTCGATA GTTTAAAAAG GAGATAAAAA 40
【０１３７】配列番号：４２ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATAAAATTA TTTTTCGATA GTTTAAACAG GAGG 34
【０１３８】配列番号：４３ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATAAAATTA TTTTTCGATA GTTTAAACAG GAGGCA 36
【０１３９】配列番号：４４ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATAAAATTA TTTTTCGATA GTTTAAACAG GAGGCAAA 38
【０１４０】配列番号：４５ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATAAAATTA TTTTTCGATA GTTTAAACAG GAGGCAAAAA 40
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 9/38 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (8)
- 【請求項１】 コリネ型細菌由来の１６ＳリボソームＲ
ＮＡの３’末端の１〜１２番目の塩基配列と少なくとも
６塩基が相補的である６〜１２塩基のｒＲＮＡ相補的塩
基配列を有する、コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻
訳させるための組換えＤＮＡ。 - 【請求項２】 前記ｒＲＮＡ相補的塩基配列の上流側に
連結された、ＡＴ含量が７５％以上である１〜３０塩基
の高ＡＴ含量塩基配列をさらに有する請求項１のＤＮ
Ａ。 - 【請求項３】 以下の工程から成る測定法で測定したと
きのベータガラクトシダーゼ活性が、配列番号３４に示
す塩基配列と同等またはそれ以上である塩基配列を有す
る請求項１または２のＤＮＡ。 (1) 大腸菌由来のベータガラクトシダーゼ遺伝子と、前
記遺伝子に連結したｔａｃプロモーターと、前記ベータ
ガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンとｔａｃプロモー
ターの間に配列番号３４に示す塩基配列または測定対象
の塩基配列とを有するプラスミドを調製する。 (2) 前記プラスミドをブレビバクテリウム・フラバム(B
revibacterium flavum)ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４９７）に導入する。 (3) 導入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２
３３を培養する。 (4) 得られた培養液について、ベータガラクトシダーゼ
活性を測定する。 - 【請求項４】前記ｒＲＮＡ相補的塩基配列が、配列表の
配列番号２９〜３６に示される塩基配列のいずれかを含
む請求項１〜３のいずれか１項のＤＮＡ。 - 【請求項５】前記高ＡＴ含量塩基配列が、配列表の配列
番号３７に示される塩基配列である請求項２のＤＮＡ。 - 【請求項６】配列表の配列番号２９〜３６及び３８〜４
５に示される塩基配列のいずれかを有する請求項３のＤ
ＮＡ。 - 【請求項７】 前記コリネ型細菌がブレビバクテリウム
・フラバム (Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１４９７）である請求項１〜６記載のＤ
ＮＡ。 - 【請求項８】 請求項１〜７に記載のＤＮＡを含み、前
記相補的塩基配列が、発現されるべき蛋白質の翻訳開始
コドンの４〜１６塩基上流に置かれているコリネ型細菌
内で複製可能なプラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03533897A JP3819512B2 (ja) | 1997-02-19 | 1997-02-19 | コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させる配列を有するｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03533897A JP3819512B2 (ja) | 1997-02-19 | 1997-02-19 | コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させる配列を有するｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10229881A true JPH10229881A (ja) | 1998-09-02 |
| JP3819512B2 JP3819512B2 (ja) | 2006-09-13 |
Family
ID=12439071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03533897A Expired - Lifetime JP3819512B2 (ja) | 1997-02-19 | 1997-02-19 | コリネ型細菌内で蛋白質を効率よく翻訳させる配列を有するｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3819512B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001005960A1 (fr) * | 1999-07-19 | 2001-01-25 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production d'un acide l-amine |
-
1997
- 1997-02-19 JP JP03533897A patent/JP3819512B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001005960A1 (fr) * | 1999-07-19 | 2001-01-25 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production d'un acide l-amine |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3819512B2 (ja) | 2006-09-13 |
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