JPH06343465A - セリン−ヒドロキシメチルトランスフェラーゼを生産する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 大腸菌ＳＨＭＴを大腸菌宿主細胞内で生産す
る方法であって、ａ）大腸菌宿主細胞を、i）転写活性
化配列、ii）翻訳活性化配列、およびiii）大腸菌ＳＨ
ＭＴをコード化するＤＮＡ配列、からなり、i）、ii）
およびiii）が大腸菌ＳＨＭＴを発現させるように機能
的に連結している組換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換
し、ｂ）超大量の大腸菌ＳＨＭＴの発現を可能にする条
件下で形質転換した大腸菌宿主細胞を培養する、ことか
らなる方法。 【効果】 本発明方法により可溶型かつ活性型の大腸菌
ＳＨＭＴを超大量に生産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は組換えＤＮＡ技術の分野
に属し、セリン-ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ
(ＳＨＭＴ)の生産法を提供するものである。

【０００２】

【従来の技術とその課題】セリン-ヒドロキシメチルト
ランスフェラーゼ(ＳＨＭＴ)は微生物、植物および動物
においてアミノ酸のいくつかの化学反応を触媒すること
が知られている。ＳＨＭＴの酵素反応には切断反応、縮
合反応、アミノ基転移反応およびラセミ化反応が含まれ
る(Schirch,L.1982,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Bio
l.53:83およびSchirchら,1968,J.Biol.Chem.243:565
1)。ＳＨＭＴの自然の生物学的規則には、グリシンへ
の、もしくはセリンからの１炭素単位の転移と、スレオ
ニンやアロスレオニンなどの１-アミノ-２-ヒドロキシ
酸の逆アルドール切断によるアルデヒドとグリシンの生
成が関与する。

【０００３】ＳＨＭＴの供給源の１つは大腸菌である。
ＳＨＭＴ酵素は大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子の生成物である。
Staufferら,1981,Gene 14:63-72はＳＨＭＴをコード化
するｇｌｙＡ遺伝子の大腸菌内でのクローニングについ
て記述している。ｇｌｙＡ遺伝子のヌクレオチド配列は
決定されおり、ＳＨＭＴ酵素のアミノ酸配列はPlamann
ら,1983,Nucleic Acid Research,11:2065-2075によって
提唱されている。ｇｌｙＡ遺伝子は大腸菌宿主細胞中で
野生型の１７〜２６倍のレベルで過剰発現されており、
過剰生産された酵素が単離、精製されている(Shirchら,
1985,J.Bacteriol.163(1):1-7)。しかし、このＳＨＭＴ
生産レベルは高濃度のＳＨＭＴを使用する大規模な酵素
法にとっては商業的に実用的でない。

【０００４】ＳＨＭＴを高レベルで生産する場合、可溶
型かつ活性型のＳＨＭＴ酵素の生産を可能にすることが
望ましく、それはこのタンパク質の精製を容易にするで
あろう。しかし、大腸菌内で高レベルに発現される多く
のタンパク質はしばしば顆粒型で生産される。これらの
タンパク質は不活性であり、使用する前にそのタンパク
質を可溶化し、適切な立体配座に再生(復元)するという
費用と時間のかかる工程に付さなくてはならない。本発
明は可溶型かつ活性型の大腸菌ＳＨＭＴを大腸菌内で超
高レベルに生産するための組換えＤＮＡ法を提供する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、可溶型かつ活
性型の大腸菌ＳＨＭＴを大腸菌宿主細胞内で超大量に生
産する方法であって、 ａ）大腸菌宿主細胞を、i）転写活性化配列、ii）翻訳
活性化配列、およびiii）大腸菌ＳＨＭＴをコード化す
るＤＮＡ配列、からなり、i）、ii）およびiii）が大腸
菌ＳＨＭＴを発現させるように機能的に連結している組
換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換し、 ｂ）超大量の大腸菌ＳＨＭＴの発現を可能にする条件下
で形質転換した大腸菌宿主細胞を培養する、ことからな
る方法を提供する。

【０００６】さらに本発明は、上記方法で有用な組換え
ＤＮＡベクターおよび形質転換宿主細胞をも提供する。

【０００７】添付の図面に記載の制限酵素部位と機能地
図は、本明細書で議論する組換えＤＮＡベクターの概略
である。制限部位情報は総括的なものではなく、ある型
の制限酵素部位はこれらの地図に実際に示されている以
上に存在し得る。 ａｍｐ：アンピシリン耐性表現型もしくはそれを付与す
る遺伝子。 ｃＩ８５７：バクテリオファージ・ラムダｐＬプロモー
ターの温度感受性リプレッサーをコード化する遺伝子。 コード配列：ある遺伝子から発現されるタンパク質のア
ミノ酸残基配列をコード化しているその遺伝子中のＤＮ
Ａの配列。 遺伝子：プロモーター、翻訳活性化配列、コード配列、
遺伝子産物の発現を駆動する位置にある３'調節配列か
らなるＤＮＡの区分。 ｋａｎ：カナマイシン耐性表現型もしくはそれを付与す
る遺伝子。 ｏｒｆ：読み取り枠。 ｐＬ：バクテリオファージ・ラムダに由来する左向きプ
ロモーター。 プロモーター：ＤＮＡの転写を指令または開始するＤＮ
Ａ配列。 組換えＤＮＡ発現ベクター：ポリペプチドまたはＲＮＡ
をコード化するＤＮＡ部分の発現を駆動する位置にある
プロモーターと他の調節配列を含む自律的に複製または
統合するあらゆる物質を意味し、プラスミドを含むがこ
れに限定されない。 ＳＨＭＴ：セリン-ヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼ。 Ｔｅｔ：テトラサイクリン耐性表現型もしくはそれを付
与する遺伝子。 形質転換体：形質転換を経た受容宿主細胞。 形質転換：受容宿主細胞にＤＮＡを導入することを意味
し、これにより受容細胞の遺伝子型が変化する。 転写活性化配列：プロモーター。 翻訳活性化配列：ｍＲＮＡに転写された時にｍＲＮＡの
タンパク質への翻訳を促進する調節ＤＮＡ配列。 超大量の大腸菌ＳＨＭＴ：総可溶性タンパク質の４０％
以上を活性なＳＨＭＴとして生産する組換え宿主細胞
(ＳＨＭＴ活性は実施例５に記載の３'-フェニルセリン
からベンズアルデヒドへの検定法によって決定する)。

【０００８】本発明は、大腸菌宿主細胞内で超大量の大
腸菌ＳＨＭＴを可溶型かつ活性型で生産する方法を提供
する。この方法は、形質転換宿主細胞の総水溶性タンパ
ク質の４０〜５０％までが可溶型かつ活性型のＳＨＭＴ
であるような、ＳＨＭＴの超高発現を可能にする。活性
なＳＨＭＴの生産に関するこの遺伝子発現レベルは過去
に記述されているレベルより７.５倍高い(Shirchら,198
5,J.Bacteriol.163(1):1-7)。

【０００９】大腸菌ＳＨＭＴの細胞内濃度を増大させる
組換えＤＮＡ発現ベクターは次の要素を必要とする：
１）大腸菌ＳＨＭＴコードＤＮＡ、および２）大腸菌内
で機能的なプロモーターおよび翻訳活性化配列(これら
の要素は大腸菌ＳＨＭＴ ＤＮＡの発現を駆動するのに
適した向きと位置で存在する)。また大腸菌ＳＨＭＴ発
現ベクターは、抗生物質耐性付与遺伝子か、あるいはそ
のベクターを含有する宿主細胞を選択する手段を提供す
る何らかの他の要素をも含有し得るが、ベクターが宿主
細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれる場合には、そのよ
うな選択可能な要素は必要でもないし、また望ましくも
ない。

【００１０】大腸菌ＳＨＭＴをコード化する大腸菌ｇｌ
ｙＡ遺伝子のＤＮＡ配列は、Plamannら,1983,Nucleic A
cids Research 11(7):2065に記載されている。Plamann
らは大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子を含有するプラスミドｐＧＳ
２９についても記述している。後述するように、本発明
のベクターを構築する際には、プラスミドｐＧＳ２９を
大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子をコード化するＤＮＡの供給源と
した。

【００１１】本発明で有用な代表的プラスミドはプラス
ミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡであり、このプラスミドは次の
ように構築された。２段階の工程で、カナマイシン耐性
遺伝子を含有するプラスミドｐＨＫＹ３９０(後述)のＮ
ｄｅＩ-ＢａｍＨＩ制限酵素断片を、プラスミドｐＧＳ
２９から得られるｇｌｙＡ読み取り枠(ＯＲＦ)を含有す
るＮｄｅＩ-ＢｃｌＩ制限酵素断片で置換した。プラス
ミドｐＧＳ２９中のｇｌｙＡ遺伝子のＡＴＧ開始(翻訳
活性化配列)に、実施例２に記述するポリメラーゼ連鎖
反応(ＰＣＲ)によってＮｄｅＩ制限酵素部位を導入し
た。次に、実施例３に記述するように、大腸菌ｇｌｙＡ
読み取り枠ＤＮＡをプラスミドｐＧＳ２９から得られる
ＮｄｅＩ-ＢｃｌＩ制限酵素断片としてプラスミドｐＨ
ＫＹ３９０中にクローン化することにより、プラスミド
ｐＸ４を形成させた。プラスミドｐＧＳ２９から得られ
るＮｄｅＩ-ＢｃｌＩ制限酵素断片は全ＯＲＦと天然の
ｇｌｙＡプロモーター配列を含有していた。

【００１２】次に、天然のｇｌｙＡプロモーターＤＮＡ
配列をＮｄｅＩ-ＢｓｔＥＩＩ制限酵素断片としてプラ
スミドｐＸ４から削除した。この断片を、プラスミドｐ
Ｖ-ｐｃｒＢ(このプラスミドの構築は実施例２に記述す
る)から得られるＰＣＲ修飾ＮｄｅＩ-ＢｓｔＩＩと置換
した。得られたプラスミドがｐＺＰ１-ｇｌｙＡであ
る。プラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡは、ＳＨＭＴコード
ＤＮＡの転写の駆動にプラスミドｐＨＫＹ３９０の修飾
バクテリオファージ・ラムダｐＬプロモーターが使用さ
れるような正しい配列にあるｇｌｙＡ ＯＲＦを含有す
る。

【００１３】プラスミドｐＨＫＹ３９０はプラスミドｐ
ＢＲ３２２から誘導される６.８７ｋｂのプラスミドで
ある。プラスミドｐＨＫＹ３９０の制限酵素および機能
地図を図４に示す。このプラスミドは、このプラスミド
の大腸菌内での複製と維持を可能にするプラスミドｐＢ
Ｒ３２２由来のＤＮＡ領域を含有する。プラスミドｐＢ
Ｒ３２２ＤＮＡのこの領域内で、アンピシリン耐性遺伝
子をバクテリオファージ・ラムダｃＩ８５７リプレッサ
ーをコード化するＤＮＡで置換した。ラムダｃＩ８５７
リプレッサーはバクテリオファージ・ラムダプロモータ
ーの温度感受性リプレッサーである。ｃＩ８５７リプレ
ッサータンパク質はプロモーターのオペレーター領域に
結合し、転写を遮断するので、低温(３０℃〜３５℃)に
おける修飾バクテリオファージ・ラムダｐＬプロモータ
ーからの転写は抑制される。高温(３６℃〜４２℃)で
は、リプレッサータンパク質が破壊され、プロモーター
からの転写を遮断することができない。

【００１４】ｐＨＫＹ３９０中の修飾バクテリオファー
ジ・ラムダｐＬプロモーターはテトラサイクリン耐性遺
伝子の下流に位置する。このプロモーターはカナマイシ
ン耐性遺伝子からのＯＲＦのすぐ隣にあり、このプロモ
ーターが２シストロン集合を介してそのＯＲＦの転写を
制御する(Schonerら,1990,Methods in Enzymology：Gen
e Expression Technology 185:94-1-3)。プラスミドｐ
ＨＫＹ３９０はカナマイシン耐性遺伝子の読み取り枠が
制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩによる消化で容易に除去
され得るように構築された。ＡＴＧ翻訳開始コドンにＮ
ｄｅＩ制限部位を有し、翻訳終結コドンまたはその下流
にＢａｍＨＩ適合制限部位を有するＯＲＦであれば、ど
のようなものでもプラスミドｐＨＫＹ３９０中にクロー
ン化することができる。その結果挿入されたＯＲＦは修
飾バクテリオファージ・ラムダｐＬプロモーターからの
発現に関して正しく配列するであろう。大腸菌ＲＶ３０
８／ｐＨＫＹ３９０は１９９２年１月３１日に、イリノ
イ州６１６０４ペオリアの米国農務省、Northern Regio
nal Research Laboratory（ＮＲＲＬ）の永久培養収集
物に寄託されており、受託番号Ｂ-１８９４６の下に入
手できる。プラスミドｐＨＫＹ３９０は当該技術分野で
よく知られているプラスミド単離技術によって大腸菌Ｒ
Ｖ３０８／ｐＨＫＹ３９０から単離することができる。

【００１５】上記のクローニング法に代わるものとし
て、ＤＮＡ合成、ｃＤＮＡクローニング、ゲノムクロー
ニング、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)技術、あるいは
これらの組み合わせを含む様々な他の方法によって大腸
菌ｇｌｙＡのＤＮＡ配列を調製し、それを本発明のベク
ター中で使用することができる。これらの技術やその他
の技術は、Maniatisら,Molecular Cloning：A Laborato
ry Manual(Cold SpringHarbor Press,ニューヨーク州コ
ールド・スプリング・ハーバー(1989))や、Current Pro
tocols in Molecular Biology(F.M.Ausbelら,1989)に記
述されている。これらの文献の内容は共に参考文献とし
て本明細書の一部を構成する。

【００１６】大腸菌ｇｌｙＡ読み取り枠のＤＮＡ配列は
市販の方法と装置を用いて合成することができる。例え
ば固相ホスホトリエステル法を用いて本発明のＤＮＡ配
列を製造することができる。完全に保護されたＤＮＡ構
築ブロックを用いる修飾ホスホトリエステル法によって
ＤＮＡ配列を合成することもできる。このような合成法
は、実質上、Itakuraら,1977,Science 198:1056、Crea
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:575およびNarangら,1
980,Methods in Enzymology 68:90に従って行うことが
できる。手動法に加えて、ＡＢＳ ３８０Ａ ＤＮＡシン
セサイザー(Applied Biosystems,カリフォルニア州9440
4フォスター・シティー、リンカーン・センター・ドラ
イブ850番)のような自動合成装置を用いてＤＮＡ配列を
合成することもできる。またポリメラーゼ連鎖反応によ
ってＤＮＡ配列を作成することもできる。例えば米国特
許第４８００１５９号、同第４６８３２０２号、１９８
７年３月２日に公開された欧州特許公開第０２５８０１
７号を参照のこと。

【００１７】例えば大腸菌ｇｌｙＡ読み取り枠をコード
し、ＮｄｅＩとＢｃｌＩ適合末端を有する下記のＤＮＡ
配列を合成し、それをプラスミドｐＨＫＹ３９０の大き
いＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片中にクローン化する
ことにより、プラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡを作成する
ことができる。下記二本鎖ＤＮＡ断片の５'から３'への
鎖を配列番号１と命名する。下記二本鎖ＤＮＡ断片の
３'から５'への鎖を配列番号２と命名する。

【化１】

【化２】

【００１８】本発明の方法は本明細書に例示する特定の
ベクターに限定されるものではなく、本発明の方法では
様々な発現ベクターを用いて大腸菌宿主細胞内で大腸菌
ＳＨＭＴを超高レベルに発現させることができる。原核
細胞内での発現は、Maniatisら(1989)とKaufmann,Genet
ic Engineering Principles and Methods(J.K.Setlow
編,Plenum Press 9:155(1988))に記述されている。

【００１９】本発明は、大腸菌ＳＨＭＴの発現を駆動す
るための特定の転写活性化配列と翻訳活性化配列に限定
されるものではない。本発明は、大腸菌内で機能し、か
つ、大腸菌ＳＨＭＴを大腸菌内で超高レベルに発現させ
るために使用し得る転写活性化配列と翻訳活性化配列の
使用を含む。大腸菌内で機能的なプロモーターと翻訳活
性化配列は数多く知られており、これらは大腸菌内で大
腸菌ＳＨＭＴの発現を駆動するのに適している。そのよ
うな転写および翻訳活性化配列には、ｌｐｐ、ｌａｃ、
ｔｒｐ、ｔａｃ、ｌｐＬおよびｌｐＲプロモーターおよ
び翻訳活性化配列が含まれるが、これらに限定されな
い。さらに、米国特許出願第０７／７３９２８０号(こ
の特許出願は参考文献として本明細書の一部を構成す
る)に開示されているような修飾バクテリオファージ・
ラムダプロモーターも本発明に有用である。

【００２０】下記の実施例は本発明のさらなる理解を助
けるためのものである。使用される特定の物質、種およ
び条件は本発明をさらに例示するためのものであり、本
発明の妥当な範囲を制限するものではない。ＤＮＡの操
作と分析の手法は基本的にSambrookら,1989,Molecular
Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLab
oratory Press,ニューヨーク州コールド・スプリング・
ハーバー)に記述されている通りに行った。制限酵素反
応の条件は製造者(Boehringer Mannheim(BM),インディ
アナ州インディアナポリス；New England Biolabs(NE
B),マサチューセッツ州ベバリー；Bethesda Research L
abs(BRL),メリーランド州ガイサースブルグ)が推奨する
条件とした。

【００２１】

【実施例】実施例１ ：プラスミドｐＧＳ２ ９で形質転換された大腸
菌宿主細胞の調製 大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子のヌクレオチド配列は既知である
(Plamannら,1983,Nucleic Acid Research 11:2065-207
5)。しかし便宜上、大腸菌ＧＳ２４５／ｐＧＳ２９から
単離されるプラスミドｐＧＳ２９を本発明のベクターの
出発物質として使用した。大腸菌ＧＳ２４５／ｐＧＳ２
９についてはPlamannおよびStauffer,1983,Gene 22:9-1
8が記述している。

【００２２】５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する
Ｌ寒天上で生育させた大腸菌ＧＳ２４５／ｐＧＳ２９コ
ロニーの一部を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが入って
いるＬブロス１リットルに移し、空気振盪機中３７℃で
約１６時間インキュベートした。Beckman ＪＡ-１０ロ
ーター(Beckman Insts.Inc.,カリフォルニア州92634フ
ラートン(Beckman))を用いて、４℃、８０００ｒｐｍで
１０分間の遠心分離によって、細胞を５００ｍｌ管中に
収集した。細胞ペレットをＴＥ-８.０(１０ｍＭトリス-
ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、１ｍＭエチレンジアミンテトラ酢
酸(ＥＤＴＡ))で洗浄し、収集し、５０ｍＭトリス-ＨＣ
ｌ(ｐＨ８.０)と２５％ショ糖に再懸濁して、総体積を
１０ｍｌにした。２５ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)中
の２０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム(Sigma Chemical Co.,ミ
ズーリ州63178セント・ルイス)１ｍｌを撹拌しながら添
加した後、その混合物を氷上で３０分間インキュベート
した。２００ｍＭ ＥＤＴＡ ４ｍｌを加えた後、氷上で
１０分間インキュベートし、次いでブリージ／ＤＯＣ溶
解溶液(１％ブリージ５８；０.４％デオキシコレート；
５０ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)；６０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ)１５ｍｌを加えた。チューブを穏やかに反転させる
ことによって混合し、氷上で１５〜３０分間インキュベ
ートした。Beckman ＪＡ-２０ローターを用いて、１８
０００ｒｐｍで１時間の遠心分離によって細胞残渣を除
去した。上清をデカントすることにより約３０ｍｌを
得、それに１０ｍｇ／ｍｌ ＲＮＡｓｅ Ａ(Sigma)１５
０μｌを加えた。３７℃で１時間インキュベートした
後、１０ｍｇ／ｍｌ プロテイナーゼＫ(Boehringer Man
nheim)１５０μｌを加え、３７℃でさらに１時間インキ
ュベートした。１／１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウム(ｐ
Ｈ７.０)の添加とそれに続く３体積の氷冷無水エタノー
ルの添加によってＤＮＡを沈殿させた。Beckman ＪＡ-
１４ロータを用いる８０００ｒｐｍで３０分間の遠心分
離によってＤＮＡを回収した。風乾したペレットをＴＥ
-８.０に再懸濁して総体積を９ｍｌにし、それに塩化セ
シウム(Boehringer Mannheim)９ｇと１０ｍｇ／ｍｌ臭
化エチジウム０.５ｍｌを加えた。得られた溶液を５.１
ｍｌのQuik-seal管(Beckaman)に充填し、Beckman ＶＴ
ｉ６５.２超遠心ローターを用いて６５０００ｒｐｍで
６時間遠心分離した。紫外光下でプラスミドバンドを可
視化し、シリンジで取り出した。得られたＤＮＡ溶液を
塩飽和イソプロパノールで抽出することによって臭化エ
チジウムを除去し、１０００体積のＴＥ-８.０に対して
１６時間透析した。ＤＮＡ溶液は使用するまで−２０℃
で保存した。

【００２３】形質転換感応大腸菌ＤＨ５α細胞をGibco
BRL(メリーランド州ガイサースブルグ)から得て、それ
を製造者の操作法に従ってプラスミドｐＧＳ２９で形質
転換した。５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬ
寒天上で形質転換体を選択した。水平ゲル電気泳動での
プラスミドサイズ分類によってプラスミドｐＧＳ２９を
含有する形質転換体を確認した。プラスミドｐＧＳ２９
を保持する代表的な大腸菌ＤＨ５α形質転換体をＤ.１
と命名した。

【００２４】別法として、プラスミドｐＧＳ２９を用い
て大腸菌ＲＶ３０８を形質転換した。大腸菌ＲＶ３０８
の培養は１９８３年９月２８日に、イリノイ州６１６０
４ペオリアの米国農務省、Northern Regional Research
Laboratory(NRRL)の永久培養収集物に寄託されてお
り、受託番号Ｂ-１５６２４の下に入手できる。

【００２５】形質転換のために大腸菌ＲＶ３０８細胞を
次のように調製した。大腸菌ＲＶ３０８細胞の試料をＬ
ブロス(１リットルあたりトリプトン１０ｇ、ＮａＣｌ
１０ｇ、酵母エキス５ｇ)中でＯ.Ｄ.₅₉₀が約０.５吸光
度単位になるまで生育させ、遠心分離によって細胞を収
集した。細胞ペレットを冷たい１００ｍＭ ＣａＣｌ₂２
５ｍｌに再懸濁し、氷上で２５分間インキュベートし
た。再び細胞を遠心分離によって集め、そのペレットを
冷たい１００ｍＭ ＣａＣｌ₂ ２.５ｍｌに再懸濁し、終
夜インキュベートした。感応細胞を形質転換するか、あ
るいは形質転換で使用する準備が整うまで−７０℃で直
接保存した。

【００２６】感応大腸菌ＲＶ３０８細胞をプラスミドｐ
ＧＳ２９で形質転換するために、ポリプロピレンチュー
ブ中の感応細胞懸濁液１００μｌを−７０℃の保存分か
ら取り出し、氷上で融解させた。細胞を穏やかに混合
し、プラスミドｐＧＳ２９の溶液(１ｎｇ／μｌ)５μｌ
を加え、得られた溶液を氷上で３０分間インキュベート
した。そのチューブを４２℃の水槽に移し、振盪しない
で４５秒間インキュベートした。この熱ショック処理
後、チューブを２分間氷上に置いた。チューブを氷から
取り出し、室温のＳ.Ｏ.Ｃ.培地(２％バクトトリプト
ン；０.５％酵母エキス；１０ｍＭ ＮａＣｌ；２.５ｍ
Ｍ ＫＣｌ；１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂；１０ｍＭ ＭｇＳ
Ｏ₄；２０ｍＭグルコース；蒸留水中)０.９ｍｌを加え
た。その溶液を毎分２２５回転(ｒｐｍ)の速度で振盪し
ながら３７℃で１時間インキュベートした。その細胞混
合物の一部を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンが入ってい
るＬ寒天(Ｌブロスと１５ｇ／Ｌの寒天)プレート上に接
種し、そのプレートを３７℃でインキュベートした。ア
ンピシリン耐性に関する選択と水平ゲル電気泳動でのプ
ラスミドサイズ分類によって形質転換体を確認した。そ
のクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素分
析によって確認した。プラスミドｐＧＳ２９を保持する
大腸菌ＲＶ３０８の代表的な形質転換体をＲ.１と命名
した。

【００２７】実施例２ ：プラスミドｐＶ-ｐｃｒＢの構築 Ａ．ＰＣＲ修飾／増幅断片の構築 ＡＴＧ開始コドンにあるＮｄｅＩ部位とｇｌｙＡ遺伝子
のＢｓｔＥＩＩ部位を含むｇｌｙＡコード化ＤＮＡを有
するように改変された大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子の５'末端
を含有するＰＣＲ修飾／増幅断片を構築した。増幅に使
用したＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーは次の通り
である。前向きプライマーは、

【化３】 という配列からなる２６塩基のオリゴヌクレオチドであ
る。配列番号３は大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子のＡＴＧ転写開
始コドンを横切ってハイブリッド形成するように設計し
た。太字はＮｄｅＩ認識配列を表し、下線を付した塩基
は元来の大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子配列とは異なる塩基であ
る。逆向きオリゴヌクレオチドプライマーは、５'-ＣＣ
ＧＧＡＧＡＡＣＣＧＴＧＡＧ-３'(配列番号４)という配
列からなる１５塩基対のＤＮＡオリゴヌクレオチドであ
る。配列番号４は大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子配列内の唯一の
ＢｓｔＥＩＩ部位のすぐ下流にハイブリッド形成するよ
うに設計した。両オリゴヌクレオチオドは共にＡＢＩ
３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置で合成し、Oligonucleotide P
urification Cartridge^R(Applied Biosystems Inc.,カ
リフォルニア州フォスター・シティー)で精製した。こ
れらのプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うために必要
な物質はGeneAmp^TM DNA Amplification ReagentKit(Per
kin Elmer Cetus,コネティカット州ノルウォーク)とし
て入手した。

【００２８】反応条件は次の通りである：鋳型ＤＮＡ
(プラスミドｐＧＳ２９)１ｎｇ；１.０ｍＭ配列番号
３；１.０ｍＭ配列番号４；各２００ｍＭ ｄＡＴＰ(デ
オキシアデノシン５'-トリリン酸)、ｄＣＴＰ(デオキシ
シトシン５'-トリリン酸)、ｄＧＴＰ(デオキシグアノシ
ン５'-トリリン酸)およびＴＴＰ(チミジル５'-トリリン
酸)；１×反応緩衝液(１０ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ８.
３)；５０ｍＭ ＫＣｌ；１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂；０.０１
％(ｗ／ｖ)ゼラチン)；Ｔａｑポリメラーゼ２.５単位；
最終体積１００μｌ。蒸発を防ぐために０.５ｍｌポリ
プロピレンチューブ中の反応混合物に鉱油１００μｌを
重層し、ＤＮＡ Thermal Cycler(Perkin Elmer Cetus)
中に設置した。サーモサイクラーの設定は次の通りであ
る；９４℃で２分間を１サイクル；ａ）９４℃で１分
間，ｂ）５０℃で２分間，ｃ）７２℃で３分間を３０サ
イクル；７２℃で７分間を１サイクル；４℃で最終サイ
クル(貯蔵)。

【００２９】この４０３塩基対のＰＣＲ修飾／増幅ＤＮ
Ａ断片を、１×ＢａｍＨＩ／ＢｓｔＥＩＩ緩衝液(１０
ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ８.０)；５ｍＭ塩化マグネシウ
ム；１００ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ２-メルカプトエタ
ノール)を含有する反応液中でＢｓｔＥＩＩ酵素５０単
位を用いて６０℃で２時間消化することにより、３８０
塩基対のＢｓｔＥＩＩ-ＮｄｅＩ ＤＮＡ断片に変換し
た。この断片を次のようにゲル単離した。消化したＤＮ
Ａを１×ＴＡＥ緩衝液(４０ｍＭトリス-酢酸；１ｍＭ
ＥＤＴＡ)中の１.５％アガロースゲルで電気泳動した。
そのゲルを臭化エチジウム溶液の希釈液(１ｍｇ／ｍｌ)
で染色し、長波長紫外(ＵＶ)光下でＤＮＡバンドを可視
化した。３８０塩基対のＢｓｔＥＩＩ消化したＰＣＲ修
飾／増幅ＤＮＡ断片の位置を特定し、それを新しい外科
用ナイフでゲルから切り出した。Maniatisらの操作法
(T.Maniatis,J.SambrookおよびE.F.Fritsch,1989,Molec
ular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Springs Har
bor Laboratory Press,6.28頁)に若干の調節を加えて、
そのゲル切片からＤＮＡ断片を溶出させた。簡単に述べ
ると、ゲル切片を１／５×ＴＡＥ緩衝液約２００μｌと
共に透析バッグに入れ、クリップで密封し、１／５×Ｔ
ＡＥ緩衝液中で約３時間電気泳動した。透析バッグの内
容物と１／５×ＴＡＥによる洗浄液４００μｌを低塩緩
衝液(０.２Ｍ ＮａＣｌ；２０ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ
７.５)；１.０ｍＭ ＥＤＴＡ)２.４ｍｌと混合し、与え
られた操作法に従って調製済ELUTIP-dカラム(Schleiche
r & Schuell,ニューハンプシャー州キーン)に充填し
た。低塩緩衝液で洗浄した後、高塩緩衝液(１.０Ｍ Ｎ
ａＣｌ；２０ｍＭトリス-ＨＣｌ(ｐＨ７.５)；１.０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ)４００μｌを２回用いて、ＤＮＡをカラム
から溶出させ、氷冷無水エタノール８００μｌの添加と
それに続く遠心分離(Eppendorf 5415C 微量遠心機中１
４０００ｒｐｍで４０分間)によって沈殿させた。ＴＥ
(ｐＨ７.５)２０μｌに溶解することによって２つの風
乾ペレットを混合し、その溶液を連結まで−２０℃で保
存した。この断片は、ＡＴＧ翻訳開始出発部位にＮｄｅ
Ｉ部位を有するようにＰＣＲで修飾した大腸菌ｇｌｙＡ
遺伝子のアミノ末端領域を含有する。

【００３０】 Ｂ．Ｓａｕ３ＡＩ-ＨｐｈＩリンカーＤＮＡ断片の構築 Ｓａｕ３ＡＩ-ＨｐｈＩリンカー断片を単離するため
に、２つの別個の消化と単離を行った。まず１×Ｈｐｈ
Ｉ緩衝液(２０ｍＭトリス-酢酸(ｐＨ７.９)；５０ｍＭ
酢酸カリウム；１０ｍＭ酢酸マグネシウム；１ｍＭジチ
オスレイトール)を含有する反応液中でＨｐｈＩ制限酵
素(ＮＥＢ)５０単位を用いてプラスミドｐＵＣ１９(Ｂ
ＲＬから入手可能)約２０μｇを３７℃で２時間消化し
た。適当な４１６塩基対のＨｐｈＩ制限断片を実施例２
Ａに記載の如くゲル単離した。次にその断片を、１×Ｓ
ａｕ３ＡＩ緩衝液(３３ｍＭトリス-酢酸(ｐＨ７.９)；
１０ｍＭ酢酸マグネシウム；６６ｍＭ酢酸カリウム；
０.５ｍＭジチオスレイトール)を含有する反応液中でＳ
ａｕ３ＡＩ制限酵素(ＢＭ)５０単位を用いて３７℃で２
時間消化した。２３４塩基対のＳａｕ３ＡＩ-ＨｐｈＩ
ＤＮＡ断片を実施例２Ａに記述の如くゲル単離した。

【００３１】Ｃ．プラスミドｐＶ-ｐｃｒＡの構築 １×ＡｃｃＩ緩衝液(３３ｍＭトリス-酢酸(ｐＨ７.
９)；１０ｍＭ酢酸マグネシウム；６６ｍＭ酢酸カリウ
ム；０.５ｍＭ ＤＴＴ)を含有する反応液中で制限酵素
ＡｃｃＩ ５０単位を用いてプラスミドｐＵＣ１９ ＤＮ
Ａ約５μｇを３７℃で２時間消化した。直線化したプラ
スミドｐＵＣ１９を実施例２Ａに記述した方法でゲル単
離した。

【００３２】１×ＡｈａＩＩ緩衝液(１０ｍＭトリス-Ｈ
Ｃｌ(ｐＨ７.９)；５０ｍＭ ＮａＣｌ；１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ₂；１ｍＭ ＤＴＴ；１００ｍｇ／ｍｌ牛血清アルブ
ミン)を含有する反応液中でＡｈａＩＩ酵素(ＮＥＢ)５
０単位を用いてプラスミドｐＧＳ２９約１０μｇを３７
℃で２時間消化した。２.０ｋｂのＡｈａＩＩ断片を実
施例２Ａに記述した方法で単離した。

【００３３】プラスミドｐＧＳ２９から得た２.０ｋｂ
のＡｈａＩＩ断片３μｌとＡｃｃＩで直線化したプラス
ミドｐＵＣ１９(２.８ｋｂ)１μｌを、１×リガーゼ緩
衝液とＴ４リガーゼ(ＢＭ)約５単位を含有する反応液１
５μｌに加えた。その反応混合物を１４℃で１６時間イ
ンキュベートした。その反応生成物を実施例１に記述の
如く大腸菌ＤＨ５α細胞に導入した。形質転換体から得
られるプラスミドをそのプラスミド中のＡｈａＩＩ断片
の向きについてスクリーニングした。プラスミドｐＵＣ
１９のＰｓｔＩ部位に近く、かつ、ＢａｍＨＩ部位に遠
いＢｓｔＥＩＩ部位を含有するプラスミドをプラスミド
ｐＶ-ｐｃｒＡとして選択した。このクローンから得ら
れるプラスミドを実施例１に記述の如く単離した。

【００３４】所望のＢｓｔＥＩＩ-ＢａｍＨＩベクター
骨格断片を得るために、１×ＢａｍＨＩ／ＢｓｔＥＩＩ
緩衝液を含有する反応液中でＢａｍＨＩ酵素(ＢＭ)５０
単位を用いてプラスミドｐＶ-ｐｃｒＡ約１０μｇを３
７℃で２時間消化した。その反応液にＢｓｔＥＩＩ(５
０単位)を加え、温度を６０℃に上げて２時間維持し
た。実施例２Ａの方法に従ってＢｓｔＥＩＩ-ＢａｍＨ
Ｉベクター骨格断片をゲル単離した。

【００３５】 Ｄ．中間体プラスミドｐＶ-ｐｃｒＢの最終的な構築 実施例２Ａで調製したＢｓｔＥＩＩ消化３８０塩基対Ｐ
ＣＲ修飾／増幅ＤＮＡ断片を、実施例２Ｂで調製したリ
ンカー断片および実施例２Ｃで調製したベクター骨格断
片と連結することにより、中間体プラスミドｐＶ-ｐｃ
ｒＢを得た。

【００３６】ベクター骨格断片１μｌ(約５０ｎｇ)、Ｓ
ａｕ３ＡＩ-ＨｐｈＩ ＤＮＡ断片２μｌ(約１００ｎｇ)
およびＢｓｔＥＩＩ消化ＰＣＲ修飾／増幅ＤＮＡ断片６
μｌ(約１００ｎｇ)を、１×連結緩衝液とＴ４リガーゼ
約５単位とを含有する反応液に加えた。その混合物を１
４℃で１６時間インキュベートし、得られたＤＮＡを実
施例１に記述の方法で大腸菌ＤＨ５αに導入した。制限
酵素分析で形質転換体をスクリーニングすることによ
り、プラスミドｐＶ-ｐｃｒＢを保持する形質転換体を
選択した。実施例１に記述の方法でその形質転換体から
プラスミドｐＶ-ｐｃｒＢを抽出し、精製した。

【００３７】実施例３：プラスミドｐＸ ４の構築 プラスミドｐＨＫＹ３９０の制限酵素部位と機能地図を
図２に示す。下記の手法でプラスミドｐＨＫＹ３９０か
らカナマイシン耐性遺伝子の読み取り枠を除去した。１
×ＮｄｅＩ緩衝液を含有する反応混合物中でＮｄｅＩ制
限酵素５０単位を用いてプラスミドｐＨＫＹ３９０ １
０μｇを３７℃で２時間消化した。消化したＤＮＡを上
述の如く沈殿させ、得られたＤＮＡペレットを１×Ｂａ
ｍＨＩ緩衝液に再懸濁した。ＢａｍＨＩ制限酵素５０単
位を加え、その混合物を３７℃で２時間インキュベート
した。プラスミドｐＨＫＹ３９０の２つのＮｄｅＩ-Ｂ
ａｍＨＩ ＤＮＡ断片のうちの大きい方を実施例２Ａに
記述した手法に従ってゲル単離した。

【００３８】大腸菌ｇｌｙＡ遺伝子と上流配列を含有す
るＮｄｅＩ-ＢｃｌＩ ＤＮＡ断片をプラスミドｐＧＳ２
９から次のようにして得た。１×ＮｄｅＩ緩衝液を含有
する反応液中でＮｄｅＩ ５０単位を用いてプラスミド
ｐＧＳ２９約１０μｇを３７℃で２時間消化した。１／
１０体積の３Ｍ酢酸ナトリウム(ｐＨ７.０)と２.５体積
の氷冷無水エタノールの添加によって、消化したＤＮＡ
を沈殿させた。３０分間の遠心分離によってＤＮＡを集
めた。ＤＮＡのペレットを１×ＢｃｌＩ緩衝液(１０ｍ
Ｍトリス-ＨＣｌ(ｐＨ７.５)；１０ｍＭ塩化マグネシウ
ム；５０ｍＭ塩化ナトリウム；１ｍＭジチオエリスリト
ール)に再懸濁、溶解し、ＢｃｌＩ制限酵素５０単位を
加え、その反応混合物を５０℃で２時間インキュベート
した。プラスミドｐＨＫＹ３９０由来のゲル単離したＮ
ｄｅＩ-ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片を含有する連結混合物に
１.７３ｋｂのＮｄｅＩ-ＢｃｌＩ ＤＮＡ断片を直接加
えた。

【００３９】ｇｌｙＡ読み取り枠と上流配列を含有する
プラスミドｐＧＳ２９の１.７３ｋｂのＮｄｅＩ-Ｂｃｌ
Ｉ ＤＮＡ断片を、プラスミドｐＨＫＹ３９０から得ら
れる大きいＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片に次のよう
に連結した。プラスミドｐＨＫＹ３９０から得られる大
きいＮｄｅＩ-ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片５μｌ(約５０ｎ
ｇ)とＮｄｅＩ-ＢｃｌＩ消化したプラスミドｐＧＳ２９
ＤＮＡ５μｌ(約５００ｎｇ)を、１×リガーゼ緩衝液
とＴ４リガーゼ５単位とを含む反応液に加えた。得られ
た混合物を１４℃で１６時間インキュベートし、得られ
たＤＮＡ生成物を実施例１に記述の如く大腸菌ＤＨ５α
細胞に導入した(ただし形質転換とインキュベーション
は３０℃で行った)。テトラサイクリン耐性について形
質転換体を選択した。得られたテトラサイクリン耐性形
質転換体のプラスミドを制限酵素分析でスクリーニング
したところ、所望のプラスミドｐＸ４の構造を持つプラ
スミドを保持する形質転換体が見つかった。選択した形
質転換体から実施例１に記述した方法でプラスミドｐＸ
４ ＤＮＡを精製した。

【００４０】実施例４ ：プラスミドｐＺＰ１ -ｇｌｙＡの構築 プラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡを構築するために、プラ
スミドｐＸ４の小さいＮｄｅＩ-ＢｓｔＥＩＩ ＤＮＡ断
片をプラスミドｐＶ-ｐｃｒＢから得られる小さいＮｄ
ｅＩ-ＢｓｔＥＩＩ ＤＮＡ断片で置換した。これは次の
ように行った。１×ＮｄｅＩ緩衝液中でＮｄｅＩ(５０
単位)を用いてプラスミドｐＸ４(１０μｇ)を３７℃で
２時間消化した。ＤＮＡを実施例３に記載の如く沈殿さ
せ、沈殿したＤＮＡをＢｓｔＥＩＩ ５０単位が入って
いる１×ＢｓｔＥＩＩ緩衝液に再懸濁した。この反応混
合物を６０℃で２時間インキュベートし、大きいＤＮＡ
断片を実施例２Ａに従ってゲル単離した。プラスミドｐ
Ｘ４の消化と同様にｐＶ-ｐｃｒＢ約２０μｇをも消化
し、３７３塩基対のＮｄｅＩ-ＢｓｔＥＩＩ ＤＮＡ断片
をゲル単離した。

【００４１】プラスミドｐＸ４から得た大きいＮｄｅＩ
-ＢｓｔＥＩＩ ＤＮＡ断片とプラスミドｐＶ-ｐｃｒＢ
から得た３７３塩基対のＮｄｅＩ-ＢｓｔＥＩＩ ＤＮＡ
断片を次のように連結して、プラスミドｐＺＰ１-ｇｌ
ｙＡを形成させた。ベクターｐＸ４から得た断片２μｌ
(約５０ｎｇ)とプラスミドｐＶ-ｐｃｒＢから得た３７
３塩基対の断片１μｌ(約１５０ｎｇ)を、１×リガーゼ
緩衝液とＴ４リガーゼ５単位が入っている反応混合物に
加えた。得られた反応混合物を１４℃で１６時間インキ
ュベートした。

【００４２】滅菌ＴＥで５倍に希釈することにより連結
反応混合物を形質転換のために調製した。希釈したＤＮ
Ａを用い、基本的に実施例３に記載の如く、感応大腸菌
ＤＨ５α細胞を形質転換した。テトラサイクリン耐性コ
ロニーを選択し、これらのコロニーから得られるプラス
ミドを水平アガロースゲル電気泳動によってサイズ分類
した。プラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡについて予期され
るサイズに対応するサイズのプラスミドを含有する形質
転換体を選択した。制限酵素分析によって、これらの形
質転換体のプラスミドがプラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡ
について予期される構造を有することを確認した。代表
的な大腸菌ＤＨ５α／ｐＺＰ１-ｇｌｙＡ形質転換体を
選択して、それをＤｇｌｙと命名した。

【００４３】プラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡを大腸菌Ｄ
Ｈ５α／ｐＺＰ１-ｇｌｙＡから単離し、それを用いて
実施例３に記述の如く大腸菌ＲＶ３０８を形質転換し
た。制限酵素分析によって、これらの形質転換体から得
られるプラスミドがプラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡにつ
いて予期される構造を有することを確認した。代表的な
大腸菌ＲＶ３０８／ｐＺＰ１-ｇｌｙＡ形質転換体を選
択し、それをＲｇｌｙと命名した。

【００４４】実施例５：酵素検定 上述の大腸菌組換え体の活性分析を容易にするために、
３'-フェニルセリンをＳＨＭＴの基質として用いる高性
能液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)検定法を開発し
た。３'-フェニルセリンのベンズアルデヒドへの変換を
監視することによってＳＨＭＴ活性を決定した。総体積
１ｍｌのこの反応混合物は２０ｍＭの３'-フェニルセリ
ンと２０ｍＭ Ｎ,Ｎ-ビス［２-ヒドロキシエチル］-２-
アミノエタンスルホン酸緩衝液(ＢＥＳ，ｐＨ７.２５)
中の適当量の酵素とを含む。この反応混合物を穏やかに
振盪しながら３０℃でインキュベートし、５分後に１０
％Ｈ₃ＰＯ₄２５μｌを添加することによって反応を停止
させた。遠心分離によってあらゆる粒子を除去し、上清
画分の少量(通常１０μｌ)をＨＰＬＣで分析した。Apex
ＯＤＳ ３μ Ｃ１８カラム(Jones Chromatography,コ
ロラド州リトルトン)、水／アセトニトリル(７２／２
５，ｖ／ｖ)による流速１ｍｌ／分の無勾配溶出および
２７９ｎｍにおける検出を用いることによって、ベンズ
アルデヒドを定量した。酵素活性１単位を上記反応条件
下で毎分１μモルのベンズアルデヒドの生成をもたらす
のに必要なＳＨＭＴの量と定義する。比活性をタンパク
質１ｍｇあたりの単位と定義する。タンパク質含量は牛
血清アルブミンを標品として用いるBradfordの標準的な
方法によって決定した。

【００４５】実施例６：ＳＨＭＴの発現 大腸菌ＲＶ３０８、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＲＶ３０８
／ｐＧＳ２９(Ｒ.１)、大腸菌ＤＨ５α／ｐＧＳ２９
(Ｄ.１)、大腸菌ＲＶ３０８／ｐＺＰＩ-ｇｌｙＡ(Ｒｇ
ｌｙ)および大腸菌ＤＨ５α／ｐＺＰＩ-ｇｌｙＡ(Ｄｇ
ｌｙ)の終夜培養物(培地体積はフラスコ体積の２５％)
を５μｇ／ｍｌテトラサイクリンが入っているルリア・
ブロスに凍結保存物から接種した。その培養を２５０ｒ
ｐｍの通気浸透機／インキュベーター上で３０℃で約１
６時間インキュベートした。光学密度(Ｏ.Ｄ.；６００
ｎｍ波長)と希釈試料の間に直線的な関係が得られるよ
うに既知体積の水で希釈した試料を用いて終夜培養ブロ
スのＯ.Ｄ.を測定した。終夜培養物を新しいルリア・ブ
ロスと５μｇ／ｍｌテトラサイクリンで１対２５に希釈
した。Ｏ.Ｄ.(６００ｎｍ波長)が終夜培養物のＯ.Ｄ.の
半分に等しくなるまで培養を生育させた後、培養の温度
を４０℃に移し、培養サイズに応じて水槽または通気振
盪／インキュベーターで振盪培養を続けた。実験を休止
するために培養をこの温度で維持した。温度転移の時点
(時間０)とその後の様々の時点で検定用の試料を採取し
た。ブロス試料中の細胞を遠心分離によって収集した。
収集した細胞を１０ｍＭトリス-ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａおよび０.１ｍＭピリドキサール-５'-リン酸(破壊緩
衝液)で１回洗浄した。各細胞ペレット５ｇを破壊緩衝
液１０ｍｌに再懸濁し、２℃で３０秒間３回超音波処理
した。超音波処理物を４８０００×ｇで１時間の遠心分
離によって透明にし、粗抽出物を得た。各培養のＳＨＭ
Ｔ活性を実施例５に記述したＨＰＬＣ酵素検定法で測定
した。大腸菌ＲＶ３０８、大腸菌ＤＨ５α、Ｒ.１、Ｄ.
１、ＲｇｌｙおよびＤｇｌｙの振盪フラスコ培養物から
得られた総酵素活性と比酵素活性を表１に示す。

【表１】 株 ＳＨＭＴ活性 タンパク質 ＳＨＭＴ比活性 (単位／ｍｌ) (ｍｇ／ｍｌ) (単位／ｍｇ) ＤＨ５α １.４８ ２７ ０.０５ Ｄ.１ ５０.８４ ３６ １.４１ Ｄｇｌｙ ９２.１６ ３１ ２.９７ ＲＶ３０８ ０.９７ ３１ ０.０３ Ｒ.１ ２４.６ ３０ ０.８２ Ｒｇｌｙ ４４.０１ ３３ １.３３

【００４６】実施例７：大腸菌ＳＨＭＴの生産 ５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを加えたＬブロス中３０
℃で、所望の細胞密度に達するまで大腸菌ＲＶ３０８／
ｐＺＰ１-ｇｌｙＡ(Ｒｇｌｙ)を生育させることによっ
て、種ロットを調製した。滅菌条件下で１ｍｌをスクリ
ューキャップ凍結バイアルに移し、液体窒素の蒸気相で
保存した。この種ロットのバイアルを貯蔵器から取り出
し、５μｇ／ｍｌテトラサイクリンが入っているＬブロ
ス５０ｍｌを含む２つのフラスコにその内容物を等しく
移し、３０℃でインキュベートした。これらのフラスコ
の内容物を、改良Ｍ-９グルコース-塩培地を含有する５
０リットルの撹拌反応器に植菌した。この種容器を３０
℃、ｐＨ７.０に制御し、オフガス分析(off gas analys
is)が応分の細胞質量に達したことを示すまで５０％以
上のＯ₂を溶解した。次にこのブロスの一部を１５０リ
ットルのバイオリアクターに移した。細胞質量の蓄積相
の間、温度を３０℃に維持し、ｐＨをｐＨ７.０に制御
した。発酵変数が予定の設定値(各バイオリアクターの
気体移動特性によって決まる)に達した時に、発酵器の
温度を４１℃まで傾斜させた。この時点で組換えタンパ
ク質の合成が細菌細胞内で始まった。最終温度に到達す
る直前に、複合アミノ酸のスラリー(加水分解したカゼ
インなど)を大量に添加した。残りの発酵のために、グ
ルコースと複合アミノ酸スラリーを一定の速度で反応器
に添加した。添加レベルは生産相の間一貫して個々のア
ミノ酸のプールが与えられ、それが維持されるに足るレ
ベルとした。生産相の間一貫して温度とｐＨを制御し
た。溶存酸素や二酸化炭素発生速度などの発酵変数が溶
存酸素残量や二酸化炭素発生低下などの発酵目標が達成
されたことを示した時に、正しく折り畳まれた可溶性の
生成物を含有する細胞を収集した。１５０リットル発酵
器では、ＲｇｌｙがＤｇｌｙより良好に生育した(即ち
Ｒｇｌｙの方が総酵素活性が高かった)。

【００４７】

【配列表】

【００４８】配列番号：１ 配列の長さ：１４０６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 Ｔ ＡＴＧ ＴＴＡ ＡＡＧ ＣＧＴ ＧＡＡ ＡＴＧ ＡＡＣ ＡＴＴ
ＧＣＣ ＧＡＴ ＴＡＴ ＧＡＴ ＧＣＣ ４０ ＧＡＡ ＣＴＧ ＴＧＧ ＣＡＧ ＧＣＴ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＡＧ ＧＡＡ
ＡＡＡ ＧＴＡ ＣＧＴ ＣＡＧ ＧＡＡ ８２ ＧＡＧ ＣＡＣ ＡＴＣ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＴＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＧＡＡ
ＡＡＣ ＴＡＣ ＡＣＣ ＡＧＣ ＣＣＣ １２４ ＣＧＣ ＧＴＡ ＡＴＧ ＣＡＧ ＧＣＧ ＣＡＧ ＧＧＴ ＴＣＴ ＣＡＧ
ＣＴＧ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＡＡ ＴＡＴ １６６ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＧＴ ＴＡＴ ＣＣＧ ＧＧＣ ＡＡＡ ＣＧＣ ＴＡＣ
ＴＡＣ ＧＧＣ ＧＧＴ ＴＧＣ ＧＡＧ ２０８ ＴＡＴ ＧＴＴ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＴＴ ＧＡＡ ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＣＧ
ＡＴＣ ＧＡＴ ＣＧＴ ＧＣＧ ＡＡＡ ２５０ ＧＡＡ ＣＴＧ ＴＴＣ ＧＧＣ ＧＣＴ ＧＡＣ ＴＡＣ ＧＣＴ ＡＡＣ
ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＣＧ ＣＡＣ ＴＣＣ ２９２ ＧＧＣ ＴＣＣ ＣＡＧ ＧＣＴ ＡＡＣ ＴＴＴ ＧＣＧ ＧＴＣ ＴＡＣ
ＡＣＣ ＧＣＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ３３４ ＣＣＡ ＧＧＴ ＧＡＴ ＡＣＣ ＧＴＴ ＣＴＧ ＧＧＴ ＡＴＧ ＡＡＣ
ＣＴＧ ＧＣＧ ＣＡＴ ＧＧＣ ＧＧＴ ３７６ ＣＡＣ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＣ ＧＧＴ ＴＣＴ ＣＣＧ ＧＴＴ ＡＡＣ
ＴＴＣ ＴＣＣ ＧＧＴ ＡＡＡ ＣＴＧ ４１８ ＴＡＣ ＡＡＣ ＡＴＣ ＧＴＴ ＣＣＴ ＴＡＣ ＧＧＴ ＡＴＣ ＧＡＴ
ＧＣＴ ＡＣＣ ＧＧＴ ＣＡＴ ＡＴＣ ４６０ ＧＡＣ ＴＡＣ ＧＣＣ ＧＡＴ ＣＴＧ ＧＡＡ ＡＡＡ ＣＡＡ ＧＣＣ
ＡＡＡ ＧＡＡ ＣＡＣ ＡＡＧ ＣＣＧ ５０２ ＡＡＡ ＡＴＧ ＡＴＴ ＡＴＣ ＧＧＴ ＧＧＴ ＴＴＣ ＴＣＴ ＧＣＡ
ＴＡＴ ＴＣＣ ＧＧＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ５４４ ＧＡＣ ＴＧＧ ＧＣＧ ＡＡＡ ＡＴＧ ＣＧＴ ＧＡＡ ＡＴＣ ＧＣＴ
ＧＡＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＧＧＴ ＧＣＴ ５８６ ＴＡＣ ＣＴＧ ＴＴＣ ＧＴＴ ＧＡＴ ＡＴＧ ＧＣＧ ＣＡＣ ＧＴＴ
ＧＣＧ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＣＴ ６２８ ＧＣＴ ＧＧＣ ＧＴＣ ＴＡＣ ＣＣＧ ＡＡＣ ＣＣＧ ＧＴＴ ＣＣＴ
ＣＡＴ ＧＣＴ ＣＡＣ ＧＴＴ ＧＴＴ ６７０ ＡＣＴ ＡＣＣ ＡＣＣ ＡＣＴ ＣＡＣ ＡＡＡ ＡＣＣ ＣＴＧ ＧＣＧ
ＧＧＴ ＣＣＧ ＣＧＣ ＧＧＣ ＧＧＣ ７１２ ＣＴＧ ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＣＧ ＡＡＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＧＣ ＧＡＡ
ＧＡＧ ＣＴＧ ＴＡＣ ＡＡＡ ＡＡＡ ７５４ ＣＴＧ ＡＡＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＧＴＴ ＴＴＣ ＣＣＴ ＧＧＴ ＧＧＴ
ＣＡＧ ＧＧＣ ＧＧＴ ＣＣＧ ＴＴＧ ７９６ ＡＴＧ ＣＡＣ ＧＴＡ ＡＴＣ ＧＣＣ ＧＧＴ ＡＡＡ ＧＣＧ ＧＴＴ
ＧＣＴ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＣＧ ８３８ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＣＴ ＧＡＧ ＴＴＣ ＡＡＡ ＡＣＴ ＴＡＣ ＣＡＧ
ＣＡＧ ＣＡＧ ＧＴＣ ＧＣＴ ＡＡＡ ８８０ ＡＡＣ ＧＣＴ ＡＡＡ ＧＣＧ ＡＴＧ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＴＧ ＴＴＣ
ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＧＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ９２２ ＡＡＡ ＧＴＧ ＧＴＴ ＴＣＣ ＧＧＣ ＧＧＣ ＡＣＴ ＧＡＴ ＡＡＣ
ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＴＴ ９６４ ＧＡＴ ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＡＴ ＡＡＡ ＡＡＣ ＣＴＧ ＡＣＣ ＧＴＴ
ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＧＡＣ ＧＣＣ １００６ ＧＣＴ ＣＴＧ ＧＧＣ ＣＧＴ ＧＣＴ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＧＴＣ
ＡＡＣ ＡＡＡ ＡＡＣ ＡＧＣ ＧＴＡ １０４８ ＣＣＧ ＡＡＣ ＧＡＴ ＣＣＧ ＡＡＧ ＡＧＣ ＣＣＧ ＴＴＴ ＧＴＧ
ＡＣＣ ＴＣＣ ＧＧＴ ＡＴＴ ＣＧＴ １０９０ ＧＴＡ ＧＧＴ ＡＣＴ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＴＴ ＡＣＣ ＣＧＴ ＣＧＣ
ＧＧＣ ＴＴＴ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＣＣ １１３２ ＧＡＡ ＧＣＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＣＴＧ ＧＣＴ ＧＧＣ ＴＧＧ ＡＴＧ
ＴＧＴ ＧＡＣ ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＡＣ １１７４ ＡＧＣ ＡＴＣ ＡＡＴ ＧＡＴ ＧＡＡ ＧＣＣ ＧＴＴ ＡＴＣ ＧＡＧ
ＣＧＣ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＧＴ ＡＡＡ １２１６ ＧＴＴ ＣＴＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＴＧＣ ＧＣＡ ＣＧＴ ＴＡＣ ＣＣＧ
ＧＴＴ ＴＡＣ ＧＣＡ １２５２ ＴＡＡＧＣＧＡＡＡＣ ＧＧＴＧＡＴＴＴＧＣ ＴＧＴＣＡＡＴＧＴＧ ＣＴＣ
ＧＴＴＧＴＴＣ ＡＴＧＣＣＧＧＡＴＧ １３０２ ＣＧＧＣＧＴＧＡＡＣ ＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧ ＧＣＣＴＡＣＡＡＡＡ ＣＴＴ
ＴＧＣＡＡＡＴ ＴＣＡＡＴＡＴＡＴＴ １３５２ ＧＣＡＡＴＣＴＣＣＧ ＴＧＴＡＧＧＣＣＴＧ ＡＴＡＡＧＣＧＴＡＧ ＣＧＣ
ＡＴＣＡＧＧＣ ＡＡＴＴＴＴＴＣＧＴ １４０２ ＴＴＡＴ
１４０６

【００４９】配列番号：２ 配列の長さ：１４０８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GATCATAAAC GAAAAATTGC CTGATGCGCT ACGCTTATCA GGCCTACACG 50 GAGATTGCAA TATATTGAAT TTGCAAAGTT TTGTAGGCCG GATAAGGCAT 100 TCACGCCGCA TCCGGCATGA ACAACGAGCA CATTGACAGC AAATCACCGT 150 TTCGCTTATG CGTAAACCGG GTAACGTGCG CAGATGTCGA GAACTTTACC 200 TTTGATGCGC TCGATAACGG CTTCATCATT GATGCTGTCC AGCTCGTCAC 250 ACATCCAGCC AGCCAGTTCT TTCGCTTCGG CTTCTTTAAA GCCGCGACGG 300 GTAATCGCCG GAGTACCTAC ACGAATACCG GAGGTCACAA ACGGGCTCTT 350 CGGATCGTTC GGTGCGCTGT TTTTGTTGAC GGTGATGTTA GCACGGCCCA 400 GAGCGGCGTC TGCTTCTTTA ACAATCAGGT TTTTATCAAC CAGATCAACC 450 AGGAACAGGT GGTTATCAGT GCCGCCGGAA ACCACTTTGT AGCCGCGCTC 500 GAGGAACACT TCTACCATCG CTTTAGCGTT TTTAGCGACC TGCTGCTGGT 550 AAGTTTTGAA CTCAGGCTCC ATCGCTTCTT TCAGAGCAAC CGCTTTACCG 600 GCGATTACGT GCATCAACGG ACCGCCCTGA CCACCAGGGA AAACGGCAGA 650 GTTCAGTTTT TTGTACAGCT CTTCGCTACC ACCTTTCGCC AGGATCAGGC 700 CGCCGCGCGG ACCCGCCAGG GTTTTGTGAG TGGTGGTAGT AACAACGTGA 750 GCATGAGGAA CCGGGTTCGG GTAGACGCCA GCAGCAACCA GGCCCGCAAC 800 GTGCGCCATA TCAACGAACA GGTAAGCACC GATGCTGTCA GCGATTTCAC 850 GCATTTTCGC CCAGTCCACC ACGCCGGAAT ATGCAGAGAA ACCACCGATA 900 ATCATTTTCG GCTTGTGTTC TTTGGCTTGT TTTTCCAGAT CGGCGTAGTC 950 GATATGACCG GTAGCATCGA TACCGTAAGG AACGATGTTG TACAGTTTAC 1000 CGGAGAAGTT AACCGGAGAA CCGTGAGTCA GGTGTCCGCC ATGCGCCAGG 1050 TTCATACCCA GAACGGTATC ACCTGGTTCC AGCAGCGCGG TGTAGACCGC 1100 AAAGTTAGCC TGGGAGCCGG AGTGCGGCTG GACGTTAGCG TAGTCAGCGC 1150 CGAACAGTTC TTTCGCACGA TCGATCGCCA GTTGTTCAAC GATATCAACA 1200 TACTCGCAAC CGCCGTAGTA GCGTTTGCCC GGATAACCTT CAGCATATTT 1250 GTTGGTCAGC TGAGAACCCT GCGCCTGCAT TACGCGGGGG CTGGTGTAGT 1300 TTTCGGAGGC GATCAGTTCG ATGTGCTCTT CCTGACGTAC TTTTTCCTGC 1350 TCCATAGCCT GCCAGACTTC GGCATCATAA TCGGCAATGT TCATTTCACG 1400 CTTTAACA 1408

【００５０】配列番号：３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GATGCATATGTTAAAGCGTGAAATGA 26

【００５１】配列番号：４ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CCGGAGAACCGTGAG 15

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドｐＧＳ２９の制限酵素部位および
機能地図。

【図２】 プラスミドｐＨＫＹ３９０の制限酵素部位お
よび機能地図。

【図３】 プラスミドｐＶ-ｐｃｒＢの制限酵素部位お
よび機能地図。

【図４】 プラスミドｐＺＰ１-ｇｌｙＡの制限酵素部
位および機能地図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジョゼフ・マーティン・ゾック アメリカ合衆国46143インディアナ州グリ ーンウッド、ウエスト・スモーキー・ロ ー・ロード5755番

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 可溶型かつ活性型の大腸菌ＳＨＭＴを大
   腸菌宿主細胞内で超大量に生産する方法であって、 ａ）大腸菌宿主細胞を、i）転写活性化配列、ii）翻訳
   活性化配列、およびiii）大腸菌ＳＨＭＴをコード化す
   るＤＮＡ配列、からなり、i）、ii）およびiii）が大腸
   菌ＳＨＭＴを発現させるように機能的に連結している組
   換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換し、 ｂ）超大量の大腸菌ＳＨＭＴの発現を可能にする条件下
   で形質転換した大腸菌宿主細胞を培養する、ことからな
   る方法
2. 【請求項２】 転写活性化配列が、野生型バクテリオフ
   ァージ・ラムダｐＬプロモーターおよび修飾されたバク
   テリオファージ・ラムダｐＬプロモーターから構成され
   る群から選択される請求項１の方法。
3. 【請求項３】 組換えＤＮＡ発現ベクターがプラスミド
   ｐＺＰ１-ｇｌｙＡである請求項２の方法。