KR0185576B1 - 코리네형 글루타메이트 생산균에서 유래된 프로모터의 스크리닝 및 분석용 벡터 - Google Patents

코리네형 글루타메이트 생산균에서 유래된 프로모터의 스크리닝 및 분석용 벡터 Download PDF

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Abstract

청구범위에 기재되어 있는 발명이 속하는 기술 분야
유전공학.
발명이 해결하고자 하는 기술적 과제
코리네형 글루타메이트생산 균의 유전자를 고수율로 발현시킬 수 있는 수단으로서 강력하게 작용할 수 있는 프로모터를 개발.
기술적 과제의 해결방법의 요지
코리네형 글루타메이트 생산균에서 유래된 프로모터를 스크리닝 및 분석하는 기능을 가진 신규한 재조합 플라스미드 pBRPR.
발명의 중요한 용도
퓨린계 핵산의 생산.

Description

코리네형 글루타메이트 생산 균에서 유래된 프로모터의 스크리닝 및 분석용 벡터
제1도는 본 발명에 따른 코리네형 글루타메이트 생산균의 프로모터를 스크리닝 및 분석할 수 있는 벡터 pBRPR의 작제도이다.
본 발명은 그람 양성균의 일종으로서 산업적으로 퓨린계 핵산의 발효생산에 유용한 균주인 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)로 부터 클로닝된 5' -크산틸산 아미나제 유전자(guaA)를 리포터 유전자로 사용하여 코리네형 글루타메이트 생산균주[예, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)]의 프로모터를 스키리닝 및 분석할 수 있는 신규한 재조합 플라스미드 벡터에 관한 것이다.
일반적으로 야생형(wild type)의 균주로부터 클로닝된 유전자들은 생체 내에서 되먹임 조절(feedback regulation) 등의 조절기작에 의해 그의 발현이 철저히 통제되고 있으며, 그의 발현정도가 미약하여 특정대사산물의 과량축적에는 불리한 면이 있다. 이러한 점을 해결하기 위한 유전자의 발현을 높이기 위해서, 가장 간단한 방법으로서 재조합 플라스미드에 실려 있는 외부유전자의 크기를 줄여 배양중 재조합 플라스미드의 안정성을 높이려는 시도가 있어 왔으나, 어느 정도 크기 이하의 유전자는 거의 동일한 안정성을 보이기 때문에 유전자의 크기 축소에 의해서는 안정성 증가에 별로 효과를 보지 못하는 실정이고, 다른 방법으로서, 세포분열시 플라스미드의 분배(partition)에 관여하여 재조합 플라스미드의 안정성을 증가시켜 주는 DNA 단편인 par 유전자를 도입함으로써 재조합 플라스미드이 안정성을 높이고자 하는 연구가 보고된 바 있으나 이는 대장균의 경우에 상세히 연구되었지만 대장균 이외의 미생물에서는 거의 보고된 바 없어 산업적으로 유용한 균주인 코리네형 글루타메이트 생산균에는 적용이 어려운 실정이다. 또 다른 유용한 방법으로는 강력한 활성을 가지는 프로모터를 도입하여 유전자에 의한 발현정도를 증가시키는 방법이 있는데, 이 방법 역시 대장균의 경우에는 lac I 프로모터, trp 프로모터, 람다(λ) 박테리오파지 PR, PL프로모터 등 강력한 프로모터가 보고되었으나, 코리네형 글루타메이트 생산균에서는 분자생물학적 기초연구가 이제 시작단계이므로 그렇게 강력한 프로모터가 보고된 바 없으며, 본 발명자들의 자체연구에 의하면 상기의 대장균의 강력 프로모터(예: PR, PL)를 도입하여도 발현이 별로 증가되지 않는 것으로 보아 대장균 프로모터의 이들 코리네형 세균에 대한 응용성은 없는 것으로 보인다.
이에, 본발명의 목적은 이렇게 분자생물학적 기초연구의 진행이 미흡한 코리네형 글루타메이트 생산균에서 강력한 프로모터를 스크리닝할 수 있고 또한 동시에 프로모터로서 기능을 하는데 필수적인 염기서열이 어느 부분인지 분석을 수행할 수 있는 벡터를 개발하는데 있다.
본 발명자들은 코리네형 글루타메이트 생산균에서 복제 및 발현이 가능한 문헌 Biotechnology Letters vol. 13 No. 10 721-726(1991) 및 대한민국특허원 제 89-5569호 및 제 90-9199호에 기술된 에쉐리시아/코리네박테리움 셔틀벡터 pECCG117에 5'- 크산틸산 아미나제 유전자의 구조유전자 부위만을 중합효소 연쇄반응(PCR: Polymerase Chain Reaction)에 의해 제작하여 도입한 뒤, 이 유전자의 개시코돈 앞부분에 외부염기서열을 클로닝 할 수 있는 부위를 도입하고 또한 그 앞부분으로부터 무작위적으로 전사가 개시되는 것을 방지하기 위하여 대장균으로부터 유래된ρ-독립적(independent) 전사종결인자(transcription terminator)인 trpA 전사종결인자의 염기서열을 도입하고 다음으로 5'-크산틸산 아미나제 유전자의 구조유전자의 개시코돈 앞에서의 불필요한 단백질합성의 시작을 저해하기 위해 모든 프레임에 대해 종결코돈의 구조를 갖는 범용 단백질합성 종결인자(universal translational terminator)의 염기서열을 도입하였으며, 클로닝된 프로모터 염기서열 중에서 프로모터의 기능에 필수적인 염기서열 부위를 밝히기 위한 연속제거(serial deletion)반응을 수행하기 위하여 제한효소에 의한 인식부위와 절단부위가 분리되어 있어 반복적인 염기서열 제거반응이 가능한 class ⅡS 제한효소 절단부위도 아울러 도입함으로써 코리네형 글루타메이트 생산균의 프로모터를 스크리닝 및 분석할 수 있는 벡터(promoter-probe bector)를 제작할 수 있었으며, 이 작제된 플라스미드를 pBRPR로 명명하였다.
따라서, 본 발명은 코리네형 글루타메이트 생산균의 프로모터를 스크리닝 및 분석하는 백터 플라스미드 pBRPR를 제공한다.
본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13058 균주로부터 크립틱 플라스미드(cryptic plasmid)인 pCB 1을 분리한 뒤 에쉐리시아 콜리 속 균주의 클로닝 벡터인 pACYC 177과 결합시켜 코리네박테리움과 에쉐리시아 속의 균주들에서 모두 형질전환 및 발현이 가능한 셔틀벡터인 pECCG 1을 제작하였으며, 이 pECCG 1로 부터 앰피실린 내성 유전자 부분을 제거하고 플라스미드 pBluescriptⅡ KS+의 다발성 절단부위(multiple-cloning site)를 도입하여 코리네박테리움 속의 균주에서 안정하게 발현되는 셔틀벡터 pECCG 117을 제작하였다. 이의 제작 방법은 Biotechnology Letters vol. 13 No. 10 721-726(1991) 및 본 출원인에 의해 대한민국 특허공고 제92-7401호에 자세히 기술되어 있다.
또한, 프로모터의 스크리닝을 위한 리포터(reporter) 유전자로는 데코이닌 내성을 갖는 브레비박테리움 암모니아게네스 균주로부터 클로닝된 5'- 크산틸산 아미나제 유전자를 사용하였으며, 이 유전자는 본 출원인에 의해 출원중인 대한민국 특허출원 제 91-13227호에 기재되어 있으며, 아래와 같은 반응기작을 가지고 있는 미생물에 대한 5'-구아닐산의 제조에 사용한 바 있다 :
이 유전자를 사용한 이유는 이 유전자가 결여되어 있어서 발현시 스크리닝이 용이한 숙주균주 브레비박테리움 암모니아게네스 D12550-40균주 (브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872의 아데닌 및 구아닌 요구 변이주)가 확보되어 있으며, 효소역가 분석이 용이하고, 5'-크산틸산 아미나제 유전자(guaA)가 브레비박테리움 암모니아게네스로부터 클로닝된 유전자이기 때문에 이들 코리네형 글루타메이드 생산균의 내부조건에 민감하게 반응함으로써 효소역학 등의 특성파악이 용이한 것으로 추정되기 때문이었다.
따라서, 본 발명에서의 구아닌이 존재하지 않는 최소배지에서 구조유전자 부위만을 갖는 5'-크산틸산 아미나제 유전자의 발현여부, 즉 개시코돈의 앞부분에 도입된 염기서열이 프로모터로서 기능을 하는가의 여부에 의하여 구아닌 및 아데닌에 대한 영양요구성을 갖는 브레비박테리움 암모니아게네스 D1550-40 균주의 성장이 결정되기 때문에, 이러한 일련의 도구들로 코리네형 글루타메이트 생산균에서 프로모터를 클로닝할 수 있는 재조합 백터 및 스크리닝 체계를 갖출 수 있었다.
하기의 실시예로 본 발명을 더욱 구체적으로 예시한다.
본 발명자들이 사용한 유전자 조작방법은 주로 분자 클로닝 실험 조작법(Molecular Cloning; A laboratory manual, 2nd ed., J. Sambrook, E.F., Fritch, T., Maniatis) 및 분자 클로닝 기술의 지표(Guide to molecular Cloning techniques, Methods in Enzymology, vol. 152, S.L., Berger, A.R,. Kimme) 등의 방법에 준하여 실시하였다.
[실시예 1]
프로모터 스크리닝 벡터 pBRPR 제작
(1) 재조합 플라스미드 pECCG117 및 pGH16의 분리
셔틀벡터 pECCG117(카나마이신내성, 5.8kb)은 KFCC-10674 균주로부터 셔틀벡터 pECCG1을 분리하고 대한민국 특허공고 제 92-7401호에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 이 셔틀백터로 형질전환된 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC6872/pECCG117 및 5'-크산틸산 아미나제 유전자를 갖고있는 폴라스미드 pGH16(KCCM10008)로 형질전환된 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC6872/pGH16으로 부터의 플라스미드의 분리는 다음의 절차로 실시하였다. 이들 균주를 하기 표1의 C배지에서 32 에서 18시간 진탕배양하여 균체를 성장시킨 후, 원심분리로 균체를 회수하여 10ml의 1mM 트리스 완충액(pH 8.0)으로 세척한 다음 40ml의 라이소자임(10mg/ml)이 함유된 용액A(50mM 글루코오즈, 25mM 트리스(pH 8.0), 10mM EDTA)에 현탁시킨 후 37℃에서 1시간 처리하였다. 여기에 100ml의 용액B(0.2N NaOH, 1% SDS)를 넣고 천천히 섞은 후 5내지 10분간 방치 후, 50ml의 3M 소디움아세테이트(pH 4.8)를 첨가하여 섞은 다음 얼음에서 10분간 방치시킨 후 원심분리하였다. 가제로 여과한 원심분리 상등액에 2배 부피의 에탄올을 첨가하고 얼음에서 10분간 방치시킨 후 원심분리시켜 얻어진 침전물을 70% 에탄올로 씻어준 다음 진공상태에서 말린다.
이를 10ml의 TE(pH 8.0) 완충액으로 녹인 후 염화세슘을 ml당 1g 씩 첨가하고 1ml의 에티디움 브로마이드(EtBr) 농축액(10mg/ml)을 섞어주고, 이 혼합물을 초고속 원심분리기를 사용하여 15℃에서 50,000rpm으로 48시간 원심분리시킨 후 주사기를 사용하여 15℃에서 50,000rpm으로 48시간 원심분리시킨 후 주사기를 사용하여 플라스미드 DNA를 취하였다. 이소아밀알코올로 4회처리하여 에티디움 브로마이드를 제거한 후 TE 완충액(10mM 트리스(pH 8.0), 1mM EDTA)에서 24시간 투석하여 염화세슘을 제거하고 난 뒤 플라스미드 DNA를 분리정제하였다.
(2) DNA 합성
Applied Biosystems 사의 model 392 DNA/RNA 합성기를 사용하여 다음의 DNA를 합성하였다: 1) 5'- 크산틸산 아미나제 유전자의 구조유전자 부분, 2) 전사종결인자(E. coli trpA terminator, ρ-independent), 3) 범용 단백질합성 종결인자(universal translational terminator, stop codon), 4) class IIS 제한효소 절단부위 및 5) 외부염기 서열도입 부위(cloning site).
5'- 크산틸산 아미나제 유전자의 구조유전자 부분은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 의해 수행하였으며, 이때 개시코돈 부위의 서열과 합성한 프라이머의 서열은 다음과 같다.
→5'-크나틸산 아미나제유전자
전사종결인자는 기존에 보고된 것 중 가장 강력하게 작동하는 것으로 알려진 대장균의 trpA 종결일자를 사용하기로 결정하였으며 이는 ρ-독립적으로서 염기서열은 아래와 같으며, 두 가닥을 모두 합성하였다. 이때 한쪽 말단에는 T4 DNA 리가제 처리에 의해 도입된 후에 Not I 제한효소 절단부위가 생산되도록 하였다.
범용 단백질합성 종결인자(universal translational terminator, stop codon)는 아래의 서열을 갖는 것으로 다음과 같이 합성하였다. class IIS 제한효소 절단부위와 외부 염기 서열도입을 위한 클로닝 부위는 아래와 같이 합성을 하였다. 이때 사용할 class IIS 제한효소는 BsaI 으로 결정하였는데, 이는 다발성 절단 부위 바깥에 1개가 존재하는데 이를 제거하기 위하여 인접한 class IIS 제한효소인 Bpm1 으로 절단한 뒤 멍빈 뉴클레아제(mung bean nuclease)처리 후 T4 DNA 리가제 처리에 의해 제거하였다.
합성된 DNA의 정제는 55℃에서 12내지 18시간 방치한 후 1/3 부피의 증류수를 첨가하여 동일부피의 1-부탄올을 3내지 4회 추출하여 암모니아를 제거하면서 농축시킨 후 진공상태에서 원심분리하면서 건조시켰다. 여기에 증류수를 적당량 첨가하여 흡광분석기(spectrophotometer)로 파장 260에서의 흡광도를 측정해서 정량한 후 최종적으로 프라이머의 농도를 100pmol/㎕ 로 조정하였다. 이렇게 하여 얻어진 DNA는 분자클로닝 실험 조작법(Molecular Cloning; A laboratory manual, 2nd ed., J. Sambrook, E.F., Fritch, T., Maniatis) 에 의거하여 폴리아크릴아미드겔 전기영동(PAGE)방법에 의해 한 단계 더 정제를 거친 후 에 실험에 사용하였으며, 매 단계의 클로닝 후에는 클로닝의 여부를 염기서열 분석(double strand sequencing)에 의해 수행하였다.
(3) 중합효소 연쇄반응에 의한 5'-크산틸산 아미나제 유전자 클로닝
재조합 플라스미드 pGH16(KCCM 10008)을 주형(template)으로하여 프라이머 1 및 2를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 이때의 반응 혼합액의 조성은 하기 표 2와 같다.
1× 완충욕액(10mM KCI, 10mM (NH)So20mM 트리스 -HCI(pH 8.8, 25℃), 20mM MgSO0.1% 트리톤×-100
중합효소연쇄반응에서 사용한 온도조절계로는 Perkin Elmer 사의 DNA Thermal Cycler 480을 사용하였으며 반응주기시 반응조건은 하기 표 3과 같다.
상기의 반응조성 및 조건에서 약 1.5kb의 5'-크산틸산 아미나제 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자를 아가로스겔 상에서 전기영동하여 증폭된 DNA의 크기 및 양을 확인하고, 프로테이나제 K 반응액(proteninase K 100㎕/㎖, SDS, 0.5%, EDTA 5mM)을 첨가하여 56℃ 에서 30분간 반응시킨 후 페놀/클로르포름 혼합액으로 추출하여 잔존하는 단백질 성분을 모두 제거하였다. 여기에 1/10 부피의 3.0M 소디움아세테이트(pH 4.8)와 2배의 에탄올을 첨가하고 얼음에서 10분간 방치시키고 나서 원심분리한 후 침전물을 70% 에탄올로 씻어준 다음 진공상태에서 건조시켰다.
그리고 나서 침전물을 TE 완충액(10mM 트리스(pH 8.0), 1mM EDTA)에 녹인 다음 dNTP 존재하에서 T4 DNA 중합효소를 처리하여 말단을 블런트로 만든 뒤 이후의 실험에 사용하였다.
(4) 셔틀벡터 pECCG117의 변형 및 5'-크산틸산 아미나제 유전자 도입
셔틀벡터 pECCG117에 프로모터 분석용 class IIS 제한효소 BsaI 의 절단부위를 도입하기 위하여 기존에 pECCG117에 존재하는 BsaI 절단부위를 제거하기 위하여 인접한 또 다른 class IIS 제한효소인 BpmI 으로 처리한 후 명 빈 뉴클레아제로 처리하여 블런트 말단을 만든 뒤, T4 DNA 리가제로 결합시켰다. 이 변형된 재조합 플라스미드를 제한효소 EcoRV로 절단하고 CIP 처리한 뒤에 전 공정인 PCR에 의해 제작된 5'-크산틸산 아미나제 유전자의 DNA 절편과 혼합하여 T4 DNA 리가제 처리 후 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 균즈를 형질전환시켰다. 여기에서 얻어진 재조합 플라스미드 중에서 5'-크산틸산 아미나제 유전자의 방향이 올바르게 된 것을 염기서열분석에 의해 선별하여 pGNH 1 이라 명명하고 이후의 실험에 사용하였다.
(5) 합성 DNA 도입
재조합 플라스미드 pGNH 1 을 제한효소 NotI 으로 절단한 뒤, CIP 를 처리하여 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 처리 및 어닐링시킨 프라이머 3과 프라이머 4를 혼합하여 T4 DNA 리가제 처리 후 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 균주에 형질전환하였다. 여기에서 얻어진 재조합 플라스미드 중에서 도입된 합성 DNA의 방향이 올바르게 된 것을 염기서열분석에 의해 선별하여 pGNT7이라 명명하고 다음의 실험에 사용하였다. 계속해서 재조합 플라스미드 pGNT7을 제한효소 NotI으로 절단한 뒤, CIP를 처리하여 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제 처리 및 어닐링시킨 프라이며 5와 플라이머 6을 혼합하여 T4 DNA 리가제 처리후 브레비박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 균주에 형질전환하였다. 여기에서 얻어진 재조합 플라스미드 중에서 도입된 합성 DNA 의 방향이 올바르게 된 것을 염기서열 분석에 의해 선별하여 pBRPR이라 명명하였다.
[실시예 2]
재조합 플리스미드 pBRPR의 프로모터 스크리닝 기능 확인
실시예 1에서 제작된 재조합 플라스미드 pBRPR이 프로모터 스크리닝용 백터로서 제대로 작동하는지를 확인하기 위하여 코리네형 클루타메이트 생산균의 일종인 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 보고된 바 있는 fda유전자(fructose-1, 6-diphosphate aldolase gene)의 프로모터 염기서열을 합성하여 도입하였다. 이는 아래의 염기서열을 가지며, Sinskey group 에서 보고한 바 있다.(Molecular Microbiology 3(11), 1625-1637, 1989).
상기의 DNA 이에 상보적인 DNA를 합성하여 재조합 플라스미드 pBRPR의 제한효소 ECOR절단 부위에 도입하여 BRPR-fda라 명명하였다. 이어서 재조합 플라스미드 pBRPR-fda에 의한 5'-크산틸산 아미나제 효소역가 및 구아닌이 존재하지 않는 최소평판 배지에서의 브레비박테리움 암모니아게네스 변이주 D1550-40(아데닌 및 구아닌 요구주)을 성장시킬 수 있는지의 여부를 비교한 결과, 형질전환주 ATCC6872/pBRPR에 증가된 5'-크산틸산 아미나제 효소역가를 부여하였으며, 구아닌이 존재하지 않은 최소 한천 평판배지(글루코오즈 10 g/L, 황산암모늄 2 g/L, 요소 2 g/L, 인산1수소칼륨 0.2 g/L, 인산2수소칼륨 0.2 g/L, 황산마그네슘 0.1 g/L, 염화칼슘 0.1 g/L, d-비오틴 100 mg/L, 염산티아민 100㎍/L , 보락스 88 mg /L, 몰리브덴산암모늄 36mg /L, 황산아연 8.8 mg/L, 황산구리 270 mg/L, 염화망간 7.7 mg/L, 염화제1철 970 mg/L, 한천 20g/L; pH 7.2) 에서의 변이주 D1550-40을 성장시킬 수 있었다. 공지의 방법에 따라 5'-크산틸산 아미나제의 효소역가를 분석한 결과 하기 표 4로 나타났다.
* 효소활성의 단위(U)는 반응 후 단위 시간당 290nm에서 흡광도의 증가로써 표시하였다.
상기의 결과는 재조합 플라스미드 pBRPR이 프로모터 스크리닝 캑터로서 기능을 할 수 있음을 나타낸다.
[실시예 3]
재조합 플라스미드 pBRPR의 프로모터 분석 기능 확인
재조합 플라스미드 pBRPR-fda를 class IIS 제한효소 BsaI으로 절단하고 멍빈 뉴클레아제로 처리한 뒤, T4 DNA 리가제로 반응 시켜 자체결합(self ligation)시킨 뒤, 5'-크산틸산 아미나제 효소역가 및 구아닌이 존재하지 않는 최소평판 배지에서의 변이주 D1550-40을 성장시킬 수 있는지의 여부를 확인하였다. 이러한 실험을 반복적으로 수행하여 5'-크산틸산 아미나제 효소역가가 발현되지 않고, 구아닌이 존재하지 않는 최소평판 배지에서의 변이주 D1550-40을 성장시킬 수 없을 때 까지 실험을 계속한 뒤 염기서열을 본 결과, 실시예 2에서 도입한 프로모터 염기서열이 일부 제거 되었음이 확인되었다. 이 결과로부터 재조합 플라스미드 pBRPR이 프로모터 분석기능을 수행할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (4)

  1. 코리네형 글루타메이트생산 균에서 유래된 유전자의 프로모터를 스크리닝 및 분석하는 기능을 가진 재조합 플라스미드 벡터 pBRPR.
  2. 제1항에 있어서, 코리네형 글루타메이트생산균 에서 유래된 유전자의 프로모터가 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Coyrnebacterium glutamicum)으로부터 유래된 프로모터인 벡터.
  3. 제1항의 플라스미드 벡터에 코리네형 글루타메이트생산 균에서 유래된 유전자의 프로모터를 삽입하고, 형성된 재조합 플라스미드를 코리네형 글루나케이트생산 균에 형질전환시키고, 이 형질전환체와 비형질전환 균주 간에 그 유전자에 대한 효소 역가의 증가를 검정함을 특징으로하여, 언급된 프로모터를 스크리닝하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 코리네형 글루타메이트생산 균에서 유래된 유전자의 프로모터가 브레비박테리움 플라붐, 브레비박테리움 락토퍼멘텀, 브레비박테리움 암모니아게네스 또는 코리네박테리움 글루타미쿰에서 유래된 유전자의 방법.
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