JPH07119239B2 - 黒腫に対する人モノクローナル抗体及びその製法 - Google Patents
黒腫に対する人モノクローナル抗体及びその製法Info
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- JPH07119239B2 JPH07119239B2 JP3261615A JP26161591A JPH07119239B2 JP H07119239 B2 JPH07119239 B2 JP H07119239B2 JP 3261615 A JP3261615 A JP 3261615A JP 26161591 A JP26161591 A JP 26161591A JP H07119239 B2 JPH07119239 B2 JP H07119239B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3053—Skin, nerves, brain
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は黒腫に反応性の人抗体獲
得法、本発明方法により得られた抗体並びにその使用に
関する。
得法、本発明方法により得られた抗体並びにその使用に
関する。
【０００２】
【従来の技術】皮膚の腫瘍である黒腫は著しく攻撃的な
腫瘍である。特に転移する黒腫は従来の方法ではほとん
ど治療することがむずかしい。従って、黒腫を治療する
ために好適な新しい治療法を見い出すことは大きな要求
である。
腫瘍である。特に転移する黒腫は従来の方法ではほとん
ど治療することがむずかしい。従って、黒腫を治療する
ために好適な新しい治療法を見い出すことは大きな要求
である。
【０００３】ディッポルド（Ｄｉｐｐｏｌｄ）等（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７７巻
（１９８０年）、第６１１４〜６１１８頁）は、黒腫に
対するマウスのモノクローナル抗体の製造に関して報告
している。そこに開示された抗体の１つはガングリオシ
ドＧＤ３に反応する。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６
２巻、１９８７年、第６８０２〜６８０７頁中には同様
に黒腫に対するマウスのモノクローナル抗体が記載され
ている。これは同じようにＧＭ３及びＧＭ２に結合する
が、ＧＤ３には結合しない。
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７７巻
（１９８０年）、第６１１４〜６１１８頁）は、黒腫に
対するマウスのモノクローナル抗体の製造に関して報告
している。そこに開示された抗体の１つはガングリオシ
ドＧＤ３に反応する。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６
２巻、１９８７年、第６８０２〜６８０７頁中には同様
に黒腫に対するマウスのモノクローナル抗体が記載され
ている。これは同じようにＧＭ３及びＧＭ２に結合する
が、ＧＤ３には結合しない。
【０００４】１９８２年にイリー（Ｉｒｉｅ）等（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第７９
巻、第５６６６〜５６７０頁）は黒腫と反応する人モノ
クローナル抗体の製造に関して報告した。そこに開示さ
れたモノクローナル抗体はガングリオシドＧＭ２もしく
はＧＤ２と反応する。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８４巻、１９８７年、第２４１６〜
２４２０頁中には同様に黒腫に対する人モノクローナル
抗体が記載されている。これらはＧＤ３及びＧＤ２もし
くはＧＭ３及びＧＤ１ａに強く結合する。Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ第４９巻、１９８９年、第１９１〜
１９６頁中にも同様に黒腫に対する人モノクローナル抗
体が記載されている。これらはＧＭ３及びＧＤ１ａもし
くはＧＤ３及びＧＤ２に強く結合する。これらのモノク
ローナル抗体の製造のために使用したリンパ球は黒腫患
者に由来する。
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第７９
巻、第５６６６〜５６７０頁）は黒腫と反応する人モノ
クローナル抗体の製造に関して報告した。そこに開示さ
れたモノクローナル抗体はガングリオシドＧＭ２もしく
はＧＤ２と反応する。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ 第８４巻、１９８７年、第２４１６〜
２４２０頁中には同様に黒腫に対する人モノクローナル
抗体が記載されている。これらはＧＤ３及びＧＤ２もし
くはＧＭ３及びＧＤ１ａに強く結合する。Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ第４９巻、１９８９年、第１９１〜
１９６頁中にも同様に黒腫に対する人モノクローナル抗
体が記載されている。これらはＧＭ３及びＧＤ１ａもし
くはＧＤ３及びＧＤ２に強く結合する。これらのモノク
ローナル抗体の製造のために使用したリンパ球は黒腫患
者に由来する。
【０００５】文献中に記載されているモノクローナル抗
体は免疫化しているか又はしていない黒腫患者から得ら
れるか、又は実験動物の免疫化により又は免疫後に得ら
れる。生体内においても黒腫に作用する抗体を獲得する
ためのこの種の実験配合物は大きな欠点を示す。マウス
のモノクローナル抗体は人免疫系により異種タンパク質
として識別され、これによりこの異種タンパク質に対す
る抗体が形成されるという欠点を有する。このことはそ
のようなモノクローナル抗体がより迅速に除去され、こ
うしてその作用が制限されることを意味する。しかし、
腫瘍患者から得られた抗体においても、その作用に関し
て大きな疑問が存在する、それというのもまさに腫瘍患
者においては免疫系の機能性が与えられないためであ
る。その上に公知技術の抗体はすべての原発性黒腫を認
識するわけでは全くなく、かつ転移黒腫の非常に僅かな
部分のみを認識するにすぎない。
体は免疫化しているか又はしていない黒腫患者から得ら
れるか、又は実験動物の免疫化により又は免疫後に得ら
れる。生体内においても黒腫に作用する抗体を獲得する
ためのこの種の実験配合物は大きな欠点を示す。マウス
のモノクローナル抗体は人免疫系により異種タンパク質
として識別され、これによりこの異種タンパク質に対す
る抗体が形成されるという欠点を有する。このことはそ
のようなモノクローナル抗体がより迅速に除去され、こ
うしてその作用が制限されることを意味する。しかし、
腫瘍患者から得られた抗体においても、その作用に関し
て大きな疑問が存在する、それというのもまさに腫瘍患
者においては免疫系の機能性が与えられないためであ
る。その上に公知技術の抗体はすべての原発性黒腫を認
識するわけでは全くなく、かつ転移黒腫の非常に僅かな
部分のみを認識するにすぎない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は公知技術の欠点が少なくとも部分的に取り除かれてい
る、黒腫に対する抗体を製造することである。
は公知技術の欠点が少なくとも部分的に取り除かれてい
る、黒腫に対する抗体を製造することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明による課題は、ガ
ングリオシドＧＭ３及びＧＤ３に結合するが、ガングリ
オシドＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ及びＧＤ２
にはほぼ結合せず、この際ガングリオシドへの抗体の結
合はガングリオシドの薄層クロマトグラフィー分離後の
免疫染色により測定されることを特徴とする、黒腫に対
する抗体の製造により解決する。
ングリオシドＧＭ３及びＧＤ３に結合するが、ガングリ
オシドＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ及びＧＤ２
にはほぼ結合せず、この際ガングリオシドへの抗体の結
合はガングリオシドの薄層クロマトグラフィー分離後の
免疫染色により測定されることを特徴とする、黒腫に対
する抗体の製造により解決する。
【０００８】人抗体である本発明による抗体は、予め免
疫化することなしにＢ−リンパ球を健常な人から単離
し、この単離したＢ−リンパ球を不滅化し、この不滅化
Ｂ−リンパ球からの抗体を原発性黒腫又は／及び転移黒
腫に対する結合に関して免疫組織化学的分析により調
べ、プラスに反応するクローンを選択し、培養し、かつ
これからモノクローン抗体を獲得する方法により得られ
る。
疫化することなしにＢ−リンパ球を健常な人から単離
し、この単離したＢ−リンパ球を不滅化し、この不滅化
Ｂ−リンパ球からの抗体を原発性黒腫又は／及び転移黒
腫に対する結合に関して免疫組織化学的分析により調
べ、プラスに反応するクローンを選択し、培養し、かつ
これからモノクローン抗体を獲得する方法により得られ
る。
【０００９】黒腫に罹病していない健常な人からの黒腫
に反応する抗体の獲得は全く驚きである。Ｂ−リンパ球
に関する提供者としては健常な黒腫罹病リスクの高い人
を選択することが有利である。黒腫罹病リスクの高い人
とは例えば日焼けのリスクの高い人を意味する、すなわ
ち予め（特に有利には長期間に渡って）強力なＵＶ−照
射を受けた、場合によりソバカスを有する明るい色の髪
又は明るい色の皮膚の人である。黒腫に反応し、かつ有
効な人抗体を獲得するための本発明による方法の適性
は、多分それぞれの人に恒常的に存在する細胞が変性
し、これにより黒腫細胞が生じ、これはその身体自体の
免疫系によって十分に闘かわれるということに起因する
と思われる。
に反応する抗体の獲得は全く驚きである。Ｂ−リンパ球
に関する提供者としては健常な黒腫罹病リスクの高い人
を選択することが有利である。黒腫罹病リスクの高い人
とは例えば日焼けのリスクの高い人を意味する、すなわ
ち予め（特に有利には長期間に渡って）強力なＵＶ−照
射を受けた、場合によりソバカスを有する明るい色の髪
又は明るい色の皮膚の人である。黒腫に反応し、かつ有
効な人抗体を獲得するための本発明による方法の適性
は、多分それぞれの人に恒常的に存在する細胞が変性
し、これにより黒腫細胞が生じ、これはその身体自体の
免疫系によって十分に闘かわれるということに起因する
と思われる。
【００１０】本発明方法の第１の工程は健常人の血液か
らＢ−リンパ球を獲得することである。本発明における
“健常人”とは黒腫の症候を全く示さない人と定義され
る。このことは自体公知の方法により行なわれる。引き
続きリンパ球の不滅化が行なわれる。このために種々の
方法が提供される。このＢ−リンパ球を人又はマウスか
ら由来する骨髄腫細胞とケーラー及びミルスタイン（Ｋ
ｏｅｈｌｅｒ、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ；Ｎａｔｕｒｅ、第２
５６巻、１９７５年、第４９５頁）の方法により融合す
る。融合のためにはヘテロ骨髄腫を使用することができ
る。同様に、Ｂ−リンパ球をエプスタイン・バール・ビ
ールス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ−Ｖｉｒｕｓ）によ
り形質転換することが可能である。更に、ヨーロッパ特
許公開第００９３４３６号又は同第０２５６５１２号公
報に記載された方法を使用することができる。この際、
形質転換するＤＮＡを含有する亜細胞のベシクルと融合
する。
らＢ−リンパ球を獲得することである。本発明における
“健常人”とは黒腫の症候を全く示さない人と定義され
る。このことは自体公知の方法により行なわれる。引き
続きリンパ球の不滅化が行なわれる。このために種々の
方法が提供される。このＢ−リンパ球を人又はマウスか
ら由来する骨髄腫細胞とケーラー及びミルスタイン（Ｋ
ｏｅｈｌｅｒ、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ；Ｎａｔｕｒｅ、第２
５６巻、１９７５年、第４９５頁）の方法により融合す
る。融合のためにはヘテロ骨髄腫を使用することができ
る。同様に、Ｂ−リンパ球をエプスタイン・バール・ビ
ールス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ−Ｖｉｒｕｓ）によ
り形質転換することが可能である。更に、ヨーロッパ特
許公開第００９３４３６号又は同第０２５６５１２号公
報に記載された方法を使用することができる。この際、
形質転換するＤＮＡを含有する亜細胞のベシクルと融合
する。
【００１１】黒腫に対して所望の反応性を有する抗体を
生産するものを不滅化したＢ−リンパ球から選択する。
黒腫に反応し、かつ転移にも有効である抗体の分泌に関
するＢ−リンパ球の選択は本発明により黒腫組織切片に
対する結合に関して免疫組織化学的分析により行なう
が、この際原発性黒腫又は／及び転移黒腫を使用するこ
とができる。抗体の免疫組織化学的分析はニールセン
（Ｎｉｅｌｓｅｎ）等の方法に類似のエリザ（ＥＬＩＳ
Ａ）テストを用いて組織切片中の黒腫への結合により行
なうのが有利である。このようにしてプラスであること
が判明したＢ−リンパ球を選択し、常法により培養し、
かつこれから専門家に公知の方法によりモノクローナル
抗体を獲得する。
生産するものを不滅化したＢ−リンパ球から選択する。
黒腫に反応し、かつ転移にも有効である抗体の分泌に関
するＢ−リンパ球の選択は本発明により黒腫組織切片に
対する結合に関して免疫組織化学的分析により行なう
が、この際原発性黒腫又は／及び転移黒腫を使用するこ
とができる。抗体の免疫組織化学的分析はニールセン
（Ｎｉｅｌｓｅｎ）等の方法に類似のエリザ（ＥＬＩＳ
Ａ）テストを用いて組織切片中の黒腫への結合により行
なうのが有利である。このようにしてプラスであること
が判明したＢ−リンパ球を選択し、常法により培養し、
かつこれから専門家に公知の方法によりモノクローナル
抗体を獲得する。
【００１２】本発明方法により、転移黒腫に対し非常に
高い反応性をも有する、黒腫に対する抗体を得ることも
可能である。こうして、本発明は組織切片において転移
黒腫の少なくとも７０％に結合する、黒腫に対する人抗
体も包含する。
高い反応性をも有する、黒腫に対する抗体を得ることも
可能である。こうして、本発明は組織切片において転移
黒腫の少なくとも７０％に結合する、黒腫に対する人抗
体も包含する。
【００１３】本発明による抗体は、ガングリオシドＧＭ
３及びＧＤ３に結合し、ガングリオシドＧＭ１、ＧＭ
２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ及びＧＤ２にほぼ結合しないこ
とを特徴とする。このことは、本発明による抗体はガン
グリオシドＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ及びＧ
Ｄ２に、ガングリオシドＧＭ３又はガングリオシドＧＤ
３への親和性に対して最高でも約５％の親和性で結合す
るということを意味する。ガングリオシドへの本発明に
よる抗体の結合性の測定は、ガングリオシドの薄層クロ
マトグラフィー分離後の免疫染色により行なわれる。こ
の方法により、抗体に特異的ガングリオシドが結合して
いるか又はしていないかを決定することが確実な方法に
より可能である。抗体の親和性をエリザテスト法により
測定することはあまり有利ではない。この方法において
は、非特異的結合を排除することは不可能であるので、
誤まったプラスの結果の可能性がある。この誤まったプ
ラスの結果は他の上記方法により全く結合を確認されな
いガングリオシドへのわずかな結合親和性において述べ
られているであろう。
３及びＧＤ３に結合し、ガングリオシドＧＭ１、ＧＭ
２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ及びＧＤ２にほぼ結合しないこ
とを特徴とする。このことは、本発明による抗体はガン
グリオシドＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ及びＧ
Ｄ２に、ガングリオシドＧＭ３又はガングリオシドＧＤ
３への親和性に対して最高でも約５％の親和性で結合す
るということを意味する。ガングリオシドへの本発明に
よる抗体の結合性の測定は、ガングリオシドの薄層クロ
マトグラフィー分離後の免疫染色により行なわれる。こ
の方法により、抗体に特異的ガングリオシドが結合して
いるか又はしていないかを決定することが確実な方法に
より可能である。抗体の親和性をエリザテスト法により
測定することはあまり有利ではない。この方法において
は、非特異的結合を排除することは不可能であるので、
誤まったプラスの結果の可能性がある。この誤まったプ
ラスの結果は他の上記方法により全く結合を確認されな
いガングリオシドへのわずかな結合親和性において述べ
られているであろう。
【００１４】本発明による方法を用いて獲得することの
できる抗体の例はモノクローナル抗体“１７”及びＡＨ
１８であり、これらはハイブリドーマセルラインＥＣＡ
ＣＣ９００９０７０３及びＥＣＡＣＣ９００９０７０１
から分泌される。これらの抗体はクラスＩｇＭのもので
ある。
できる抗体の例はモノクローナル抗体“１７”及びＡＨ
１８であり、これらはハイブリドーマセルラインＥＣＡ
ＣＣ９００９０７０３及びＥＣＡＣＣ９００９０７０１
から分泌される。これらの抗体はクラスＩｇＭのもので
ある。
【００１５】本発明のもう１つの課題はハイブリドーマ
セルラインＥＣＡＣＣ９００９０７０３又はＥＣＡＣＣ
９００９０７０１から得られるモノクローナル抗体と同
様な結合性を有する人モノクローナル抗体である。“同
様に結合性の抗体”という概念は考慮される抗体とのエ
ピトープ重なりを検出可能である抗体を表わす。このエ
ピトープ重なりは競合テスト法を用いて検出することが
できる。このためには例えば酵素−イムノアッセイを用
いて、ある抗体が公知抗体と一定の抗原もしくは特別な
エピトープへの結合に関してどの程度競合するかという
ことを試験する。このためには相応する固定抗原を標識
した形の本発明による抗体及び考慮される抗体の過剰と
恒温保持する。結合した標識の検出により、考慮される
抗体が定義した抗体をどの程度追い出すことができるか
を容易に確認することができる。１０5倍の過剰におい
て少なくとも５０％の追出しが生じる場合は、エピトー
プ重なりが存在する。
セルラインＥＣＡＣＣ９００９０７０３又はＥＣＡＣＣ
９００９０７０１から得られるモノクローナル抗体と同
様な結合性を有する人モノクローナル抗体である。“同
様に結合性の抗体”という概念は考慮される抗体とのエ
ピトープ重なりを検出可能である抗体を表わす。このエ
ピトープ重なりは競合テスト法を用いて検出することが
できる。このためには例えば酵素−イムノアッセイを用
いて、ある抗体が公知抗体と一定の抗原もしくは特別な
エピトープへの結合に関してどの程度競合するかという
ことを試験する。このためには相応する固定抗原を標識
した形の本発明による抗体及び考慮される抗体の過剰と
恒温保持する。結合した標識の検出により、考慮される
抗体が定義した抗体をどの程度追い出すことができるか
を容易に確認することができる。１０5倍の過剰におい
て少なくとも５０％の追出しが生じる場合は、エピトー
プ重なりが存在する。
【００１６】本発明による抗体が黒腫だけではなく、他
の腫瘍組織、特に肺癌腫及び乳癌腫組織に結合すること
もできることが意外にも確認された。これに関する１つ
の例は本発明による抗体“１７”である。
の腫瘍組織、特に肺癌腫及び乳癌腫組織に結合すること
もできることが意外にも確認された。これに関する１つ
の例は本発明による抗体“１７”である。
【００１７】更に、本願発明は、その結合特異性を有す
るが、抗原結合に関して重要でない領域における修飾を
示す、本発明による抗体の誘導体をも包含する。この抗
体誘導体は本発明による抗体を１種以上の不変の分域の
交換又は／及び他の分子との結合により得ることができ
る。こうして、例えば不変分域の交換をイソタイプ−ス
イッチに関して行なうことができ、ここでは例えばクラ
スＩｇＭの抗体をクラスＩｇＧの抗体中にその抗原特異
性の保持下に導入することができる。このイソタイプ−
スイッチは細胞生物学的又は分子生物学的方法により行
なうことができ、これは専門家に公知である（例えばＲ
ｏｔｈｍａｎ Ｐ．等、Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
第１０巻、１９９０年、第１６７２〜１６７９頁）。し
かしながら、本発明によるモノクローナル抗体は他の分
子、特にマーカー又はトキシンとも結合していてよく、
これによりその診断又は治療への使用可能性も変わる。
マーカー（例えばペルオキシダーゼのような酵素）又は
トキシン（例えば、リシン、コレラトキシン）と抗体と
の好適な結合法もしくは放射性標識付は専門家に公知で
ある。
るが、抗原結合に関して重要でない領域における修飾を
示す、本発明による抗体の誘導体をも包含する。この抗
体誘導体は本発明による抗体を１種以上の不変の分域の
交換又は／及び他の分子との結合により得ることができ
る。こうして、例えば不変分域の交換をイソタイプ−ス
イッチに関して行なうことができ、ここでは例えばクラ
スＩｇＭの抗体をクラスＩｇＧの抗体中にその抗原特異
性の保持下に導入することができる。このイソタイプ−
スイッチは細胞生物学的又は分子生物学的方法により行
なうことができ、これは専門家に公知である（例えばＲ
ｏｔｈｍａｎ Ｐ．等、Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．
第１０巻、１９９０年、第１６７２〜１６７９頁）。し
かしながら、本発明によるモノクローナル抗体は他の分
子、特にマーカー又はトキシンとも結合していてよく、
これによりその診断又は治療への使用可能性も変わる。
マーカー（例えばペルオキシダーゼのような酵素）又は
トキシン（例えば、リシン、コレラトキシン）と抗体と
の好適な結合法もしくは放射性標識付は専門家に公知で
ある。
【００１８】本発明の更なる課題は黒腫の診断又は治療
のための、特に黒腫患者の受動及び能動免疫のための本
発明による抗体の使用である。この際、有利にセルライ
ンＥＣＡＣＣ９００９０７０３から分泌される抗体“１
７”又は／及びセルラインＥＣＡＣＣ９００９０７０１
から分泌される抗体ＡＨ１８を使用する。
のための、特に黒腫患者の受動及び能動免疫のための本
発明による抗体の使用である。この際、有利にセルライ
ンＥＣＡＣＣ９００９０７０３から分泌される抗体“１
７”又は／及びセルラインＥＣＡＣＣ９００９０７０１
から分泌される抗体ＡＨ１８を使用する。
【００１９】本発明方法により得られたモノクローナル
抗体は生きた黒腫細胞及び他の腫瘍細胞に結合するの
で、生体中のこの細胞との戦かいにも使用することがで
きる。こうして、本発明は１種又は複数種の本発明によ
る抗体からなり、かつ、場合により常用の医薬担体、助
剤、充填剤及び添加剤を一緒に含有してなる医薬組成物
も包含する。本発明による医薬組成物の投与は腫瘍、特
に黒腫の予防にも転移の後にも可能である。受動免疫の
ために好適な本発明による抗体の投与量は１〜２００ｍ
ｇであり、この際この投与量は場合により繰り返し投与
される。このモノクローナル抗体はイリー（Ｉｒｉｅ）
及びモルトン（Ｍｏｒｔｏｎ）が記載したように（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８３
巻、１９８６年、第８６９４〜８６９８頁）、黒腫中に
局所投与することができる。しかしながら、黒腫の転移
後は専門家によりしばしば行なわれる全身投与が有利で
ある。本発明による抗体は有利に単独で治療に使用され
るが、毒素、治療剤等との結合体としても使用すること
ができる。
抗体は生きた黒腫細胞及び他の腫瘍細胞に結合するの
で、生体中のこの細胞との戦かいにも使用することがで
きる。こうして、本発明は１種又は複数種の本発明によ
る抗体からなり、かつ、場合により常用の医薬担体、助
剤、充填剤及び添加剤を一緒に含有してなる医薬組成物
も包含する。本発明による医薬組成物の投与は腫瘍、特
に黒腫の予防にも転移の後にも可能である。受動免疫の
ために好適な本発明による抗体の投与量は１〜２００ｍ
ｇであり、この際この投与量は場合により繰り返し投与
される。このモノクローナル抗体はイリー（Ｉｒｉｅ）
及びモルトン（Ｍｏｒｔｏｎ）が記載したように（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８３
巻、１９８６年、第８６９４〜８６９８頁）、黒腫中に
局所投与することができる。しかしながら、黒腫の転移
後は専門家によりしばしば行なわれる全身投与が有利で
ある。本発明による抗体は有利に単独で治療に使用され
るが、毒素、治療剤等との結合体としても使用すること
ができる。
【００２０】本発明方法により得られた抗体は黒腫及び
転移黒腫と結合性であるので、組織中の黒腫細胞及び他
の腫瘍細胞の定性又は定量検出にも優れて適している。
この際、この検出は自体公知法で免疫学的測定法で行な
われる。この種の方法は専門家によりしばしば行なわれ
るので、ここでもはや説明する必要はない。この際、本
発明により得られた抗体は非標識、標識又は／及び固定
レセプターとして使用することができる。
転移黒腫と結合性であるので、組織中の黒腫細胞及び他
の腫瘍細胞の定性又は定量検出にも優れて適している。
この際、この検出は自体公知法で免疫学的測定法で行な
われる。この種の方法は専門家によりしばしば行なわれ
るので、ここでもはや説明する必要はない。この際、本
発明により得られた抗体は非標識、標識又は／及び固定
レセプターとして使用することができる。
【００２１】モノクローナル抗体により限定された抗原
もしくはエピトープも同様に体液中の免疫化学的測定法
により検出することができる。この際、本発明によるモ
ノクローナル抗体は標識付又は／及び固定化レセプター
として使用される。この測定法を実施するためには多く
の変法が公知であり、これらはすべて好適である。こう
して、２種又は３種又はそれ以上のレセプターを使用す
ることができ、かつ個個のレセプターとの恒温保持はい
ろいろの順序で、均一相又は不均一相で行なわれる。評
価は少なくとも２種のレセプターと試料溶液中で検出す
べき物質との結合により生じるシグナル変化により行な
われる。有利に本発明による測定は均一相中で、例えば
凝集テストの原理により行なわれ、この際レセプターと
して被覆された粒子、例えばラテックス粒子又は赤血球
を使用し、これを特異的に結合性のレセプター及び検出
すべき細胞と結合させることにより網状化し、これによ
り凝集させるか、又は不均一相で、有利にサンドイッチ
イムノアッセイとして行なう。いずれの場合において
も、少なくとも２種のレセプターＲ1及びＲ2を使用し、
そのうちの１つは本発明によるモノクローナル抗体（例
えば“１７”）又は同様に結合性の抗体又はこれから得
られる誘導体を含有し、他のレセプターは他の本発明に
よる抗体（例えばＡＨ１８）又は同様に結合性の抗体又
はその誘導体を含有する。
もしくはエピトープも同様に体液中の免疫化学的測定法
により検出することができる。この際、本発明によるモ
ノクローナル抗体は標識付又は／及び固定化レセプター
として使用される。この測定法を実施するためには多く
の変法が公知であり、これらはすべて好適である。こう
して、２種又は３種又はそれ以上のレセプターを使用す
ることができ、かつ個個のレセプターとの恒温保持はい
ろいろの順序で、均一相又は不均一相で行なわれる。評
価は少なくとも２種のレセプターと試料溶液中で検出す
べき物質との結合により生じるシグナル変化により行な
われる。有利に本発明による測定は均一相中で、例えば
凝集テストの原理により行なわれ、この際レセプターと
して被覆された粒子、例えばラテックス粒子又は赤血球
を使用し、これを特異的に結合性のレセプター及び検出
すべき細胞と結合させることにより網状化し、これによ
り凝集させるか、又は不均一相で、有利にサンドイッチ
イムノアッセイとして行なう。いずれの場合において
も、少なくとも２種のレセプターＲ1及びＲ2を使用し、
そのうちの１つは本発明によるモノクローナル抗体（例
えば“１７”）又は同様に結合性の抗体又はこれから得
られる誘導体を含有し、他のレセプターは他の本発明に
よる抗体（例えばＡＨ１８）又は同様に結合性の抗体又
はその誘導体を含有する。
【００２２】体液を両方のレセプターと恒温保持する際
に、Ｒ1、ガングリオシド及びＲ2からの複合体が形成さ
れる。これらのレセプターは、Ｒ1もＲ2もその中でガン
グリオシドと結合している複合体だけがシグナル変化を
生じ、こうして両方の特異的抗体と結合性であるような
ガングリオシドだけが把握されるように選ばれる。
に、Ｒ1、ガングリオシド及びＲ2からの複合体が形成さ
れる。これらのレセプターは、Ｒ1もＲ2もその中でガン
グリオシドと結合している複合体だけがシグナル変化を
生じ、こうして両方の特異的抗体と結合性であるような
ガングリオシドだけが把握されるように選ばれる。
【００２３】本発明による測定はサンドイッチイムノア
ッセイとして有利に行なわれる。このためにはレセプタ
ーＲ1を固定するか、又は固定可能にし、試料溶液と反
応させる。引き続き、レセプターＲ2を添加する。固定
化レセプターＲ1、検出すべきガングリオシド及びレセ
プターＲ2からなる複合体が形成される。
ッセイとして有利に行なわれる。このためにはレセプタ
ーＲ1を固定するか、又は固定可能にし、試料溶液と反
応させる。引き続き、レセプターＲ2を添加する。固定
化レセプターＲ1、検出すべきガングリオシド及びレセ
プターＲ2からなる複合体が形成される。
【００２４】本発明による抗体は予後の指標を決定する
ためにも使用することができる。この際黒腫患者の治療
の後、モノクローナル抗体により認識される抗原が体液
中、特に患者の血清中に一定の時間後に出現するか、又
は消失するか確認される。
ためにも使用することができる。この際黒腫患者の治療
の後、モノクローナル抗体により認識される抗原が体液
中、特に患者の血清中に一定の時間後に出現するか、又
は消失するか確認される。
【００２５】更に、本発明は腫瘍、特に黒腫の診断又は
治療のための方法をも包含し、この際本発明による抗体
１種又は複数種の混合物を、場合により常用の医薬担
体、助剤、充填剤及び添加剤と一緒に、有利には１〜２
００ｍｇの投与量で投与する。
治療のための方法をも包含し、この際本発明による抗体
１種又は複数種の混合物を、場合により常用の医薬担
体、助剤、充填剤及び添加剤と一緒に、有利には１〜２
００ｍｇの投与量で投与する。
【００２６】本発明において挙げた、抗体“１７”及び
ＡＨ１８を分泌するセルラインＥＣＡＣＣ９００９０７
０３及びＥＣＡＣＣ９００９０７０１はヨーロッパ寄託
機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ａｎｉｍａｌ ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ、Ｐｏｒｔ
ｏｎ Ｄｏｗｎ（ＧＢ））に１９９０年９月７日に寄託
された。
ＡＨ１８を分泌するセルラインＥＣＡＣＣ９００９０７
０３及びＥＣＡＣＣ９００９０７０１はヨーロッパ寄託
機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ａｎｉｍａｌ ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ、Ｐｏｒｔ
ｏｎ Ｄｏｗｎ（ＧＢ））に１９９０年９月７日に寄託
された。
【００２７】
【実施例】次に実施例につき本発明を詳細に説明する。
【００２８】例 １ 黒腫に対する抗体の選択 健常人から血液２０〜２００ｍｌを採血し、これから単
核細胞を単離する。引き続きこの細胞を従来の方法によ
り不滅化する（Ｋｏｅｈｌｅｒ／Ｍｉｌｓｔｅｉｎもし
くはＥＢＶ−形質転換もしくはＤＮＡ−トランスフェク
ション）。２〜４週間後、不滅化細胞の培養上澄を試験
する。このためには、黒腫の人組織切片に関してエリザ
テストを実施する。このテストはニールセン（Ｎｉｅｌ
ｓｅｎ）等の方法と同様にして行なう（Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａ、第６巻、１９８７年、第１０３〜１０９頁）。
核細胞を単離する。引き続きこの細胞を従来の方法によ
り不滅化する（Ｋｏｅｈｌｅｒ／Ｍｉｌｓｔｅｉｎもし
くはＥＢＶ−形質転換もしくはＤＮＡ−トランスフェク
ション）。２〜４週間後、不滅化細胞の培養上澄を試験
する。このためには、黒腫の人組織切片に関してエリザ
テストを実施する。このテストはニールセン（Ｎｉｅｌ
ｓｅｎ）等の方法と同様にして行なう（Ｈｙｂｒｉｄｏ
ｍａ、第６巻、１９８７年、第１０３〜１０９頁）。
【００２９】低温冷凍した腫瘍組織を厚さ３〜５μｍに
切断し、シランで前処理したデッキグラス上に担持す
る。この組織切片を−８０℃で貯蔵するか、又はすぐに
使用する。更に、必要によりアセトン中−２０℃で１０
分間これを固定する。引き続き、場合によりアセトンを
留去し、その後この切片を約３分間ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅ
ｃｃｏ及びＶｏｇｔによる燐酸塩緩衝塩溶液、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．、第９９巻、１９５４年、第１６７〜１８
２頁）中に浸漬する。ＰＢＳのしずくを切った後、遮蔽
抗体（濃度４０μｇ／ｍｌ）２０〜３０μｌを担持す
る。この遮蔽抗体は人ＦｃμもしくはＦｃγに対するネ
ズミモノクローナル抗体の又はポリクローナル羊血清の
Ｆａｂ−フラグメントである。この遮蔽抗体を１〜２時
間、又は１夜室温もしくは４℃で切片上で恒温保持す
る。
切断し、シランで前処理したデッキグラス上に担持す
る。この組織切片を−８０℃で貯蔵するか、又はすぐに
使用する。更に、必要によりアセトン中−２０℃で１０
分間これを固定する。引き続き、場合によりアセトンを
留去し、その後この切片を約３分間ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅ
ｃｃｏ及びＶｏｇｔによる燐酸塩緩衝塩溶液、Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．、第９９巻、１９５４年、第１６７〜１８
２頁）中に浸漬する。ＰＢＳのしずくを切った後、遮蔽
抗体（濃度４０μｇ／ｍｌ）２０〜３０μｌを担持す
る。この遮蔽抗体は人ＦｃμもしくはＦｃγに対するネ
ズミモノクローナル抗体の又はポリクローナル羊血清の
Ｆａｂ−フラグメントである。この遮蔽抗体を１〜２時
間、又は１夜室温もしくは４℃で切片上で恒温保持す
る。
【００３０】引き続き、この切片をＰＢＳ中で４℃で約
４分間３回洗浄する。次いで、試験すべき抗体含有溶液
（すなわち、不滅化細胞の培養上澄）をピペットで担持
する。４℃で数時間（通常２時間）恒温保持した後、抗
体含有溶液をＰＢＳ中で約４分間継続する洗浄を３回行
なうことにより洗い流す。引き続き、この切片を遮蔽に
おけると同じ抗体と共に恒温保持するが、この場合は使
用したモノクローナルもしくはポリクローナル抗体はペ
ルオキシダーゼに結合している（２Ｕ／ｍｌ）。１時間
４℃で恒温保持し、引き続き前記のように洗浄する。次
いで、スライドガラスを基質溶液（ＤＭＳＯ／トリスＨ
Ｃｌ ５０ｍｍｏｌ／ｌ中のアミノエチルカルバゾー
ル、ｐＨ７．３）中でＨ2Ｏ2の存在で浸漬し、かつ約４
〜５分間恒温保持する。引き続き、スライドガラスを約
５分間ＰＢＳ中で洗浄する。
４分間３回洗浄する。次いで、試験すべき抗体含有溶液
（すなわち、不滅化細胞の培養上澄）をピペットで担持
する。４℃で数時間（通常２時間）恒温保持した後、抗
体含有溶液をＰＢＳ中で約４分間継続する洗浄を３回行
なうことにより洗い流す。引き続き、この切片を遮蔽に
おけると同じ抗体と共に恒温保持するが、この場合は使
用したモノクローナルもしくはポリクローナル抗体はペ
ルオキシダーゼに結合している（２Ｕ／ｍｌ）。１時間
４℃で恒温保持し、引き続き前記のように洗浄する。次
いで、スライドガラスを基質溶液（ＤＭＳＯ／トリスＨ
Ｃｌ ５０ｍｍｏｌ／ｌ中のアミノエチルカルバゾー
ル、ｐＨ７．３）中でＨ2Ｏ2の存在で浸漬し、かつ約４
〜５分間恒温保持する。引き続き、スライドガラスを約
５分間ＰＢＳ中で洗浄する。
【００３１】所望の場合、組織切片中の細胞核をヘマラ
ウン（Ｈａｅｍａｌａｕｎ；メルク社、Ｈ2Ｏ中で１：
３希釈）で対比染色してもよい。このためにはスライド
ガラスを約２０秒間ヘマラウン溶液中に浸漬し、引き続
き２つのＰＢＳ浴（各約５分間）中で“青くする”。
ウン（Ｈａｅｍａｌａｕｎ；メルク社、Ｈ2Ｏ中で１：
３希釈）で対比染色してもよい。このためにはスライド
ガラスを約２０秒間ヘマラウン溶液中に浸漬し、引き続
き２つのＰＢＳ浴（各約５分間）中で“青くする”。
【００３２】引き続き、切片を貯蔵のために水性埋め込
み剤（例えばグリセリン−ゼラチン、Ｆａ．Ｍｅｒｋ又
はＫｒｙｓｔａｌ Ｍｏｕｎｔ、Ｆａ Ｂｉｏｍｅｄａ
Ｃｏｒｐ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用い
て被覆する。
み剤（例えばグリセリン−ゼラチン、Ｆａ．Ｍｅｒｋ又
はＫｒｙｓｔａｌ Ｍｏｕｎｔ、Ｆａ Ｂｉｏｍｅｄａ
Ｃｏｒｐ．、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用い
て被覆する。
【００３３】所望の抗体を生産するセルラインを増大さ
せ、かつクローン化する。得られたクローンを同様に、
前記のように分析する。所望の抗体を生産するクローン
を更に培養し、このクローンから生産された抗体を公知
法により獲得する。
せ、かつクローン化する。得られたクローンを同様に、
前記のように分析する。所望の抗体を生産するクローン
を更に培養し、このクローンから生産された抗体を公知
法により獲得する。
【００３４】この方法により、本発明による抗体“１
７”及びＡＨ１８を得ることができた。
７”及びＡＨ１８を得ることができた。
【００３５】例 ２ 抗体特異性テスト 例１により不滅化されたセルラインから得られた人モノ
クローナル抗体の特異性を知るために、人原発性黒腫及
び人転移黒腫への結合に関するテストを実施する。テス
トの実施を例１に記載したように行なった。この際、本
発明による抗体“１７”及びＡＨ１８で次の結果が得ら
れた。
クローナル抗体の特異性を知るために、人原発性黒腫及
び人転移黒腫への結合に関するテストを実施する。テス
トの実施を例１に記載したように行なった。この際、本
発明による抗体“１７”及びＡＨ１８で次の結果が得ら
れた。
【００３６】 第 １ 表 反 応 性 人モノクロー ネ ビ 原発性 転 移 ナル抗体 （Ｎａｅｖｉ） 黒 腫 （プラスの数／テスト数） “１７” 28/29 48/52(90%) 54/54(100%) ＡＨ１８ 23/26 48/54(90%) 43/51(80%) 例 ３ 3.1 正常組織への抗体の結合性 例１により得られたモノクローナル抗体“１７”を正常
組織との結合性に関してテストした。このテスト実施を
例１に記載したように行なった。
組織との結合性に関してテストした。このテスト実施を
例１に記載したように行なった。
【００３７】抗体を脳（皮質、脳橋、視床、類扁桃
体）、網膜、皮膚（ケラチン細胞、メラニン細胞、ラン
ゲルハンス細胞、内皮細胞、平滑筋肉組織、汗腺、神経
繊維）、筋肉、乳房、子宮、膀胱、胆嚢、脾臓、腎臓、
副腎、肺、耳下腺、腸、赤血球（市販のテスト試料４及
び血液供与者３００）及び副甲状腺からの人組織に対す
る反応性に関してテストした。本発明による抗体と前記
組織種類との反応は全く見られなかった。
体）、網膜、皮膚（ケラチン細胞、メラニン細胞、ラン
ゲルハンス細胞、内皮細胞、平滑筋肉組織、汗腺、神経
繊維）、筋肉、乳房、子宮、膀胱、胆嚢、脾臓、腎臓、
副腎、肺、耳下腺、腸、赤血球（市販のテスト試料４及
び血液供与者３００）及び副甲状腺からの人組織に対す
る反応性に関してテストした。本発明による抗体と前記
組織種類との反応は全く見られなかった。
【００３８】3.2 腫瘍への抗体の結合性 例１により不滅化セルラインから得られる人モノクロー
ナル抗体の更なる特異性を測定するために、人腫瘍組織
への他のテストを実施した。テストの実施は例１に記載
したように行なった。この際、本発明による抗体で次の
結果が得られた： 第 ２ 表 腫 瘍 “１７”もしくはＡＨ１８との反応性 プラスの数／テスト数 黒 腫 ４８／５２ 肺癌腫 １０／１９ 乳癌腫 ４／９ 例 ４ 精製したガングリオシドに対するモノクローナル抗体の
反応性をガングリオシドの薄層クロマトグラフィーによ
る免疫斑点中で調べた。
ナル抗体の更なる特異性を測定するために、人腫瘍組織
への他のテストを実施した。テストの実施は例１に記載
したように行なった。この際、本発明による抗体で次の
結果が得られた： 第 ２ 表 腫 瘍 “１７”もしくはＡＨ１８との反応性 プラスの数／テスト数 黒 腫 ４８／５２ 肺癌腫 １０／１９ 乳癌腫 ４／９ 例 ４ 精製したガングリオシドに対するモノクローナル抗体の
反応性をガングリオシドの薄層クロマトグラフィーによ
る免疫斑点中で調べた。
【００３９】このためにはベーリンガー・マンハイム社
のガングリオシドＧＭ３、ＧＭ２及びＧＤ１ａ、スウェ
−デンのビオカルブ（Ｂｉｏｃａｒｂ）社のＧＤ２及び
ＧＤ３、フィディア（Ｆｉｄｉａ）社、イタリアのＧＭ
１及びパルマン（Ｐａｌｌｍａｎｎ）社、ミュンヘンの
ＧＤ１ｂを使用した。薄層プレート（ＨＰＴＬＣ Ａｌ
ｕ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ254）をメルク社か
ら入手した。ガングリオシドのための溶離剤はクロロホ
ルム：メタノール：Ｈ2Ｏ（０．０２％ＣａＣｌ2×２Ｈ
2Ｏ）６０：４０：９からなる。薄層プレートのための
固定剤としてはポリイソブチルアクリレート（高分子
量）、アルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ）をヘキサン中の０．１％溶液として使用
した。
のガングリオシドＧＭ３、ＧＭ２及びＧＤ１ａ、スウェ
−デンのビオカルブ（Ｂｉｏｃａｒｂ）社のＧＤ２及び
ＧＤ３、フィディア（Ｆｉｄｉａ）社、イタリアのＧＭ
１及びパルマン（Ｐａｌｌｍａｎｎ）社、ミュンヘンの
ＧＤ１ｂを使用した。薄層プレート（ＨＰＴＬＣ Ａｌ
ｕ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ254）をメルク社か
ら入手した。ガングリオシドのための溶離剤はクロロホ
ルム：メタノール：Ｈ2Ｏ（０．０２％ＣａＣｌ2×２Ｈ
2Ｏ）６０：４０：９からなる。薄層プレートのための
固定剤としてはポリイソブチルアクリレート（高分子
量）、アルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ）をヘキサン中の０．１％溶液として使用
した。
【００４０】実施：この方法及び変法は専門家によりし
ばしば実施され、ここでは例としてのみ再現される。
ばしば実施され、ここでは例としてのみ再現される。
【００４１】試料担持：ガングリオシドの１ｍｇ／ｍｌ
溶液５μｌを担持する。溶剤としては前記溶離剤を使用
した。試料をハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）注射器で
薄層プレート上に約５ｍｍ幅の線状に順次担持する；そ
の間に繰り返し十分に乾かし、こうして線をできるかぎ
り細く保つ。最後に、薄層プレートをもう１回温風で十
分に乾燥する。このプレートを溶剤で飽和した室中に入
れ、溶離剤がプレートの約８０％までを湿らせるまで恒
温保持する。引き続き、このプレートを取り出し、乾燥
させる。
溶液５μｌを担持する。溶剤としては前記溶離剤を使用
した。試料をハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）注射器で
薄層プレート上に約５ｍｍ幅の線状に順次担持する；そ
の間に繰り返し十分に乾かし、こうして線をできるかぎ
り細く保つ。最後に、薄層プレートをもう１回温風で十
分に乾燥する。このプレートを溶剤で飽和した室中に入
れ、溶離剤がプレートの約８０％までを湿らせるまで恒
温保持する。引き続き、このプレートを取り出し、乾燥
させる。
【００４２】次いでこのプレートを０．１％ポリイソブ
チルアクリレート溶液中で約１分間振る。再びプレート
を乾燥させる。遮蔽のために、プレートをピペットを用
いて１％ＲＳＡ／ＰＢＳ（牛血清アルブミン、ベーリン
ガーマンハイム社）溶液で被覆し（気泡を作らないこと
！）、約３０分間室温で放置する。その後、遮蔽溶液を
注ぎ出す。引き続き、ＰＢＳで２回洗浄する。このため
にはプレートをＰＢＳを有するシャーレ中で浸漬し、そ
れぞれ２分間放置する。その間にＰＢＳを吸引する（Ｐ
ＢＳはプレート上に直接与えないこと；振らないこと；
プレートをカラカラに乾燥させないこと）。
チルアクリレート溶液中で約１分間振る。再びプレート
を乾燥させる。遮蔽のために、プレートをピペットを用
いて１％ＲＳＡ／ＰＢＳ（牛血清アルブミン、ベーリン
ガーマンハイム社）溶液で被覆し（気泡を作らないこと
！）、約３０分間室温で放置する。その後、遮蔽溶液を
注ぎ出す。引き続き、ＰＢＳで２回洗浄する。このため
にはプレートをＰＢＳを有するシャーレ中で浸漬し、そ
れぞれ２分間放置する。その間にＰＢＳを吸引する（Ｐ
ＢＳはプレート上に直接与えないこと；振らないこと；
プレートをカラカラに乾燥させないこと）。
【００４３】その後、このプレートをモノクローナル抗
体含有液（濃度１〜１０μｇ／ｍｌ）で被覆し、室温で
１時間放置する。
体含有液（濃度１〜１０μｇ／ｍｌ）で被覆し、室温で
１時間放置する。
【００４４】引き続き、ＰＢＳで５回洗浄する（前
記）。次いで、このプレートを結合体（人Ｆｃμに対す
るポリクローナル、ペルオキシダーゼ標識羊−Ｆａｂ−
フラグメント、組織テスト例１におけると同じ濃度）で
被覆し、室温で１時間恒温保持する。引き続き、ＰＢＳ
（前記と同じもの）で６回洗浄する。次いで基質を添加
し、このプレートを現像の間軽く振る。
記）。次いで、このプレートを結合体（人Ｆｃμに対す
るポリクローナル、ペルオキシダーゼ標識羊−Ｆａｂ−
フラグメント、組織テスト例１におけると同じ濃度）で
被覆し、室温で１時間恒温保持する。引き続き、ＰＢＳ
（前記と同じもの）で６回洗浄する。次いで基質を添加
し、このプレートを現像の間軽く振る。
【００４５】基質としてはＴＭＢ／ＤＯＮＳを使用する
（テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）１２ｍｇ＋ジオク
チルナトリウムスルホサクシネート（ＤＯＮＳ）４０ｍ
ｇをメタノール１０ｍｌ中に（３７℃で）溶かし、かつ
クエン酸／燐酸塩−緩衝液ｐＨ５．０（０．１Ｍクエン
酸、メルク社２５ｍｌ＋０．２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4×２Ｈ
2Ｏ、メルク社２８ｍｌを１００ｍｌにする）１０ｍｌ
並びにＨ2Ｏ2（３０％）１０μｌと混合する。負の対照
が着色しない間、現像し；次いで何回も蒸留Ｈ2Ｏで洗
浄する。ＴＭＢ／ＤＯＮＳでの染色はさめるので、この
プレートを遮光下に乾燥させ、すぐに撮影する。
（テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）１２ｍｇ＋ジオク
チルナトリウムスルホサクシネート（ＤＯＮＳ）４０ｍ
ｇをメタノール１０ｍｌ中に（３７℃で）溶かし、かつ
クエン酸／燐酸塩−緩衝液ｐＨ５．０（０．１Ｍクエン
酸、メルク社２５ｍｌ＋０．２Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4×２Ｈ
2Ｏ、メルク社２８ｍｌを１００ｍｌにする）１０ｍｌ
並びにＨ2Ｏ2（３０％）１０μｌと混合する。負の対照
が着色しない間、現像し；次いで何回も蒸留Ｈ2Ｏで洗
浄する。ＴＭＢ／ＤＯＮＳでの染色はさめるので、この
プレートを遮光下に乾燥させ、すぐに撮影する。
【００４６】前記の方法をＭＡＫ１７もしくはＭＡＫ
ＡＨ１８を用いて実施すると、第３表中に示した結果が
得られる。ＭＡＫ１７及びＭＡＫ ＡＨ１８はＧＭ３及
びＧＤ３と反応するが、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ１ａ、Ｇ
Ｄ１ｂ及びＧＤ２と反応しない。
ＡＨ１８を用いて実施すると、第３表中に示した結果が
得られる。ＭＡＫ１７及びＭＡＫ ＡＨ１８はＧＭ３及
びＧＤ３と反応するが、ＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ１ａ、Ｇ
Ｄ１ｂ及びＧＤ２と反応しない。
【００４７】照合のために、平行実験中のガングリオシ
ドをレゾルシンを用いる着色により可視とした。このた
めにはレゾルシン溶液（メルク社のレゾルシン４００ｍ
ｌ＋Ｈ2Ｏ １００ｍｌ＋Ｈ2ＳＯ4 ５ｍｌ）でプレート
を吹き付け、１１０℃で乾燥箱中で約１０分間現像す
る。
ドをレゾルシンを用いる着色により可視とした。このた
めにはレゾルシン溶液（メルク社のレゾルシン４００ｍ
ｌ＋Ｈ2Ｏ １００ｍｌ＋Ｈ2ＳＯ4 ５ｍｌ）でプレート
を吹き付け、１１０℃で乾燥箱中で約１０分間現像す
る。
【００４８】この対照はすべてのガングリオシドが同量
で薄層プレート上に担持されたことを示す。
で薄層プレート上に担持されたことを示す。
【００４９】 第 ３ 表 薄層クロマトグラフィーによるガングリオシドの検出 レゾルシン ＭＡＫ“１７”もしくはＭＡＫ ＡＨ１８ ＧＭ１ ＋ − ＧＭ２ ＋ − ＧＭ３ ＋ ＋ ＧＤ１ａ ＋ − ＧＤ１ｂ ＋ − ＧＤ２ ＋ − ＧＤ３ ＋ ＋ 第３表からは本発明による抗体が一定のガングリオシド
とのみ反応するということが明らかである。テストした
ガングリオシドのうちＧＭ３及びＧＤ３だけがプラスの
シグナルを示す。ガングリオシドＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ
１ａ、ＧＤ２及びＧＤ１ｂとは挙げる程の反応性は見い
出されない（≦５％）。
とのみ反応するということが明らかである。テストした
ガングリオシドのうちＧＭ３及びＧＤ３だけがプラスの
シグナルを示す。ガングリオシドＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ
１ａ、ＧＤ２及びＧＤ１ｂとは挙げる程の反応性は見い
出されない（≦５％）。
【００５０】例 ５ 抗体とセルラインとの反応性 試験すべきセルラインの細胞をテラサキプレート（Ｇｒ
ｅｉｎｅｒ社より入手）中で１夜培養する。培養上澄を
付着する細胞から除去し、試験すべき抗体溶液に代え
る。１〜２時間の恒温保持後、抗体溶液を除去し、細胞
フィールドを多数回洗浄し、細胞に結合しているモノク
ローナル抗体を検出する。このためにはＰＢＳで洗浄し
た後、ペルオキシダーゼ標識羊−抗−人−軽−鎖−抗体
１００μｌを添加し、再び室温で１〜２時間恒温保持す
る。新たに洗浄した後、酵素反応をペルオキシダーゼ基
質（ＡＢＴＳ；商標名）を用いて開始した。室温で１０
〜６０分間の後、４０６ｎｍにおける吸光を測光器で測
定した。このためには、選択的にアミノエチルカルバゾ
ールのようなペルオキシダーゼ基質を添加し、反応の終
了後細胞のもしくは細胞上の褐色がかった沈殿を検微鏡
を用いて評価することもできる。
ｅｉｎｅｒ社より入手）中で１夜培養する。培養上澄を
付着する細胞から除去し、試験すべき抗体溶液に代え
る。１〜２時間の恒温保持後、抗体溶液を除去し、細胞
フィールドを多数回洗浄し、細胞に結合しているモノク
ローナル抗体を検出する。このためにはＰＢＳで洗浄し
た後、ペルオキシダーゼ標識羊−抗−人−軽−鎖−抗体
１００μｌを添加し、再び室温で１〜２時間恒温保持す
る。新たに洗浄した後、酵素反応をペルオキシダーゼ基
質（ＡＢＴＳ；商標名）を用いて開始した。室温で１０
〜６０分間の後、４０６ｎｍにおける吸光を測光器で測
定した。このためには、選択的にアミノエチルカルバゾ
ールのようなペルオキシダーゼ基質を添加し、反応の終
了後細胞のもしくは細胞上の褐色がかった沈殿を検微鏡
を用いて評価することもできる。
【００５１】第４表中に示した結果からは、抗体１７は
黒腫ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ７２）と反
応し、一方人包皮線維芽細胞とは全く反応は見られない
（これは公知法により自体単離された）。更に、抗体１
７はインシュリノーマー細胞ＲＩＮ（Ｄｒ．Ｅｉｓｅｎ
ｂａｒｔ、Ｊｏｓｓｌｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｅｎ
ｔｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．０２２１５から取
得）及び神経芽細胞腫細胞ＩＭＲ３２（ＡＴＣＣＣＣＬ
１２７）と反応を示す。
黒腫ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ７２）と反
応し、一方人包皮線維芽細胞とは全く反応は見られない
（これは公知法により自体単離された）。更に、抗体１
７はインシュリノーマー細胞ＲＩＮ（Ｄｒ．Ｅｉｓｅｎ
ｂａｒｔ、Ｊｏｓｓｌｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃｅｎ
ｔｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．０２２１５から取
得）及び神経芽細胞腫細胞ＩＭＲ３２（ＡＴＣＣＣＣＬ
１２７）と反応を示す。
【００５２】 第 ４ 表 種々のセルラインに対する抗体反応性 SK MEL 28 RIN IMR 32 人包皮線 抗 体 （黒腫） （インシュリノーマ） （神経芽細胞腫） 維芽細胞 “１７” ＋＋ ＋ ＋ − 例 ６ 黒腫に対する抗体のエピトープ重なりの測定 抗体とモノクローナル抗体ＥＣＡＣＣ９００９０７０３
又はＥＣＡＣＣ９００９０７０１とのエピトープ重なり
を検出するために、競合酵素イムノアッセイを実施す
る。このためには、ベーリンガーマンハイム、ビオカル
ブ、パルマンもしくはフィジア（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｂｉｏｃａｒｂ、Ｐａｌｌｍａｎ
ｎもしくはＦｉｄｉａ）からのガングリオシドＧＭ３、
ＧＭ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１及びＧＤ１
及びＧＤ１ｂ（例４参照）をメタノール中に溶かし（１
０μｇ／ｍｌ）、かつそれぞれ該溶液１００μｌを９６
穴微量滴定プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中にピペットで
装入する。溶液の蒸発後（室温で１夜にわたって、又は
３７℃で１時間かけて）ＰＢＳで洗浄し、次いで非特異
的結合位をＰＢＳ中の１％クロテインＣ−溶液で遮蔽す
る（室温で１〜２時間恒温保持し、ＰＢＳ／０．０５％
ツウィーン２０で洗浄）。引き続き、ペルオキシダーゼ
で標識された（最終濃度２５０ｍＵ／ｍｌ）モノクロー
ナル抗体ＥＣＡＣＣ９００９０７０３又はＥＣＡＣＣ９
００９０７０１の１種及び評価されるべき抗体と同時に
室温で９０分間恒温保持する。新たにＰＢＳ／０．０５
％ツウィ−ン２０で４回洗浄した後、過硼素酸ナトリウ
ムを含有する緩衝液中で酵素基質溶液ＡＢＴＳ（商標
名）と室温で恒温保持し、引き続き４０５ｎｍにおける
吸光度を結合したＰＯＤ標識モノクローナル抗体ＥＣＡ
ＣＣ９００９０７０３又はＥＣＡＣＣ９００９０７０１
の量に関する尺度として測定する。この値をモノクロー
ナル抗体ＥＣＡＣＣ９００９０７０３又はＥＣＡＣＣ９
００９０７０１単独との恒温保持の際に得られる吸光度
と比較する（評価すべき抗体の添加において生じる希釈
効果の相殺のために相応する量の緩衝液を添加して行な
う）。モノクローナル抗体ＥＣＡＣＣ９００９０７０３
又はＥＣＡＣＣ９００９０７０１酵素結合体（２５０ｍ
Ｕ／ｍｌ）に対して評価すべき抗体の１０5倍過剰まで
少なくとも５０％の競合が見られる場合、エピトープ重
なりが存在する。
又はＥＣＡＣＣ９００９０７０１とのエピトープ重なり
を検出するために、競合酵素イムノアッセイを実施す
る。このためには、ベーリンガーマンハイム、ビオカル
ブ、パルマンもしくはフィジア（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｂｉｏｃａｒｂ、Ｐａｌｌｍａｎ
ｎもしくはＦｉｄｉａ）からのガングリオシドＧＭ３、
ＧＭ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ１及びＧＤ１
及びＧＤ１ｂ（例４参照）をメタノール中に溶かし（１
０μｇ／ｍｌ）、かつそれぞれ該溶液１００μｌを９６
穴微量滴定プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）中にピペットで
装入する。溶液の蒸発後（室温で１夜にわたって、又は
３７℃で１時間かけて）ＰＢＳで洗浄し、次いで非特異
的結合位をＰＢＳ中の１％クロテインＣ−溶液で遮蔽す
る（室温で１〜２時間恒温保持し、ＰＢＳ／０．０５％
ツウィーン２０で洗浄）。引き続き、ペルオキシダーゼ
で標識された（最終濃度２５０ｍＵ／ｍｌ）モノクロー
ナル抗体ＥＣＡＣＣ９００９０７０３又はＥＣＡＣＣ９
００９０７０１の１種及び評価されるべき抗体と同時に
室温で９０分間恒温保持する。新たにＰＢＳ／０．０５
％ツウィ−ン２０で４回洗浄した後、過硼素酸ナトリウ
ムを含有する緩衝液中で酵素基質溶液ＡＢＴＳ（商標
名）と室温で恒温保持し、引き続き４０５ｎｍにおける
吸光度を結合したＰＯＤ標識モノクローナル抗体ＥＣＡ
ＣＣ９００９０７０３又はＥＣＡＣＣ９００９０７０１
の量に関する尺度として測定する。この値をモノクロー
ナル抗体ＥＣＡＣＣ９００９０７０３又はＥＣＡＣＣ９
００９０７０１単独との恒温保持の際に得られる吸光度
と比較する（評価すべき抗体の添加において生じる希釈
効果の相殺のために相応する量の緩衝液を添加して行な
う）。モノクローナル抗体ＥＣＡＣＣ９００９０７０３
又はＥＣＡＣＣ９００９０７０１酵素結合体（２５０ｍ
Ｕ／ｍｌ）に対して評価すべき抗体の１０5倍過剰まで
少なくとも５０％の競合が見られる場合、エピトープ重
なりが存在する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｂ 33/577 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ヨーゼフ エントル ドイツ連邦共和国 ヴァイルハイム ウル メンシュトラーセ 12 (72)発明者 ヘルベルト ユングファー ドイツ連邦共和国 シュタルンベルク フ ェルディナント−マリア−シュトラーセ 14 (72)発明者 ヴィンフリート アルベルト ドイツ連邦共和国 エーベルフィング ハ ウプトシュトラーセ 16 アー
Claims (6)
- 【請求項１】 黒腫に対する人モノクローナル抗体にお
いて、これはガングリオシドＧＭ３及びＧＤ３に結合す
るが、ガングリオシドＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ１ａ、ＧＤ
１ｂ及びＧＤ２にはガングリオシドＧＭ３又はＧＤ３の
親和性に比較して最高でも約５％の親和性で結合し、こ
の際抗体のガングリオシドへの結合はガングリオシドの
薄層クロマトグラフィーによる分離後の免疫染色により
決定される、黒腫に対する人モノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ＩｇＭクラスの抗体である請求項１記載
の抗体。 - 【請求項３】 移転黒腫の少なくとも７０％に結合する
請求項１又は２記載の抗体。 - 【請求項４】 肺癌腫又は／及び乳癌腫にも付加的に結
合することのできる請求項１から３項までのいずれか１
項記載の抗体。 - 【請求項５】 ハイブリドーマセルラインＥＣＡＣＣ９
００９０７０３又はＥＣＡＣＣ９００９０７０１から得
られる請求項１記載の抗体。 - 【請求項６】 健常な人からのＢ−リンパ球を不滅化
し、不滅化Ｂ−リンパ球からの抗体を原発性黒腫又は／
及び転移黒腫に対する結合に関して免疫組織化学的分析
により調べ、プラスに反応するＢ−リンパ球クローンを
選択し、培養し、かつこれからモノクローナル抗体を獲
得することを特徴とする、請求項１から４までのいずれ
か１項記載の黒腫に反応する人モノクローナル抗体の製
法。
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| DE4032312.9 | 1990-10-11 | ||
| DE4107154.9 | 1991-03-06 | ||
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| DE4208795A1 (de) * | 1992-03-19 | 1993-09-23 | Behringwerke Ag | Monoklonaler anti-gangliosid-antikoerper, seine herstellung und verwendung als tumortherapeutikum |
| CA2322003A1 (en) * | 1998-02-27 | 1999-09-02 | Novopharm Biotech Inc. | Human monoclonal antibodies capable of oligospecifically recognizing the major tumor-associated gangliosides and methods of use thereof |
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| US7906492B2 (en) * | 2001-01-16 | 2011-03-15 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Therapy-enhancing glucan |
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| DE10229906A1 (de) * | 2002-07-04 | 2004-01-22 | Müller-Hermelink, Hans Konrad, Prof. Dr. | Humaner monoklonaler Antikörper |
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1994
- 1994-03-15 US US08/214,020 patent/US5610280A/en not_active Expired - Fee Related
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