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Die Erfindung betrifft einen humanen
monoklonalen Antikörper
mit schweren und leichten Kettenmolekülen, die jeweils einen von
Antikörper
zu Antikörper
konstant und einen von Antikörper
zu Antikörper
variabel aufgebauten Bereich aufweisen, oder ein funktionelles Fragment
davon. Desweiteren sieht die Erfindung Verfahren zur Herstellung
des Antikörpers
vor, die Verwendung des Antikörpers
zur Bekämpfung
von Tumoren, und ein Arzneimittel und ein Diagnostikum, welche den
Antikörper
enthalten.
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Die derzeitigen Verfahren zur Behandlung
von Krebs umfassen eine operative Entfernung des Tumors, Strahlenbehandlungen
und Chemotherapie. Ein wesentlicher Nachteil jeder dieser Methoden
ist darin zu sehen, daß sie
nicht spezifisch auf die Tumorzellen ausgerichtet sind. So kann
es bei einer operativen Entfernung beispielsweise vorkommen, daß nicht
der ganze Tumor erfaßt
wird, was dazu führt,
daß sich
ein neuer Tumor entwickelt und gegebenenfalls Methastasen gebildet
werden, die sich an weiteren Stellen im Körper festsetzen. Bei der Behandlung
von Tumoren mit Strahlen oder chemotherapeutischen Mitteln führt die
fehlende Selektivität
häufig
dazu, daß auch
gesunde Zeilen durch die eingesetzten Mittel geschädigt werden.
Die nachteilige Folge hiervon ist, daß die Dosen an Strahlung oder
chemischen Wirkstoffen nicht so hoch gewählt werden können, daß sie alle
Krebszellen abtöten.
Ein wesentlicher Teil der heutigen Krebsforschung zielt daher darauf
ab, effektivere und insbesondere selektiv wirkende Verfahren und
Mittel zur Bekämpfung
von Tumoren zu finden.
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Wie immunologische Studien gezeigt
haben, ist auch dann, wenn das Immunsystem maligne Zellen nicht
wirksam bekämpfen
kann, eine zelluläre
und humorale Aktivität
meßbar.
Diese Aktivität
reicht jedoch nicht aus, um die Tumorzellen zu zerstören. Ein
vielversprechender Ansatz zur Bekämpfung von Tumoren ist daher,
von der Immunantwort des Pa tienten stammende Antikörper zu
isolieren, geeignet zu vermehren und therapeutisch einzusetzen.
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Ein Verfahren nach dem Stand der
Technik, das diesen Weg beschreitet, ist unter dem Namen Hybridoma-Technik
bekannt. Es beruht auf der In-Vitro-Gewinnung von zellulären Hybriden,
die durch Zellfusion von normalen Lymphocyten mit unbegrenzt lebens-
u. teilungsfähigen
Myelomzellen gewonnen werden. Die hierbei erzeugten Hybridom-Zellen
weisen die Eigenschaften beider Elternzellen auf. Dementsprechend
besitzen sie die Fähigkeit
der Lymphozyten, Antikörper
zu produzieren, und die Fähigkeit
der Mylomzelle zur unbegrenzten Teilung und damit zur Produktion
der Antikörper
in großen
Mengen.
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Jede aus der Fusion resultierende
Hybridzelle stellt monoklonale Antikörper her, dessen Spezifität von der
ursprünglichen
Lymphozyten-Zelle bestimmt wird. Die Hybridom-Zellen werden vermehrt
und dann diejenigen selektiert, welche Antikörper der gewünschten
Spezifität
produzieren. Die Kultivierung dieser Auswahl und deren Isolierung
führt zu
hochspezifisch reagierenden Antikörpern, welche nur mit einer
bestimmten antigenen Determinante reagieren. Monoklonale Antikörper, welche
spezifisch an Antigene von Tumoren binden, eröffnen daher vielversprechende
Möglichkeiten
für Diagnose
und Therapie von Tumorzellen.
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Zur Verbesserung der Verfahren und
Mittel im Kampf gegen Krebs besteht daher der Bedarf an derartigen
monolonalen Antikörpern.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen humanen monoklonalen
Antikörper,
Verfahren zu dessen Herstellung und aus dem Antikörper abgeleitete
Dignostika und Arzneimittel anzugeben, die eine hohe Spezifität für Antigene
verschiedener Tumore aufweisen und sich daher für eine tumorspezifische Therapie
und Dignose gut eignen.
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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe hinsichtlich
des monoklonalen Antikörpers
dadurch gelöst,
daß
- – wenigstens
eine variable Region der leichten Ketten substanziell jeweils die
in Anlage 2 und/oder der schweren Ketten substanziell jeweils die
in Anlage 1 wiedergegebene Aminosäure-Sequenz aufweist.
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Aus chemischer Sicht sind Antikörper Immunglobulin-Moleküle. Diese
Moleküle
weisen jeweils zwei identische leichte und zwei identische schwere
Ketten auf, die durch Disulfid-Brücken miteinander verbunden sind.
Jede der Ketten enthält
eine Region von etwa 110 Aminosäuren
mit variabler Sequenz, während
der verbleibende Rest jeder Kette einen Bereich mit konstanter Sequenz
aufweist. Die variablen Regionen von leichter und schwerer Kette
ihrerseits umfassen jeweils mehrere hypervariable Regionen, welche
für die
Bindung der Antigene verantwortlich sind. Die spezielle Ausbildung
der hypervariablen Regionen bestimmen daher die spezifischen Eigenschaften
des Antikörpers.
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Wie klinische Tests belegen, begründet die
Ausbildung der genannten variablen Bereiche des erfindungsgemäßen Antikörpers gemäß der angegebenen
Aminosäuren-Sequenz
eine hohe spezifische Wirksamkeit gegenüber den Antigenen der untersuchten
Tumorzellen. Da die auf Tumorzellen auftretenden Antigene auf Normalzellen
nicht vorhanden sind, zeigen vorliegende Antikörper gegenüber normalen Zellen erwartungsgemäß keine
oder nur geringe Bindung.
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Erfindungswesentlich ist die substanzielle
Gleichheit einer der variablen Regionen der leichten oder der schweren
Ketten mit der erfindungsgemäßen Sequenz.
Die substanzielle Gleichheit bedeutet dabei eine überwiegende Übereinstimmung
der genannten Bereiche. Geringfügige
Modifikationen oder Substitutionen der Ketten sind in vorliegender
Erfindung mit eingeschlossen, sofern der monoklonale Antikörper oder
der funktionelle Teil davon tumorspezifische Eigenschaften beibehält.
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Tumorspezifische monoklonaler Antikörper nach
dem Stand der Technik betreffen in der überwiegenden Zahl der Fälle von
Mäusen
hergeleitete Antikörper.
Jene Antikörper
weisen in nachteiliger Weise jedoch eine stark eingeschränkte Einsatzmöglichkeit
auf, da Mausantikörper
bei Anwendung auf den Menschen durch dessen Immunsystem als Fremdprotein
erkannt und neutralisiert werden können noch bevor sie ihre therapeutische
Wirkung entfalten.
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Die Erfindung geht demgegenüber von
humanen monoklonalen Antikörpern
aus, welche diese Beschränkungen
bei Einsatz in der Humanmedizin nicht aufweisen. Diese Antikörper weisen
Sequenzen der hypervariablen Kettenbereiche auf, die substanziell
denen von menschlichem Immunglobulin entsprechen. Die Antikörper können daher
nach Erkennung der Determinanten oder Epitope der ihnen entsprechenden
Antigene ungehindert an den betreffenden Zellen anbinden, ohne daß eine Abwehrreaktion
des Immunsystems erfolgt. Bei einer Kopplung der erfindungsgemäßen Antikörper mit
diagnostischen und therapeutischen Mitteln sind vorliegende Antikörper somit
in vorteilhafter Weise zur Früherkennung
und effektiven Behandlung von Tumoren unterschiedlicher Art geeignet.
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Bei der Lösung der Aufgabe hinsichtlich
des Herstellungsverfahrens wird vorgeschlagenen, die humanen monoklonalen
Antikörpers
vorzugsweise mittels der Hybridoma-Technik zu erzeugen. Gemäß einem Merkmal
der Erfindung werden hierzu B-Lymphozyten aus einem lymphatischen
Organ, vorzugsweise der Milz oder des Lymphknotens, eines Karzinom-Patienten entnommen.
Diese Lymphozyten sind infolge des vorhandenen Karzinoms zur Bildung
derjenigen Antikörpern
stimuliert, welche speziell auf die Antigene der vorliegenden Tumorzellen
reagieren.
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Die Lymphozyten werden in vitro jeweils
mit einer Myelom-Zelle fusioniert. Gemäß vorliegender Erfindung werden
hierbei die Heteromyelomzellen HAB-1 sowie deren Subklone verwendet.
Die Heteromyelomzelle HAB-1 ist spezifiziert in der Literatur: Fallen,
G et al., HAB-1, BrJCancer 62, 595-8 (1990). Gleichermaßen können Subklone
der HAB-1-Zelle Verwendung finden, die als HAB-1.X bezeichenbar
sind. Die entstandenen Zellklone besitzen wie die originären B-Lymohozyten
die Eigenschaft, Antikörper
zu produzieren. Die Spezifität dieser
Antikörper
wird dabei durch die ursprüngliche
Lymphozyten-Zelle bestimmt. In vorliegendem Fall bedeutet dies,
daß auch
die von den Zellklonen produzierten Antikörper mit den Antigenen des
speziell vorliegenden Tumors korrespondieren. Nach Selektion derjenigen
Zellen, die jeweils Antikörper
der gewünschten
Spezifität synthetisieren,
werden diese Zellen kultiviert und dabei von jeder der Hybridzellen
jeweils monoklonale Antikörper
in unbegrenzter Menge produziert.
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Gemäß einem Merkmal der Erfindung
werden bei dem vorgeschlagenen Verfahren insbesondere Lymphozyten
von Patienten entnommen, die ein Karzinom des
- – Magen
- – Dickdarm
- – Bauchspeicheldrüse
- – Speiseröhre
- – Lunge
- – Prostata
- – Brust
aufweisen.
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Neben einer Herstellung der vorliegenden
humanen monoklonalen Antikörper
durch die Hybridoma-Technik schließt die Erfindung auch andere
Herstellungsmethoden ein. Vorgeschlagen wird, insbesondere bei der
Herstellung kleinerer funktioneller Fragmente, die direkte Synthese
mittels der dem Fachmann bekannten Rekombinanten-Methode oder der
Herstellung mittels der bekannten Phagenbankmethode (phage display).
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Die Vermehrung erfolgt unter Anwendung
der bekannten Polymerase Ketten Reaktion (Polymerase chain reaction
= PCR).
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Das PCR-Verfahren ist dem Fachmann
bekannt, beispielsweise aus dem US-Patent
4,683,195 . Es dient der gezielten
Vervielfältigung
eines spezifischen DNA-Fragments und wird mit Vorteil dann angewandt, wenn
DNA-Abschnitte nur in geringen Spuren vorliegen. Das Verfahren ermöglicht,
eine bekannte DNA-Sequenz unter einer Vielzahl ähnlicher Sequenzen zu erkennen
und in vitro in kurzer Zeit stark zu vermehren. Hierbei kann eine
spezielle DNA-Sequenz innerhalb einer Zeitspanne von ca. 3 h etwa
100.000fach vervielfältigt
werden.
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Bei Anwendung des vorliegenden Verfahrens
zur Herstellung der erfindnungsgermäßen monoklonalen Antikörper, oder
von funktionellen Fragmentes davon, wird RNA der Hybridomzellen,
die tumorspezifische monoklonale Antikörper produzieren, in vitro
mittels reverser Transcriptase in komplementäre doppelsträngige cDNA
umkopiert. Anschließend
wird die cDNA, welche funktionelle Fragmente der variablen Bereiche
der leichten und schweren Ketten enthält, mittels PCR vervielfältigt. Die
PCR-Produkte werden gereinigt, extrahiert und anschließend kloniert.
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Der Aufbau des konstanten Bereichs
der schweren Kette eines Antikörpers
bestimmt dessen Isotyp und legt die Effektor-Funktion des Antikörpers fest.
Bei Immunglobulin besteht die konstante Region der schweren Ketten
aus einer der fünf
in der Literatur mit μ, γ, δ, α oder ε bezeichneten
Sequenzen, die konstante Region der leichten Ketten aus einer der
Sequenzen κ oder λ.
Der unterschiedliche Aufbau der schweren Ketten führt zu den
fünf Immunglobilin-Klassen
IgA, IgD, IgE, IgG und IgM. Die Antikörper gemäß vorliegender Erfindung gehören in der
Regel der Klasse IgM an, wobei sowohl leichte Ketten der Klasse λ als auch
k auftreten können.
Ebenso ist eine Ausbildung des Antikörpers gemäß Klasse IgG vorgesehen.
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Die Erfindung umfaßt monoklonale
Antikörper
als auch funktionelle Fragmente davon. Dabei ist die Funktionalität der genannten
Fragmente dadurch gekennzeichnet, daß sie Eigenschaften des Antikörpers aufweisen.
Diese können
beispielsweise darin bestehen, daß sie eine Bindungsfähigkeit
gegenüber
Antigenen oder eine Spezifität
für Tumorzellen
besitzen, oder aufgrund des Aufbaus ihres konstanten Bereichs eine
Effektor-Funktion aufweisen. Gemäß einem
Merkmal der Erfindung sind insbesondere Fragmente einbezogen, welche
gemäß bekannter
Nomenklatur (z.B. Cell Biophysics, 22 (1993), S. 189–224) einer
der Gruppen
VL, VH,
Fv, Fc, Fab, Fab',
F(ab')2
angehören. Dabei
umfaßt
die Gruppe
VL Fragmente, welche den
variablen oder den variablen und konstanten Bereich der leichten
Ketten einschließen
VH Fragmente, welche den variablen Bereich
oder den variablen und den konstanten Bereich der schweren Ketten
einschließen
Fv
Fragmente, welche die variablen Regionen der schweren und der leichten
Ketten oder Teile davon einschließen
Fc Fragmente, welche
die konstanten Regionen der schweren Ketten oder Teile davon einschließen
Fab
Fragmente, welche größer als
die Fragmente der Gruppe Fv sind
Fab' Fragmente, welch größer als die Fragmente der Gruppe
Fab sind
F(ab')2 Fragmente, welche die variablen Bereiche
beider schwerer und beider leichter Ketten oder Teile davon enthalten
und optional die ersten konstanten Bereiche beider schweren Ketten
oder Teile davon.
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Durch Verwendung der genannten Fragmente
ist es möglich,
spezielle Anforderungen für
bestimmte Anwendungen zu realisieren. Eine Anpassung der Eigenschaften
des Antikörpers
oder dessen funktioneller Fragmente läßt sich gemäß einem Merkmal der Erfindung
auch dadurch erreichen, daß einzelne
Aminosäure-Gruppen
substituiert und/oder hinzugefügt
und/oder entfernt sind. Eingriffe dieser Art führen dazu, daß beispielsweise
die Stabilität
oder die Selektivität
des Antikörpers
bzw. dessen funktioneller Fragmente modifiziert werden, dessen globalen
Eigenschaften, wie beispielsweise die Bindungsfähigkeit gegenüber Tumor-Antigenen,
jedoch erhalten bleiben.
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Die Antikörper bzw. deren funktionelle
Fragmente gemäß vorliegender
Erfindung können
mit weiteren Wirkstoffen verbunden werden. Durch eine Ankopplung
derartiger Substanzen werden die Anwendungsbereiche des vorliegenden
Antikörpers
wesentlich erweitert. Insbesondere lassen sich die humanen monoklonalen Antikörper gemäß vorliegender
Erfindung hierdurch für
diagnostische Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen und für therapeutische
Verfahren zur Bekämpfung
von Tumorzellen einsetzen.
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Gemäß einem Merkmal der Erfindung
sind insbesondere folgende Substanzen vorgesehen:
- – eine radiaktive
Substanz,
- – und/oder
ein Farbstoff,
- – und/oder
ein Enzym,
- – und/oder
ein Immunotoxin,
- – und/oder
ein Wachstumshemmer,
wobei diese Wirkstoffe - – zum
qualitativen oder quantitativen Nachweis,
- – zur
Verringerung der Proliferation,
- – zur
Erzeugung der Apoptose
- – zur
Vermeidung von Metastasenbildung
- von Tumorzellen dienen können.
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Der Nachweis von Tumorzellen wird
häufig
mit dem Fachleuten unter dem Namen Immunoassay bekannten Verfahren
geführt,
dessen Grundlage die Antigen-Antikörper-Reaktion ist. Um aus dieser
Reaktion quantitative Aussage gewinnen zu können, wird der Antikörper gemäß vorliegender
Erfindung mit einer gut nachweisbaren Markierungssubstanz gekoppelt.
Substanz und Kopplung sind dabei so gewählt, daß die immunologischen Eigenschaften
der Komponenten weitgehend erhalten bleiben. Die bekanntesten Immunoassays
sind Radioimmunoassay, Enzymimmunoassay und Fluoreszenzimmunoassay.
Im Ergebnis ermöglichen die
an die Antikörper
angekoppelten diagnostischen Substanzen empfindliche und zuverlässige Verfahren
zur Früherkennung
von Krebs.
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Die genannten cytotoxischen Substanzen
zielen auf eine Verminderung der Lebens- oder Teilungsfähigkeit
der Tumorzellen. Sie bewirken alternativ eine Unterdrückung der
DNA-Synthese, Unterdrückung
der Zellteilung, Apoptose der Zellen oder einen nicht apoptotischen
Zelltod. Sie bringen damit das Wachstum von Tumorzellen zum Stillstand
oder bringen Tumorzellen zum Absterben.
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Durch Kopplung der genannten Substanzen
mit den selektiv gegen Krebszellen wirksamen Antikörpern gemäß vorliegender
Erfindung lassen sich somit gezielt Tumore unterschiedlicher Art
wirkungsvoll bekämpfen.
Die Erfindung sieht hierbei insbesondere
- – die Diagnose
- – und/oder
Prophylaxe
- – und/oder
Therapie
folgender Tumore vor: - – Adeno-Karzinom
des Colons
- – Adeno-Karzinom
des Endometriums.
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Schließlich umfaßt vorliegende Erfindung auch
ein Arzneimittel und ein Diagnostikum, die jeweils dadurch gekennzeichnet
sind, daß deren
Wirkstoffe den genannten monoklonalen Antikörper oder funktionelle Fragmente
davon enthalten. Die genannten Mittel enthalten in der Regel weitere
Zusatzstoffe, wie physiologische Lösungen, Lösungsmittel, Glycole, Öle oder
dergl. im Stand der Technik bekannte Substanzen.
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METHODEN, BEISPIELE UND
EINZELHEITEN
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Antikörper CM-2
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Schwere Kette (VH)
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Aminosäure-Sequenz
siehe Anlage
1
DNA-Seauenz
siehe Anlage 1
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Leichte Kette (VL)
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Aminosäure-Sequenz
siehe Anlage
2
DNA-Sequenz
siehe Anlage 2
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Methode 1:
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Immortalisierung von Lymphozyten
und Primärtestung
der Antikörper
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Zur Immortalisierung werden die Lymphozyten
mit einer Variante des Heteromyeloms HAB-1 nach Standardprotokoll
fusioniert und kultiviert. Kurz zusammengefaßt, Lymphozyten werden mit
HAB-1 Zellen mittels PEG verschmolzen. Die Triome werden auf vier
24-Lochplatten ausgesät.
Die durchschnittliche Wachstumsfrequenz beträgt 80–90%, 50% der wachsenden Klone
sezernieren Immunglobuline.
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Die erste Austestung der sezernierten
humanen monoklonalen Antikörper
erfolgt im ELISA, um den Isotyp zu ermitteln. Der nächste Test
ist eine immunhistochemische Färbung
auf Cryoschnitten des autologen Tumors.
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Benötigte Medien:
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- – RPMI
1640 (Firma PAA) ohne Zusätze
- – RPMI
1640 mit HAT-Zusatz (HAT-Suppilement, Firma PAA) sowie 10% FCS,
1 % Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin
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Immortialisierung:
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- – HAB-1
(Fusionspartner) zweimal mit RPMI ohne Zusätze waschen
- – zentrifugieren
5 min bei 1500 U/min
- – eingefrorene
Lymphozyten (aus Milz oder Lymphknoten) auftauen und zweimal mit
RPMI ohne Zusätze waschen,
ebenfalls zentrifugieren
- – beide
Pellets jeweils in 10 ml RPMI ohne Zusatz aufnehmen und in der Neubauer-Zählkammer
zählen
- – im
Verhältnis
von 1:2–1:3
HAB-1 zu Lymphozyten, fusionieren
- – die
Zellpellets nach dem zweiten Waschvorgang zusammen geben, mischen
und 8 min bei 1500 U/min zentrifugieren
- – das
zuvor bei 37 °C
aufgewärmte
PEG (Polyethylene Glycol 1500, Firma Roche) vorsichtig tröpfelweise auf
das Pellet unter leicht rotierenden Bewegungen des 50 ml Röhrchens
laufen lassen
- – leicht
resuspendieren und dann genau 90 sek. im Wasserbad bei 37 °C rotieren
lassen
- – danach
wir das PEG mit RPMI ohne Zusätze
heraus gewaschen (zwei volle 10er Pipetten)
- – zentrifugieren
5 min bei 1500 U/min
- – 24-Well-Platten
ausplattieren mit 1 ml pro Well RPMI mit HAT-Zusatz
- – das
Pellet lösen
in RPMI mit HAT-Zusatz
- – jeweils
einen halben ml der Zellen in ein 24-Well pipettieren
- – Fusionsplatten
in den Brutschrank stellen
- – wöchentlich
Mediumwechsel mit RPMI mit HAT-Zusatz
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Methode 2:
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Molekulare Charakterisierung
der Antikörper
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Zur Sequenzierung der monoklonalen
Antikörper
wird cDNA aus gesamt RNA (RNAse Kit, Quiagen) von Triomen hergestellt
(M-MLV reverse transcriptase, Gibco). Anschließend werden die entsprechenden VH-Gene durch PCR-Amplifikation
vervielfältigt
(Tag Polymerase, MBI-Fermentas).
Die PCR-Produkte werden über
Gel-Elektrophorese gereinigt und extrahiert. Nach dem Klonieren
der PCR-Produkte (pCR-Script Amp SK+cloning kit, Stratagene) werden
die positiven Klone sequenziert (DyeDeoxy Termination cycle sequencing kit,
Applied BioSystems). Die Sequenzen werden mit Hilfe von Dnasis für Windows,
Genebank und V-Base Databases
analysiert (Vollmers et al., 1998).
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Immunhistochemische
Charakterisierung
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Antikörper, die mit dem autologen
Tumor reagieren, werden auf einem Panel von Normalgeweben und Tumorgeweben
im Immunperoxidase Test (Protokoll siehe unten) untersucht, um einen Überblick über die
Reaktion des Antikörpers
und die Verteilung des Antigens zu erhalten.
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Antikörper, die spezifisch mit den
Tumorzellen reagieren und nicht mit gesundem Gewebe, werden weiter
untersucht. Zunächst
auf Tumoren des gleichen Typs verschiedener Patienten, dann auf
Tumoren anderer Organe und schließlich auf Normalgeweben. Eine
nähere
Charakterisierung des Antikörpers
und des Antigens erfolgt nur. wenn das Reaktionsmuster des Antikörpers auf
eine zumindest eingeschränkte
Spezifität
mit malignem Gewebe schließen
läßt.
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Immunperoxidasefärbung auf
Kryoschnitten und Cytospins
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- – Objektträger (OT)
- – OT's nach dem Schneiden
mindestens 2 h trocknen lassen
- – OT's 10 min in Aceton
stellen
- - 30 min trocknen lassen
- – 3 × mit Tris-NaCl
waschen und anschließend
5 min in Tris-NaCl stehen lassen
- – mit
100 μl Milchpulver
(3 % in PBS) absättigen
für 15–30 min
- – 3 × mit Tris-NaCl
waschen
- – 100 μl des jeweiligen
1. Antikörpers:
→ für negative
Kontrolle RPMI
→ für positive
Kontrolle CK8 1:50 mit BSA/PBS oder CAM 5.2 1:10 mit BSA/PBS (BSA
0,5 %ig in PBS)
- – 30
min inkubieren lassen
- – 3 × mit Tris-NaCl
waschen
- – 100 μl des jeweiligen
2. Antikörpers:
→ Rabbit
Anti Maus Peroxidase konjugiert 70 % PBS + 30%Humanserum + 1:50
AK
→ Rabbit
Anti Human IgM Peroxidase konjugiert 70 % PBS + 30 % Kaninchenserum
+ 1:50 AK
- – 30
min inkubieren lassen
- – 3 × mit Tris-NaCl
waschen
- – OT's 10 min in PBS stellen
- – 1
DAB-Tablette und 1 H2O2-Tablette
in 1 ml Leitungswasser lösen
- – 100 μl Substrat
auf die OT's pipettieren
und für
10 min inkubieren lassen
- – mit
Aqua dest. spülen
- – OT's für 5 min
in Hämalaun
stellen
- – 15
min fließend
wässern
- – OT's in Aqua dest. stellen
und mit Glyceringelatine eindecken
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Färbungen auf Tumor-Geweben
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Tumorgewebe wurden gefärbt, um
beurteilen zu können,
auf wie vielen Karzinomen die zu untersuchenden Antikörper eine
Reaktion zeigen. Färbungen
auf Tumorgeweben
Färbungen
auf Normalgewebe
Färbungen
auf fetalen Geweben
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Cell-Death-ELISAPLUS (Firma Roche, Mannheim)
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Das Ausmaß der Apoptoseinduktion durch
den Antikörper
CM-1 wurde mit Hilfe des Cell Death Detection ELISAplus analysiert.
Dieser Test basiert auf dem Prinzip eines quantitativen Sandwich-Enzym-Immunoassays, bei
dem Peroxidase-konjugierte murine monoklonale Antikörper eingesetzt
werden, die gegen Histon- bzw. DNA-Komponenten gerichtet sind. Nach enzymatischer
Umsetzung eines farblosen Substrates kann dann anhand der Farbintensität des Reaktionsproduktes
die Menge der vorhandenen Nukleosomen und damit die relative Anzahl
apoptotischer Zellen photometrisch bestimmt werden.
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Hierzu werden 100 μl einer Zellsuspension
(1.0 × 105/ml) der verschiedenen Zell-Linien mit 100 μl der unverdünnten bzw.
1:1 verdünnten
Antikörperüberstände in einer
96-Well-Platte für
24h im Brutschrank bei 37 °C
und 7% C2 inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit
werden die Zellen 10 min lang bei 200 g zentrifugiert, der Überstand
abgesaugt und 200 μl
Lysispuffer hinzugegeben, wodurch in den folgenden 30 min bei Raumtemperatur
die Lyse der Zellen erfolgt. Nach erneutem Zentrifugieren werden
jeweils 20 μl
des Überstandes
in Streptavidin-beschichtete Mikrotiterplatten übertragen und dann 80 μl des Immunoreagentes
(1/20 Anti-DNA-POD, 1/20 Anti-Histon Biotin, 18/20 Inmkubationspuffer)
hinzupipettiert. Zusätzlich
wird eine im Testkit enthaltene Positivkontrolle und ein Blank-Ansatz
mitgeführt.
Nachdem die Platten 2 Stunden lang bei ca. 250 rpm durchmischt worden
sind, wird nach dreimaligem Waschen mit Inkubationspuffer (250 μl) 100 μl der ABTS-Lösung (1
ABTS-Tablette in
5ml Substratpuffer) in jedes Well pipettiert. Nach erneutem Durchmischen spiegelt
sich dann die Intensität
der antikörperinduzierten Apoptose
in einem intensiven grünen
Farbniederschlag wider. Die Farbintensität wurde mit Hilfe eines ELISA-Readers
bei λ =
415 nm gegen die Referenzwellenlängevon
490 nm vermessen und daraus die Intensität der antikörperinduzierten Apoptose errechnet.
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Antikörper: CM-2
Zell-Linie:
CACO-2
Inkubationszeit: 24h
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CellDeathELISA
Nach 24 ständiger
Inkubation zeigte der untersuchte Antikörper CM-2 im Vergleich zu den
Negativkontrollen eine ausgeprägte
Apoptose-Indikation,
wobei der Effekt bei CM-2 den der Negativkontrolle um das 1,46 überstieg.
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MTT-Test
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- – Zellen
trypsinisieren und in 10 ml RPMI-Vollmedium (RPMI-1640, 10% FCS,
1 % Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin) resuspendieren
- – Zellen
zählen
und auf 1×106 Zellen pro ml verdünnen
- – in
eine 96-Well-Platte 50 μl
Zellsuspension pro Well pipettieren, (erste Reihe freilassen!),
d.h. pro Well liegt eine Zellzahl von 5×104 Zellen
vor
- – pro
Well 50 μl
Antikörper
(verschiedene Verdünnungen
in Vollmedium) hinzufügen
- – 96-Well-Platte
24 h bzw. 48 h im Brutschrank inkubieren
- – 50 μl MTT-Lösung in
jedes Well pipettieren
- – Platte
20 min im Brutschrank inkubieren
- – Platte
anschließend
10 min bei 2800 rpm zentrifugieren und den Überstand absaugen
- – 150 μl DMSO pro
Well hinzufügen
und das Zellpellet resuspendieren
- – Absorption
bei einer Wellenlänge
von 540 nm und 690 nm im ELI-SA-Reader
bestimmen.
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MTT: 3-(4.5-dimethylthiazol-2-yl)
-2,5-diphenyltetrazolium (SIGMA), 5mg/ml in PBS lösen.
Antikörper: CM-2
Zell-Linie:
COLO-206F (Kolon-Karzinom)
Inkubationszeit: 24h MTT-Test
Zell-Linie: COLD-206F (Kolon-Karzinom)
Inkubationszeit:
48h Antikörper: CM-2