JPH06511233A - 骨の形成を促進するための骨成長因子および骨吸収阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 骨の形成を促進するための骨成長因子および骨吸収阻害剤主μじＵ１互 本発明は、概して、ポリペプチド因子、ならびに、骨の成長および成熟における それらの使用に関する。特に、本発明は、骨吸収を阻害する物質とともに使用さ れるときの、新しい骨の形成を刺激する骨成長因子の使用に関する。これらの・ 治療上の組合せは、骨の質量の増加を伴う、骨の形成の速度の増加をもたらす。

λ朋−Δ背１ 形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）ファミリーは、インビボおよびインビトロに おける骨を含む種々の生理学的プロセスに関係する。例えば、インビトロにおけ る研究では、ＴＧＦ−βは、骨芽細胞の増殖およびマトリックス合成を刺激しく 　Ｃｅｎｔｒｅｌ　Ｉａら、（１９１１７）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６ ２：２８６９−２８７４）、そして、骨芽細胞の形成および活性を阻害すること が報告されている（Ｃｈｅｎｕら、　（１９８８）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８５：６８３−５６８７：　０ｒｅｆｆｏら、　（ １９８８）　Ｊ、Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎ、Ｒｅｓ、３：４３９−４４６）。　インビ ボにおいては、大たい骨（Ｊｏｙｃｅら、（１９９０）　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂ ｉｏｌ、　１１０＋２１９５−２２０７）および頭蓋冠（ＮｏｄａおよびＣａｎ ＋１ｌｌｉｅｒｅ（１９８９）　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　１２４：２９９１− ２２９４）　ヘのＴＧＦ−βの骨膜下注入は、嘔歯類動物の局所の骨の形成を刺 激する。さらに、ＴＧＦ−βを毎日皮下に注入されたマウスは、骨におけるＴＧ Ｆ−βの全身性のインビボ活性を実証する、骨マトリックスの蓄積の増加を伴う 多くの立方骨の骨芽細胞の増加を示し、また同様の処置を受けたラットも骨芽細 胞の増加を示した（ＭａｔｈｅｖＳらのｒＴＧＦ−βの全身送達は、ラット中で 、骨芽細胞の極だった増加を生じさせ、オステオイド合成を刺激し、そして長骨 および推骨の骨の形成の速度を増加させる」というポスターがＡｍｅｒｉｃａｎ 　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｂｏｎｅ　ａｎｄ　Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈの１９９０年のミーティングで発表された）。

アクチピン（Ａｃｔｉｖｉｎ＞は、インヒビン、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、 。

および構造的にＴＧＦ−β１と関連するタンパク質のファミリーを構成する他の タンパク質と、構造的に類似するダイマーのタンパク質である。これらのタンパ ク質は、ＴＧＦ−β類のクロマトグラフィー特性を示す。アミノ酸配列に関して 相同性を有することに加えて、アクチビンは、ＴＧＦ−β類を特徴付けるシステ ィン位置の保存を示す。アクチビンは、５ＤＳ−ＰＡＧＥによれば非還元条件下 で２５　ｋＤの分子量を示す（そして還元条件下で１４ｋＤの分子量を示す）。

アクチビンサブユニットには、βＡあるいはβＢと呼ばれる、２種の既知形態が 存在する。ホモダイマーの形態のβＡＡおよびβＢＢ、ならびに、ヘテロダイマ ーの形態のβＡＢが、文献に記載されている。アクチビンサブユニットは、それ らのアミノ酸配列に関して、ＴＧＦ−β１およびｂＴＧＦ−β２鎖との約３０％ の相同性を有する。インヒビンもまた、アクチビンに構造的に関連するポリペプ チドである。インヒビンは、アクチビンβＡあるいはβＢサブユニットと、別の ヶサブユニ、トとのヘテロダイマーである。インヒビンは、本質的にアクチビン と逆の活性を示す。

アクチビンβＡホモダイマーおよびβＡＢヘテロダイマーはブタの卵胞液から精 製され、そしてインビトロにおいてラット下垂体細胞からの卵胞刺激ホルモン（ ＦＳ）Ｉ）の放出を刺激することが示された（Ｌ　Ｖａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ　 （１９８６）　３２１ニア７６−７９）。

他の報告された活性には、神経分泌二ニーロンからのオキシトシンの放出の刺激 （Ｐ、　Ｅ、　５ａｖｃｈｅｓｋｏら、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８Ｂ）　旦３４： ６１５−１７；　Ｗ、Ｖａｌｅら、　ｒＲｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ 　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＪ　（１９８８）　４４：１−３４）　； 膵島からのインスリン分泌の刺激（Ｙ、Ｔｏｔｓｕｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｉ、＆ 　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏ＋ｕ＋、＜１９８８）１５６：３３５−３９） 　；ならびに、骨髄培養中での赤血球のおよび多分化能の始原細胞のコロニー形 成の刺激（Ｊ、　Ｙｕら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）　３３０ニア６５−６７； 　Ｈ，Ｅ、Ｂｒｏｘｗ＋ｅｙｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃ１ ．　ＩＪ、Ｓ、Ａ、　（１９８８）　８５：９０５２−５６）が含まれる。アク チビンβＡは、赤血球分化因子（ＥＤＦ）と明かに同じである（Ｍ、　Ｍｕｒａ ｔａら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、（１９８ｇ）　 ８５：２４３４−３８）アクチピンのアミノ酸配列がＴＧＦ−βと同じであるこ と以外、アクチビンは線維芽細胞および上皮細胞上に存在する。ＴＧＦ−βレセ プター１型、１１型、あるいはｌｌＩ型への結合に対しＴＧＦ　−βと競合しな い。しかし、アクチビンがラット下垂体腫瘍細胞へのＴＧＦ−β１の結合に対し て競合することが、報告されている　（Ｓ、Ｃｈｅｉｆｅｔｚら、Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｅｍ、　（１９８８）　２６３二１７２２５−２８）。

ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２がインビボにおいて軟骨内の骨の形成を誘導す ることが、報告されている（Ｍ、　Ｅ、　Ｊｏｙｃｅら、ム」罰１１８ｉｏ１． 　（１９９０）　１１０：２１９５−２２０７）。

「骨の形態形成タンパク質Ｊ　（ＢＭＰ）は、Ｕｒｉｓｔに発せられた米国特許 第４．２９４．７５３号および第４．４５５．２５６号の開示に従って、尿素あ るいはグアニジン塩酸塩を用いて無機質脱落した骨から抽出され、そして再沈澱 された。引続きＵｒｉｓｔは、この粗タンパク質混合物のイオン交換精製で、ｐ ｉ４４．８でのカルボキシメチルセルロース樹脂（ＣＭＣ）へは吸着されなかっ た活性が得られたことを報告した（Ｕｒｉｓｔ、　Ｍ、　Ｒ，、Ｃｌ１ｎ、　Ｏ ｒｔ恒」工Ｒｅ１．　Ｒｅｓ、（１９Ｂ２）　１６２：２１９）。５ｃｉｅｎｃ ｅ　（１９ｇ３）　２２０：６８０−６８５、および、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌ、ｓ、Ａ、　（１９８４）　ｌ：３７１−３７５ のＵｒｉｓｔの報告には、１７．５００および１８．５００ダルトンの分子量を 有するＢＭＰが記載されている。Ｕｒｉｓｔの特許公開であるＥＰＡ公開第０２ １２４７４号には、ＢＭＰの制限されたタンパク質分解により得られた４、　０ ００から７．０００ダルトンのＢＭＰフラグメントが記載されている。

米国特許第４．６０８．１９９号には、３０．０００−３２．０００ダルトンの 骨由来のタンパク質が記載されている。このタンパク質は、水可溶性であり、そ してコンカナバリンＡに対する親和性を有していないと、記載されている。

Ｗｏ　８ｇ１００２０５には、骨形成の活性を有すると主張している、ＢＭＰ− １、ＢＭＰ−２クラスＩ　（ｒＢＭＰ−２Ｊ　）、ＢＭＰ−３、およびＢＭＰ− ２クラスＩＩ　（、ｒＢＭＰ−４Ｊ　）と呼ばれる４つのタンパク質が報告され ている。

Ｊ、　Ｍ、　ＷｏｚｎｅｙのＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 　Ｖｏｌ、　１　（１９８９）、　ｐｐ、　２６７−２８０には、ＢＭＰ−５、 ＢＭＰ−６、およびＢＭＰ−７と呼ばれる、ＢＭＰ−２に密接に関連するさらに ３つのＢＭＰタンパク質が記載されている。

Ｗｏ　８９１０９７Ｂ？および８９１０９７８ｇには、今やＢＭＰ−７であるこ とが知られている、ｒＯＰ−ＩＪと呼ばれるタンパク質が記載されている。ＢＭ Ｐ−７のクローニングは、Ｅ、　０ｚｋａｙｎａｋら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ 　（１９９０）　９＋２０８５−２０９３に記載されており、ＢＭＰ−７の精製 は、Ｔ、に、Ｓａｍｐａｔｈら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９９０）　２６ ５：１３１９Ｂ−１３２０５に記載されている。

５ｅｙｅｄｉｎおよびＴｈｏｍａｓに発せらた米国特許第４．４３４．０９４号 で、カオトロピック剤を用いた抽出、アニオンおよびカチオン交換カラムでの分 画、およびｐＨ４，８においてＣＭＣに吸着される画分からの活性の回収による 、骨の形成を刺激する骨由来のタンパク質の部分精製が報告された。この新規タ ンパク質の画分は、「骨形成因子」と呼ばれ、約３０．０００ダルトン未満の分 子量を有することに特徴がある。

ｌｓｇａａｒｄら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、Ｍｅｔａｂ、１３：Ｅ３６７−７２ ．１９８６）　は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）による骨の成長の刺激を報 告している。

５ｌｏｖｉｋら（Ｊ、Ｂｏｎｅ　＆　Ｍｉｎ、Ｒｅｓ、１：３７７−３８１．　 １９８６）　は、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）による骨の成長の刺激を報告して いる。

インビトロにおける効果は、骨の吸収および新しい骨の形成にはいくつかの様式 が組み合わされているようであると、示唆している。例えば、ＴＧＦ−βは、明 白にこのプロセスに関連する。Ｐｆｅｉ　１ｓｃｈｉｆｔｅｒおよびＭｕｎｄｙ は、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｔ、ＵＳ、Ａ、　（１９８７）　８４：２０２４−２０２８において、頭蓋 冠を、副甲状腺ホルモン、１．２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、およびインタ ーロイキンｌとともにインキユベートした骨吸収を刺激する全ての因子が培養培 地中において内因性のＴＧＦ−β活性の増加を示す一方、骨吸収を阻害するカル シトニンとともにインキュベーシヲンが内因性のＴＧＦ−β活性の減少に相関す ることを実証した。

本発明は、外因性の骨成長因子と骨吸収を阻害する物質との組合せ投与による、 新しい骨の形成を刺激するためのインビボにおける組合せ治療を提供する。これ らの組合せは、骨の質量および骨の形成の速度の増加を相乗的に促進するようで あり、単独成分としてよりもより有効な骨の喪失および骨の置換を予防するため の治療を提供する。

λ胛旦要１ 本発明は、骨成長因子と骨吸収阻害剤との組合せを投与することによる、被検体 における新しい骨の形成を刺激する方法を包含する。好ましくは、骨成長因子は ＴＧＦ−β、アクチビン、ＢＭＰ、ＩＧＦ、　ＰＴＨ，あるいはそれらの活性フ ラグメントであリ、骨吸収阻害剤はエストロゲン、ビスホスホネート、フッ化ナ トリウム、カルシトニン、あるいはクモ半ジフェン、または、関連化合物である 。

本発明の他の局面は、骨成長因子と骨吸収阻害剤との組合せを投与することによ り、被検体における骨の喪失を治療する方法である。

本発明はさらに、被検体における骨の形成を誘導するための骨成長因子および骨 吸収阻害剤の組成物を提供する。

本発明の他の局面は、被検体における骨の喪失を治療するための、骨成長因子お よび骨吸収阻害剤の組成物である。

図面の簡単な説明 図１＾およびＩＢは、卵巣摘出を受けたラット（Ａ）およびエストロゲンで処置 された卵巣摘出を受けたラット（Ｂ）における、二重蛍光色素でラベルした小柱 表面を示す顕微鏡写真である。

図２ＡおよびＢは、ＴＧＦ−β（Ａ）、あるいはＴＦＧ−βとエストロゲン（Ｂ ）とを与えられた、卵巣摘出を受けたラットにおける、二重蛍光色素でラベルし た小柱表面を示す顕微鏡写真である。

図３は、卵巣摘出を受けたラットおよびエストロゲン処ｌされた卵巣摘出を受け たラットからの骨の有機成分含量と無機成分含量との割合の比較を示すグラフで ある。

図４は、卵巣摘出を受けたう、ト、および、丁ＧＦ−β処置およびエストロゲン を加えたＴＧＦ−β処置された、卵巣摘出を受けたうｙ）からの骨の有機成分含 量と無機成分含量との割合の比較を示すグラフである。

図５Ａハ、ＴＦＧ−β、エストロゲン、エストロゲンを加えたＴＧＦ−β、ある いは賦形剤のみで処置された、卵巣摘出を受けたラットの、二重ラベルされた骨 の表面の含有百分率の比較を示すグラフである。図５Ｂは、ＴＦＧ−β、エスト ロゲン、エストロゲンを加えたＴＧＦ−β、あるいは賦形剤のみで処置された、 卵巣摘出を受けたラットの骨の形成の速度の比較を示すグラフである。

λ胛旦用亙ｌ且里 Ａ、定−１ 本明細書および添付の請求の範囲で使用されている、単数形ｒａＪ、ｒａｎＪ、 および「ｔｈｅＪには、他の明確な記載がなければ、複数の対象が含まれる。従 って、例えば、ｒａ　ＴＧＦ−β」には、本明細書に一般的に記載されている梨 のダイマーのタンパク質の統計的混合物が含まれ、そして「投与方法（ｔｈｅ　 ｍｅｔｈｏｄ　ｏｒ　ＡｄｖｘｉｎｒｓｔｒａｔＬｏｎ）　Ｊには、本明細書に 記載の型、および／または、この開示をよむことにより当業者には明白となる型 の、１種またはそれ以上の方法が含まれる。

用語「骨成長因子」とは、骨あるいは軟骨の形成に影響するタンパク質のファミ リーのことである。骨成長因子の例には、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β） 、アクチビン、ＪＧＦ、　ＰＴ■、および骨の形態形成因子（ＢＭＰ）が含まれ る。

用を吾ｒＴＧＦ−β」　とは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、Ｔ ＧＦ−β４、　ＴＧＦ−β５、ＴＧＦ−βポリペプチド鎖のヘテロダイマー（例 えばＴＧＦ−β１．２）、およびそれらのフラグメンント、合成ペプチド、なら びに、Ｍｅｔｏｄｓｆｏ　Ｐｅ　ａｔｔｏ　ｏ　Ｍｅｄ’ａ　Ｓｕ　ｅｍｅｎｔ ｓ　ａｎｄ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　ｆｏ　Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ　Ａｎｉｍａｌ 　Ｃｅｌ　Ｃｕ　ｔｕｒＱ　（１９８４）　ｐｐ、　１８１−１９４．　Ａｌａ ｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、に記載のような多くの周知の任意のＴＧＦ−βア ッセイによる実質的に等価の生物学的活性を有する相同タンパク質を含む、β型 の形質転換成長因子のことである。この特定のアッセイでは、　軟寒天−ｃの細 胞コロニーの形成を測定することにより、非新生物形成（ｎｏｎ−ｎｅｏｐｌａ ｓｔｉｃ）の正常ラット腎（ＮＨＫ）線維芽細胞の足場依存成長（ａｎｃｈｏｒ ａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ）を誘導する能力が決定される。他 の周知のＴＧＦ−β活性アッセイには、限定はされないが、骨芽細胞の増殖刺激 、角化細胞の増殖阻害、種々の細胞でのコラーゲン合成の阻害、マイトジェン刺 激子細胞増殖の阻害、および走化性活性の刺激が含まれる。ＴＧＦ−β１および ＴＧＦ−β２の調製は、本明細書に参考として援用されている米国特許第４．７ ７４．３２２号に記載されている。他のＴＧＦ−β類もまた記載されている。米 国特許第４．８８６．７４７号には、ＴＧＦ−β３の同定およびそのヌクレオチ ド配列、ならびに、組み換え細胞培養からのＴＧＦ−βの回収方法が記載されて いる。Ｓ、　Ｂ、　Ｊａｋ。

ｆｌｅｗら、Ｍｏ１ｅｃ、Ｅ　ｄｏｃｒｉｎｏｌ、（１９８８）　２：１１８６ −１１９５には、ｃＤＮＡの特徴付けにより同定された、ＴＧＦ−β４およびそ のヌクレオチド配列が記載されている。Ａ、　Ｂ、　Ｒｏｂｅｒｔｓら、江」遺 １１■ｏＬ！、　Ｖｏｌ、　２　（１９９０）　ｐｐ、　１３５−１４７には、 ■厄ｌｕ−馴化培地からのＴＧＦ−β５の精製が記載されている。

本明細書に使用されている用１ｒＴＧＦ−β」には、１９９０年１１月１６日に 出願された同時係属の米国特許出願番号第６１４．３０６号に記載されているヘ テロダイマーＴＧＦ−β２．３もまた含むことを意図する。ＴＧＦ−β２．３は 、カラムクロマトグラフィーのピークのそばの画分（ｓｉｄｅ　ｆｒａｃＨｏｎ ）をプールし、これらの画分を逆相ＨＰＬＣにかけ、５ＯＳ−ＰＡＧＥによりＴ ＧＦ−β２よりさらに遅く移動する画分を回収し、これらのより遅く移動する画 分をＦＰＬＣにかけて、ｐＨ４，６から６．７のグラジェント間で移動したもの を回収し、ｐＨ４，６から６．７での溶出物を逆相１’１ＰＬｃあるいはゲル電 気泳動にかけ、実質的に純粋なＴＧＦ−β２．３を回収することにより、前抽出 物から調製され得る。

本明細書に使用されている用１ｉｒＴＧＦ−β」には、その作用機構カＴＧＦ− βレセプターあるいは第二メツセンジャー経路ヲ介して媒介される任意の他の合 成分子もまた含むことを、意図する。

これらのタンパク質は、それらの活性が種物異的ではないので、競技用、愛玩用 、および酪農用動物、ならびに、ヒトを含む、一般的な被検体の治療に使用され 得る。

用語「骨吸収の阻害」とは、骨の喪失の予防のことであり、特に、無機層および ／または有機マトリックス層からの、骨芽細胞の形成あるいは代謝の直接あるい は間接変化による、現存の骨の除去を阻害することである。従って、本明細書に 使用されているように、用語「骨吸収阻害剤」とは、骨芽細胞の形成あるいは代 謝の直接あるいは間接変化による、骨の喪失を予防する物質のことである。

用語「骨形成的に効果な」とは、成熟骨の形成および分化に有効な量を意味する 。本明細書に使用されているように、骨形成的に有効な投与量はまた、「薬学的 に有効な」量である。

本明細書に使用されている用Ｐｉ「被検体」とは、治療を必要とする、すなわち 骨の修復あるいは置換を必要とする、哺乳類あるいは鳥類のような生命のあるを 推動物のことである。

このような必要性は、骨折、偽関節、欠損、補てつインプランチーシランなどの 場合において、局所的に生じる。このような必要性はまた、骨粗しよう症、変形 性関節症、パジェット（Ｐａｇｅｔ）病、骨軟化症、骨石灰脱失症、多発性骨髄 腫（■ａｙｅｔｏ■ａ）、および癌の他の形態、ならびに、年齢に関連した骨の 質量の喪失のような、全身的な骨の疾患の場合においても生じる。

よび／または不健康な状態の進展を予防するために、予防的に作用するのに十分 な量の物質を被検体に供給すること、あるいは（２）疾患症状および／または疾 患症候群、ならびに、衰弱および／または不健康な状態を軽減あるいは除去する ために十分な量の物質を被検体に供給することを、意味するべきである。

Ｂ、ｆｌブト汰 骨の喪失の予防、および／または、喪失した骨を付は戻す薬剤は、卵巣摘出を受 けたラットで評価され得る。この動物モデルは、当該分野では既に公表されてい る（例えば、Ｉｒｏｎｓｋｌら（１９８５）　Ｃａ１ｃ’ｆ、　Ｔｉ５ｓｕｅ　 Ｉｎｔ、３７：３２４−３２８；　Ｋｉｍｍｅｌら（１９９０）　Ｃａ　ｃｉｆ 、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｉｎｔ、　４６：１０１−１１０；およびＤｕｒｂｒｉｄｇ ｅら（１９９０）　Ｃａ　ｅｆｉ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｉｎｔ、　４７：３１１３− ３！ＩＴを参照のこと。これらは、全体的に本明細書に参考として援用されてい る）。Ｗｒ・ｏｎｓｋｉら（（１９８５）　Ｃａ１ｃ’ｆ、　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｉ ｎｋ、　４３：１７９−１８３）は、卵巣摘出を受けたラットにおける骨の喪失 と骨の転換との関連を記載している。

骨吸収阻害剤の例には、エストロゲン類、ビスホスホネート類、カルシトシン類 、フッ化ナトリウム類、およびタモキシフェン類が含まれる（　Ｔｕｒｎｅｒら （１９８７）　Ｊ、　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅ　ａｌ　Ｒｅｓ、　２：１１５−１２ ２ＨＷｒｏｎｓｋｉら（１９８８）　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　１２８：６８１ −６８６：およびＷｒｏｎｓｋｉら（１９８９）　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　１ ２５：８１０−８１６；　Ｐｆｅｉｌｓｈｉｆｔｅｒら（１９８７）　Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８４：２０２４−２０２８；　Ｔ ｕｒｎｅｒら（１９８８）　Ｅｎｄｏｃｒｔｎｏｌｏ　１２２：１１４６−１１ ５０）。

特定の阻害剤の全分子が使用され得るか、あるいは、阻害剤分子の機能部分のみ が使用され得る。

骨成長因子および／または骨吸収阻害剤を含む投与のための本発明の薬学的処方 物は、一般的には薬学的に受容可能な賦形剤に加えて、骨の成長を促進するため の骨形成的に有効な量の骨成長因子を含む。適切な賦形剤には、水、生理食塩水 、リンガ−液、ノ１ンク液、およびグルコース、ラクトース、デキストロース、 エタノール、グリセロール、アルブミンなどの溶液を含む、非経口投与に適した ほとんどのキャリアカ５含まれる。これらの組成物は、安定剤、抗酸化剤、抗菌 剤、防腐剤、緩衝剤、界面活性剤、および他の付属の添加剤を必要に応じて含み 得る。ＴＦＧ−βおよび骨吸収阻害剤もまた、適切なキャリアからの持続放出の 形態で送達され得る。

今のところ好ましい賦形剤は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）ある（Ｘは等張クエン酸 緩衝液中の、約Ｉ　Ｂ／ｍｌの血清アルブミン（種物異的）である。非経口投与 のために適切な賦形剤の十分な。

考察は、Ｅ、　Ｗ、　ＭａｒｉｔｎのｒＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａ ｃｅｕｔｔｃａｌ　５ｅｔｅｎｃｅｓＪ　（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ、　Ｃｏ、、最新 版の賦形剤および処方の章：このような開示は本明細書に参考として援用されて −する）に認められ得る。このような処方物は、一般的に当該分野に公知であり 、全身治療を提供するために全身的に投与される。

骨成長因子および骨吸収を阻害する物質力≦、連続的１こ、あるいは、単一組成 物として同時に、被検体に投与され得る。

連続的に投与される場合の骨成長因子と骨吸収阻害剤との投与間隔は、典型的に 旧週間から１年、最適にＣよ１週間力１ら６ケ月である。

単一組成物として骨成長因子および骨吸収を阻害する物質的１０：１から１：１ ０、好ましくは５：１から１＝５、最適ζ−Ｃま１：１である。

最適比は、化合物により変化すること力５予浪１１される。さら１こ、単一組成 物として投与される場合の骨成長因子および骨吸収阻害剤は、組成物の別々の成 分であり得るか、あるいは、互いに複合化され得る。

正確な投与必要量は、被検体の年齢、大きさ、性別、および症状、治療されるべ き疾患の特性および重篤度などにより変化する。従って、正確な有効量は前もっ て特定され得ず、治療する者により決定される。しかし、適切な量は以下に記載 したような動物モデルによる通例の実験により決定され得る。一般的には、全身 治療のための骨成長因子の有効投与量は体重あたり約ｏ、ｏｏｔμｇ／ｋｇから 約ｌＯ■ｇ／ｋｇの範囲である。エストロゲンの有効投与量は、体重あたり１μ ｇ／ｋｇから約１鵬ｇ／ｋｇである。ビスホスホネート鎖の有効投与量は、体重 あたり約０．０５μｇ／ｋｇから約１５＋ｓｇ／ｋｇである。カルシトニンの有 効投与量は、体重あたり約０．０５　ＭＲＣＵ　（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉｌ　Ｕｎｉｔｓ）　／ｋｇから約２．５　ＭＲＣＵ／ｋｇ である。

局所投与のための有効投与量は、適用部位につき約ｏ、ｏｏｔμ。

ｇから１■ｇである。

本発明の方法および組成物は、骨粗しよう症、変形性関節症、パンエツト病、骨 軟化症、骨石灰脱失症、多発性骨髄腫、および他の癌の形態から生じる骨の喪失 、他の医学的治療（例えばステロイド）の副作用から生じる骨の喪失、および年 齢に関連した骨の質量の喪失のような骨の衰弱から生じる、骨折、欠損、ならび に疾患を治療するのに有用である。

使用の１つの方法に従って、骨成長因子および骨吸収阻害剤は、経口的、および ／または、皮下あるいは静脈内注射を含む非経口的に全身的に、ならびに／ある いは、鼻腔内に投与され得る。さらに、骨成長因子および骨吸収阻害剤は、適切 なキャリアから持続放出の形態で送達され得る。

使用の他の方法に従って、骨成長因子が、骨の成長あるいは修復の必要な特定の 領域に、骨吸収阻害剤との部位への共存投与、あるいは、別の賦形剤中の骨吸収 阻害剤の投与のいずれかとともに局所的に投与され得るか、または、骨吸収阻害 剤が、別の賦形剤中の骨吸収因子の投与とともに局所的に供給され得る。従って 、骨成長因子および／または骨吸収阻害剤は、例えば、注入、あるいは、持続放 出キャリアの外科手術的なインプランテーンヨンにより、治療されるべき部位に 直接インブラントされ得る。適切なキャリアには、ヒドロゲル類、制御または持 続放出装置（例えば、Ａｌｚｅｔ’Ｅ’ミニポンプ）、ポリ乳酸、ならびにコラ ーゲンマトリックス類が含まれる。今のところ好ましいキャリアは、相同あるい は異種原線維アテロペプチドコラーゲン（例えばＣｏｌＣｏ１１ａ　Ｃｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎ、　Ｐａ１ｏ＾ｌｔｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａから入手可能なｚ ｙｄｅｒρＣｏｌｌＣｏ１１ａ冒ｐｌａｎｔ）とヒドロキシアパタイトトリカル シウムホスフェート（Ｚｉｍｍｅｒ、　Ｉｎｃ、、　Ｗａｒｓａｗ、　ＩＮから 入手可能な■Ａ−ＴＣＰ）との組合せのような微粒子状のリン酸カルシウム無機 成分を含有する、アテロペプチドコラーゲン配合物である。コラーゲン／無機マ トリックスインブラント中に骨成長因子および／または骨吸収阻害剤を含有する 投与のためのインブラント組成物が、今のところ好ましい。

持続放出賦形剤中で送達される骨成長因子および／または骨吸収阻害剤は、イン ブラントの固定の改良、例えば関節を再構成する金属補てっ物、および、歯ある いは整形外科インブラントへの新しい骨の内部成長の改良に特に有用である。

あるいは、骨成長因子は、別の賦形剤中で送達される阻害剤とともにインブラン ト内に送達され得、また逆も可能である。

歯および整形外科インブラントは、インブラント装置の骨への接続を促進するた めに、骨吸収阻害剤と組合せた骨成長因子で被覆され得る。あるいは、骨成長因 子がインブラントを被覆するために使用され得、そして、骨吸収阻害剤が共存投 与され得るかあるいは別の賦形剤中で連続投与され得るかであり、また逆も可能 である。

一般的に、インブラント装置は、以下のように、骨成長因子および／または骨吸 収阻害剤で被覆され得る。骨成長因子（および所望であれば骨吸収阻害剤）を、 ０．０１μｇ／ｍｌから２゜Ｏｍｇ／ｍｌの濃度範囲で、２ｍｇ／ｍｌの血清ア ルブミンを含有するり・ン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解する。インブラントの多孔 性末端を溶液に浸し、空気乾燥（または凍結乾燥）するか、あるいは、身体の部 位に直ちにインブラントする。所望であれば、ヒアルロン酸を最終濃度が０．１ ｍｇ／■ｌから１００ｍｇ／■ｌなるように添加することにより、あるいは、他 の薬学的に受容可能な賦形剤を添加することにより、被覆溶液の粘度を増大させ る。あるいは、骨成長因子（および所望であれば骨吸収阻害剤）を含有する溶液 を、コラーゲンゲルまたはヒトコラーゲン（例えばＺｙｄｅｒｗ＠　ＣｏｌＣｏ １１ａ　Ｉｍｐｌａｎｔ、ＣｏｌＣｏ１１ａ　Ｃｏｒｐ、、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔ ｏ。

ＣＡ）と混合し、最終コラーゲン濃度が２■ｇ／■ｌから１００ｓ＋ｇ／ｍｌに なるようにペーストまたはゲルを形成し、次に、これをインブラント装置の多孔 性末端の被覆に使用する。インブラントへの新しい骨の形成を最大にする一方、 インブラントへの軟組織の内部成長を最少限にするために、被覆されたインブラ ント装置を、直ちに身体の部位に設置するかあるいは空気乾燥してインブラント 前にＰＢＳで再水和する。

Ｃ，）ＩＪＪ 以下の実施例は、完全な開示および記載により、抽出、単離、処方、および使用 する、本発明の組成物ならびに方法を、当業者に提供するために掲げるものであ り、発明者が発明とするものの範囲を限定することは意図していない。結果とし て、使用した数（例えば、量、時間、温度）に関する正確さは保証されるが、い くらかの実験誤差および偏差は考慮されるべきである。他に明記されていなけれ ば、部は重量部であり、温度は摂氏度、圧力は大気圧あるいは大気圧付近、なら びに、他のパラメーターは従来の当業者に通常許容され得る通りのものである。

実１ル− ２５日齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｖｌｅｙラットに、卵巣摘出あるいは虚偽手術 を行い、８週間収容して骨の喪失を起こさせた。５匹の卵巣摘出を受けたラット および３匹の虚偽手術を受けたラットに、５μｇのＴＧＦ−β２を、７日間毎日 皮下投与した。４匹の卵巣摘出を受けたラットに、賦形剤のみを７日間毎日投与 した。ラットを７日間の処置の最終日に安楽死させ、大たい骨を軟組織から切開 した。

骨標本をエタノール中で固定し、処理して、石灰質を除去せずにメチルメタクリ レート中に埋め込んだ。末端大たい骨の薄い切片（４μ冒）を、Ｒｅｉｃｈｅｒ ｔ−Ｊｕｎｇミクロトームで切りだした。この薄い切片を、一般形態学用のトル イジンブルーで染色した。

定性評価は、上記グループのラットからの大たい骨で実施した。虚偽コントロー ルの枝骨および皮質骨内膜表面の両方は、全体的に活動していなかった（すなわ ち、骨芽細胞あるいは破骨細胞の活性はほとんどなかった）。逆に、虚偽にＴＦ Ｇ−βを加えた処置をしたグループでは、虚偽コントロールあるいはＯｖｘプル ープのいずれよりも骨芽細胞および破骨細胞がより容易に認められた。

従って、これらの観察により、ＴＦＧ−β処置をした虚偽手術動物において、処 置をしなかった虚偽手術ラットと比較して増大された骨の転換の効果が認められ る。同様の程度の骨の転換が、賦形剤処置の卵巣摘出を受けたコントロールと比 較してＴＧＦ−β処置の卵巣摘出を受けたラットでは認められなかったので、卵 巣摘出を受けた動物には存在しない、ＴＧＦ−βが新しい骨の形成を刺激し得る 因子を無傷の動物が有することは明白である。

支血且１ ９０日齢の４２匹のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｖｌｅｙラットに卵巣摘出を行い、術 後ｌＯ週間収容して骨の喪失を起こさせた。術後７０日目から２週間の間、１０ βｇ／ｋｇの１７β−エストラジオールを含有するあるいは含有しない５μｇ／ 動物のＴＧＦ−β２で、ラットを毎日（５日／週）処置した。卵巣摘出を受けた ラットの別のグループを、コントロールとして、賦形剤のみあるいは１７β−エ ストラジオールのみで処置した。各グループは、６匹のラットからなる。

骨を、蛍光色素マーカー、カルセイン、およびテトラサイ・タリノで代謝的にラ ベルした。安楽死の前にカルセインを７日間、および、安楽死の前にテトラサイ クリンを２日間与え、石灰化および骨の形成の速度を評価した。

第一腰椎および脛骨の付着している全ての軟組織を取り除き、室温にて２日間ア セトン中で脱脂した。１時間乾燥後、骨を８０℃のオーブン中で２日間さらに乾 燥し、１時間かけて冷却して、分析用天秤で重量を測定した。次に、マツフルる つぼ中で６００℃にて２時間灰化して、デシケータ−中で４５分間がけて冷却し た。骨の試料を、２８ＨＮＯ３を加えながらポットプレート上で炭化し、最終炭 化は火炎上で行った。次に、試料をマツフルるつぼ中で６００°Ｃにて２４時間 灰化し、デシケータ−中で量を得た。

組織学用の骨の標本を、エタノール中で脱水し、石灰質を除去せずにメチルメタ クリレート中に埋め込んだ。末端穴た。

い骨の薄い切片（４μ■）および厚い切片（１５μ園）を、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ− Ｊｕｎｇ　２０５０ミクロトームで切りだした。薄い切片をトルイジンブルーで 染色して、全体的な形態学およびオステオイドの蓄積を評価した。厚い切片は染 色せずに、蛍光色素マーカーの指標により、骨の転換の機能パラメーターを評価 した。

乾燥重量および灰分重量の測定結果は、脛骨および第−腰椎両方の有機物含有量 の無機物含有量に対する割合を計算するのに使用した。その結果を図３および４ に示す。

図３に示されるように、エストロゲンのみの処置は、処置をしていないＯｖｘコ ントロールに比較して、脛骨の有機／無機比をわずかに減少させ、５μｇ／動物 のＴＧＦ−β２処置は、有機／無機比を少し増加させた。しかし、ＴＦＧ−β２ を１７βエストラジオールとともに投与すると、有機／無機比は、いずれかの物 。

質のみよりもはるかに増大し、処置をしていないＯｖｘコントロールよりも有意 に増大した。

図４に示されるように、腰椎Ｌ１の評価においても同様の結果が認められた。有 機／無機比の減少はエストロゲンのみによるときに認められた。この部位では、 ＴＧＦ−βのみの処置では有機／無機比の増加は認められなかったが、１７β− エストラジオールを加えたＴＧＦ−βの処置では、処置をしていないＯｖｘコン トロールに比較して有機／無機比が有意に増加した。

染色された切片の試験では、処置されていないｏｖｘコントロール動物およびエ ストロゲンで処置されたラットが小柱表面に極わずかのオステオイド蓄積を有す ることが、示された。

逆に、ＴＧＦ−βで処置されたラットは、染色可能なオステオイドの総量に有意 な増加を有した。ＴＧＦ−βおよびエストロゲン。

の両方を与えられたラットは、いずれかの因子のみによるよりも、大量のオステ オイド蓄積を有した。

染色されていない切片の定性試験では、処置されていないＯｖｘラットおよびエ ストロゲンで処置されたラットが、二重蛍光色素ラベルを含む小柱表面を有する ことが示された（図ＩＡおよびＩＢ；　４０Ｘの倍率での蛍光顕微鏡で観察した １５μ園切片である；ｂは骨を示し、■は骨髄を示す；二重ラベルされた表面を 矢印で示しである）。ＴＧＦ−βで処置されたラットは、前の２つのグループに 比較して、二重ラベルされた小柱表面の量の増加を示す。一方、ＴＦＧ−βおよ びエストロゲンを与えられたラットは、全ての試験グループに高レベルの二重ラ ベルされた表面を示した。このことは、上記の、オステオイド蓄積およびより広 範囲のオステオイド薄層（ｓｅａ■）の増加と非常に関連していた。

組織形態形成学的データを、大たい骨の貴地の海綿質において収集した。領域の １列を、皮質から皮質を２５０ｘで測定し、各切片ごとに通常１０−１４領域を 測定した。皮質骨内膜表面は、測定には含まれなかった。枝骨の総周囲（表面） および領域（量）（周囲（■■）／領域（ｍｍ２）　＝骨の量）を、マツキンッ トシュコンピュータでインターフェースされたグラフにトレースした。単一ラベ ル（５ＬＳ）あるいは二重ラベル（ｄＬＳ）で被覆された総柱骨表面の含有百分 率をトレースして、以下の式により石灰化した表面の含有百分率を計算した。

ｔＭｓ　−（ｄｏｓ　＋　５ｓＬｓ／２）ここにおいて、ＢＳは骨の表面を示す 。石灰付加速度（ＭＡＲ）は、内部ラベルの広さを、１日における内部ラベル時 間で割り算し、そして、切片傾斜に対する修正を行って、μ１７日における修正 されたＭＡＲを得た（ＯＪ６５を掛けて、μｇ／ｙｒに換算した）。

骨の形成速度（ＢＦＲ）は、以下のように、総ＭＳではなく、ｄＬＳのみを用い てコンピュータで計算した：ｄＬＳ　ｘ修正ＭＡＲ／ＢＹ　＝　ＢＦＲ。

データは、平均上ＳＰで表し、グループの比較は１つの因子ＡＮＯＶＡＳを用い て行った。これらのデータを、図５Ａおよび５Ｂに示す。図５Ａでは、卵巣摘出 を受けたラットにおける、ＴＧＦ−βおよびエストロゲンの相乗効果を示し、図 ５Ｂでは、ＴＧＦ−βおよびエストロゲンで処置した卵巣摘出を受けたラットに おける、骨形成の相乗速度を示す。

従って、ＴＧＦ−βによる卵巣摘出を受けたう・ノドの処置は、骨の形成速度を 増加させた。さらに、この増加は、エストロゲンによる同時処置により、有意に 促進された。

ＦＩＧ、　Ｉ　Ａ ＦＩＧ、２Ａ ｆｉ＋の　鳴主特／資峡を蛾干Ｔ１敷　−牌鑵Ｌ１の酊吟／鼾僧几数 ＦＩＧ、４ ＦＩＧ、５Ａ Ｏ−９０−８６４＋　ＢＦＲ（ｖ／ｙｌ　ｄＬＳＦＩＧ、５Ｂ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３７／３０　 ＡＤＵ　８３１４−４Ｃ３７／３６　ＡＤＤ　８３１４−４Ｃ （７２）発明者　ローゼン、ディピッドアメリカ合衆国　カリフォルニア　９５ １３５サン　ホセ、パルマイン　コート　３１４１Ｉ

Claims (68)

【特許請求の範囲】
1. １．被検体における新しい骨の形成を刺激する方法であって、薬学的に有効な投 与量の骨成長因子および薬学的に有効な投与量の骨吸収阻害剤を該被検体に投与 する工程を包含する、方法。
2. ２．前記骨成長因子がＴＧＦ−βである、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記骨成長因子がアクチビンである、請求項１に記載の方法。
4. ４．前記骨成長因子が骨の形態形成タンパク質（ＢＭＰ）である、請求項１に記 載の方法。
5. ５．前記骨成長因子がＩＧＦである、請求項１に記載の方法。
6. ６．前記骨成長因子が副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）あるいはその活性フラグメン トである、請求項１に記載の方法。
7. ７．前記骨吸収阻害剤がエストロゲンである、請求項１に記載の方法。
8. ８．前記骨吸収阻害剤がカルシトニンである、請求項１に記載の方法。
9. ９．前記骨吸収阻害剤がビスホスホネートである、請求項１に記載の方法。
10. １０．前記骨吸収障害剤がフッ化ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
11. １１．前記骨吸収阻害剤がタモキシフェンである、請求項１に記載の方法。
12. １２．前記被検体がヒトである、請求項１に記載の方法。
13. １３．前記骨成長因子および骨吸収阻害剤が連続的に投与される、請求項１に記 載の方法。
14. １４．前記骨成長因子および骨吸収阻害剤が同時に投与される、請求項１に記載 の方法。
15. １５．被検体における骨の喪失を治療する方法であって、薬学的に有効な投与量 の骨成長因子および薬学的に有効な投与量の骨吸収阻害剤を該被検体に投与する 工程を包含する、方法。
16. １６．前記骨成長因子がＴＣＦ−βである、請求項１５に記載の方法。
17. １７．前記骨成長因子がアクチビンである、請求項１５記載の方法。
18. １８．前記骨成長因子が骨の形態形成タンパク質（ＢＭＰ）である、請求項１５ に記載の方法。
19. １９．前記骨成長因子がＩＧＦである、請求項１５に記載の方法。
20. ２０．前記骨成長因子が副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）あるいはその活性フラグメ ントである、請求項１５に記載の方法。
21. ２１．前記骨吸収阻害剤がエストロゲンである、請求項１５に記載の方法。
22. ２２．前記骨吸収阻害剤がカルシトニンである、請求項１５に記載の方法。
23. ２３．前記骨吸収阻害剤がビスホスホネートである、請求項１５に記載の方法。
24. ２４．前記骨吸収阻害剤がフッ化ナトリウムである、請求項１５に記載の方法。
25. ２５．前記骨吸収阻害剤がタモキシフェンである、請求項１５に記載の方法。
26. ２６．前記被検体がヒトである、請求項１５に記載の方法。
27. ２７．前記骨の喪失が骨粗しょう症関連である、請求項１５に記載の方法。
28. ２８．前記骨の喪失が骨軟化症関連である、請求項１５に記載の方法。
29. ２９．前記骨の喪失が骨石灰脱失症関連である、請求項１５に記載の方法。
30. ３０．前記骨の喪失が年齢関連である、請求項１５に記載の方法。
31. ３１．前記骨の喪失がステロイド治療に関連する、請求項１５に記載の方法。
32. ３２．前記骨の喪失が変形性関節症関連である、請求項１５に記載の方法。
33. ３３．前記骨の喪失がパジェット病と関連する、請求項１５に記載の方法。
34. ３４．前記骨の喪失が癌と関連する、請求項１５に記載の方法。
35. ３５．前記癌が多発性骨髄腫である、請求項３５に記載の方法。
36. ３６．前記治療が予防となる、請求項１５に記載の方法。
37. ３７．前記骨成長因子および骨吸収阻害剤が連続的に投与される、請求項１５に 記載の方法。
38. ３８．前記骨成長因子および骨吸収阻害剤が同時に投与される、請求項１５に記 載の方法。
39. ３９．被検体において骨の形成を誘導する組成物であって、薬学的に受容可能な 賦形剤中に薬学的に有効な投与量の骨成長因子および薬学的に有効な骨喪失阻害 剤を含有する、組成物。
40. ４０．前記骨成長因子がＴＧＦ−βである、請求項３９に記載の組成物。
41. ４１．前記骨成長因子がアクチビンである、請求項３９記載の組成物。
42. ４２．前記骨成長因子が骨の形態形成タンパク質（ＢＭＰ）である、請求項３９ に記載の組成物。
43. ４３．前記骨成長因子がＩＧＦである、請求項３９に記載の組成物。
44. ４４．前記骨成長因子が副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）である、請求項３９に記載 の組成物。
45. ４５．前記骨吸収阻害剤がエストロゲンである、請求項３９に記載の組成物。
46. ４６．前記骨吸収阻害剤がカルシトニンである、請求項３９に記載の組成物。
47. ４７．前記骨吸収阻害剤がビスホスホネートである、請求項３９に記載の組成物 。
48. ４８．前記骨吸収阻害剤がフッ化ナトリウムである、請求項３９に記載の組成物 。
49. ４９．前記骨吸収阻害剤がタモキシフェンである、請求項３９に記載の組成物。
50. ５０．骨成長タンパク質の骨吸収阻害剤に対するモル比が１０：１から１：１０ である、請求項３９に記載の組成物。
51. ５１．骨成長タンパク質の骨吸収阻害剤に対するモル比が５：１から１：１であ る、請求項３９に記載の組成物。
52. ５２．骨成長タンパク質が前記骨吸収阻害剤に複合体化されている、請求項３９ に記載の組成物。
53. ５３．さらに持続放出賦形剤を含有する、請求項３９に記載の組成物。
54. ５４．被検体における骨の喪失を治療するための組成物であって、薬学的に受容 可能な賦形剤中に薬学的に有効な投与量の骨成長因子および薬学的に有効な骨吸 収阻害剤を含有する、組成物。
55. ５５．前記骨成長因子がＴＧＦ−βである、請求項５４に記載の組成物。
56. ５６．前記骨成長因子がアクチビンである、請求項５４記載の組成物。
57. ５７．前記骨成長因子が骨の形態形成タンパク質（ＢＭＰ）である、請求項５４ に記載の組成物。
58. ５８．前記骨成長因子がＩＧＦである、請求項５４に記載の組成物。
59. ５９．前記骨成長因子が副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）である、請求項５４に記載 の組成物。
60. ６０．前記骨吸収阻害剤がエストロゲンである、請求項５４に記載の組成物。
61. ６１．前記骨吸収阻害剤がカルシトニンである、請求項５４に記載の組成物。
62. ６２．前記骨吸収阻害剤がビスホスホネートである、請求項５４に記載の組成物 。
63. ６３．前記骨吸収阻害剤がフッ化ナトリウムである、請求項５４に記載の組成物 。
64. ６４．前記骨吸収阻害剤がタモキシフェンである、請求項５４に記載の組成物。
65. ６５．前記骨成長因子の骨吸収阻害剤に対するモル比が１０：１から１：１０で ある、請求項５４に記載の組成物。
66. ６６．前記骨成長因子の骨吸収阻害剤に対するモル比が５：１から１：１である 、請求項５４に記載の組成物。
67. ６７．前記骨成長因子が前記骨吸収阻害剤に複合体化されている、請求項５４に 記載の組成物。
68. ６８．さらに持続放出賦形剤を含有する、請求項５４に記載の組成物。