JPH06509420A - イムノアッセイにおける誤結果除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 イムノアッセイにおける誤結果除去方法発明の分野 本発明は、イムノアッセイにおける誤結果除去方法、そして特に、デテクター（ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）抗体としての免疫反応性抗体断片接合体および未重合ＩｇＧ を用いることにより捕獲抗体および／またはデテクター抗体と相互作用できる干 渉抗体の存在による誤結果を除去することに関イムノアッセイは、生物学的検体 例えば血清、血漿、血液などの中の抗原の有無をスクリーニングするための診断 ツールとして用いられている。典型的には、かかるアッセイは、様々な方式で反 応させることのできる異なる抗原決定基に対する二辺上の抗体の使用を伴う。例 えば正（ｆｏｒｗａｒｄ）サンドイッチアッセイ方式では、溶存するかまたは固 相に固定された第一抗体を抗原を含むと思われる検体とインキュベートする。抗 原が存在する場合には、第−抗体−抗原複合体が生じ、次いでその生成複合体を レポーターに接合された第二抗体と反応させて第−抗体−抗原−第二抗体−レポ ーター複合体を生成させ、そして次にそれを検出することができる。

残念なことに、イムノアッセイは誤作用して検体中に抗原が存在しないのに誤結 果を生じることがある。誤結果は、例えば検体中に抗原が存在しないのに第二抗 体−レポーター接合体が第一抗体と反応してしまう場合など、多くの方法で生じ 得る。これは非特異的相互作用例えば疎水性相互作用、イオン性相互作用、水素 結合、ファンデアワールスカなどのために生じ得る。

非特異的相互作用に発生は、第一抗体および／または第二抗体接合体の両者に結 合する試験検体中に存在する物質によることもあり得る。通常、かかる物質は、 第一および／または第二抗体の生産に用いられた生物種の免疫グロブリンに既に 晒された動物からの血清検体中に存在する。これらの免疫グロブリンはその物質 中で干渉抗体の形成を生起する抗原として働く。

誤結果防止方法には、例えば１９９０年４月３日にＬｅｎｚらに付与された米国 特許第４．９１４．０４０号に記載されているように、特異免疫反応体の一つと してＩｇＧまたはそのＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２の断片のホモポリマー、また は同種の動物に由来するＩｇＧ分子とＦｃ不含ＩｇＧ断片のヘテロポリマーを使 用する方法がある。

１９９０年９１７日に公開されたＰＣＴ出願公開Ｎｏ、　ＷＯ９Ｑ／１０２２６ は、抗原を検査する検体中の干渉抗体と共に、捕獲およびインジケーター抗体（ 酵素にカプリングした完全抗体）の調製に用いた生物種由来の少量の干渉抗体複 合体化血清（■＾Ｃ３）を用いることにより、ＥＬＩＳ＾アッセイ方法における 偽陽性結果を防止することを記載している。

■＾ＣＳポリクローナル抗体は干渉抗体と反応して干渉抗体が捕獲抗体およびイ ンジケーター抗体を連結しないよう本発明は、デテクター抗体としての免疫反応 性抗体断片接合体および未重合ＩｇＧを被検体（ａｎａｌｙｔｅ）の有無を検査 しようとする検体中に存在する干渉抗体と反応させることより成る、干渉抗体の 存在によるイムノアッセイにおける誤結果を実質的に除去する方法に関する。

図面の簡単な説明 図１は、完全抗体接合体を重合ＩｇＧの存在下または非存在下にデテクター抗体 として用いたイムノアッセイ方式で得られたＣＫＭＢ値を示す。それらの結果は 、１８検体中のＣＫ１１Ｂ値が１２ｎｇ／ｍｌより大であり、また２４ｐ９の重 合ＩｇＧによってそれ以上減少し得なかったことを示している。

図２は、大きく上昇したＣＫＭＢ値を有する前記図１に記載の１８検体中の３検 体のＣＫＭＢ値を、８０ｎという多量の重合１ｇＧをアッセイ１回あたり用いて も１２１ｎｇ／ｍ／以下には減少し得なかったことを示している。

図３は、デテクター抗体が完全抗体接合体である場合、未重合ポリクローナルＩ ｇＧが非特異的結合を実質的に減少し得なかったことを示している。

図４は、デテクター抗体としてのＦ（ａｂ’）ｚ接合体および未重合ポリクロー ナルＩｇＧを用い、実質的にすべての非特異的結合が除去されたことを示してい る。

図５は、デテクター抗体としてのｌ’（ａｂ’Ｌ接合体を未重合ポリクローナル ＩｇＧの存在下または非存在下に用いて実質的にすべての非特異的結合が除去さ れたことを示している。重合ＩｇＧおよび未重合ＩｇＧの非存在下および存在下 に完全抗体接合体をデテクター抗体として用いた場合のＣＫＩｉＢ値を、重合Ｉ ｇＧおよび未重合ＩｇＧの非存在下および存在下にＦ（ａｂ’）、接合体を用い た場合に得られた値と比較した。

図６は、未重合マウスＩｇＧの存在下および非存在下に三つの患者検体の各々に ついて測定されたｈＣＧ測定値をここで用いられる「捕獲抗体」という用語は、 被検体を結合できる抗体を意味し、ポリクローナル、モノクローナルまたはその 免疫反応性断片のいずれでもよい。それは不均一（固相）また均一（溶液相）ア ッセイのいずれに用いることもできる。

ここで用いられる「デテクター抗体」は捕獲抗体が結合するものとは異なるエピ トープで被検体を結合できるレポーターに接合された抗体を意味し、そしてその 抗体はポリクローナル、モノクローナルまたはその免疫反応性断片のいずれでも よい。

ここで用いられる「免疫反応性抗体断片」という用語は、抗体の結合領域を含む 一新片または複数断片を意味する。かかる断片はＦｃ部分を欠く断片として定義 されるＦａｂ−型断片、例えばＦａｂ、　Ｆｅｂ’、およびＦ（ａｂ’　）　２ 断片であってよい。

ここで用いられる「干渉抗体」という用語は、捕獲抗体および／またはデテクタ ー抗体の免疫反応性断片と相互作用できる検体中に存在する検体を意味する。

ここで用いられる「実質的に除去する」という用語は、感知できないほどの量、 すなわち誤結果を生じない量の非特異的結合は生じてもよいことを意味する。

本発明により、デテクター抗体としての免疫反応性抗体断片接合体および未重合 ＩｇＧを被検体の有無を検査しようとする検体中に存在する干渉抗体と反応させ ることより成る、干渉抗体の存在によるイムノアッセイにおける誤結果を実質的 に除去する方法が提供される。

免疫反応性抗体断片接合体および未重合ＩｇＧは、イムノアッセイ過捏の様々な 段階で生物学的検体中の干渉抗体と反応させることができる。それらは検体に、 それを捕獲抗体とインキュベートした後で同時に添加することができる。捕獲抗 体、免疫反応性抗体断片接合体および未重合ＩｇＧは、干渉抗体を含んでいると 思われる検体と同時に反応させることができる。免疫反応性抗体断片接合体と未 重合ＩｇＧとを検体と反応させてから捕獲抗体とインキュベートすることもでき る。もう一つのバリニーシコンとして、干渉抗体含有検体を未重合ＩｇＧと反応 させてから捕獲抗体および免疫反応性抗体断片接合体とインキュベートすること ができる。好ましくは、免疫反応性抗体断片接合体および未重合ＩｇＧを被検体 含有検体および捕獲抗体と同時に反応させる。

未重合ＩｇＧの使用量は、検体中に存在する実質的にすべての干渉抗体を複合体 化するのに十分な量とすべきである。その量は、検体のサイズ、いつ試薬を添加 するか、などに依存して変化することになる。

本発明の方法は、固相方式であろうと、溶液方式であろうと実際上任意のイムノ アッセイ方式に用いることができる。かかるアッセイには米国特許第４．０９８ ．８７６号（その開示を引用により本明細書の記載に含める）に記載されている ような逆サンドイッチアッセイ、競合アッセイ、正サンドイッチアッセイ、およ び米国特許第４、２４４．９４０号（その開示を引用により本明細書の記載に含 める）に記載されているような同時的アッセイが包含されるが、それらに限定さ れるものではない。モノクローナル抗体を用いた免疫測定アッセイは米国特許第 ４．３７６．１１０号および４．４８６．５３０号に記載されているところ、そ れらの開示を引用により本明細書の記載に含める。

同相イムノアッセイを用いる場合、広範にわたる様々な支持体のいずれを用いて もよい。例えば、合成ポリマー支持体例えばポリスチレン、ポリプロピレン、置 換ポリスチレン、例えばアミノ化またはカルボキシル化ポリスチレン、ポリアク リルアミド、ポリアミド、ポリビニルクロリドなどニガラスビーズ、アガロース などを挙げることができる。好ましくは、固相は１９８７年４月２８日に１、ａ ｕらに付与された米国特許第４．６６１．４０８号（その開示を引用により本明 細書の記載に含める）に記載されているような被覆二酸化クロム粒子である。こ れらの二酸化クロムは加水分解的に十分安定であり、不均一イムノアッセイおよ びバイオアフィニティー分離における固体支持体として有用である。粒子の芯部 は、５〜１００ｍ’／ｇの表面積、１００〜７５０エルステッドの保持力、５〜 ４５ｅｍｕ／９の残留磁気および８〜８５ｅｍｕ／ｇの飽和磁気を有する針状、 ルチル二酸化クロムである。これらの粒子は表面安定化され、そしてＳｉｎ、の コーティングで更に安定化される。そのシリカ被覆二酸化クロムは次いで更にシ ランで被覆することによってその粒子を更に安定化させると共にタンパク質に対 する結合部位を与える。

捕獲抗体は前述の如く、ポリクローナル、モノクローナルまたはその免疫反応性 断片であってもよく、また当業者に知られた技法を用いて調製することができる 。

捕獲抗体、免疫反応性抗体断片および未重合ＩｇＧは、抗体を産生できる実際上 任意の生物種、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはウマなどから調製す ることができる。本発明の好ましい態様として、抗体および免疫反応性断片はマ ウス細胞から調製される。

未重合ＩｇＧは、モノクローナルであろうとポリクローナルであろうと、抗体製 造の標準的方法を用いて調製することができる。本発明の実施にあたっては、使 用未重合ＩｇＧを非免疫供給源由来とするのが好ましい。未重合ＩｇＧを捕獲抗 体および接合体と同じ種からのものとするのが好ましい。

免疫反応性抗体断片接合体は、慣用のカプリングおよび標準方法を用いてレポー ターにカプリングされた免疫反応性抗体断片である。免疫反応性抗体断片へのカ プリングには広い範囲の様々なレポーターを利用することができる。レポーター は放射性同位元素例えば１１５１、酵素、蛍光原物質、化学発光物質または電気 化学的物質であってよい。

本発明の実施に用いることのできるレポーター酵素例には、ヒドロラーゼ、リア ーゼ、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、イソメラーゼおよびリガー ゼなどが包含される。特定例には、アルカリ性ホスファターゼ、ベーターガラク トシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼが包含される。その他の例がＩｓ ｈｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ　＾ｅｔａ、　１９４：　５１〜７４（１９９０）に見ら れるところ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。

本発明は実際上任意の被検体の測定に適している。例えば、クレアチンキナーゼ のＭＢイソ酵素（ＣＫＩＩＢ）　、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）　、黄体形成 ホルモン（Ｌｌｌ）　、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＩ’ｌ）　、プロラクチン、フ ェリチン、アルファーフェトプロティン（八ＦＰ）　、ヒト絨毛膜ゴナドトロピ ン（ｈＣＧ）などが挙げられる。

以下の実施例は本発明の実施を例説するためのものであって、いささかも限定と してとらえられてはならない。

実施例 下記のすべての実施例はａｃａ＠　ディスクリ−１・（ｄ　１ｓｃｒｅｔｅ）臨 床アナライザー（Ｅ、１．　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅＮｅｖｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃ ｏｍｐａｎｙ、ウィルミントン、プラウエア州１９８９８）を用いた。ａｃａ［ Ｆ］の一例は米国特許第４．０６６、４１２号に記載されているところ、その開 示を引用により本明細書の記載に含める。更に、前述の如く、本発明の方法は、 イムノアッセイ方式に用いるのに適した任意の抗体および／またはそれらの免疫 反応性断片を用いて実施することができる。

以下の試薬およびプロトコール後述の実施例に用いた。

ａ）　ＣＫＩＩＢイムノアッセイに用いられた細胞系統用いられたモノクローナ ル抗体を産生ずる細胞系統は、米国特許第４．９１２．０３３号およびＶａｉｄ ｙａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅｗ、　３２（４）＋　８５７〜６６３（１９８６）に記載された手順を用 いて取得したところ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。

脱水生産完了後、そのようにして得られたモノクローナル抗体は、例えば硫酸ア ンモニウム沈殿透析、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマト グラフィーなど任意の数の標準的技法を用いて精製することができる。モノクロ ーナル抗体の単離および精製のためのこれらのおよびその他の方法は一般的に、 Ｇｏｄｉｎｇ。

１ｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎ ｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ。

＾ｃａｄｅｗｉｃ　ｐｒｅｓｓ、ｏンドンおよびニューヨーク、　１９８３およ び米国特許第４．５３３．４９６号に記載されているところ、その開示を引用に より本明細書の記載に含める。

精製および単離のための好ましい方法はプロティンＡセファ０−ス（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ウプサラ。

スエーデン）でのアフィニティークロマトグラフィーであった。プロティンＡは 免疫グロブリンを抗原結合部位と相互作用することなく結合する黄色ブドウ球菌 （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）から単離されたポリペプチド （分子量４２．０００）である。

後述の如く二酸化クロム粒子上に固定された捕獲試薬として用いられた抗−（Ｊ Ｂモノクローナル抗体は前述の如く取得した。クローン番号は２５８１　８１１ ．１であり、そしてモノクローナル抗体はＩｇＧ、サブクラスのものであった。

前述の如（、本発明は特定の抗体および／または免疫反応性断片の使用に限定さ れない。例えばイムノアッセイに有用な任意のＣＫＭＢ抗体を使用することがで きる。

後述の免疫反応性断片の生産に用いられた抗−ＣＫＭＢモノクローナル抗体は前 述の如く取得した。クローン番号は２５８０　ＣＣ４，２であり、そしてモノク ローナル抗体はＩｇＧｚｂサブクラスであった。

プロティンＡ精製抗体は４℃で一夜アセテート緩衝液（１００ｍｌｌ酢酸ナトリ ウム、１５０５Ｍ塩化ナトリウム、ｐｒｔ３．５）に対して透析した。透析した 抗体を透析緩衝液を用いて５■ｇ／ｍｅの濃度まで希釈した。抗体溶液を３７℃ の水浴に５〜１０分間置い装。

ペプシン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、セントルイス、ミズーリ州 ）の１０１１９／ＩＩ／溶液をアセテート緩衝液中で調製した。５０：１の抗体 ：ペプシン重量比を与えるのに必要なペプシン量を計算した。ペプシンを添加し ながら抗体溶液を撹拌した。その混合物を１０〜１５分間インキュベートした。

３．５Ｍ　Ｔｒｉｓ塩基を溶液のｐｌＴが７．０〜８．０の範囲となるまで徐々 に滴加することにより反応を止めた。

Ｆ（ａｂ’）ｓ調製物を２．２　Ｘ　２５ｃｗ＋カラム中、４〜４．５８１／時 の流速で、１５〜２０ｍ１のプロティンＡ−セファロースを通した。タンパク質 ビークを両分の吸光度を２８０ｎ閣で記録することによりモニターした。タンパ ク質ピークを集め、そして６２ｍｍ　ＰＭ　３０膜フイルターを嵌装した＾鳳１ ｃｏｎ撹拌セルを用いて約３０＊ｑ／ｍｌまで濃縮した。滅菌したＦ（ａｂ’） を濃縮液を濾過しそして一２０℃で貯蔵した。

ｂ）　Ｆ（ａｂ’）ｚβ−ガラクトシダーゼ接合体の製造前述の如き抗−ＣＫＩ ＩＢ抗体断片を、“Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉａｕ＊ｕｎｏ−ａｓｓａｙｓ”　、　Ｉｓ ｈｉｋａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｄｓ、、　ｐｐ、　８１〜９０（１９８１） 中のＫｉｔａｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｅｎｚｙｖｅ　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｗｉ ｔｈ　Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ　ｏｆ　ｍａ ｌｅｉｍｉｄｅに記載された手順を用いてβ−ガラクトシダーゼにカプリングし たところ、その開示を引用により本発明の記載に含める。接合体は次のようにし て製造した： 抗−（ＪＩＩＢモノクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）を断片を抗体透析ｖＩｌ液（２ ０＊Ｉｌホ７．７　工り緩衝液、３００ｍ１ｌ　ＮａＣ１’、　ｐＨ７，０）に 対して透析した。１モルのＦ（ａｂ’）、を３０モルのｓｍｃｃ［Ｎ−スクシン イミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート ］と混合しそして室温で３５分間絶えず撹拌しながらインキュベートした。

その混合物をＵｖ検出器（２８０ｎｍでの吸光度）を設けた５ｅｐｈａｄｅｘ　 Ｇ−２５カラム（２，２Ｘ　１３ｃｍ）にかけた。活性化Ｆ（ａｂ’　）　！断 片を抗体透析緩衝液を用いて溶出した。タンパク質ビークを集めた。体積を記録 しそしてタンパク質濃度を推定した。Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ｌｌａｎｎｈｅｉ ｍから購入した１モルノ大ＩＩＩ　ｍ　（Ｅ、　ｃｏｌｔ）β−ガラクトシダー ゼ［ＳＭＣＣ活性化Ｆ（ａｂ’）１と当量］を抗体透析緩衝液に溶解した。活性 化Ｆ（ａｂ’　）　ｔをβ−ガラクトシダーゼと混合しそして少（とも２５分間 ２５℃で絶えず撹拌しながらインキュベートした。接合体の合成は、１００ｊ／ ループＧＦ　４５０分析カラムを脩えたＬＫＢ　ＦＩＰＬＣを用いてモニターし た。主ピークがクロマトグラム上で第二ビークを超えたところで、接合体反応混 合物１ｍｌあたりＩｈｌの０．１ＭＮ−エチルマレイミド溶液を添加することに より反応を急止した。その混合物を＾■１ｃｏｎ撹拌セルおよびＹｌ　ｔｏｏフ ィルター（いずれもＡｗｉｃｏｎ社製）を用いて４．　Ｑｗ／まで濃縮した。そ の接合体濃縮液を０．２μシリンジフイルターを通して濾過し、そしてｌｌｌ１ ループＧＦ　４５０カラム、Ｕｖモニター、フラクションコレクターおよびチャ ートレコーダーを備えたＬＫＢ　ＩＩＰＬＣを用いて精製した。適切な両分を集 め、プールしモして２８０ｎ−波長で吸光度を測定したタンパク質濃度を推定し た。生成濃縮液を濾過し、滅菌しそして４℃で貯蔵した。

接合体濃縮液は、ＣＫＩＩＢアッセイのために必要に応じてβ−ガラクトシダー ゼ接合体希釈緩衝液（脱イオン水１１あたり、３３．５　ｑ　ＰＩＰＥＳ（ピペ ラジン−Ｎ、　Ｎ’−ビス〔２−工９　ン７ｔＬｔホン酸１　）　）０．２９　 １ｇ＋Ｊｔ、２９．２　ｑ　ＮａＣｊ！、　１００９牛血清アルブミン、および ０．１６７９７ウスＩｇＧ、　ｐＨ７，０）で希釈した。

Ｃ）二酸化クロム粒子にカプリングされた抗−ＣＫＢ捕獲抗体 抗−ＣＫＢ抗体を、Ｂｉｒｋｗｅｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（Ｂｉｒｌｖｅｙｅｒ 、　ｅｔ　ａｌ。

＾ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｏｖｅｌ　ｃｈｒｏｍｉｕｍ　ｄｉｏｘｉｄ ｅ　ｍａｇｎｅｔｉｃｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｔｏ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｄ ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｔ。

３３：　１５４３〜１５４７．１９８７）により実質的に記載された手順に従っ て二酸化クロム粒子上に固定したところ、その開示を引用により本明細書の記載 に含める。

４１のカプリング緩衝液を、１９６＠／（７）１０ｓＭ　ＫＨ２ＰＯ４（−塩基 性）および２０４ｍ１の１０ｍＭ　ＫｔＨＰＯａ　（二塩基性）　ヲ混合し、そ してその容量を脱イオン水を用いて４Ｉ！まで増加させることにより調製した。

ｐｎは７．０１：１４節した。抗−ＣＫＢモノクローナル抗体（２５８１ＢＨ１ ，１）を変えられたカプリング緩衝液に対し一夜透析し、そして透析を更に４時 間続けた。透析した抗体の容量を測定し、そしてタンパク質濃度を推定した。抗 体溶液をカプリング緩衝液を用いて２１１９／ＴＩＮまで希釈した。希釈抗体（ ２ｍｙ／　Ｉｔ／）およびグルタルアルデヒド活性化二酸化クロム粒子の５％懸 濁液を等容ずつ組織培養フラスコ中で混合した（この実験では、最終反応容量は ２００ｍ／とした）。混合物を４℃で一夜放置混合した。その組織培養フラスコ を室温で磁気プレート上に置くことにより、粒子を６０分間放置分離した。上清 を除去し、そして粒子に結合した抗体量を測定するためにアリコートを貯蔵した 。これらの条件下では９８％以」二の抗体が粒子に結合した。２００ｍ１のクエ ンチ溶液（２，０Ｍグリシン緩衝液）を用いて反応をクエンチし、そして室温で １時間揺動させた。粒子を磁気プレート上で３０分間分離した。−上清を除去し 、次いで組織培養フラスコ中１５０ｍ／の洗浄１ｌＷＲ液（１０■ＩＪン酸カリ ウム緩衝液、０．１％牛血清アルブミン、ｐＨ７，４）で１０回洗浄した。最終 洗浄からの上清を捨てた。２００ｇ／の貯蔵緩衝液（］、０＋ｓＭ’Ｊン酸カリ ウムｌ！術液、０１％牛血清アルブミン、０．０１％チメロサール、ｐＨ７，４ ）を粒子懸濁液に添加しそして４℃で貯蔵した。１０ａｌの粒子懸濁液は１０声 ９の抗−ＣＫＢ抗体と２５０ｇｇの二酸化クロＩ・を含有した。

ｄ）　ＣＫ）ＩＢに対する終点（ｅｎｄｐａｉｎｔ）法によるβ−ガラクトシダ ーゼ活性測定用波長の選択 自動化イムノアッセイについてここに記載するＣＫ）ＩＢのイムノアツセイは、 レポーター酵素、すなわち検出自在標識、としてβ−ガラクトシダーゼを用いた 。クロロフェノールレッドガラクトシド（ＣＰＲＧ）を基質として用いてβ−ガ ラクトンダーゼ活性を測定するところ、その際酵素はＣＰＲＧと反応してクロロ フェノールレッド（ＣＰＲ）を生成する。アッセイ１回あたり約３ｍｇのＣＰＲ Ｇを用いた。

ＣＰＲＧの吸収極大は４１４ｒｖで生じた。

他方、ＣＰＲは５７７ｎｍｉこ吸収極大を有した。酵素により形成されたＣＰＲ 量はＣＰＲＧの１％以下である。図１は、緩衝液中の二酸化クロム粒子の吸収ス ペクトルのほか、二酸化クロム粒子の存在下におけるＣＰＲＧおよびＣＰＲの吸 収スペクトルを示す。

三色法終点測定が良好で再現性ある測定値を与えることを見出した。このアプロ ーチを用いる場合、その終点測定にはシグナルを２波長で測定することも必要で あるということに留意しなければならない。選択された第一波長は５７７ｎｍで あったがこれはＣＰＲの吸収がその波長で最大となるからである。６００ｎ■波 長をブランクとして用いると満足できる性能が得られた。この検出系で最良結果 を得るには６２０ｎｍフィルターが必要であると分析された。

それより低い例えば５１０や５４０ｎ−といった波長を用いることもできるが、 それらはＣＰＲＧビークの下向き勾配にあたり、従ってＣＰＲＧ濃度の変動に対 し敏感である可能性がある。

従って、好ましい測定系は、β−ガラクトシダーゼ活性を有する生成物を５７７ ０■の第一波長、および６００ｎｍまたはそれ以上の第二波長で測定すべきであ る。第一波長から得られた読みから第二波長からえらられた読みを差し引くこと により酵素活性の正確な測定が可能となった。

ｅ）試薬 １、ＣＫＭＢキャリキャリブレーターｌあたり０，１３．８．３２．６４および １２８ｎ９のヒトＣＫＩＩＢ。精製ヒトＣＫＭＢ　（＾ａｌｔ。

５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｌｔｄ、、ビスツ（Ｖｉｓｔａ）　、カリホルニア州） をＣＫＩＩＢ不含ヒト血清プールに添加した。

２、　抗−ＣＫＢ二酸化クロム粒子を前述の如く調製した。

３、　抗−ＣＫＩｉＢ　Ｆ（ａｂ’）ｔβ−ガラクトシダーゼ１１に濃ｍ液を前 述の如く調製した。

４　接合体希釈緩衝液は、脱イオン水１１あたり、１００９の牛血清アルブミン 、３３．５９のナトリウムＰＩＰＥＳ。

２９２ｇの塩化ナトリウムおよび０．２９の塩化マグネシウムを有した（　ｐＨ ７，０）。

５、　洗浄緩衝液は２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ１５０ｗｌｌホウ酸ナトリウムより構 成した（　ｐｔ１７．８５）。

６、　再懸濁緩衝液は０．０３Ｍ　ＦＩＥＰＥＳ、　０．０２Ｍ＋）ＩＪウムＨ ＥＰＥＳ、　０．０１Ｍ酢酸マグネシウムおよび０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０よ り構成した（　ｐＦ＋７．６）。

７．３１のクロロフェノールレッドガラクトシド、８．７５１のトレハロース、 ３０すのマンニトールおよび３．１５１１ｇのカーボワックス（２０ミクロン） を含むＣＰＲＧ錠剤は、１９７６年１月２０日にＢｒ１ｇｇ５らに付与された米 国特許第３、９３２．９４３号に実質的に開示された方法を用いて調製されたと ころ、その開示を引用により本明細書の記載に含める。

８、　４０．４＋＋ｑ（ＤナトリウムＨＥＰＥＳ、　２２．８＋＋ｇ１７）ＩＩ ＥＰＥｓ１７．　（１＋ｇのソルビトール、１．１５■９の酢酸マグネシウムお よび４、　Ｑｍｇのカーポワックス（２０ミクロン）を含有するＩＩＥＰＥｓ（ （ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−〔２−エタンスルホン酸） ）錠剤は１９７６年１月２０日にＢｒ１ｇｇ５らに付与された米国特許第３．９ ３２．９４３号に実質的に開示された方法を用いて調製されたところ、その開示 を引用により本明細書の記載に含める。

ｆ）　プロトコール 前述の如く二酸化クロム粒子上に被覆された抗−ＣＫＢ抗体１０ｇｇを３００ｕ ’の適宜に希釈された接合体と共に反応管に分注した。３００＋１１の検体また はキャリブレータ−をその反応管に分注し、次いでその反応管内に渦流生成させ （ｖｏｒｔｅｘｅｄ）そして１５分間３７℃の水浴に入れそして２分間ごとに混 合した。そのインキュベーション時間経過後、それら反応管をＣｏｒｎｉｎｇ磁 気試験管立磁気試験管色により粒子を分離した。上清を吸引した後、５００〆ｌ の洗浄緩衝液を添加しそして粒子を再懸濁した。この段階を３回繰り返した。最 終洗浄段階の後で７５μｌの再懸濁緩衝液を添加しそして粒子を再び再経過した 。６０メｌの粒子懸濁液をバックに分注した。

粒子に結合したβ−ガラクトシダーゼ活性をａｃａ＠　（Ｅ。

Ｉ、　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ウイ ルミントン。

プラウエア州１９８９８）で測定した。ａＣａ＠　ディスクリート臨床アナライ ザーと共に用いるためのａｃａ　＠　ＣＰＲＧバック（プラウエア州つイルミン トンのＥ、１．ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅＮｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ 社から入手可能な標準的ａｃａ　＠　ディスクリート臨床アナライザーパック） は、ディンプル（（ぼみ）２に１（ＥＰＥＳ錠剤をそしてディンプル３にはＣＰ ＲＧ錠剤を含む。ここでディンプル２および３としては標準的ａｃａ　ｏ　ディ スクリート臨床アナライザーパック内の錠剤貯蔵区域のことであり、ＣＰＲＧ錠 剤は３りのクロロフェノールレッドがラクトシト、８．７５＋＋すのトレハロー ス、３Ｔｏｇのマンニトールおよび３．１５ｍｇのカーボワ・ソクス〔２０ミク ロン〕を含有しくこれは１９７６年１月２０日にＢｒ１ｇｇ５らに付与された米 国特許第３．９３２．９４３号に実質的に開示された方法を用いて製造されたと ころ、その開示を引用により本明細書の記載に含める）、またｎＥＰＥｓ錠剤は ４０．４舅９のナトリウムＦＩＥＰＥＳ、　２２．８ｍｇの■ＥＰＥｓ、　７． ０譚すのソルビトール、１．１５ｗａの酢酸マグネシウムおよび４．　Ｏｍｑの カーポワックス〔２０ミクロン〕を含有する（これは当該技術分野に知られた標 準的錠剤化方法を用いて調製された）。

次にそれらバックをセロファンテープでシールしそして粒子に結合したβ−ガラ クトシダーゼ活性を次のようにしてａｃａ　＠　ディスクリート臨床アナライザ ーを用いて測定した。パックをａＣａ■にかけたところで、２ｍｇのホスフェー ト緩衝液（ｐＨ７，８）および３ｍｇの水をパックに分注した。ブレーカ−ミキ サー１（錠剤試薬を破砕しそして試薬の混合を助長するａｃａ　ｏ　ディスクリ ート臨床アナライザーの一成分）を用いてＨＥＰＥＳおよびＣＰＲＧ錠剤を溶解 しそして粒子を！濁させる。結合した酵素はＣＰＲＧと反応して３７℃でＣＰＲ を形成した。４．２分後、形成されたＣＰＲを５７７および６００ｎ−波長で測 定した。５７７ｎ■はＣＰＲが吸収極大を有する第一波長であり、モして６００ ｎ閣はブランク用波長であった。６００ｎ１１での読みを５７７ｎｗでの読みか ら差し引いて、懸濁された粒子による干渉を除去した。ａｃａ　ｏ　での終点読 みと呼ばれる５７７ｎ−読み−６００ｎ■読みをＩＪＭＢキャリキャリブレータ トル値に対してプロットして標準曲線を作成した。

実施例１ 干渉抗体の存在に起因する非特異的結合のためにＣＫＩＩＢイムノアッセイにお いて偽陽性結果を与える疑いのある８１血清検体を前記プロトコールを用いて、 ＣＪＩＩＢ値について分析した。このアッセイは、重合ＩｇＧの非存在下および 存在下に完全抗−ＣＫＭＢ抗体接合体をデテクター抗体として用いて行った。

詳細には、抗−スルホニル尿素除草剤（Ｇｌｅａｎ＠、　Ｅ。

１、　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｗｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ウィ ルミントン。

プラウエア州）マウスモノクローナルＩｇＧ　４６／　６７、１．２゜Ｅ、　１ ．　ｄｕ　Ｐａｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｗｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏ、、　Ｉｎｃ、、ウ イルミントン、プラウエア州）を常法を用いて作り、そして前述の如くプロティ ンＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。

その抗体（４６／　６７、１．２）溶液を１０置１ノン酸ナトリウム、３００＊ ｌｌ塩化ナトリウム、０．０２％アジ化ナトリウムを含有するホスフェート緩衝 液（ｐｌ’１７．０）に対して透析した。

すべての試薬はミズーリ州セントルイスのＳｉｇ＋ｓａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ 、社から購入した。次にその抗体溶液を、Ｘ１５０膜を脩えた＾■１ｃｏｎ標準 セル型式８０５０を用いて４．８〜５．２■９／■ｌに濃縮した。

５ｍｖ／ｍｌのモノクローナル抗体溶液をグルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、社）の０．０２％溶液と２２℃で１６〜２４時間と反応 した。次にグリシン溶液をグリシン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、社 ）の最終濃度が０．０１Ｍとなるように添加した。これによって残留反応をすべ て急止した。

グルタルアルデヒドおよびグリシンなどの過剰試薬をホスフェート緩衝食塩水（ Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、社）に対して４〜８℃で一夜透析するこ とにより除去した。その透析した重合ＩｇＧを１５分間１２０００ｒｐｍで遠心 分離（プラウエア州）ウイルミントンのＥ、　１．　ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎ ｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏ。

社の５ｏｒｖａｌｌ、型式ＲＣ５Ｂ）　Ｌ、て大集塊を除去した。その上清をＸ ｌ５０膜を備えた＾■１ｃｏｎ標準セル型式８０５０を用いて濃縮し、そしてア ジ化ナトリウムを０．１％濃度となるように添加した。最後に、その重合ＩｇＧ 溶液を０．２ミクロンフィルターを有するＮａ１ｇｅｎｅ使い捨てフィルターウ ェアを用いてフィルター滅菌し、そして４℃で貯蔵した。

図１に示された結果は８１検体のうち１８検体に１２膜ｇ／＋１’を超えるＣＫ ＩＢ値が認められたことを示している。これらの値は、２４ｐｔｉの重合ＩｇＧ を用いた場合正常の上限である１２膜ｇ／ｓ＋／より減少し得なかった。これら の１８検体のＣＫＭＢ値はＩ’１ｙｂｒｉｔｅｃｈ社のｒＴａｎｄｅｓｏ−Ｅ　 ＣＫＭＢ免疫酵素測定（ｆｍｕｎｏｅｎｚｙｍｅｔｒｉｃ）　Ｊアッセイを用い た場合はｌｏｎｇ／厘ｌより低かった。

実施例２ 重合ＩｇＧ量を高めることにより、最高ＣＫＭＢ値を与えた前記１８検体のうち の３検体について（ＪＩＩＢ値を減少させる試みを行った。完全抗−ＣＫＩＢ抗 体接合体をデテクター抗体として用いた。

図２は、アッセイ１回あたり８０１ｇという多量の重合ＩｇＧを用いてもこれら ３検体の見掛けＣＫ１１Ｂ値をｌ　２　ｎ　ｇ　／　麿１より下には減少できな かったことを示している。それらの結果は、完全抗体接合体をイムノアッセイの デテクター抗体として用いた場合には重合ＩｇＧが非特異的結合を効果的に低下 させないことを示唆している。

実施例３ 偽陽性結果を示した前記実施例２で評価された３検体のうちの２検体（＃　８６ ２３および＃　６６０９）を様々な量の未重合ポリクローナルマウスＩｇＧおよ び完全抗体接合体を用いることにより評価した。

図３は、これら検体のうちの１検体（検体＃　６６０９）で得られた偽陽性結果 を、１　ｎｇ／■ｌ以下の未重合ポリクローナルマウスＩｇＧを用いて１２膜ｇ ／ｍ／より低いＣＫＭＢ値に低下させ得たことを示している。しかしながらがか る結果は他方の検体（検体＃　８６２３）については得られらなかった、すなわ ち偽陽性結果を除去し得なかった。これらの結果は、完全抗体接合体をイムノア ッセイのデテクター試薬として用いた場合には、未重合ポリクローナルマウスＩ ｇＧは一部の患者検体中の干渉検体の存在による非特異的結合を完全には除去し ないことを示唆している。

実施例４ 検体＃　６６０９を次に、未重合ポリクローナルマウスＩｇＧの存在下または非 存在下に免疫反応性抗−ＣＫｌｉＢ抗体断片接合体をデテクター抗体として用い て評価した。具体的には、β−ガラクトシダーゼにカプリングされたＦ（ａｂ’ 　）　２をデテクター抗体として用いた。未重合ポリクローナルマウスＩｇＧの 量を最適化した。

図４はＦ（ａｂ’　）　！接合体それだけでは検体中の偽陽性結果の除去に効果 的でなかったことを示す。しかしながら、Ｆ（ａｂ’）２接合体を１回のアッセ イあたり５０ｊ９という少量の未重合ポリクローナルマウスＩｇＧと共に用いる と、検体中の干渉抗体の存在による非特異的結合が完全に除去前記実施例１に記 載されているように偽陽性結果を与えた１８検体すべてを、重合ＩｇＧおよびポ リクローナルマウスＩｇＧ　（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ、サンティー（Ｓａｎｔｅｅ）　、　カリホルニア州）の非存在下および存在 下にＦ（ａｂ’）、接合体をデテクター抗体を用いて再分析した。

図５は、Ｆ（ａｂ’）２接合体および未重合ポリクローナルＩｇＧの使用が試験 されたすべての患者検体中の非特異的結合による問題を実質的に除去したことを 示している。

ｈＣＧのイムノアッセイにおける非特異的結合に対するポリクローナルマウスＩ ｇＧの効果ａ）　Ｆ（ａｂ’　）２β−ガラクトシダーゼ接合体試薬の製造デテ クター抗体断片接合体の製造に用いられた抗−ｈｃｃモノクローナル抗体（Ｈｙ ｂｒｉｔｅｃｈ　５１４）をＨｙｂｒｉｔｅｃｈＩｎｃ、社（Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　 ２６９００６．サンジエゴ、カリポルニア州９２１２６）から購入した。この抗 体は約３　Ｘ　１０−１０Ｍのアフィニティーを有するβ鎖特異的モノクローナ ル抗体であった。しかしながら、イムノアッセイ方式に用いるのに十分なアフィ ニティーを有する任意の抗−ｈＣＧモノクローナル抗体を用いることができ、ま たかかる抗体は当業者に知られた技法、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅ ｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ、２５６：　４９５〜４９５　（１９７５年８月７日）に記載の方 法を用いて製造することができる。Ｆ（ａｂ’）１断片およびＦ（ａｂ’）ｚβ −ガラクトシダーゼ接合体は前記実施例１と同様に製造した。

前記実施例１と同様にして製造された濃縮接合体の溶液をある量のβ−ガラクト シダーゼ接合体希釈緩衝液（１００ｍＭ　ＰＩＰＥＳ、　ｉ　ｍＭ　ＭｇＣ／、 、５００ｍＭ　ＮａＣ／、　１０％　（ｗ／　Ｖ　）牛血清アルブミン、および １６７膜ｇ／ｍｌのプロティン−Ａ精製マウスＩｇＧを含有する。ｐ■７．０） で希釈して４　Ｘ　１０−’Ｍβ−ガラクトシダーゼの最終濃度とする。

ｂ）二酸化クロム粒子にカプリングされた抗−ｈＣＧ捕獲抗体 二酸化クロム粒子は、１９８７年４月２８日にＬａｕらに付与された米国特許第 ４．６６１．４０８号に実質的に記載されているように製造したところ、その開 示を引用により本明細書の記載に含める。捕獲抗体として用いられらた抗−ｈＣ Ｇ抗体（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ細胞系統３４／２５）は、全分子ｈＣＧを免疫原として 用い、そしてモノクローナル抗体の生産について当該技術分野において知られる 常法を用いて製造された。使用した抗体は約３Ｘ１０−Ｉ′′のアフィニティー を有するα−鎖特異的抗−ｈＣＧモノクローナル抗体であった。

しかしながら、イムノアッセイ方式に用いるのに十分なアフィニティーを有する 任意の抗−ｈＣＧモノクローナル抗体を用いることができ、そしてかかる抗体は 、モノクローナル抗体の生産について当該技術分野において知られる技法例えば 前述のＫｏｈｌｅｒおよび旧Ｌｓｔｅｉｎの方法を用いて製造することができる 。

捕獲抗−ｈＣＧ抗体は、前記実施例１に記載されているように二酸化クロム粒子 にカプリングした。抗−ｈＣＧ捕獲抗体を０．７５＠９／　ｍｌの最終濃度とな るように２５ｍｇ／ｍｌの固体を含有する二酸化クロム粒子のスラリーに添加し た。

このようにして得られた抗−１１ＣＧ捕獲抗体被覆二酸化クロム粒子スラリーを 、不活性物質として添加された９、８３属９のトレハロース、０．９８１１９の カーボワックスおよび０．０３冒９のチメロソルと共に、１錠あたり３．０１の 抗体被覆二酸化クロム粒子を含有する錠剤にした。それら錠剤は、１９７６年１ 月２０日にＢｒ１ｇｇ５らに付与された米国特許第３、９３２．９４３号に実質 的に開示されたような方法を用いて製造されたところ、その開示を引用により本 発明の記載に含める。

ｃ）　ｈＣＧのイムノアッセイにおける非特異的結合に対するポリクローナルＩ ｇＧの効果 抗−■ＣＧ捕獲抗体被覆二酸化クロム粒子を含む５個の錠剤を３ｍｌの水に溶解 しそしてそれら試験管を室温で１５分間インキュベートした。２５０＃ｙの二酸 化クロム粒子固体を２２本の１２＋＋ｇＸ　７５＋＋ｇポリエチレン試験管に分 注した。

一連のｈＣＧキャリブレータ−（０，２５，１００，３００および５００ｓ　Ｉ Ｕ／諺ｌのヒトｈＣＧ／肩１　、　ｈＣＧは妊婦尿から精製しそして世界保健機 関（ｆＴＩＯ）のファースト・インターナショナル・レファレンス・プレバレー ジョン（１１ＩｔＩｎｔｅｒ−ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｐｒｅ ｐａｒａｔｉｏｎ　；略してＦｉｒｓｔ　ＩＲＰ）に従って標準化した）の各々 の１０ｔ／を一連の試験管に添加しく各キャリブレータ−濃度について重複実験 用試験管を用意した）、次にその内容物を渦流生成により混合しそして３７℃加 熱ブロックに２分装置いた。同様に、三つの患者検体の各々の１０＃／を１２本 の試験管（各患者検体について２セツトの重複実験用試験管を用意した）に添加 し、それらの内容物を次に渦流生成により混合し、そして３７℃加熱ブロックに ２分装置いた。４０ＣＤＩの適切に希釈されたＦ（ａｂ’）１−β−ガラクトシ ダーゼ接合体試薬（１００ｓｌ　ＰＩＦＥＳ、　１　ｍｌｌ　ＭｇＣ１ｘ、５０ ０ｄ　ＮａＣｌ５１０％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミンおよび１６’Ｏｙ／ｍｌプ ロティンーＡ精製マウスＩｇＧを含む接合体希釈緩衝液（ｐＨ７，０）で希釈さ れた４　Ｘ　１０−’Ｍ　β−ガラクトシダーゼ標識抗体接合体）をキャリブレ ータ−を含有する１０本の試験管の各々に、および患者検体を含有する６本の試 験管（各患者検体について２本の試験管）に添加し、モして容管の内容物を渦流 生成により混合し、次いで３７℃で１５分間インキュベートした。同様にして４ ００ａｌの適切に希釈されたＦ（ａｂ’　）　２β−ガラクトシダーゼ接合体試 薬（１００ｍｌｉ　ＰＩＰＥＳ、１ｍｌ１ＭｇＣ／、、５００ｍ１ｌ　ＮａＣＪ 、１０％（ｗ／ｖ）牛血清アルブミンを含むがポリクローナルマウスＩｇＧは含 まない接合体希釈Ｉｌ術液で希釈されたβ−ガラクトシダーゼ標識抗体接合体） を残る患者検体含有試験管６本（各患者検体について試験管２本）の各々に添加 し、モして容管の内容物を渦流生成により混合し、次いで３７℃で１５分間イン キュベートした。１５分後に、管を磁気試験前立てに粒子が試験管の側壁に磁気 的に保持されるように置くことによりすべての管に含まれる粒子を分離した。容 管の上演を吸引により除去し、５０ｈＡ’の洗浄緩衝液（２５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ 、５ＱｗＭホウ酸ナトリウム、ｐＨ７，８５）を容管に添加し、そして粒子を渦 流生成により再懸濁した。その洗浄手順をさらに２回繰り返した。最終洗浄の後 、７５１１の再懸濁緩衝液（０，０３Ｍ　ＨＥＰＥＳ、　０．０２Ｍナトリウム ＦＩＥｌ’ＥＳ、　Ｏ，ＯＬＭ酢酸酢酸マグネシウムよび０．００５％Ｔｗｅｅ ｎ２０、ｐｉ＋７．６）を添加し、そして粒子を渦流生成により再懸濁した。モ して５ｏｕｌの粒子を、ディンプル２にはＨＥＰＥＳ錠剤をそしてディンプル３ にはＣＦ’ＲＧ錠剤を含んでいるａＣａ［Ｆ］ＣＰ）ＩＧバ・ンク標準的ａＣａ ［Ｆ］　ディスクリート臨床アナライザーバック（ａＣａ■ディスクリート臨床 アナライザーと共に用いるべ（、プラウエア州つイルミントンのＥ、Ｉ、ｄｕ　 Ｐｏｎｔ　ｄｅＮｅｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙから入手できる）のデ ィンプル１に分注した。ここでディンプル２および３とは標準的ａＣａ［Ｆ］デ ィスクリート臨床アナライザーパック内の錠剤貯蔵区域のことであり、ＣＰＲＧ 錠剤は３１９のクロロフェノールレッドがラクトシト、８．７５ｍｇのトレハロ ース、３０すのマンニトールおよび３．１５８９のカーボワックス〔２０ミクロ ン〕を含有しくこれは１９７６年１月２０日にＢｒ１ｇｇ５らに付与された米国 特許第３．９３２．９４３号に実質的に開示された方法を用いて製造された）、 またＨＥＰＥＳ錠剤は４０．４＠９のナトリウムＩＩＥＰＥｓ、　２２．８露９ のＨＥＰＥＳ、７．０りのソルビトール、１、１５冨りの酢酸マグネシウム、お よび４．０厘すのカーボワ・マウス〔２０ミクロン〕を含有する（これは当該技 術分野に知られらた標準的錠剤化方法を用いて調製された）。それらパックをセ ロファンテープでシールし、そして粒子に結合したβ−ガラクトシダーゼ活性を ａＣａ■で測定した。ａｃａ■での測定値は次のようにして得られた。パックを ａｃａ　＠　にかけたところで２概ｌのホスフェート緩衝液（ｐｆ１７．８）お よび３ｍ／の水をバック内に分注した。ブレーカ−ミキサー１（錠剤試薬を破砕 し、そして試薬の混合を助長するａＣａ＠　ディスクリート臨床アナライザーバ ックの一成分である）を用いてＨＥＰＥＳおよびＣＰＲＧ錠剤を溶解しそして粒 子を懸濁させた。結合したβ−ガラクトシダ−ゼ酵素はＣＰＲＧと反応して３７ ℃でクロロフェノールレッド（ＣＰＲ）を形成した。４．２分後、形成されたＣ ＰＲを５７７および６００ｎ−波長で測定した。５７７ｎ■はＣＰＲが吸収極大 を有する第一波長であり、そして６００ｎ■はブランク用波長である。６００ｎ 曹での読みを５７７ｎ−での読みから差し引いた。

ａＣａ■　での二色性終点読みと呼ばれる、５７７ｎ■での測定値から６０ｏｎ −での測定値を引いたものをｈＣＧキャリブレータ−の濃度に対してプロットし て標準曲線を作成した。

結果を図６に示す。図６は、未重合マウスＩｇＧの存在下および非存在下で三つ の患者検体の各々について測定されたｈＣＧ測定値を示す。それらの結果はｈＣ Ｇのイムノアッセイにおける偽陽性結果を減少させる上での未重合マウスＩｇＧ の効果を示している。

（ＪＬＬＩ／ｊｌｌＬＩ）　ＥＩＩＡＩ＞（：）ＦＩＧ、２ 重合　ｒｇｃ　（μｇ／アッセイ） マウス　ＩｇＬ　（μｇ／アッセイ） ポリクローナルマウス　ＩｇＧ（μｇ／アッセイ）（ｉｕＪ／Ｅ　Ｌｌ）　ｉｔ 　ｍ　ＩＩＢ！　’ｔｌし”４＞Ｉ○患者検体＃ 、　ｓｏ　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０６００６国際調査報告

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．デテクター抗体としての免疫反応性抗体断片接合体および未重合ＩｇＧを被 検体の有無を検査しようとする検体中に存在する干渉抗体と反応させることより 成る、干渉抗体の存在によるイムノアッセイにおける誤結果を実質的に除去する 方法。
2. ２．免疫反応性断片がＦａｂ、Ｆａｂ′またはＦ（ａｂ′）２より成る群より選 択される請求項１記載の方法。
3. ３．生物種がマウス、ラット、ウサギ、ヤギまたはウマより成る群より選択され る請求項１記載の方法。
4. ４．抗原がＣＫＭＢ、ＴＳＨまたはｈＣＧより成る群より選択される請求項１記 載の方法。
5. ５．未重合ＩｇＧが捕獲抗体および接合体と同種に由来する請求項１記載の方法 。