JPH06507972A - 同時多重分析 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ■■ 本出願は、１９９０年５月２０日に出願された米国特許出願第０７７７０２，３ ０２号の一部継続出願である。

ＬＬ上二且皿上１ 本発明は、生物から取り出したただ１個の液体サンプルに含まれる多数の分析物 に対する定量分析に関する。本発明は特に、粒子の凝集速度に基づく光学分析法 に関する。

１豆立１遣 診断や治療に役立てるため、種々の物質が混じり合った患者の体液中における生 物学的物質の存否と量（マイクロモルからピコモルの濃度）をモニタする、広範 囲に適用可能な、正確で感度が高くかつ自動化の可能な分析方法がめられている 。

液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー、質量スペクトルおよび多く のバイオアッセイ方法等、これまで用いられてきた多くの様々な方法は、分析に 時間がかかり、装置が高価で、かつ容易に自動化できないものであった。

ラジオレセプターおよびラジオイムノアッセイ等の競合タンパク質を結合する分 析は、分析感度および分析効率を太き（改善したが、危険な放射性物質を扱わね ばならず、かつ自動化に馴染まないという欠点がある。一方、酵素結合および蛍 光化学物質との結合を利用したイムノアッセイならびにＤＮＡプローブアッセイ は危険な放射性物質を扱う必要はないが、依然として自動化されに（いという問 題は残っている。

最近では、放射化学標識の煩雑さを避け、抗体反応の特異性を利用する、粒子を 用いたイムノアッセイが多く開発されている。二抗体価の抗体と抗原もしくはハ ブテンとの間で起こる凝集反応は、多種類のバクテリア、赤血球あるいはポリマ ー性粒子の目視分析および定量分析に利用されてきた。この際、凝集は、抗体と 抗原が架橋した粒子凝集体が成長することにより得られ、検出の可能な大きな網 状体を形成する。凝集は、固定化された抗体もしくは抗体の粒子の懸濁液に、特 異的に結合する相手（抗体もしくは抗原）を付加することにより得られる。特異 的に結合する相手の濃度が低いときは、数個の粒子だけからなる小さい凝集体が 形成される。粒子を用いる診断テストは、通常抗原と抗体のきわめて特異的な相 互関係に基づく。抗体と抗原は、しばしば「均質なラテックス粒子」と呼ばれる サブミクロン・オーダーのポリスチレン粒子に吸着させることができる（Ｂａｎ ｇｓ、Ｌ、Ｂ、　ｒ　Ｕｎｉｆｏｒｍ　Ｌａｔｅｘ　ＰａｒｔｉｃｌｅｓＪ、イ ンジアナポリス：セラーゲン（１９８４年）参照）。これらの適切な被覆処理を 施され、感知されやすくした粒子は、分析しようとする抗原もしくは抗体を含む サンプルと混合されたときに起こる抗原−抗体反応を肉眼でとらえやす（するよ うに働く。

粒径が０．０２〜ｌｏｏｇｍのポリマー性微粒子をコロイド溶液に懸濁させたも のは、市販されている。

これら粒子の性質は、主としてその表面の物理的・化学的性質によって定まる。

単一のポリスチレンラテックス粒子は、ファン・デル・ワールス力によって凝集 した多数のポリスチレン分子（０，１μｍ径の粒子でも１０００個以上の分子か らなる）から構成される。

粒子を構成する各ポリマー分子は、通常親水性で、かつ重合開始剤として使用さ れる化合物の断片から得られる帯電した末端官能基を有する（　５ｅａｉ＋ａｎ 、　Ｇ、　Ｖ、　Ｆ、編ｒＡｐｐｌｙｉｎｇ　Ｌａｔｅｘ　Ｂａ５ｅｄ　Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＪ　、Ｈｅａｌｔｈ　＆　５ｃ ｉｅｎｃｅ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、ワシントン、Ｄ、Ｃ，（１９９０年 ）第１〜１９頁参照）。

ポリスチレンラテックス粒子は、通常安定化のため、帯電したスルフェート基を 有する。しかし、この粒子の表面には、ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミ ノ基およびポリマー性のカルボキシレート基など他の種々の官能基も導入するこ とができる。これらの官能基は、とりわけ種々の配位子やレセプターをラテック スビーズの表面に結合する際有利に働（。

上述のように、市販されているポリスチレン微粒子の大きさは、０．０２μｍか ら約１００μｍであるが、血清の診断テストに利用できるものは主に０．１から １．０μｍ径のものである。粒子の挙動特性は、粒子径と単分散性に左右される 。重力による沈降は、凝集分析に用いられる大きさの粒子においては大きな問題 とはならないが、径の大きい粒子に起こる。

被覆をしていないラテックス粒子は、すべての粒子が同種の電荷を有するため、 比較的安定な疎水性の懸濁液を形成する。しかし、この粒子は、抗原や抗体のよ うな配位子て被覆すると、保存中は懸濁を保ち、かつ相補的な交差反応性及配位 子と反応させたときは凝集する、安定な親水性懸濁液を形成する。ラテックス粒 子を被覆するのに用いられる配位子は、次の三つの方法のいずれかにより粒子に 接触させる。（ｉ）物理的（受動的）吸着、（ｉｉ）簡易（強制）吸着、（１ｉ ｉｌ共有結合。

ラテックスの凝集テストは、粒子の凝集もしくは凝集抑制のいずれかを利用する 。従来の凝集テストは、抗体あるいは比較的高分子量の抗原の検出に用いられ、 他方凝集抑制テストは、主として低分子量の抗原およびいくらか大きな抗原の検 出に用いられている。

透過光、吸収光あるいは散乱光を測定する光学器械を用いると、被覆したラテッ クス粒子の凝集を定量的に評価し、感度のよい粒子イムノアッセイを実現するこ とが可能になる。水中に分散した粒子によって散乱される光の強度は、粒子の数 、その径、入射光の波長、入射光に対する検出器の角度、その他の要因によって 変化する。

凝集が始まるときは、最初に単一の粒子が二つ集まって対になる。モノマー性光 敗乱粒子の数は激減し。

他方凝集体の見かけの径は、急激に増加する。そして、この後、粒子の数および 径の変化は、穏やかになる。後述の本発明において開示する粒子の凝集で大切な ことは、時間の関数として測定される散乱光の強度が、非常の感度のよい運動性 イムノアッセイの基礎となるということである。

粒子イムノアッセイを定量化するいくつかの方法については、すでに装置も開発 されている。例えばＣｏｕｌｔｅｒ　Ｒカウンタ（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔ ｒｏｎｉｃｓ社、ヒアリー、フロリダ州）のような粒子あるいは粒子の塊の数を 不連続なチャネルで数える装置は、凝集の追跡に用いられている。小さな径の粒 子が凝集すると、信号は一つのチャネルから消え、より高次の複数のチャネルに 現れる。こうして単一粒子の数が減少したときはその数を数え、他方新しく凝集 した粒子塊の数が増加したときはその数を数えることができる。

散乱光を直接追跡するには比濁計を、また光の吸収の変化を測定する（散乱光な 間接的に測定することになる）には、分光光度計を用いることができる。角度の 異方性あるいは動的な光の散乱もしくはフォトンの相関分光分析は、粒子の凝集 を定量的に測定する新しくかつより強力な方法である。

上述のように、これまでラテックス粒子凝集テストの定量化には、濁度計あるい は比濁計のような、凝集粒子と非凝集粒子の光散乱の度合いの差を利用する光学 器械が用いられてきた。このような方法は均質な反応混合物を、これを分離せず に監視することができるという利点を有するが、これらの方法は、あくまで−重 テスト（分析物が一種）の場合にのみ満足のいくものであって、本発明が目的と するラテックス粒子凝集テストにおける同時定量多重分析にとっては、満足のい く方法ではない。

凝集しあるいは解体するイムノビーズの溶液からの光散乱は、分析物の濃度の定 量分析に用いることができる。濁度計は、粒子凝集体の懸濁液を通した光の透過 を測定し、他方比濁計は特定の方向における散乱光を直接測定する。どちらの場 合も、凝集した粒子と凝集していない粒子の両母集団からの光散乱が測定される 。この例としては１例えば三菱化学■、東京のＬＰＩＡＲ比濁計（しかしこれは 一時に１個の分析物しか分析できない）　、ＫａｐＩＩＩｅｙｅｒらの米国特許 第４，３０５，９２５号（これは単一分析物についてのラテックス凝集イムノア ッセイの分析範囲を広げるため、２種類の大きさの粒子を使用する比濁法を開示 している）、およびＺｉｅｇｅらの国際公開第９０７０８９６１号（単一分析物 の検出のため、共重合材料からなる配位担体粒子を用いた比濁計による定量イム ノアッセイを開示している）がある。しかし、これらの特許は、異なる分析物を 同時に測定するため多種類の粒径を用いることについては何ら示唆するものがな い。

大きさ、形状および組成の異なる粒子は、光をその波長に従って、それぞれ異な る方向に散乱することはよく知られている（　Ｍ、　Ｋｅｒｋｅｒ、　ｒＴｈｅ 　Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｌｉｇｈｔ　ａｎｄ　０ｔｈｅｒ　Ｅｌｅｃｔ ｒｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ＲａｄｉａｔｉｏｎＪ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ 、ニューヨーク（１９６９年）参照）。そこで同時分析を行うため、溶液中の異 なる粒子の異なる角度での散乱パターンを利用するなら、それは理論的にも興味 深い。しかし、実際問題としては、異なる粒子の異なる角度での散乱パターンに は、非常に多くの重畳があるため、一つの凝集反応の結果を他のそれから区別す るのは不可能である。

以下に述べるように、本発明においては、同時・定量・多重分析方法のための装 置を使用する。この装置は、濁度計でも比濁計でもなく、その代わりに溶液中の 多数の粒子というよりは、単一粒子あるいは粒子凝集体から散乱した光を監視す るためのもので、フロー粒子分析器（Ｆ　Ｐ　Ａ　；　Ｆｌｏｗ　Ｐａｒｔｉｃ ｌｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒｓ）として知られる。

これまでのところＦＰＡには２つのタイプがあり、それは、個々の粒子あるいは その凝集体の大きさを監視するのに、各粒子あるいは凝集体を、電子検知ゾーン を通過させるが、あるいは光学検知ゾーンを通過させるかにより判別される。最 初のタイプのものは、粒子および粒子凝集体を、物理的に小さく、寸法を電子的 に定めるオリフィスを通過させる。他方二つ目のタイプのものは、粒子および粒 子凝集体を、焦点合ゎせをして絞った光学ビーム中に通過させる。これら二つの タイプは、ともに定量的なラテックス粒子凝集分析に応用されてきたが（下記参 照）、同時・定量・多重ラテックスビーズ凝集テストに用いて成功した例はなく 、単一分析物テストへの使用に限られ、また単一のサンプルにおいて多重分析を 行うには複雑な信号を必要とする。

電子フロータイブのオリフィスは、電気絶縁性粒子の母集団において粒径の違い を検出することはできるが、このタイプの装置を実際にラテックス粒子凝集テス トに使用するにはい（っかの制限がある。すなわち、凝集テストの最中に不可避 的に形成される大きな凝集体や、サンプルに含まれる粒子状の不純物が、粒子の 大きさを感度よく検出するオリフィスに目詰まりを起こさせるのである（Ｍａｓ ｓｏｎ、Ｐ、Ｌ、らｒ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｖｏ１ｏｇｙＪ第７４ 〜ｌＯ６頁（１９８１年）およびＣ。

ｈｅｎ、Ｒ，米国特許第４，８５１，３２９号参照）。この制限事項は、ラテッ クス粒子凝集テストを定量的なものにする際、電子的サイズ検知オリフィスをル ーチン化して実際に使用するのを妨げている。

一方、光学的ＦＰＡは比較的大きな孔を有する細管式の検知室を用いるため、電 子ＦＰＡはど簡単には目詰まりを起こさない。したがって、この光学的ＦＰＡは 、イムノアッセイを含む定量的ラテックス粒子凝集分析（アッセイ）を、単一粒 子の分析に用いようとするアプローチとしては好ましいものである。

前方への散乱光を測定することによって凝集の形成を検知する光学的ＦＰＡは、 Ｍａｓｓｏｎら（前掲書）、同じ（Ｍａｓｓｏｎら（米国特許第４，２７９，６ １７号）　、　Ｃａｏ＋ｂｉａｓ。

ら（米国特許第４，２７９，６１７号）、およびＣｏｈｅｎら（前掲書）に記載 されている。しかし、これらの文献により知られるシステムは定量的で感度もよ いものの、単−分析物用の分析（アッセイ）であり、粒子の凝集速度に基づく分 析方法ではない。そしてこれらの文献は、単一サンプル中の多重分析物の同時粒 子凝集分析（アッセイ）を開示してはいない。

上述のＭａｓｓｏｎとＣａｍｂｉａｓｏのシステムは、光束を絞った光ビームを 通過する非凝集粒子による前方への散乱光パルスを検知するもので、凝集粒子に よる光パルスを遮断するため電子ウィンドーを設定するが、このシステムは、二 つの異なった大きさのラテックス粒子を凝集させる。これは多分、粒子の多重対 （Ｉｌｕｌｔｉｐｌｅｔｓｌの初期分布が、分析に係る反応に及ぼす効果を減じ るためであろう（Ｕｚｇｉｒｉｓらの米国特許第４，１９１，７３９号参照）。

もしただ一種類の大きさの粒子だけを使用するなら、イムノ化学反応により形成 される付加的な二量体、三量体等を測定するときは、二量体、三量体および多量 体の初期分布も考慮に入れなければならない。しかし、もし二種類の異なった大 きさの粒子を、所与の分析物を測定するのに必要な同じ免疫化学物質で被覆し、 これら大きさの異なる粒子を、免疫化学反応を行う際に混合する場合は、二種類 の大きさの粒子が分析の初期に凝集体を形成することはない。このため、多重対 の初期の分布が免疫化学反応に及ぼす影響は減じられる（本発明の詳細な説明を 参照）。

このラテックス粒子の凝集を利用した単一分析物のテストの際、大きさの異なる 粒子を使用するやり方は、前述のＵｚｇｉｒｉｓら、Ｍａｓｓｏｎら、ｅｏｈｅ ｎら、およびＣａｍｂｉａｓｏらの特許に開示されているが、ラテックス粒子の 凝集による同時多重分析に応用した例は見当たらない。実際、これらの特許で推 奨されている粒子の大きさはきわめて不十分なため、これらの発明は単一分析物 の場合においても追試は不可能である。以下に説明する本発明は、同時・多重の ラテックス粒子凝集反応を定量的に監視する際、異なる粒径あるいは屈折率の粒 子を選択し、使用するという特別のものである。

上述のＣａｍｂｉａｓｏらは、抑制イムノアッセイにおいて、ある特定の大きさ の粒子上に固定した交差反応性抗体と、その粒子とは異なる大きさの粒子上にあ って、ただ−個の抗体部位と反応する抗原を使用する方法を開示している。ここ では、固定した抗原はそのイムノアッセイに対して特異性を示すこと、およびそ の患者サンプル中の抗原に対する分析（アッセイ）は、正しい固定抗原を選択す ることにより行われると述べられている。しかし、この方法は、−以上の交差反 応性分析物が他の交差反応性抗原と同時に存在する場合にはうま（いかない。こ のため、このＣａｍｂｉａｓｏらの方法は、同時多重分析に用いることはできな い。

Ａｂｂｏｔｔらの米国特許第４，５２１，５２１号は、液体中の単一分析物を、 この分析物に結合した粒子の凝集速度を測定することにより、定量的に分析する 方法を開示している。この場合は垂直散乱光を測定するのが好ましい。しかし、 Ａｂｂｏｔｔらの方法は、同一サンプル中における多重分析物を同時に分析する 方法を教えてはいない。また、この方法は、ただ−個のサンプル中における多重 分析物のそれぞれに、異なる粒径あるいは屈折率の粒子を使用することまでは教 示してはいない。そして、本発明のような配位子に結合する粒子より、むしろ分 析物に結合する粒子を用いることを勧めているＡｂｂｏｔｔらは、自分たちのイ ムノアッセイに適した分析装置も提案している。しかし、この分析装置は、本発 明の光学フロー粒子分析器とは、概念、動作原理、設計、電子設備および操作の 点でまったく異なっている。Ａｂｂｏｔｔらの分析装置は、同じ分析物について 各粒径に相当する粒子の数を数え、粒径分布を割り出す装置である。Ａｂｂｏｔ ｔらは、これを、本発明の装置に関する態様で示したように、光検出器からのパ ルス信号を個々の出力信号に分離するシングルチャネルアナライザを用いたり、 検出器から得られるパルス信号のピークの高さをサンプリングするピーク検出手 段を用い、対応するピークの値を出力することにより行っているのではない。代 りに、Ａｂｂｏｔｔらは、閾値コンパレータと、このコンパレータを通過する各 電子パルスについて論理信号を発生する単一安定型マルチパイプレーク（ｌＩｏ ｎｏｓｔａｌｅ　ｍｕｌｔｉｖｉｂｒａｔｏｒｌ、およびその論理信号を計数す るカウンタを含むカウンタ網を用いている。閾値コンパレータの出力は、本発明 で用いるような検出器の出力信号ではなく、光検出器のパルス信号と予め設定し ておいた閾値との差に等しい。さらに、このコンパレータの出力は単一分析物の 場合にのみ代表値となり得る。Ａｂｂｏｔｔらの装置における回路は、検出器か らのパルス信号を分離するものではなく、パルス信号が所定の閾値を越えた場合 、オール・オア・ナツシング（ａｌｌ　ｏｒ　ｎｏｔｈｉｎｇｌの原理により単 にコンパレータを作動させるためのものである。

粒径の大きな多量体は、粒径の小さな多量体あるいはモノマーより振幅の大きな パルスを発生するため、Ａｂｂｏｔｔのシステムにおいては、Ｎ量体の粒子から のパルスは、すべてのチャネルの閾値を越え、すべてのカウンタの値を増加させ る。この閾値の回路は明らかにシングルチャネルアナライザのものではない。さ らにＡｂｂｏｔｔの閾値回路は、下記の本発明におけるピーク検出手段が行うよ うには、パルスピークの値をサンプリングできず、単に信号が閾値を越えたとき に、作動を開始するだけである。信号は、そのピーク高さに到達する前に、その とき設定しである閾値を越え、閾値回路を作動させる。さらに、閾値コンパレー タの出力は、単にパルスが閾値を越えたという事実を知らせるパルスに過ぎない 。そのＦＰＡにとってピーク高さのサンプリングは不可欠であるが、閾値コンパ レータの出力はそのピーク高さについては何の情報も与えない。

キャノン■の日本国特許第１２０７６６３号は、フロー粒子によるラテックス凝 集分析法および液体サンプル中の多重分析物の同時測定を行う装置に関するもの である。この特許は、検出対象たる抗体ないし抗原に特異的な抗原もしくは抗体 で被覆した粒子を用いている。

各粒子の大きさは、同じでも違っていてもよい。この方法においては、二つの方 向への光の散乱を検出することにより、分析物を検出する。この二つの方向の中 のひとつは、側方への散乱であり、本発明の都合のよい凝集速度に基づく分析で はなく、むしろ粒子凝集の終点で測定している。

したがって、流動性あるいは静止した粒子の分析装置を用い、粒子の凝集に基づ いて行う分析方法は公知ではあるが、同じ原理に基礎をおきながら、イムノアッ セイを含む粒子の管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏｌ実験室テスト用のパネルを備えた分 析装置を実現できる粒子凝集を利用した分析法が切にめられている。すなわち、 もしそのような同時テストが、現在行われている方法のように、患者のサンプル を小分けし、多種類の試薬を多段階に分けて用い、かつ分析の結果は後に対照を 行って始めて分るのではなく、患者のただ１個の体液サンプルを小分けする必要 がなく、サンプルに直に、ただ１種の試薬を添加することによって行うことがで きるならば、きわめて都合のよいものになる。

免豆旦１１ 本発明は、液体サンプルについて、定量的な、粒子の凝集速度に基づく、多重分 析物の濃度を同時に推定する新しい方法であり、新規な高解像度の光学シースフ ローセル（Ｓｈｅａｔｈ　Ｆｌｏｗ　Ｃｅ１ｌ）と、異種材料で被覆された種々 の大きさのモノマー粒子とその凝集した多量体による、単方向・低角度・前方光 散乱からのパルス信号を測定するシングル検出器と、新しいフロー粒子アナライ ザ（Ｆｌｏｗ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ａｎａｌｙｚｅｒ；Ｆ　Ｐ　Ａ　）を用いる 。

よって、本発明の目的は、単一の液体サンプル中の多重分析物の分析を行うため の方法を開示することである。本発明の方法においては、モノマー粒子とその凝 集した多量体あるいはポリマー粒子による単方向・低角度・前方光散乱からのパ ルス信号を、時間の関数として測定する。この測定値は液体サンプル中の分析物 の濃度と相関関係にある。それぞれの分析物は、単一の大きさないし屈折率で、 単一種による被覆を施された粒子を用いて測定される。

本発明のもう一つの目的は、種々の大きさのポリマー性粒子の凝集について、そ の凝集速度に基づいた分析方法を紹介することである。異なる大きさの各粒子は 、液体サンプル中の異種分析物の濃度を推定するのに使用される。

本発明のさらなる目的は、本発明で利用する粒子径あるいは屈折率の適当な範囲 を決定する方法を紹介することである。

また、本発明は、粒子の凝集速度を用いた液体サンプル中の多重分析物の同時イ ムノアッセイを記載することも目的とする。

さらに、本発明は、本発明の粒子凝集速度に基づいた同時多重分析のために特別 に設計された、シースタイプ（鞘状）のフローセルとフロー粒子アナライザを提 供することも目的とする。

そして、これら多様な目的は、以下の本発明の詳細な説明、実施例および請求の 範囲の記載を参照することにより理解されるであろう。

１に且１ 図１は、本発明に係るフロー粒子アナライザにより検出された二量体、三量体お よびより高次の多重対からのモノマーの分離を示す図である。

図２は、本発明のフロー粒子アナライザにおけるシースフローセルの概略図であ る。

図３は、フローセルを通る粒子のシースフロー（鞘状の流れ）を示す説明図であ る。

図４は、本発明における光学システムの一般的な配置図である。

図５Δは、本発明の８態様に係るフロー粒子アナライザにおける電子構成要素の 配置図、図５旦は各パルス高さを示すグラフ、図５Ωは粒子の３つの母集団につ いてのシングルチャネルアナライザによる計数結果を示すグラフである。

図６Δは、本発明の第２の態様に係るフロー粒子アナライザの電子構成要素の配 置図、図６旦は２つの粒子母集団についてパルス高さとプロットの総数の関係を プロットしたグラフである。

図７は、ポリスチレン球状粒子の２つの母集団から得られた散乱光パルス高の分 布を、シースフローを経たものとシースフローを経ないものに分けて示したチャ ートである。

図８は、散乱光の平均強度を、粒子径の関数として理論的にプロットしたグラフ である。

図９は、被覆しないポリスチレンラテックス粒子（粒径３．２２μｍ）のパルス 高のスペクトルを示すチャートである。

図１Ｏは、図９に示した実験結果から得られたモノマーのピークチャネルデータ を用い、散乱光の平均強度と粒子径の関係をプロットしたグラフである。

図１１は、免疫グロブリンＩｇＡを単独で分析した結果（・・・・・・口・・・ ・・・）と、粒子凝集速度を利用した本発明の分析方法を、免疫グロブリンＩｇ Ｇの存在下に免疫グロブリンＩｇＡに適用した分析結果（・・・・・・◆・・・ ・・・）を示すグラフである。

図１２は、免疫グロブリンＩｇＧを単独で分析した結果（・・・・・・口・・・ ・・・）と、粒子凝集速度を利用した本発明の分析方法を、免疫グロブリンＩｇ Ａの存在下に免疫グロブリンＩｇＧに適用した分析結果（・・・・・・◆・・・ ・・・）を示すグラフである。

図１３は、本発明の粒子凝集速度を利用した分析方法とシースフロー光学ＦＰＡ システムを、ヒトの血清中における甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ，濃度は０゜０ （○）、１．０（■）、２５（◆）および１００（ロ）μＩ　Ｕ　／　ｍ　Ｌ　 ）の分析に適当した際の、モノマーに対する相対的な二量体の形成量を時間の関 数として表したグラフである。

図１４は１分析物ＩｇＡを、異なる大きさのモノマーから形成し、抗ＩｇＡ抗体 で被覆したポリスチレン球と反応させた後の、モノマー、二量体および三量体の ３つの母集団を示す、ＦＰＡによって形成したヒストグラムである。相対的なモ ノマーの粒径は、図１４Ａが１．００、図１４Ｂが１．０８、図１４Ｃが１゜２ ３、および図１４Ｄが１．４６である。

図１５は、３種の大きさのポリスチレン微粒子を構成するモノマーおよび二量体 の光学的な解像の可能性を示すパルス高のヒストグラムである。図中、Ｍｌとり 。

はそれぞれモノマーと二量体（タイマー）が粒径１゜０５μｍの球であることを 示し、Ｍ２とＤ２はそれが１゜６２μｍであること、およびＭ、とＤ３はそれが １．７８μｍであることを示す。

図１６は、本発明の光学ＦＰＡを用いて分析した、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＴＳＨ の同時多重分析物についての粒子凝集速度曲線を示すグラフである。このグラフ においては、二量体のモノマーに対する数量比を時間の関数としてプロットした 。各曲線における実際の分析物の濃度は、後述の実施例４における表１に示しで ある。この実験においては、ＩｇＡを対照例（濃度ゼロ）とした。

図１７は、ＴＳ）Ｉを対照例（濃度ゼロ）とした点を除いて図１６のグラフと同 じである。

図１位は、ＩｇＥを対照例（濃度ゼロ）とした点を除いて図１６のグラフと同じ である。

明の詳細な曾日 本発明は、単一の液体サンプル中にある数種の分析物の濃度を、粒子の凝集速度 に基づいて定量的に同時分析するための方法である。本発明においては、新規な 高解像度の光学フロー粒子アナライザを用いるが、ここでは、種々の大きさおよ び／または屈折率の、被覆したモノマー粒子とその凝集した多量体による単方向 ・低角度の前方散乱光をシングル光検出器で検出し、これを単一のサンプル中に おける多重分析物の同時分析のために考案した、粒子凝集速度に基づく安定な分 析方法の基礎とする。本明細書においては、「粒子」、「球」、「微粒子」およ び「ビーズ」の語は、同じ意味で、相互に入れ替えることができるものである。

そして、これらの語は、その周囲を被覆する媒体に比して、はぼ単一の粒径で単 一の屈折率を有する、ポリマー性（すなわちラテックス、ポリスチレン製）の球 状粒子を指す。

光Ｊと敗」Ｌ 単一の球状粒子は、以下のような要因に従って入射光を散乱する。（ａ）入射光 の強度、（ｂ）粒径、（Ｃ）入射光の波長、（ｄ）粒子の屈折率、（ｅ）被覆媒 体の屈折率、および（ｆ）散乱光の観察角度。これらの要因を考慮に入れれば、 単一の球状粒子からの光散乱を理論的に分析することは可能である（上述のＭ。

Ｋｅｒｋｅｒ、　［１９６９年］を参照）。

ところが、異なる粒径の球状粒子凝集体（すなわち二量体、三量体、　９０、ｎ 量体）による光の散乱は、上述の要因だけではなく、この凝集体の光ビーム中に おける配向、および凝集体の立体配置にも依存する。例えば三量体は、直鎖状も しくは三角形の立体配置をとる。より高次のｎ量体の場合は、この立体配置の総 数は膨大なものとなり、コンピュータでも分析は実際上不可能である。したがっ て、本発明の記述は、理論と実験の観察を組合せてなされている。

光散乱パルス高あるいはパルスの積分値は、粒子の体積等の単純な測定項目と直 線的な比例関係にはない単一の粒径および形状の粒子は、ＦＰＡにより高精度で 解像される。「正確に」１〜１０μｍの粒径を有する球状粒子については、光散 乱パルス高は１．５％の分布幅でＦＰＡ値をとるのが普通である。換言すれば、 １．００μｍの粒子を１．０１４ｍの粒子から識別することができる（デジタル 型の電子装置は相応の解像力を有するものとする）。したがって、本発明によれ ば、図１のＦＰＡを用いて、二重対（二量体）、三重対（三量体）および高次の 多重体（ｎ量体）の分布を、電子装置により可視化することができる。対称な凝 集体は本発明のシースフロー中においては配向（整列）する傾向があるため、多 量体の分布が広い幅で出ることもあるが、その影響はきわめて少ない。粒径が大 きくなると、粒径とパルス高の相関が非線形になるため、多重対間の分離の距離 は小さくなる。

本発明は、分析対象となる各分析物について、異なる粒径もしくは異なる屈折率 の球状粒子を用い、これら粒径・屈折率の異なる粒子あるいは粒子凝集体の識別 にはフロー粒子アナライザを利用する。光学フロー粒子アナライザにおいては、 粒径による粒子の識別に関係する要因だけが、同時分析の可能な分析物の数を決 定する。そのような要因は二つある。一つは粒子の配置効果、もう一つは散乱パ ルス振幅と粒径の間の非単調な関係である。これらの効果・関係を処理する手段 を以下に述べる。

旦　の−月１と豆　の　シ 光学フロー粒子アナライザにおいては、−個の粒子もしくは粒子凝集体が入射光 ビームを通過する度ごとに、散乱光のパルスを与える。光学ビームはその光束の 断面積全体に亙って均一な強度を保つことはできない。このため、高解像度を実 現するには、粒子および凝集体を、光学ビームのほぼ同じ領域を通過させること が不可欠である。これは、Ｍａｓｓｏｎ、　Ｐ、　Ｌ、らのｒ　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ１ｏｇｙ＋第７４号、第１０６〜１３９頁（１９８１年） および米国特許第４，２７９，６１７号、Ｃａｍｂｉａｓｏらの米国特許第４， １８４，８４９号、ならびにＣｏｈｅｎらの米国特許第４，８５１，３２９号に おける、ラテックス粒子の凝集を利用したフロー粒子アナライザについての説明 では触れられていない。しかし、本発明においては、この問題を「シースフロー （ｓｈｅａｔｈ　ｆｌｏｗｌＪを利用することにより解決した。

本発明で用いるシースフローにおいては、粒子を通すセルは、セル中の流れを断 面積の小さい流れにし、またこのセルにおける流れを光ビームの強度が最も強く 、かつその強度が最も均一な領域に集中させる、第２の（もう一つの）同心円的 な流れを利用することにより、フロー（流れ）の中心に位置させられる（Ｗ、Ｇ 。

ｈｄｅらｒＦｌｏｗ　Ｃｙｔｏ＋ｎｅｔｒｙ第Ｖ巻、ｒＤＮＡ　Ｍｅａｓｕｒｅ ｓ＋ｅｎｔｓｏｎ　Ｓｐｅｒｍ　ａｎｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ　ｏｆ　Ｇｅ ｎｅｔｉｃａｌｌｙ　Ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　Ａｂｎｏｒａ＋ａｌ　Ｈｕｎ＋ａ ｎｓＪ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔｓｆｏｒｌａｇｅｔ、ノルウェー国、ベルゲン （１９８０年）第２７３〜２７６頁、およびＨ，５ｈａｐｉｒｏ　ｒＰｒａｃｔ ｉｃａｌ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ第２版Ｊ、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ社 、ニューヨーク、第７４頁以下参照）。　本発明は、シースフローを、光散乱信 号において粒子および粒子凝集体の最大の解像度を得るための第１の手段として 用いる。図２は、本発明の光学フロー粒子アナライザにおけるシースフローセル を構成する重要な要素の概略図である。サンプルは、フローセル中において、シ ース流体（ｓｈｅａｔｈ　ｆｌｕｉｄｌに囲まれた粒子流に変えられる。入射光 （すなわちスペクトルバンドの狭いレーザ光）は粒子に直角に衝突し、散乱光が 発生する。図３は、粒子流の下流側におけるシースフローの概略図である。

図４は、本発明で用いるＦＰＡ光学システムにおいて互いに関連する要素の一般 的な配置図である。モノマー性の粒子およびその凝集体によって散乱され、シー スフローセルから射出した光は、中央部にビームブロッカ−を備えた集光レンズ を通過し、光検出器に到達する。本発明で使用するのに適した光検出器は、フォ トダイオード、光電子増倍管、フォトトランジスタおよびフォトレジスタ（ｐｈ ｏｔｏｒｅｓｉｓｔｏｒｓｌである。光ビームの焦点領域を通過するモノマー性 粒子およびその凝集体はそれぞれ、光検出器によって検知される、低角度の前方 散乱光を生み出す。

光検出器からの信号はいくつかの方法で分析することができるが、本発明におい ては、次の２つの方法が有利である。一つは主としてハードウェアに基づ（方法 であり、もう一つは主にソフトウェアに依存した方いては、光検出器からの信号 は、まずプリアンプにかけられ、ついでオシロスコープ上で監視される。図５旦 から分るように、平均パルス高ｖ＆ｌを有する各パルス母集団が、各粒子径およ び凝集体径について観察される。シングルチャネルアナライザ（Ｓｉｎｇｌｅ　 ＣｈａｎｎｅｌＡｎａｌｙｚｅｒ　；　ｒ　Ｓ　ＣＡ　Ｊ　：コネチカット州メ リデンのＣａｎｂｅｒｒａ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を分析物１種につき１ 台使用し、これをそれぞれプリアンプに接続する。このＳＣＡは、各母集団の平 均パルス高■２±ΔＶのパルス高の狭い範囲を区画する電子ウィンドーを設定す る。

各ＳＣＡを通過するパルスは、アナログ−デジタル変換器（Ａｎａｌｏｇ−ｔｏ −Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ　；　ｒ　Ａ　Ｄ　ＣＪ　）、ついでコ ンピュータ（ＣＰＵ）に格納される。コンピュータは、各ＳＣＡからのパルスの 到着回数を監視し、この回数を時間の関数として表す。図５は、この例において 用いられる三つの母集団それぞれについてのパルス計数値を時間の関数として示 す。この時間対パルス計数値の関係を表すグラフ（３個）における種々の特性は 、分析物の濃度と相関する。この特性とは、パルス計数値の初期変化率、最大変 化率、最大パルス計数値、経時的な二量体の形成量、経時的に変化する二量体： モノマーの計数値の比の差、および各ぶろっとに係る時間間隔である（実施例２ および４参照）。

なお、プリアンプとオシロスコープは用いなくてもよい。

図５に示した例のように、３つのＳＣＡを用いるのは、本発明の中のハードウェ アに基づく方法の一つの例である。ＳＣＡは、各分析物により被覆されたモノマ ー性粒子それぞれに異なるものを割り当てるとするならば、同時分析しようとす る分析物の数に応じて、３つより多くても少な（でもよい。

図６Δに示す、ソフトウェアを基礎とする第２の方法においては、ＳＣＡは用い ず、すべてのパルスはプリアンプから、各パルスのピーク高さをサンプリングす るＡＤＣに直接送られる。ピーク高さの値は、ついでコンピュータＣＰＵに送ら れる。コンピュータは、ピーク高さの値を粒径に応じて区分けし、ヒストグラム に表す。

このヒストグラムは、必要に応じて平滑化される。

この平滑化は、好ましくは二項加重移動平均法を用いて行う。当業者ならば、こ のヒストグラムを平滑化する他の方法も思いつ（であろう。この好ましい二項加 重移動平均法においては、ヒストグラムのＸ軸−に沿ったパルス高値の任意の範 囲を選択し、これに対応するＹ軸の値（各パルス高において観察されるパルスの 数）を重み付けするために二項係数を用いる。例えば、もし７個のパルス高範囲 を選択した場合は、パスカルの三角形（あるいは二項係数表）において７個の要 素がある行を参照し、各パルス高について観察されたパルスの数を、パスカルの 三角形において対応する要素で乗する。その積は合計し、ついでパスカルの三角 形における７個の要素の合計で除す。こうして得られた値は、新しい「パルス高 の数」として、選択した範囲の中間にあるパルス高値に付加する。この方法が中 間の要素に最大の加重を与えることになるが、これはパスカルの三角形の性質に よる。このアルゴリズムは、Ｘ軸上で１つだけシフトした新しいパルス高間隔に おいて、継続される。この二項係数を用いた重み付けは、ついでこの組における 「中間」のデータポイントにも適用される。高速でのデータ分析を達成するには 、この平滑化ルーチンは、すべてのヒストグラムに対し、一般的に２回まで適用 される。しかし、ヒストグラムは平滑化のしすぎで性質が損なわれるということ はないため、この特別なルーチンを２回以上適用しても、危険性はほとんどない 。

この平滑化したヒストグラムのピークは、種々の最高値決定法により、容易にめ ることができる。パルス高値の範囲は、各ピークを分類することにより選択され 、パルス回数の総計（図６における曲線の下方にある面積に等しい）は、そのパ ルス高値の範囲において計数される。この工程は、先の第１の方法（図５）にお いて、ＳＣＡにより設定された電子ウィンドーを使用する工程に相当する。この 「パルスの総数」は、上述の調整可能な時間で除され、「計数値」となる。

この計数値の計算は１粒子の凝集反応の間、時間の関数として計数値をプロット しながら、種々の回数繰り返される。そして、この結果得られた曲線は、各ピー クに対応する分析物の濃度を決定するために用いられる。上述のハードウェアを 用いる態様で説明したように、この時間対計数値の関係を規定する特性は、最初 の変化率（最初の勾配）、最大勾配、最大計数値、経時的な二量体の形成量、経 時的に変化する二量体；モノマーの計数値の比の差、および各プロットの時間間 隔である（実施例２および４参照）。

図７は、平均粒径１．６μｍと２．０３ｇｍの２つのポリスチレン球状粒子の母 集団から得られた、散乱光パルス高の分布を示す。図において、シースフローを 用いた場合は光学フロー粒子アナライザは、粒径の差が０．４３ａｍしかないの に、２つの母集団を明瞭に識別する。しかし、シースフローを用いない場合には 、２つの分布は重畳し、容易には識別できない。

このように、シースフローは、フロ一式の細胞計数において、蛍光パルスについ て高い解像度を得ようとする場合には、粒子における蛍光材料の塊が何であろう と、都合のよいものである。しかし、これは光散乱については妥当しない。本発 明者は、シースフローを用いても、ある範囲の粒径は、本質的に解像不能であ５ ことを確認した。この結論は、従来技術からは予期し得ない。本発明は、この、 多重分析のため、シースフローとともに重要な粒径範囲を選択する手段をも与え る。

１−の　像　−−′　パルスのｍ−と兎　の５の東ＩＬ係 Ｍｉｅの理論（前述のＭ、にｅｒｋｅｒ、　１９６９年）に基づいて、十分な光 学的波長分析を行った結果、均一な屈折率を有する球状粒子からの散乱光のパル ス振幅は、簡単に粒径の単調関数にはならないことが分った。この分析結果は、 球状粒子に定在波が生起し、ある種の粒径に対してはプラスの干渉（図８の山） を、また他の種の粒径に対してはマイナスの干渉（図８の谷）を引き起こすため と考えられる。プラスの干渉は光の散乱を増加させ、他方マイナスの干渉は光の 散乱を減少させる。図８の理論的な曲線は、光学的な波長分析から得たものであ る。光散乱の理論的な分析は、いつも近似的なものである。しかし、本発明によ る実験的な分析（図１０参照）は、光の散乱に対するこれらプラスとマイナスの 干渉の影響を明瞭に示している。

本発明の実施例における実験データはＦＰＡにより収集し、図８の理論カーブと 比較した。ＦＰＡは次のような条件下で行った。まず光源には、波長６３２゜８ ｎｍのヘリウムネオンレーザを用い、このレーザ光を一点には収束しない（非点 収差）水平ストライブ状の光束（水平方向に２５０μｍ、垂直方向に１０μｍの 寸法をもつ）に集束させた。シースフローのシステムは、粒子を実質的にビーム の中央部１０ｕｍの中に収めるのに用いた。集光レンズは、単方向性の低角度（ 系の光軸に対して約２〜７度）前方散乱をした散乱光を集光するのに使用した。

本発明においては低角度の前方散乱を利用するのがよい。本発明のデータは、こ の低角度前方散乱は、直角、すなわち垂直散乱に比べ、約１００倍高いＳ／Ｎ比 を実現することを示している。散乱光のパルスは、フォトダイオードで検出され 、プリアンプにかけられ、そして上述のデータ分析システムにパルス高ごとに登 録される。

被覆しないポリスチレンラテックス粒子（ペンシルバニア州ワレントンのＰｏｔ 　ｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を蒸留水に懸濁させ、ＦＰＡのフローセルに通した 。蒸留水中で懸濁させたのは、被覆していない粒子が、イオンによって誘発され る凝集を起こさないようにするためである。パルス高のスペクトルは、各粒径に ついて得られ、図９に示すように、分析のため表示される。平均パルス高と粒径 の関係についてプロット（図１０）し、理論カーブ（図８）と比較してみる。全 般に理論値と実験値はよく合致している。しかし、粒径が大きくなると、パルス 高の実験値は理論値より低くなるという傾向が認められる（図１０のカーブの右 端）。

この曲線によれば、シースフローを用いても、ある粒径の範囲においては分解可 能な散乱光が得られないことが分る。例えば、上述の図１０における実験条件下 では、２〜３μｍの粒径の粒子は（カーブの谷に当る）は、互いに分解不能であ る。これは、粒径が４゜０〜５．５μｍの範囲にある粒子についてもいえる。

一般的にいって、同時分析のためには図１０において曲線の勾配が急な粒径範囲 にある粒子を用いるのが好ましい。この方が各粒子が互いに容易に分解できるか らである（例えば図７参照）。すなわち、粒径が０．０２〜１２μｍの粒子を用 いるのが好ましく、特に０．５〜７．０μｍの粒径のものを用いるのがよい。

ところで、これ以上の実験を示すまでもな（、上述の本発明の方法およびＦＰＡ を、特定の多重分析物用同時分析のため、光学的に解像可能な粒子を選択するこ とに用いるのも、本発明の範囲に含まれる。一般的にいって、その場合には、分 析対象となる、抗体で被覆された、異なる径あるいは屈折率のモノマー性球体で ある特定の分析物を、適当な分析試薬溶液において懸濁させる。本発明の分析は 、ＦＰＡを用いて、各球体ごとに行われる。適当な反応時間が経過したら（反応 は、通常試薬の混合後約３分して開始し、その後約３０分続く）、モノマー、二 量体および三量体の母集団を電圧の関数として示すヒストグラムが得られる。

このヒストグラム（例えば図１４参照）を粒径の目盛りと重量すると、光学的に 分解可能な粒径が、簡単な検査で知れるようになる。

上述の、被覆粒子をイムノアッセイ試薬とともに用いる粒径選択方法に代えて、 二量体、三量体、ｎ量体の形成は遅くなるが、非被覆粒子を塩の溶液中に懸濁す る方法もある（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、　Ｐ、Ａ、らｒ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ　ａｎｄ 　５ｕｒｆａｃｅｓ’、第２３号、第２７３〜２９９頁（１９８７年））。例え ば、ポリスチレン球体を０．３５ＭのＮａＣｌ２溶液に懸濁し、１０分間攪拌す る。ついでこの溶液からサンプルを定期的に取り出し、本発明の光学ＦＰＡで分 析し、ヒストグラムを得る。

光散乱パルスの振幅対粒径の関係を示す曲線は、以下のパラメータ、すなわち粒 子の屈折率、懸濁液の屈折率、入射光の波長あるいは散乱光の観察角度、が変わ ると、変化する。同時分析に最適な粒径は、上述のパラメータのいかなる組合せ に対しても、このようにして必ず決定できる。本発明においては、同時分析の可 能な粒子種の数を最大にするため、上述の最適な粒径範囲から粒子を選択する。

本発明の方法は、二つのビーズを結合させるいかなる化学反応も監視できる。例 えば、分析しようとする患者サンプル中の分析物が抗体である多重抗原−抗体反 応も、同一の患者体液サンプル中において、抗体に対するエピトープ（抗原決定 基）を含む異なる抗原で被覆したそれぞれ異なる粒径のビーズを用いて、同時に 分析できる。同様に、ビーズを、抗原分析物のエピトープに対応する抗体で被覆 することもできる。

本発明の方法は、種々の形で柔軟に適用できる。本発明は、被覆粒子の凝集ある いは凝集抑制を測定することにも用いることができる。この場合、反応混合物を 構成する成分は、同時に加えてもよいし、また順番に加えてもよい。この方法は 、異種の分析物で被覆された粒子が、競合分析における分析物の配位子に競合し て結合する、競合系あるいはサンドウィッチ系に対しても適用できる。

凝固反応を起こしている血液あるいは血漿中におけるビーズの凝集を検出するの も、本発明の範囲に含まれる。そのような反応は、ホメオスタシスの測定に便利 である。

多重分析物の分析、凝固分析および細胞の計数を同時に同じ装置で行うことがで きるというのは、そのためには３つの異なる装置を必要とする現在の技術に比べ 、極めて有利である。本発明の方法およびＦＰＡは、この種の組合せテストを開 発する上では理想的なものである。

以下の実施例は単に本発明の特別な態様を示したもので、請求の範囲に述べた本 発明の範囲を制限するためのものではない。

実施例１ 物が二つの　Ａの口　生立イムノアッセイヒトのＩｇＧとヒトのＩｇＥに対する 同時イムノアッセイを上述のシースフロー光学ＦＰＡシステムを用いて行った。

２種の粒径のポリスチレン微粒子Ｐｏ１ｙｓｔｙｒｅｎｅ　Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅ ｒｅ　Ｒ（ペンシルバニア州ワリントンのＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を２ ０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８）０．５％（ｗ／ｖｌ中に懸濁させた。そし てこの中、粒径１．２３μｍのビーズ（粒径の変動係数は０．１〜４．０％）を ウサギの抗ヒトＩｇＡ抗体２２．５μｇ／■Ｌと、また粒径２．０５μｍのビー ズをウサギの抗ヒトＩｇＧ抗体（ペンシルバニア州ウェストグローブのＪａｃｋ ｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１７ ．５μｇ／ｍＬとともに、それぞれ３０分間培養した。抗体で被覆したビーズは 、ついで非特異的結合部位を遮蔽するため、０．２％の固体状脂肪分非含有ドラ イミルク（カリフォルニア州ロスアンゼルスのＣａｒｎａｔｉｏｎ　Ｃｏｍｐａ ｎｙ製造）で１５分間被覆した。こうして被覆を完了したビーズは、貯蔵緩衝液 （ウシの血清アルブミン０．５％とｐＨ７，４のＮａＨｓをＯ，１％含む１．５ ＭのＮａＣｆｆ）中で繰り返し懸濁させることにより洗浄した。一方、対照とし て用いる抗体で被覆しないビーズも、固体状脂肪分非含有ドライミルクで１５分 間被覆し、かつ上述の手順で洗浄した。

これら２種の粒径のモノマーがＦＰＡの検知領域を通過したときに得られる計数 値を監視するため、電子ウィンドーを設定した。即座に発生する計数値の最初の 対時間変化率（勾配は負）を測定したところ、分析物の濃度と定量的に連関して いた。ここでは、通常異種径のビーズの混合の後３〜３．５分続く、凝集反応の 初期遅延を無視するデータ分析方法を用いた。この凝集反応の遅延の間に、分析 物はビーズ中に急速に拡散するが、ビーズ間の衝突はほとんど起こらないため、 検出の可能な凝集はまだ生じない。この初期遅延の後、動きの少ない粒子が衝突 し、分析物の濃度に依存した速度で凝集する。

これらの実験結果は、図１１（ＩｇＡ単独に分析した場合と、ＩｇＧと同時分析 した場合）と図１２（工ｇＧ単独に分析した場合と、ＩｇＡと同時分析した場合 ）にまとめた。これらの図における曲線は、二つの分析物の単独分析と二重分析 について、モノマーの初期減少速度と分析物の濃度の関係を示す。分析物を単独 で分析した場合も、他の分析物と同時分析した場合もデータ間に大きな差はない ことが分る。したがって、二種の免疫化学反応が同じ反応混合物中で生じても、 各反応は互いに独立に進行すると結論できる。

この反応の独立性の原因は、シースフローを使用したこと、および光散乱対ビー ズの粒径カーブ（図１０）における適当な領域あるいは図１４の重畳したヒスト グラムから得た、異なる粒径のビーズを採用したことにめられる。

実施例２ ヒト血清中の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）のイムノアッセイを上述のシースフ ロー光学ＦＰＡシステムを用いて行った。

粒径１．６２μｍのポリスチレン微粒子（ワシントン州シアトルのＩｎｔｅｒｆ ａｃｉａｌ　Ｄｙｎａｎ＋ｉｃｓ　Ｃｏｒｐ、社製）を、ｌＯｍＭ（１）ＨＥＰ ＥＳ緩衝液（ｐＨ７，５）に１゜Ｑ　ａ＋ｇ／ｍＬの抗ＴＳＨモノクロナール抗 体を溶解した溶液中で培養し、この微粒子を上記抗体で被覆した。被覆した微粒 子は、簡単な遠心分離で回収し、その４倍の量の、ウシの血清アルブミン０．１ ％（Ｗ／Ｖｌ　と０゜０１％のＮａＨｓを含むＨＥＰＥＳ緩衝液（ｌｏｍＭ、ｐ Ｈ７，５）中で３回洗浄した。

被覆したポリスチレン微粒子はついで、ｏ、１％のウシ血清アルブミン、ｏ、ｏ ｉ％のＮ　ａ　Ｎ　ｓおよび３００ｍＭのＮａＩを含む、２０ｍＭのグリシン緩 衝液（ｐＨ９，３）中で懸濁させる。こうして得た試薬は、既知の濃度のヒトＴ ＳＨを含む、等量の標準的なヒトの血清にュージャージー州トムズリバーのＯＥ Ｍ　Ｃ。

ｎｃｅｐｔｓ、　Ｉｎｃｌに添加され、継続的に攪拌される。モノマー性粒子の 初期濃度は、約５Ｘ１０’モノマー／＋ｓＬであった。これまでの製造・被覆工 程の結果得られた二量体粒子の濃度は、上述の初期モノマー濃度の約２％であっ た。反応混合物中におけるＴＳＨの濃度は、０　、　Ｏｕ　ＩＩ／ｍＬ（対照用 ；図１３（７）Ｏ）　、ｌ　、　ＯｇＩＵ／ｍＬ（図１３の■ン、２５μＩＵ／ ＋Ｌ（図１３の◆）および１００　ｕ　ＩＵ／ａｌ１図１３の口）であった。

反応混合物は、反応の開始から１５分間にわたって、間隔をおきながらサンプル を抽出し、本発明の光学ＦＰＡシステムを用いて分析した。二量体の計数値は、 二量体ウィンドーから直に得られる「生の」計数値、また二量体対モノマーもし くは二量体対対照用ビーズ（分析物によって被覆されていないビーズ）の計数値 の比として得られる相対的な計数値として測定した。図１３には、相対的な二量 体の計数値（図には「相対的な二量体の量」として示す）を、上記４種のＴＳＨ 濃度について表す。

各分析物の反応曲線（相対的な二量体量対時間の関係）は、勾配の小さい、初期 凝集遅延相を有する。各曲線はまた、この初期遅延相の後に、勾配が最大となる 領域を有する。勾配が最大となる相に達するまでの時間は、分析物の濃度が増加 するにつれて短縮されている。勾配の最大値は、勿論ＴＳＨ濃度が最大の曲線に ついて得られている。モノマーに対する二量体の量（相対的な二量体量）の最大 の％は、分析物の濃度が増加するにつれて大きくなっており、この最大の％に達 するまでに要する時間は、分析物の濃度が減少するにつれて長（なっている。さ らに、各曲線の下方の面積は、同じ時間までで積分した場合、ＴＳＨ濃度が増加 するにつれて増加している。ところで、これまでに述べた反応曲線の特徴は、す べてＴＳＨの濃度に関係しているが、これらは必ずしも線形の関係ではないとい うことに留意しておく必要がある。

時間に対して計数値をプロットしたものは、数学的なモデルでは正確には予測し 得ない特徴をも説明することができる。特に分析物の濃度が高い場合に、曲線が 非単調な形状を示すということは驚（べきことで、分析物ごとに考えていかねば ならないことである。例えば、ＴＳＨの反応が二量体について最大の計数値を実 現するまでの時間は、先のＩｇＥ分析反応（実施例１参照。分析物のモル濃度は 同じ）において最大の二量体量に到達するのに必要な時間とは一致しない。この 差は、分析物の濃度に関係して最も利用価値のあるプロット特性をめる際に、考 慮に入れなければならない。

図１３のプロット特性は、二量体の絶対的あるいは相対的な計数値が以下の３つ の方法のいずれによって得られる場合でも、大きな変化はない。

１）二量体のパルス高を感知するために設置した５ＣＡ（シングルチャネルアナ ライザ）からのパルスをまずアナログ−デジタル変換器、ついでコンピュータに 送る。

２）七ツマ−のパルス高を感知するために設置した５ＣＡ（二量体の計数値は各 ＳＣＡからの値によって得られる）からパルスを送り、これらのパルスをコンピ ュータによってまとめ、二量体対モノマーの計数値比を得る。

３）１．０５μｍの対照用粒子からのモノマーのパルス高を感知するために設置 したＳＣＡ　（二量体の計数値は各ＳＣＡからの値によって得られる）からパル スをアナログ−デジタル変換器に送り、これらのパルスをコンピュータによって まとめ、二量体対対照用粒子の計数値比を得る。

コンピュータを介して得られた（前述のソフトウェアによる態様）パルス高のヒ ストグラムを形成するために、アナログ−デジタル変換器ともにピーク検出アナ ライザ手段を用いたときも、同じような反応曲線が得られた。この態様において は、ヒストグラムが平滑化されたものであれ、平滑化されないものであれ、モノ マーと二量体の母集団用の電子ウィンドーをひとまとめに扱うため、ＳＣＡでは なくコンピュータを用いた。そして、反応混合物を１５分間にわたって繰り返し サンプリングしたところ、図１３に示したものと変わらない反応プロットが得ら れた。

反応二量体と反応モノマーの比あるいは反応二量体と対照用ビーズの比を用いな いときは、これらの実験における精確さは、計数されるモノマー粒子の数と、Ｆ ＰＡにおける流体のフロー速度の安定性によって左右された。

実施例３ したポリスチレン　の′−・　ｌ　の′４種の粒径のポリスチレン球体（Ｐｏｌ ｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製；以下Ａ、Ｂ、ＣおよびＤとする〕を実施例１に示した 抗ＩｇＡ抗体で被覆した。被覆した球体は洗浄し、非特異的結合部位は、実施例 １に記載したように遮蔽した。

ついで被覆した各粒径の球体の懸濁液を、前述の本発明のＦＰＡおよび凝集速度 を利用した方法を用い、別々に、濃度が既知のＩ　ｇ　Ａ　（１ｍｇ／ｍＬｌと １５分間反応させた。分析物との反応前の、Ａを基準とした相対的なモノマーの 粒径は、Ａが１．００．Ｂが１．０８、Ｃが１．２３、およびＤが１．４６であ る。モノマー、二量体および三量体の母集団を示すヒストグラムは、光学ＦＰＡ により作成した。

図１４を参照すると、４つの曲線の組は、初期反応のヒストグラムが互いに明瞭 に識別可能なピークを与えるため、球体ＡとＢ、球体ＡとＤ、および球体ＣとＤ は光学的に解像可能なことを示している。これとは対照的に、球体ＢとＣ１およ び球体ＡとＣは、互いに重量し合うモノマーと二量体のピークを有するため、光 学的には解像不能である。よって、この分析結果は、二分析物の同時分析に当っ ては、球体ＡとＢ、球体ＡとＤ、および球体ＣとＤの組合せなら、間違いなく用 いられるのを示している。

実施例４ −のサンプルにおＣるＴＳＨｌ ＬｇｊおよびＩ　Ａの６ ３つの分析物−−ヒトＴＳＨ，ＩｇＥおよびＩｇＡについて、上述のシースフロ ー光学ＦＰＡシステムを用いて、同時多重イムノアッセイを行った。

ポリスチレン球体（Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）は、先の 実施例３の基準に従って、光学的に解像可能な、粒径が１．０５μｍ、１．６２ μｍおよび１．７８μｍのものを選択した。これら粒子の凝集に当っては、凝集 をゆっくりと行わせるため、０．３５ＭのＮａＣｇ、溶液中で、１０分間攪拌し ながら、未被覆の球体を導入した。ついでこの懸濁液は、シースフロー光学ＦＰ Ａシステムにより分析し、パルス高のヒストグラムを作成した。このヒストグラ ムを図１５に示す。図のＭ、、Ｍ、、およびＭ、は、それぞれ１．０５μｍ、１ ．６２μｍおよび１．７８μｍの粒径のモノマーを、またり、、Ｄ、、およびＤ ｓは、それぞれＭ　＋　、Ｍ　＊およびＭ、の二量体を表す。

ついで、球体は実施例１と２で述べたように、抗体で被覆した。粒径ｌ、０５μ ｍの球体は抗ヒトＴＳ）Ｉ抗体で、１．６２μｍの球体は抗１ｇＥ抗体で、また １、７８μｍの球体は抗ＩｇＡ抗体で被覆した。

ＴＳＨ，ＩｇＥおよびＩｇＡを除いたヒト血清ｔＯＥＭＣｏｎｃｅｐｔｓ社製） を、既知の濃度でこの血清に添加される分析物ＴＳＨ１ＩｇＥおよびＩｇＡのた めの担体として使用した（表１参照）。

反応溶液は実施例２で説明したものと同じである。

上述の標準的な血清溶液は、反応混合物全体の１０％（Ｖ／Ｖｌ　を占めた。

モノマーの初期濃度は、各粒径とも５　Ｘ　Ｉ　Ｏ’／ａＬであった。また二量 体の初期濃度は、各粒径につき約１．５％であった。

反応混合物はすべて、約２０分間にわたってＦＰＡシステムでサンプリングした 。粒子に凝集を起こさせるためには、反応混合物の攪拌が必要である。したがっ て、ＦＰＡ用の反応混合物から一部取り出したアリコートでは反応は進行しない 。図１６（ＩｇＡに対する反応）、図１７（ＴＳＨに対する反応）、および図１ ８（ＩｇＥに対する反応）においては、ＴＳＨはμＩＩ／＋ｏＬ単位、ＩｇＥは ＩＩ／ｍＬ単位、そしてＩｇＡはｍｇ、μｇ、あるいはｎｇ／ｍＬ単位で表しで ある。各実験における実際の濃度は、表１に示す。

ｕ　ＩＩ／ｍＬ　ＩＵ／ｍＬ １６　・・・・・・口・・・・・・　０　２　１００・・・・・・◆・・・・・ ・　５００　ｎｇ／■Ｌ１２５・・・・・・■・・・・・・　１　ｕｇ／ｍＬ　 ２　１００１７　・・・・・・口・・・・・・　１　μｇ／ｍＬ　２　１００・ ・・・・・◆・・・・・・　５００　ｎｇ／ｍＬ　１　２５・・・・・・■・・ ・・・・　５　ｍｇ／＋Ｌ　Ｏ１０Ｇ１８　・・・・・・口・・・・・・　ｌ　 ｕｇ／ＩＩＬ　２　１００・・・・・・◆・・・・・・　５００　ｎｇ／＋ｓＬ 　ｌ　２５図１６〜１８の標準的な凝集速度を示す曲線は、各濃度の分析物の組 について、二量体・モノマー比の経時変化をプロットすることにより得られた。

各反応速度曲線は互いに明瞭に識別でき、検出レベルに達するような［クロスト ーク（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋｌ　Ｊもない。各図においては、それぞれ他の２つ の分析物について高い濃度が確認される一方で、濃度「ゼロ」の分析物もある。

図１６においては、ＩｇＡが濃度「ゼロ」と認められ、図１７においてはＴＳＨ が、また図１８においては、ＩｇＥが濃度「ゼロ」と認められる（詳細は表１参 照）。濃度「ゼロ」の曲線は、明瞭な勾配をもたない。よって、他の２つの分析 物の間には、高１度ではあるが、相互作用はないと結論できる。ＩｇＡが１０− ’Ｍ　（５ｍｇ／ｒ＠Ｌｌを超える濃度で存在する極端な場合でも、図１７にお けるＴＳＨのゼロ濃度（・・・・・・■・・・・・・）は１０−”Ｍより大きく はない。すなわち、分析物の実際の濃度より７オーダーも低い。したがって臨床 の場におけるような、最も厳格な条件が要求される場合でも、このような濃度比 が得られるならば十分である。

これまで詳しく述べてきたように、図１６〜１８における種々のプロット特性は 、この実験を、単一の液体サンプルにおけるＴＳＨ，ＩｇＡおよびＩｇＥの同時 定量分析の基礎とする際には、分析物の濃度と相関させることもできる。

末立子渣 中央にＣ−ムフ゛ロ１９カー妃 イ穐えた集光、レンズ′ 畢萼の回数 ｔ・２．乙 ｈ ０　２０＋）　４０Ｃ１［，０（Ｉ　淑１０　１０１：む　１２（ｎ：＋分析側 の濃度 分析物のま崖 ｍ間（利ね 轟姦型 時間（分） 時間（分） 時間（分） フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ 、ＦＩ、ＪＰ、ＫＲ，Ｎｏ、Ｒ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．単一の液体サンプル中の多種の分析物を同時に分析する粒子凝集分析方法で あって、 ａ）液体サンプルを、前記多種の分析物のそれぞれに対して一意的な粒径もしく は屈折率のモノマー性粒子を含む試薬と混合する工程であって、 前記一意的なモノマー性粒子は、その粒子もしくはその凝集体がその粒径もしく は屈折率により他と光学的に分解可能であるという条件の下に、被覆粒子−分析 物の結合対を形成するよう、対応する分析物と特異的に結合する互いに異なる組 成物により被覆される工程と、 ｂ）前記液体サンプルと試薬の混合物を、外部入射光源を備え、入射光から、前 記一意的な被覆粒子−分析物の結合対もしくはその凝集体について、一意的な光 散乱パルス信号を発生させる光学フロー粒子アナライザのシースフローセルに通 過させる工程と、ｃ）前記一意的な被覆粒子−分析物の結合対における一恵的な モノマー性被覆粒子もしくはその凝集体の、即座に発生する計数値を同時に測定 するため、単方向の低角度前方光散乱を電子的に分析する工程と、ｄ）前記計数 値を前記各分析物の濃度に関係づける工程を含む方法。 ２．前記粒子の粒径は０．０２〜１２．０μｍの範囲にある請求の範囲第１項記 載の方法。 ３．前記粒子の粒径は０．５〜７．０μｍの範囲にある請求の範囲第１項記載の 方法。 ４．前記粒子は、粒子表面に官能基を有するポリマー性粒子を含む請求の範囲第 １項記載の方法。 ５．前記ポリマーはポリスチレンである請求の範囲第４項記載の方法。 ６．前記官能基はヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシレートポリマー、ア ミン、アミジン、スルフェートおよびホスフェートの各基からなる群より選ばれ る請求の範囲第５項記載の方法。 ７．前記所与の分析反応に対して一意的な粒子は、分析物たる抗原に対する抗体 で被覆される請求の範囲第１項記載の方法。 ８．前記所与の分析反応に対して一意的な粒子は、分析物たる抗体に対する抗原 で被覆される請求の範囲第１項記載の方法。 ９．前記各一意的な粒子のサンプルとの混合は、同時もしくは順番に行われる請 求の範囲第１項記載の方法。 １０．前記被覆粒子−分析物の複数の結合反応のうち少なくとも１つは競合的な 結合反応である請求の範囲第１項記載の方法。 １１．前記被覆粒子−分析物の複数の結合反応のうち少なくとも１つはサンドウ ィッチアッセイである請求の範囲第１項記載の方法。 １２．前記粒子は血液凝固系の一もしくはそれ以上の成分で被覆される請求の範 囲第１項記載の方法。 １３．前記入射光はレーザ装置により発せられる請求の範囲第１項記載の方法。 １４．前記光散乱は、フォトダイオード、光電子増倍管、フォトトランジスタも しくはフォトレジスタにより検出される請求の範囲第１項記載の方法。 １５．前記単方向光散乱から得られるパルス信号の電子分析は、 ａ）前記信号をオシロスコープで監視する工程と、ｂ）一もしくはそれ以上のシ ングルチャネルアナライザ（ＳＣＡ）において、それぞれのＳＣＡは前記当初の 液体サンプルに存在する各分析物専用という条件の下に、各粒子もしくは粒子凝 集体の径に対応するパルス高を通過させるための電子ウィンドーを設定する工程 と、 ｃ）前記各ＳＣＡを通過したパルスを、デジタル化された出力パルスを生成する ため、アナログーデジタル変換器（ＡＤＣ）の各入力として差し向ける工程と、 ｄ）前記デジタル化されたＳＣＡ出力パルスをコンピュータ（ＣＰＵ）に登録す る工程と、 ｅ）前記ＣＰＵにおける各ＳＣＡからのパルスの到着回数を、時間の関数として 計算し、時間対パルス計数値の関係としてプロットする工程と、 ｆ）前記時間対パルス計数値のプロット数点の特徴を分析物の濃度と関係づける 工程を含む請求の範囲第１項記載の方法。 １６．前記電子的に計算されたプロットの特性は、パルス計数値の初期変化率、 パルス計数値の最大変化率パルス計数値の最大値、相対的な二量体の量の経時変 化、二量体対モノマーの比の時間に伴う差、およびパルス計数値算出の時間間隔 からなる群より選ばれる一もしくはそれ以上の特性を含む請求の範囲第１５項記 載の方法。 １７，前記単方向光散乱から得られるパルス信号の電子分析は、 ａ）前記光散乱パルスのすべてを、前記各パルスのピーク高さをサンプリングす るアナログーデジタル変換器（ＡＤＣ）に送る工程と、 ｂ）前記ピーク高さを、前記ＡＤＣからコンピュータ（ＣＰＵ）に送る工程と、 ｃ）前記ピーク高さの値を粒径ごとにヒストグラムに区分けするため、前記ＣＰ Ｕを用いる工程と、ｄ）前記パルスのピークをひとまとめにするパルス高範囲を 選択する工程と、 ｅ）前記パルス高範囲中におけるパルスの総数を所定の時間間隔で除し、パルス 計数値（ＣＲ）を算出する工程と、 ｆ）前記凝集反応の間、前記ＣＲの計算を繰り返す工程と、 ｇ）前記ＣＲを時間の関数としてプロットする工程とｈ）前記プロットの特性を 、前記各ピークに対応する分析物の濃度を決定するために用いる工程を含む請求 の範囲第１項記載の方法。 １８．前記プロットの特性は、パルス計数値の初期変化率、パルス計数値の最大 変化率、パルス計数値の最大値、相対的な二量体の量の経時変化、二量体対モノ マーの比の時間に伴う差、およびパルス計数値算出の時間間隔からなる群より選 ばれる一もしくはそれ以上の特性を含む請求の範囲第１７項記載の方法。 １９．単一の液体サンプル中にある多種の分析物を、粒子凝集の速度に基づいて 同時分析するための光学フロー粒子アナライザであって、 ａ）光源と、 ｂ）光学的に設定される検視ゾーンであって、前記光源からの光がこの検視ゾー ンに向けて収斂され入射する検視ゾーンと、 ｃ）前記検視ゾーンを通して、前記単一の液体サンプルと、前記分析物のそれぞ れの種に一意の粒径もしくは屈折率を有するモノマー性被覆粒子を含有する試薬 を含む反応混合物を流通させる手段であって、前記一意の粒径もしくは屈折率を 有する粒子またはその凝集体の一意性は、他の一意の粒径もしくは屈折率を有す るモノマー性被覆粒子またはその凝集体による単方向・低角度の前方光散乱と光 学的に識別可能な単方向・低角度の前方光散乱からのパルス信号を発生させるた めであり、ここで前記各一意の被覆粒子は被覆粒子−分析物結合対の凝集体を形 成するよう、また前記検視ゾーンを流通する一意のモノマー性被覆粒子もしくは その凝集した多量体が前記一意の被覆粒子−分析物結合対もしくはその凝集した 多量体に一意の、散乱光の不連続なパルスを生成するよう、対応する分析物と特 異的に結合する一意の組成物によって被覆される、手段と、 ｄ）前記単方向・低角度の前方散乱光のパルスを集光するレンズ手段と、 ｅ）前記集光された単方向・低角度の前方散乱光のパルスを受光し、この集光さ れたパルスを、前記各分析物に対応する被覆粒子モノマーもしくはその凝集した 多量体に一意の電子的な各パルス信号に変換するシングル光検出器手段と、 ｆ）前記電子的なパルス信号を、それぞれの分析物を代表する個々の出力信号に 分離するアナライザ手段であって、 前記アナライザ手段は複数のシングルチャネルアナライザを具備し、 前記各シングルチャネルアナライザは、前記各一意の粒径もしくは屈折率のモノ マー性被覆粒子またはその凝集した多量体のそれぞれから得られるパルス信号を 監視するよう、そしてその出力信号として、前記分析物のそれぞれに対応する一 意の被覆したモノマー性粒子もしくはその凝集した多量体のそれぞれの種ごとに 異なる、所定範囲の値をもつ信号を通過させるよう前記多種の分析物のそれぞれ に一意の粒径もしくは屈折率を有する各被覆粒子モノマーまたはその凝集した多 量体専用とされる、アナライザ手段と、ｇ）前記アナライザ手段から得られる出 力信号の単位時間当りの到着回数を計算し、この到着回数を前記各分析物の濃度 と関係づける計算機手段を備える光学フロー粒子アナライザ。 ２０．前記光源はレーザビーム発生器を含む請求の範囲第１９項記載の光学フロ ー粒子アナライザ。 ２１．前記光学的に設定され、収斂された光が入射する検視ゾーンは、前記流通 する粒子を前記光ビームの焦点の中央部に整列させるシースフローセルを具備す る請求の範囲第１９項記載の光学フロー粒子アナライザ。 ２２．前記レンズ手段は、中央部にビームブロッカーを備えた集光レンズを含む 請求の範囲第１９項記載の光学フロー粒子アナライザ。 ２３．前記光検出器手段は、フォトダイオード、光電子増倍管、フォトトランジ スタおよびフォトレジスタからなる群より選ばれる請求の範囲第１９項記載の光 学フロー粒子アナライザ。 ２４．前記光学フロー粒子アナライザは、前記シングル光検出器手段からの前記 電子パルス信号を前もって増幅し、その前もって増幅されたパルス信号を前記ア ナライザ手段に印加する増幅手段をさらに具備する請求の範囲第１９項記載の光 学フロー粒子アナライザ。 ２５．前記増幅手段はプリアンプを含む請求の範囲第２４項記載の光学フロー粒 子アナライザ。 ２６．前記光学フロー粒子アナライザは、前記前もって増幅されたパルス信号を 監視する監視手段をさらに具備する請求の範囲第２４項記載の光学フロー粒子ア ナライザ。 ２７．前記前もって増幅されたパルス信号を監視する監視手段は、オシロスコー プを含む請求の範囲第２６項記載の光学フロー粒子アナライザ。 ２８．前記複数のシングルチャネルアナライザは、前記前もって増幅された信号 を受信し、その出力信号として、前記所定の信号値の範囲に収まる、その前もっ て増幅された信号を通過させる請求の範囲第２４項記載の光学フロー粒子アナラ イザ。 ２９．前記光学フロー粒子アナライザは、前記出力信号を、その信号のピーク高 さを代表するデジタル信号に転換するピーク検出器手段をさらに具備する請求の 範囲第１９項記載の光学フロー粒子アナライザ。 ３０．前記ピーク検出器手段はアナログーデジタル信号変換器を含む請求の範囲 第２９項記載の光学フロー粒子アナライザ。 ３１．前記計算機手段はコンピュータを含む請求の範囲第１９項記載の光学フロ ー粒子アナライザ。 ３２．前記コンピュータは、前記アナライザ手段からの各出力信号の到着回数を 繰り返し監視する手段と、前記分析における凝集反応の間、これらの到着回数を 時間の関数として繰り返しプロットする手段と、パルス計数値の初期変化率、パ ルス計数値の最大変化率、パルス計数値の最大値、相対的な二量体の量の経時変 化、二量体対モノマーの比の時間に伴う差、およびパルス計数値算出の時間間隔 からなる群より選ばれる前記プロットの特性に基づいて各分析物の濃度を決定す る手段を含む請求の範囲第３１項記載の光学フロー粒子アナライザ。 ３３．単一の液体サンプル中にある多種の分析物を、粒子凝集の速度に基づいて 同時分析するための光学フロー粒子アナライザであって、 ａ）光源と、 ｂ）光学的に設定される検視ゾーンであって、前記光源からの光がこの検視ゾー ンに向けて収斂され入射する検視ゾーンと、 ｃ）前記検視ゾーンを通して、前記単一の液体サンプルと、前記分析物のそれぞ れの種に一意の粒径もしくは屈折率を有するモノマー性被覆粒子を含有する試薬 を含む反応混合物を流通させる手段であって、前記一意の粒径もしくは屈折率を 有する粒子またはその凝集体の一意性は、他の一意の粒径もしくは屈折率を有す るモノマー性被覆粒子またはその凝集体による単方向・低角度の前方光散乱と光 学的に識別可能な単方向・低角度の前方光散乱からのパルス信号を発生させるた めであり、ここで前記各一意の被覆粒子は被覆粒子−分析物結合対の凝集体を形 成するよう、また前記検視ゾーンを流通する一意のモノマー性被覆粒子もしくは その凝集した多量体が前記一意の被覆粒子−分析物結合対もしくはその凝集した 多量体に一意の、散乱光の不連続なパルスを生成するよう、対応する分析物と特 異的に結合する一意の組成物によって被覆される、手段と、 ｄ）前記単方向・低角度の前方散乱光のパルスを集光するレンズ手段と、 ｅ）前記集光された単方向・低角度の前方散乱光のパルスを受光し、この集光さ れたパルスを、前記各分析物に対応する被覆粒子モノマーもしくはその凝集した 多量体に一意の電子的な各パルス信号に変換するシンクル光検出器手段と、 ｆ）前記電子的なパルス信号のピーク高さ値をサンプリングし、この値に対応す るピーク高信号として出力するピーク検出器手段と、 ｇ）前記ピーク高信号を前記各分析物の濃度と関係づける計算機手段を備える光 学フロー粒子アナライザ。 ３４．前記光源はレーザビーム発生器を含む請求の範囲第３３項記載の光学フロ ー粒子アナライザ。 ３５．前記光学的に設定され、収斂された光が入射する検視ゾーンは、前記流通 する粒子を前記光ビームの焦点の中央部に整列させるシースフローセルを具備す る請求の範囲第３３項記載の光学フロー粒子アナライザ。 ３６．前記レンズ手段は、中央部にビームブロッカーを備えた集光レンズを含む 請求の範囲第３３項記載の光学フロー粒子アナライザ。 ３７．前記光検出器手段は、フォトダイオード、光電子増倍管、フォトトランジ スタおよびフォトレジスタからなる群より選ばれる請求の範囲第３３項記載の光 学フロー粒子アナライザ。 ３８．前記光学フロー粒子アナライザは、前記シングル光検出器手段からの前記 電子パルス信号を前もって増幅し、その前もって増幅されたパルス信号を前記ピ ーク検出器手段に出力する増幅手段をさらに具備する請求の範囲第３３項記載の 光学フロー粒子アナライザ。 ３９．前記ピーク検出器手段は、前記電子パルス信号のピーク高さをサンプリン グし、そのピーク高さをデジタル式のピーク高さ信号に変換するアナログーデジ タル変換器手段をさらに具備する請求の範囲第３３項記載の光学フロー粒子アナ ライザ。 ４０．前記計算機手段はコンピュータを含む請求の範囲第３３項記載の光学フロ ー粒子アナライザ。 ４１．前記コンピュータは、前記ピーク高さ値を大きさによって区分けし、ヒス トグラムにする手段と、前記ヒストグラムの各ピークをまとめる間隔を選択する 手段と、前記粒子凝集反応の間に、選択した前記各ピーク高さの間隔中にあるパ ルス計数値を繰り返し計算する手段と、前記各パルス計数値を時間の関数として プロットする手段と、パルス計数値の初期変化率、パルス計数値の最大変化率、 パルス計数値の最大値、相対的な二量体の量の経時変化、二量体対モノマーの比 の時間に伴う差、およびパルス計数値算出の時間間隔からなる群より選ばれる前 記プロットの特性に基づいて、前記各ピークに対応する各分析物の濃度を決定す る手段を含む請求の範囲第４０項記載の光学フロー粒子アナライザ。 ４２．前記光学フロー粒子アナライザは、前記ヒストグラムを平滑化する手段を さらに具備する請求の範囲第４１項記載の光学フロー粒子アナライザ。