JPH06507605A - 脂質の分画 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 脂質の分画 免豆立１１ この発明は、脂質混合物の分画に関する。

血漿リポ蛋白質は、種々の量のコレステロール、トリグリセリド、リン脂質及び 蛋白質を含む球状粒子である。それらは、リン脂質、遊離のコレステロール及び 蛋白質からなる外表面、及び殆どエステル化したコレステロール及びトリグリセ リドを含む内部コアを含む、血漿リポ蛋白質は、血流中でコレステロール及びト リグリセリドを可溶化し且つ輸送するのに役立つ。

血漿リポ蛋白質中の蛋白質及び脂質の相対比率は、血漿リポ蛋白質の密度を決定 する（　Ｇｏｔｔｏ、　１９８ｇ、　Ｈａｓｐ。

Ｐｒａｃｔ、　２３：４　（補遺１））、それらの密度、粒子サイズ、組成及び 電気泳動移動度に基づいて、循環リポ蛋白質は、主要クラスに分類された。これ らのクラスは、カイロミクロン、超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）、低密度リポ 蛋白質（ＬＤＬ）、及び高密度リポ蛋白質（ＨＤＬ）である、これらのクラスの 特性の幾らかを表１に示す。

表１ 血漿リポ蛋白質の特性 直径　密度　起源 一−ユ入り一　工ｌＺニュ上 カイａミクａｙ　７５０−１２，０００　＜０．９５　腸ＶＬＤＬ　３００−７ ００　＜１．００６　肝臓Ｌ　Ｄ　Ｌ　１８０−３００　１．０１９−１．０６ ３　ＶＬＤＬ（７）代謝ＨＤ　Ｌ　５０−１２０　１．０６３−１．２１　肝臓 及び腸リボ蛋白質の主要クラスは、更に、サブクラスに分割することが出来る。

ＬＤＬは、ＭｃＮａｍａｒａ、　１９９０．　ＡＡＡＣＬｉｐｉｄｓ　ａｎｄ　 Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ　４：１ （参考として本明細書中に援用）　、　Ｋｒａｕｓｓ等、１９８２．　Ｊ。

Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ、　２３：９７　（参考として本明細書中に援用）及びＭｃ Ｎａｍａｒａ等、１９ｇ？、＾ｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓヱ：４８３　（ 参考として本明細書中に援用）に記載されたように少なくとも７つのサブクラス を含む、ＨＤＬは、ｌ１ｌｈｉｔａｋｅｒ、　１９８６゜Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ 、　３２：１２７４　（参考として本明細書中に援用）及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、 　１９７７、　ＢＬｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　４９３：５５ （参考として本明細書中に援用）に記載されたように少なくとも２つのサブクラ スを含む。

冠状動脈心疾患の主要な危険因子は、高コレステロール血症、喫煙、高血圧、糖 尿病、肥満及び男性であることである。高コレステロール血症が、一般に、これ らの危険因子の内で最も顕著なも、のであるにもかかわらず、多くの臨床研究は 、異なるクラスのリポ蛋白質は非常に性質が異なり、心疾患に対して異なった影 響を持つことを示した（　Ｃｒｏｕｓｅ等、　１９８５．　Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ　 Ｒｅｓ、、　２６：５６６−５７２；にａｎｎｅｌ等、１９７９．＾ｎｎ、　Ｉ ｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ、、　９０：８５−９１；Ｋａｎｎｅｌ等、１９８４．　 Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　７０：１５７Ａ−２０５Ａ）　、事実、ＨＤＬの存在 は、冠状動脈心疾患に対する防御効果を与え、それ故、相対的に低いＨＤＬ−コ レステロールレベルは大きい危険を示すといえる（　ＭＨｌｅｒ等、１９７５゜ Ｌａｎｃｅｔ　１６：２３；　Ｃａ５ｔｅｌｌｉ等、１９７７、　Ｃ１ｒｃｕｌ ａｔｉｏｎ　５５ニア６７；　Ｇｏｒｄｏｎ等、１９７７、ＡＩｌ、Ｊ、Ｍｅｄ 、６２ニア０７；　Ｈｅ１ｓ等、１９８０、　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　６２： １１６　（補遺４））。

ＨＤＬコレステロールの、冠状動脈疾患に対する強力な逆危険因子としての重要 性の認識は、臨床及び研究用に適したＨＤＬコレステロールアッセイの実質的な 需要へと導いた。超遠心分離、電気泳動及び特異的沈殿を含む種々の方法（Ｈａ ｖｅｌ等、１９５５．　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　３４：１３４５） が、種々のクラスのリポ蛋白質を分離するために用いられた。

沈殿に基づく方法が、リポ蛋白質の常例的定量に広く用いられて来た。幾らかの 沈殿に基づく方法が、最近の文献に記載された。これらの方法の殆どは、Ｂｕｒ ｓｔｅｉｎとその同僚による初期の仕事（Ｒ，Ｐａ０１＠ｔｔｉ及びり。

Ｋｒ１ｔｃｈｅｖｓｋｙｉｉ、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　１１＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ＮＹ　 １９７３．　中のＢｕｒｓｔｅｉｎ。

鯖、及び５ｃｈｏｌｎｉｃｋ、　Ｊ、Ｒ，、Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｏｌｙ ａｎｉｏｎ−ｓｅｔａｌ　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ　（６７−１０８頁）に概 説されている）に基づいている。これらの方法において、溶液（例えば、血清） 中のリボ蛋白質の分画は、第一に、選択的沈殿により、続いて、遠心分離によっ て達成される０次いで、その上清を用いてコレステロール含量を測定し、或は、 上清から特異的に除去した画分のコレステロール含量を測定する０例えば、低密 度リボ蛋白質（ＬＤＬ）コレステロールは、キレート緩衝液（ｐＨ５，０４）中 のヘパリンを用いてＬＤＬのみを特異的に沈殿させることによりこの方法で測定 することが出来る。その他は、ＬＤＬ及びＶＬＤＬの特異的沈殿をもたらすポリ ビニルサルフェート又はポリエチレングリコールを用いて報告された。それぞれ の場合において、コレステロール含量の測定の前に沈殿が必要である。

同様に、ＨＤＬ−コレステロールの測定は、通常、２段階工程であり、先ず、Ｈ ＤＬを他のアポＢ含有血漿リボ蛋白質から分離し、そして、ＨＤＬ含有画分のコ レステロール含量を測定する。殆どの一般的に用いられる方法は、Ｂｕｒｓｔｅ ｉｎ及び彼の同僚により開発された方法（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ等、１９８ｇ、Ｃ１ ａｒｋｓｏｎ　ＴＢ、Ｋｒ１ｔｃｈｅｖｓｋｙ　Ｄ。

Ｐｏ１ｌａｋ　ＯＪ編：　Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ　ｏｎ　Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅ ｒｏｓｉｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｋａｒｇｅｒ中）に基づいており、その中 でアポＢ含有リボ蛋白質は、二価カチオンと組合せたポリアニオンを用いる沈殿 により除去される（　Ｂａｃｈｏｒｉｋ等、　１９８６゜Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎ ｚｙｍｏｌ、　１２９ニアｇ　）　、　２　ツの最も一般的に用いられる沈殿剤 は燐タングステン酸ナトリウム−Ｍ　ｇ　Ｃ１！及びデキストランサルフェート （分子量５０．０００）−ＭｇＣ１，である（　１ｌＢｒｎｉｃｋ等、　１９８ ２゜Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　２３：１３７９　）　、他の用いられる沈殿剤は 、ヘパリンサルフェート−Ｍ　ｎ　Ｃ１ｍ及びヘパリンサルフェート−炭酸カル シウムを含む、これらのアッセイにおいて、沈殿試薬を血清又は血漿のアリコー トに加える０重い白色沈殿が直ちに生じ、混合物を、沈殿が完結するまで放！す る。その沈殿を、次いで、遠心分離により沈降させ、澄んだ上清のアリコートを コレステロールアッセイ用に除去する。

主要集団研究において広く用いられている第一の方法は、ヘパリン及びＭ　ｎ　 ”を用いてＶＬＤＬ及びＬＤＬを沈殿させ、ＨＤＬを上清溶液中に残してコレス テロール量によって測定する（　Ｂｕｒｓｔｅｉｎ等、１９６０．　Ｃ１１ｎ、 　Ｃｈｉｎ。

Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃ１１ｎｉｃｓ　Ｐｒｏｇｒａｍ、Ｌｉｐｉｄ 　ａｎｄＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　１．　Ｎａｔｉｏｎａ ｌ　Ｈｅａｒｔ　ａｎｄ　ＬｕｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、　ＤＨＥＷ　Ｐｕｂｌ ｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｎｏ、（ＮＩＨ）　７５−６２８゜１９７４）　、この方法 は、広（研究されてきており（ＢＢｈｏｒｉｋ等、１９７６、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅ ｗ、２２：１ｇ２ｇ−１８３４゜Ｗａｒｎｉｃｋ等、１９７８ａ、　Ｊ、　Ｌｉ ｐｉｄ　Ｒｅｓ、　１９：６５−７６　）　、変法がＷａｒｎｉｃｋ等、１９７ ８ａ　（前掲書）　；　１ｌａｒｎｉｃｋ等、１９７８ｂ。

Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　２４：９００に記載されている。

兄」Ｌの」Ｌ杓 一般的に、この発明は、試料中の第一のクラスのリボ蛋白質（例えば、ＨＤＬ、 ＬＤＬ又はＶＬＤＬ（７）何れか）を第二のクラスのリボ蛋白質（例えば、試料 中に残存する型のリボ蛋白質の何れか又はすべて）から分離する（例えば、ＨＤ ＬをＬＤＬ及び／又はＶＬＤＬから、ＬＤＬをＨＤＬ及び／又はＶＬＤＬから、 或は、ＶＬＤＬをＬＤＬ及び／又はＨＤＬから分離する）方法を叙述する。この 方法は、第二のクラスのリボ蛋白質を、好ましくは、試料を沈殿試薬に接触させ ることにより沈殿させ、その試料を磁気的に反応性の粒子に接触させ及び、磁気 的に反応性の粒子が沈降するまで磁場内に置き、それにより、沈殿した第二のク ラスのリボ蛋白質の沈降を引き起こし且つ第一のクラスのリボ蛋白質を試料の上 清中に残すことを含む。

好ましい実施態様は、試料を磁気的に反応性の粒子と接触させる前に沈殿試薬を 試料と接触させるもの、沈殿試薬及び磁気的に反応性の粒子を同時に試料と接触 させる（即ち、それらを同時に加える）もの、沈殿試薬が、例えば、デキストラ ンサルフェート及びＭｇＣ１□、又は燐タングステン酸及びＭ　ｇ　Ｃ１ｍを含 むもの、磁気的に反応性の粒子が、ポリアクロレイン及び鉄形態（例えば、酸化 鉄）を含むもの、試料が、１，３００ｍｇ／ｄ１までトリグリセリドを含むもの 、試料が、生物学的液体（例えば、動物（例えば、を推動物（例えば、哺乳類（ 例えば、ヒト）））からの、血液、血漿又は血清）であるもの、試料を動物に戻 さないもの、及び試料を、例えば、それを採取した動物へ戻すものを含む。

他の面において、この発明は、試料中の第一のクラスのリボ蛋白質（例えば、Ｈ ＤＬ、ＬＤＬ又はＶＬＤＬ）に含まれる一成分（例えば、コレステロール、リン 脂質、アポリボ蛋白質、トリグリセリド、又はコレステロールエステル）の量を 測定する方法を叙述する。試料は、第−及び第二のクラスのリボ蛋白質を含み、 第二のクラスは、任意の他のクラスのリボ蛋白質（例えば、第一のクラスがＨＤ Ｌであるならば、第二のクラスはＬＤＬ、ＶＬＤＬ又はその両方）を含んでいる 。この方法は、第二のクラスのリボ蛋白質を好ましくは試料を沈殿試薬に接触さ せることにより沈殿させ、その試料を磁気的に反応性の粒子と接触させ、その試 料を磁気的に反応性の粒子が沈降するまで磁場内に置（ことを含み、それにより 、沈殿した第二のクラスのリボ蛋白質の沈降を引き起こして第一のクラスのリボ 蛋白質を試料の上清中に残し、そして、第一のクラスのリボ蛋白質中のコレステ ロールの量を測定する。

好ましい実施態様は、第一のクラス中の興味ある成分の量を上清中の成分の量を 測定することにより測定するもの、及び、第一のクラス中の成分の量を、試料中 に存在する成分の総量を測定し、沈降した第二のクラス中の成分の量を測定し、 そして後者を前者から引くことにより測定するものを含む。

好ましい実施態様は、試料を磁気的に反応性の粒子に接触させる前に沈殿試薬を 試料に接触させるもの、沈殿試薬及び磁気的に反応性の粒子を同時に試料に接触 させる（即ち、それらを同時に試料に加える）もの、沈殿試薬が例えばデキスト ランサルフェート及びＭ　ｇ　Ｃ１ｍ又は燐タングステン酸及びＭｇＣ１１を含 むもの、磁気的に反応性の粒子がポリアクロレイン及び鉄形態（例えば、酸化鉄 ）を含むもの、試料が１，３００ｍｇ／ｄｉまでのトリグリセリドを含むもの、 試料が生物学的液体（例えば、動物（例えば、を推動物（例えば、哺乳類（例え ば、ヒト）））からの血液、血漿又は血清）であるもの、測定を自動装置にて行 なうもの、及び測定を手動式分光計にて行なうものを含む。

好ましい実施態様は、試料のＨＤＬ中の一成分（例えば、コレステロール、リン 脂質、アポリボ蛋白質、トリグリセリド又はコレステロールエステル）の濃度を 、試料中のＬ　Ｄ　Ｌ及びＶＬＤＬを沈殿させ及び沈降させ、次いで、上清中の 成分濃度を測定することにより測定するもの：試料のＬＤＬ中の一成分（例えば 、コレステロール、リン脂質、アポリポ蛋白質、トリグリセリド又はコレステロ ールエステル）の濃度を、試料中のＨＤＬ及びＶＬＤＬを沈殿及び沈降させ、次 いで、上清中の成分濃度を測定することにより測定するもの；試料のＶＬＤＬ中 の成分（例えば、コレステロール、リン脂質、アポリボ蛋白質、トリグリセリド 又はコレステロールエステル）の濃度を、試料中のＬＤＬ及びＨＤＬを沈殿及び 沈降させ、次いで、上清中の成分濃度を測定することにより測定するもの；試料 のＨＤＬ中の一成分（例えば、コレステロール、リン脂質、アポリボ蛋白質、ト リグリセリド又はコレステロールエステル）の濃度を、試料中のＬＤＬ及びＶＬ ＤＬを沈殿及び沈降させ、沈降物中の成分の量を測定し、試料中の成分の総量を 測定し、次いで、前者を後者から引くことにより測定するもの：試料のＬＤＬ中 の一成分（例えば、コレステロール、リン脂質、アポリボ蛋白質、トリグリセリ ド又はコレステロールエステル）の濃度を、試料中のＨＤＬ及びＶＬＤＬを沈殿 及び沈降させ、沈降物中の成分の量を測定し、試料中の成分の総量を測定し、次 いで、前者を後者から引くことにより測定するもの；並びに試料のＶＬＤＬ中の 一成分（例えば、コレステロール、リン脂質、アポリボ蛋白質、トリグリセリド 又はコレステロールエステル）の濃度を、試料中のＨＤＬ及びＬＤＬを沈殿及び 沈降させ、沈降物中の成分の量を測定し、試料中の成分の総量を測定し１次いで 、前者を後者から引（ことにより測定するものを含む。

この発明は又、試料中の第一のクラスのリポ蛋白質（例、ｔ　ｉｆ、ＨＤＬ又は ＬＤＬ又はＶＬＤＬ）に含まれるー成分（例えば、コレステロール、リン脂質、 アポリボ蛋白質、トリグリセリド又はコレステロールエステル）の量を測定する 方法をも含む、試料は、第−及び第二のクラスのリボ蛋白質を含み、第二のクラ スのリボ蛋白質は任意の他のクラスのリボ蛋白質（例えば、第一のクラスがＨＤ Ｌであるならば、第二のクラスはＬＤＬ又はＶＬＤＬ又はそれらの両方であって よい）を含んでよい。

この方法は、第一のクラスのリボ蛋白質を好ましくは試料を沈殿試薬に接触させ ることにより沈殿させ、その試料を磁気的に反応性の粒子に接触させ、その試料 を磁気的に反応性の粒子が沈降するまで磁場内に置き、それにより、沈殿した第 一のクラスのリボ蛋白質の沈降を引き起こして第二のクラスのリボ蛋白質を試料 の上清中に残し、そして第一のクラスのリポ蛋白質中のコレステロールの量を測 定することを含む。

好ましい実施態様は、第一のクラス中の興味ある成分の鳳を、沈降した第一のク ラス中の成分の量を測定することにより測定するもの、及び第一のクラス中の成 分の量を、試料中に存在する成分の総量を測定し、上清中の成分の量を測定し、 そして後者を前者から引（ことにより測定するものを含む。

好ましい実施態様は、沈殿試薬を、試料を磁気的に反応性の粒子と接触させる前 に、試料と接触させるもの；沈殿試薬及び磁気的に反応性の粒子を同時に試料と 接触させる（即ち、それらを同時に試料に加える）もの；沈殿試薬が例えばデキ ストランサルフェート及びＭｇＣｌ　＊　、ポリエチレングリコール、ヘパリン 及びクエン酸又は燐タングステン酸及びＭ　ｇ　Ｃ１ｇを含むもの；磁気的に反 応性の粒子がポリアクロレイン及び鉄形態（例えば、酸化鉄）を含むもの；試料 が１，３００ｍｇ／ｄ１までのトリグリセリドを含むもの；試料が、生物学的液 体（例えば、動物（例えば、を推動物（例えば、哺乳類（例λば、ヒト）））か らの血液、血漿又は血清）であるもの：測定を自動装置で行なうもの；及び測定 を手動の分光計で行なうものを含む。

好ましい実施態様は、試料のＬＤＬ中の一成分（例えば、コレステロール、リン 脂質、アポリボ蛋白質、トリグリセリド又はコレステロールエステル）のレベル を、試料中のＬＤＬを沈殿及び沈降させ、次いで、沈降物中の成分のレベルを測 定することに・より測定するもの；試料のＶＬＤＬ中の一成分（例えば、コレス テロール、リン脂質、アポリボ蛋白質、トリグリセリド又はコレステロールエス テル）のレベルを、試料中のＶＬＤＬを沈殿及び沈降させ、次いで、沈降物中の 成分のレベルを測定することにより測定するもの；試料のＨＤＬ中の一成分（例 えば、コレステロール、リン脂質、アポリボ蛋白質、トリグリセリド又はコレス テロールエステル）のレベルを、試料中のＨＤＬを沈殿及び沈降させ、次いで、 沈降物中の成分のレベルを測定することにより測定するもの；試料のＬＤＬ中の 一成分（例えば、コレステロール、リン脂質、アポリポ蛋白質、トリグリセリド 又はコレステロールエステル）のレベルを、試料中のＬＤＬを沈殿及び沈降させ （ＨＤＬ及びＶＬＤＬを上清中に残す）、上清中の成分の量を測定し、試料中の 成分の総量を測定し、次いで、前者を後者から引（ことにより測定するもの；試 料のＨＤＬ中の一成分（例えば、コレステロール、リン脂質、アポリボ蛋白質、 トリグリセリド又はコレステロールエステル）のレベルを、試料中のＨＤＬを沈 殿及び沈降させ（ＬＤＬ及びＶＬＤＬを上清中に残す）、上清中の成分の量を測 定し、試料中の成分の総量を測定し、次いで、前者を後者から引くことにより測 定するもの：並びに試料のＶＬＤＬ中の一成分（例えば、コレステロール、リン 脂質、アポリポ蛋白質、トリグリセリド又はコレステロールエステル）のレベル を、試料中のＶＬＤＬを沈殿及び沈降させ（ＬＤＬ及びＨＤＬを上清中に残す） 、上清中の成分の量を測定し、試料中の成分の総量を測定し、次いで、前者を後 者から引くことにより測定するものを含む。

リボ蛋白質のクラスは、ここで用いる場合、リボ蛋白質の主要クラス（例えば、 ＨＤＬ、ＬＤＬ又はＶＬＤＬ）の１つを指すか、又は主要クラスのサブクラスの １つ（例えば、ＬＤＬ主要クラスの７つのサブクラスの内の１つ又はＨＤＬ主要 クラスの２つのサブクラスの内の１つ）を指す。

この発明の方法は、血液、血漿又は血清等の水性媒質から選択的に沈殿させたリ ボ蛋白質の迅速な除去のために磁気的に反応性の粒子を利用する。好ましい実施 態様は、一つ以上のリボ蛋白質（例えば、ＨＤＬ、ＬＤＬ又はＶＬＤＬの何れか ）の選択的沈殿により、磁気的に誘導される沈降と協力して向上した分画な与え る０分画は、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬコレステロール及びＶＬＤＬコレス テロール等の病理学的に重要な脂質成分の測定において重要なステップである。

磁化し得る粒子の利用は、血漿リボ蛋白質の分画における遠心分離ステップの必 要性を除去するか又は減じる。結果として、磁気に基づ（分離は比較的迅速であ り、高価な又はエネルギー消費的な装置を必要とせず、放射線学的、生物学的及 び物理学的事故を減少させる。

更に、試料は、試料の完全性を危険にさらし得る遠心分離で生じる熱にさらされ ない。

この発明の方法は、高濃度のトリグリセリドを有する試料中であっても、試料を 更に希釈することな（沈殿したリボ蛋白質の完全な沈降を可能にする。従って、 試料を希釈するために必要な時間及び費用並びに希釈から生じる評価の誤りが除 かれる。

この発明の磁気的分離方法は、（コレステロール測定用に一般に用いる型の）自 動式臨床分析機に取り入れて、ＨＤＬ−コレステロール、及び／又はＬＤＬ−コ レステロール、及び／又はＶＬＤＬ−コレステロールのインラインでの分離を行 ない且つ直接自動測定をすることが出来る。

この発明の磁気的分離方法は、リボ蛋白質の１つのクラス中に見出される任意の リボ蛋白質成分（例えば、リン脂質、トリグリセリド、アポリポ蛋白質又はコレ ステロールエステル）の測定に用いることが出来る。

この発明の他の特徴及び利点は、下記の好ましい実施態様の説明及び請求の範囲 から明らかとなろう。

ましし）　の１日 仄１ 「磁気的に反応性の粒子」又は「磁気的粒子」は、ここで用いる場合、水性媒質 中に分散又は懸濁可能で且つ懸濁液から磁場の適用により分離可能な任意の粒子 である。これは、本来的に磁気的に反応性である粒子又は（例えば、磁気的に反 応性の物質に結合すること又はかかる物質の粒子への取り込みによって）磁気的 に反応性にされた粒子を含む。この磁気的成分は、例えば、その物質をセルロー ス又はポリアクロレイン等の高分子マトリックスに含浸することによって、粒子 中に取り込み得る。これらの磁気的粒子は、強磁性、超常磁性、又は一層好まし くは常磁性であってよい。

磁気的に反応性の粒子の磁気的成分は、磁場の影響を受け易い任意の成分であっ てよく、例えば、鉄、コバルト又はニッケルの塩、酸化物、ホウ化物又は硫化物 ；高い磁化率を有する稀土類元素（例えば、ヘマタイト又はフェライト）：又は 純粋な磁気的に反応性の金属又はその合金がある。多様な粒子（例えば、セルロ ース／酸化鉄又はポリアクロレイン／酸化鉄）が、この発明において利用するの に適している。

磁気的粒子は、Ｃｏｒｔｅｘ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　Ｉｎｃ、（カリフォルニア 州、Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ在）から入手可能である。幾つかの型の磁気的粒子 を試験した。それらは、好ましい順に記せば、ポリアクロレイン／酸化鉄（例え ば、Ｃｏｒｔｅｘ＃ＣＭ１００１）　、セルロース／酸化鉄（Ｃｏｒｔｅｘ　＃ ＣＭ１０００）、低密度セルロース／酸化鉄（Ｃｏｒｔｅｘ　＃ＣＭ１００３） 　、及び磁化可能な木炭（Ｃｏｒｔｅｘ　＃ＣＭ５００２）である。

磁気的に反応性の粒子の製造方法は、当業者に公知であり、磁気的酸化鉄コアを 有する粒子の生産を開示している米国特許第４，６２８，０３７号（本明細書中 に参考として援用する）　；ポリマーマトリックス（例えば、炭水化物マトリッ クス）中に含まれた磁気的粒子からなる球の製造を開示している米国特許第４， ６８７，７４８号（本明細書中に参考として援用する）；ポリマーの存在下での 利用可能な配位部位を有する遷移金属の共沈殿による磁気的ポリマー粒子の生産 を開示している米国特許第４，７９５，６９８号（本明細書中に参考として援用 する）；及び、ＣｒＯヨのコアを有する磁気的に反応性の粒子の製造を開示して いる米国特許第４．６６１．４０８号（本明細書中に参考として援用する）を参 照されたい。磁気的に反応性の粒子は又、ここに記すように、市販されてもいる 。

磁気的に反応性の粒子は、沈殿試薬に続いて又は同時に加えることが出来る。同 時に加えるならば、（単一の沈殿／磁気的反応性粒子試薬を用いて）大きさ及び 表面特性は、沈殿が完結するとき（そのときに磁気的分離を適用する）まで粒子 が懸濁液中に残るように選択すべきである。この「同時添加」手順の型について は、１〜１０ミクロンの範囲の粒子を選択的リポ蛋白質沈殿アッセイに用いた。

磁気的に反応性の１ミクロンより小さい粒子も又、磁場をかけるまで懸濁液中に 残りそうなのでよく作用するであろう０粒子の大きさの上限は、大きさに加えて 、磁場のない場合に沈降速度を決定する因子、例えば、粒子密度、粒子表面上の 官能基の性質（例えば、親木基は比較的遅い沈降を生じるが、他方、疎水基はも っと迅速な沈降を生じる）に依存し、及び用いる特定のリポ蛋白質沈殿反応の反 応速度に依存する。これらの粒子は、所望のリポ蛋白質の沈殿を可能にするのに 十分なだけ長（懸濁液中に残らなくてはならない。

磁気的に反応性の粒子の大きさの選択に影響する因子は、当業者に公知であり、 欧州特許出願筒８６３０９９６７．７（本明細書中に参考として援用）；米国特 許第４．６２８．０３７号（本明細書中に参考として援用）：米国特許第４，６ ８７，７４８号（本明細書中に参考として援用）を参照されたい。

特定のリポ蛋白質沈殿に用いる試薬は、沈殿すべきリポ蛋白質によって変わるで あろうし、当業者に公知の方法によって選択することが出来る。ヘパリン及びシ トレート、ヘパリン−Ｍｎ”、デキストランサルフェート−Ｍｇ″４、ポリエチ レングリコール、ポリエチレングリコール−ポリビニルサルフェート及び燐タン グステン酸−Ｍｇ−は、すべて、１つ以上のクラスのリポ蛋白質の選択的沈殿に 上首尾に用いられてきた。

ＨＤＬ−コレステロールの分析に有用な沈殿試薬は、当業者に公知であり、次の ものを含む：ヘパリン／　Ｍ　ｎ”　（例えば、テキサス州、Ｄａｌｌａｓ在、 ＷＡＫＯＣｈｅｍｉｃａｌｓより入手可能）　（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ等、　１９６ ０前掲書、１ｌａｒｎｉｃｋ等、１９７８、　Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ、　Ｒｅｓ、　 １９：６５．参考として本明細書中に援用する）　；燐タングステン酸／　Ｍ　 ｇ　Ｃｌ　ｇ　（例えば、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ又はＲｏｃｈｅ　Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｉｃｓから入手可能）（Ｄｒａｇｅｒ等、１９８２　Ｌａｂ、　Ｍ ｅｄ、　６：１９ｇ、参考として本明細書中に援用する、Ｂｕｒｓｔｅｉｎ等、 １９６９、Ｌｉｆｅ　Ｓｅｔ、　旦：３４５゜参考として本明細書中に援用する ）；デキストラン−３Ｏ−／　Ｍ　ｇ　Ｃ１＊　（例えば、ＤＭＡから入手可能 ）（Ｗａｒｎｉｃｋ等、１９８２、Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　２８：１３７９． 参考として本明細書中に援用する）；ヘパリン／　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　＊　／シュー クロース；　（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ、　１９６２．　Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　２２５：６０５、参考として本明細書中に援用する）；ヘパリン／Ｃａ　” 　（Ｎｏ＋ａａ等、１９７８．　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　２４：１５０．参考 として本明細書中に援用する）；ヘパリン／　Ｃａ＋″／Ｎｉ”（Ｎｏｍａ等、 １９７９、Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　２５：１４８０．　参考として本明細書中 に援用する）；或は、ポリエチレングリコール（コネチカット州、Ｍｏｎｒｏｅ 在、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ＣｈｅｍｉｃａｌｓＬｔｄ、から入手可能）　（Ｖ ｉｋａｒｉ、　１９７６、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｌａｂ。

Ｉｎｖｅｓｔ、　３６：２６５、参考として本明細書中に援用する）。

ＨＤＬのサブクラスは、互いに及び他のクラスのリボ蛋白質から分離可能であり 、ＷＭｔａｋｅｒ等、１９８６、Ｃ１１ｎ。

Ｃｈｅｌ！＋、　３２：１２７４　（参考として本明細書中に援用する）又はＧ ｉｄｅｚ等、１９８２．　Ｊ、　Ｌｉｐｉｄ、　Ｒｅｓ、　２３：１２０６　（ 参考として本明細書中に援用する）を参照されたい。

ＬＤＬ−コレステロールの分析において有用な沈殿試薬は、当業者に公知であり 、下記を含む：ヘパリン及びシトレート　（マサチューセッツ州、Ｃａｍｂｒｉ ｄｇｅ、　０ｎｅＫｅｎｄａｌｌ在、Ｇｅｎｚｙｓ＋ｅから、又は　Ｅ、　Ｍｅ ｒｃｋ、　Ａ、Ｇ。

（ドイツ国）から、ＬＤＬコレステリン　Ｃａｔ、　Ｎｏ。

１４９９２として入手可能）　（Ｗｉｅｌａｎｄ等、１９８３、Ｊ、　Ｌｉｐｉ ｄＲｅｓ、　２４：９０４．９ｊ考として援用する）　；ポリビニルサルフェー ト（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　（ＦＲＧ）からＬＤＬ−コレ ステロールＣａｔ、　Ｎｏ、　７２６２９０として入手可能）（Ａｓｓｍａｎｎ 等、　１９８４、Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｓ＋、　Ａｃｔａ　１４０ニア７　（参考 として本明細書中に援用する）　、Ｍａｉｅｒ等、１９８３、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈ ｅｗ、　２９：１１７３　（参考として本明細書中に援用する）　、Ｋｅｒｓｃ ｈｅｒ等、１９８５、Ｃｌ１ｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８：１１８　（参考として 本明細書中に援用する））；　ＰＶＳ／ＰＥＧＭＥ（ポリビニルサルフェートポ リエチレングリコールメチルエーテル）（フランス２国、Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅ ｒｅｓ在、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘより入手可能Ｃａｔ、　Ｎｏ、　６１５３２． ６９２６０）（１ｌｅｔ＋ｍｅｙｅｒ等、ＡＩｈ、　Ａｓ５ｏｃ、ｆｏｒ　Ｃｌ １ｎ、　Ｃｈｅ＋５ｉｓｔｒｙの国内会議のアブストラクト（１９８３）、ドイ ツ国、Ｔｕｔｚｉｎｇ在、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｓ、ＧｍｂＨ ，リサーチセンター）；ヘパリン／Ｃａ”／ＥＤＴＡ／リパーゼ（Ｂａｒｔｌ等 、１９８３ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅｗ、　Ａｃｔａ　１２８：１９９．参考として本 明細書中に援用する）：デキストランＳＱ、／Ｃａ”（オーストリア国、Ｖｉｅ ｎｎａ在、Ｉｍｍｕｎｏ　Ａ、Ｇ、から、Ｑｕａｎｔｏｌｉｐ　Ｌ　Ｄ　Ｌ　− コレステロールとして入手可能）　（Ｗａｌｔｏｎ等、１９６４、Ｊ。

Ｃ１１ｎ、　Ｐａｔｈ、■：６２７．参考として本明細書中に援用する、Ｃｏｒ ｎｗｅｌｌ等、　１９６１．　Ｊ、　Ｌｉｐｉｄｓ　Ｒｅｓ、　ｇ：１１０．参 考として本明細書中に援用する）；ヘパリン／レジン（Ｎｏ５ａ等、１９７８． 　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｗ、　２４：１５０４．参考として本明細書中に援用する ）。

各特異的沈殿試薬について、１つ以上の型の磁気的に反応性の粒子を広い範囲の 粒子濃度にわたって適用することが出来る（例えば、燐タングステン酸又はデキ ストランサルフェートを用いてＬＤＬ及びＶＬＤＬを沈殿させ、ＨＤＬを上清溶 液中に残すことが出来る）、これらの試薬系の何れを用いても、多（の磁気的に 反応性の粒子は、「順次的添加」モードにおいてよく働く（即ち、沈殿試薬を先 ず加え、そして、沈殿が起きた後に磁気的に反応性の粒子を加える）、幾らかは 又、「同時添加」においても申し分なく遂行される（即ち、沈殿試薬及び磁気的 粒子を同時に加える）、シかしながら、試薬は、有効な沈殿及び沈降を生じる任 意の順序で加えることが出来る。

迅速な完全な分離を達成するために必要な磁気的に反応性の粒子の濃度は、例え ば、試料中の脂質濃度によって変化する。所定の適用のための濃度は、当業者に 公知の方法により及びここに記載するような方法により決定することが出来る。

多（の場合において、試薬混合物中の磁気的に反応性の粒子の濃度は、５〜５０ 　ｍ　ｇ　／　ｍｌ（一層好ましくは、１５〜２５ｍｇ／ｍｌ）で変化するであ ろう。

沈殿試薬は、当業者に公知の方法により、磁気的に反応性の粒子の表面に結合し て、安定性、ロフト間統−性を増大し、或は一層迅速な分離を確実にすることが 出来るが、この迅速な、効率的な分離を与えるための磁気的に反応性の粒子の利 用は、通常、沈殿試薬が磁気的粒子に結合されていることを必要としない。

１：　血゛　のＨＤＬコレステロール　のにお番る　・）　に　づ　と心　に　 づく直ｌ立旦Ｉ この実施例において、この発明の磁気的粒子に基づ（分離方法を、沈殿したリボ 蛋白質を沈降させるのに遠心分離を用いる方法と比較した。すべての場合におい て、リポ蛋白質をデキストランＳ　Ｏ４／　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　ｗで沈殿させた。

磁気的粒子及び沈殿試薬を組合せて、組み合わされた磁気的粒子／沈殿試薬を形 成した。磁気的粒子を、水中の５０ｍｇ／ｍｌの粒子のスラリーとして組み合わ された試薬に加えた。１００ｍ１の組み合わされた磁気的粒子沈殿試薬は、１０ 〜５０ｍ１のスラリー、５０ｍ１のデキストランサルフェート−Ｍ　ｇ　Ｇ　１ 　＊及び（必要なら）１００ｍｌにするための水を含んだ、デキストランサルフ ェート−Ｍ　ｇ　Ｃｌ　ｍ溶液は、ＤＭＡから購入するか、市販の物質から１ｌ ａｒｎｉｃｋ等、１９８２．　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｗ。

■：１３７４の方法（参考として本明細書中に援用）に従って処方した０表２中 のデータは、ＤＭＡから得たデキストランサルフェート−Ｍ　ｇ　Ｃ１ｍを用い て得た０表２に示した磁気的分離において、Ｏ，１ｍｌの組み合わされた沈殿試 薬／磁気的粒子試薬（５０ｍｌの磁気的粒子スラリー／　１００　ｍ　ｌの組み 合わされた試薬）を、０．５０ｍ１の血清試料に加えて１０分間インキュベート した（その後の実験は、１分間のインキュベーションで十分であることを示して いる）、磁気的に沈降すべき試料を、七ロノダイアグノスチクス（Ｓｅｒｏｎｏ 　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の磁気ラック中に１〜１０分間（通常、１〜３分間 で十分である）置いた。

磁気的粒子はＣｏｒｔｅｘ　Ｂｉｏｃｈｅｓ、、　ｒｎｃ、　（カリフォルニア 州、Ｓａｎ　Ｌｅａｎｄｒｏ在）から得た。４つの型の粒子、Ｍ−１，Ｍ−２、 Ｍ−３及びＭ−４を試験した０Ｍ−１は、低密度セルロース／酸化鉄（＃ＣＭ１ ００４　）　（直径１〜１０μ）を指し；Ｍ−２は、セルロース／ｉｔ化鉄（＃ ＣＭ１００Ｏ）　（直径１〜１０μ）を指し：Ｍ−３は、ポリアクロレイン／酸 化鉄（＃ＣＭ１００１　）　（直径１〜ｌＯμ）を指し：Ｍ−４は、磁化可能な 木炭（ＩＣＭ５００２　）　（直径１〜２５μ）を指す。

遠心分離した試料について、０．０５ｍ１の沈殿試薬を０．５０ｍ１の試料に加 えて１０分間放置し、次いで、標準的な研究室用遠心分離機にて２０００ｒｐｍ で１５分間遠心した。上清中の総コレステロール（ＨＤＬコレステロールに等し い）を、標準的方法により分析し、結果をコレステロールのｍｇ／ａｔで表した 。

結果を表２に示す。

２　：　八　ｔ　１　の 信頼し得る結果のために必要とされる磁気的粒子の量は、遠心分離に基づ（アッ セイにおいて得られたＨＤＬ−コレステロール値を、種々の量のポリアクロレイ ン／酸化鉄粒子を用いて磁気的分離において得られた値と比較することにより決 定した。これらの粒子の量を、上記のように、１００ｍ１の組合せた試薬に加え るスラリーの量を変えることにより変えた。０．１０ｍ１の組合せた試薬を０． ５０ｍ１の試料に加えた。すべての他の物質及び方法は、実施例１において述べ である。結果を表３及び４に示す、これらの結果は、ＨＤＬコレステロールのｍ 　ｇ　／　ｄ　１で表しである。

３：　する　四 この実施例において、磁気に基づく分離方法を遠心分離に基づく方法と比較した ０表５において、デキストランサルフェート／　Ｍ　ｇ　Ｃ１ｍ　（ＤＭＡより 入手）を沈殿試薬として用いて磁気的分離を行なった（ＲＤＩ　ＨＤＬ−Ｍ　） 　。

磁気的に沈降させた試料に右いて、０．１０ｍ１の組合せた磁気的粒子／沈殿試 薬（２０ｍｌの磁気的粒子スラリー／　ｌ　ＯＯｍ　１の組合せた試薬）を０． ５０ｍ１の試料に加えて１０分後に磁場をかけた。総試料コレステロール及び総 試料トリグリセリドを、標準的方法により測定し、ｍｇ／ａｔで示した。すべて の他の方法及び物質は、実施例１において述べである。

Φ　ＰＩ−ＰＩ　ｈ　Ｐｌ　トＮ　―　Φ　…　・　・　Ｑ　ΦＮ　い　！　ｎ 　マ　ｎ　い　ｎ　−い　ＰＩＦＩ　哨　い　ｎ　菅い　ト　梢　■　ｒ−ｃｒ ＋　リ　ψ　寸　ω　−い　ト　啼　−門ｌ＋１　い　寸　Ｎ　給　へ　寸　ψ 　マ　Ｐｌ　ｈ　ＰＩ　マ　！　い　豐−〇　０　■　曽　ｔ＋−％Ｄ　〜　臂 　ψ　ｅｔ　ａｔ　ｌ”ｌ　Ｐ４　ト　い＾　％Ｄ　リ　臂　１”Ｉ　ＰＩ　Ｐ Ｉ　哨　膿　ＰＩ　ＰＩ　Ｍ　ψ　ｎ　ト　リＰＩＰＩＮ　ｗ　Ｌｎ（Ｔｈ？０ １６０１　ト　０％ＯＩｌ’ｌＯ１ω梢　％Ｄ　％Ｄ　サ　ｌ’ｌ　Ｆｌ　ｆ” ｌ　唖　い　ｎ　苛　啼　い　ｎ　ト　ψＮ　寸　ト　Φ　い　い　Φ　い　ψ 　Ｆｌト１−（Ｔｈ−トＩｎ１ｎｄＯＯ）ＷＦｌ？％０Ｏ１ｌ”−Ｉ　ＣＦ＋０ ｆｆｉＯ’＋Ｎ　Ｎ　へ　ヘ　−　ヘ　−〜　へ　−−Ｉ　−ヘ　ヘ　−Ｏｅ＠ 　Ｎ　ｒ’ｌ　ｗ　＋Ｊ’ｌ　％Ｏｔｚ　ω　Ｃｈ　Ｏ＋−１ｒ’ａ　ｃ”＋　 ？　ｔｎＰｉ　、４　、ｌ　Ｆ−１、ｌ　？　−？　ｖ−４１−Ｉ　Ｎ　へ　へ 　へ　ヘ　ヘ−〇　ロ　の　い　０　寸　０　寸　−リ　０　り　マ　ト　ロｔ ｏ　ｎ　ｗ　い　１　リ　ｎ　噌’　トＦ’ｌ　Ｆｌ　哨　１”ｌｆ”ｌ　り　 ０表７は、組合せた磁気的粒子／沈殿試薬の添加後、器場をかける前に、１分間 又は１０分間待つことの効果−比較している。他の条件は、表６に記載したごと きでうった。

Φ　％Ｄ　Ｎ　ｏ　へ　ｎ　ト　ロ　０　！　ψ　い　ｌ’１Ｍ　−へＭＦ　ｆ ”ｌ　Ｉ　ＦＩ　Ｐ１〜へＱ　Ｑ　ＰＩ　ｑＦ　ｔｚ　−Ｍ　Ｆｌ　＃　Ｆｌω 　ｖＤ　リ　Φ　０　〜　ψ　ト　の　肖　ト　哨　−へ　−円Ｗ　ＰＩ　？　 Ｎ　１＋ｌ　へ　Ｎ　ＦＩ　Ｍ　ｌ−’ｌ　Ｉｎ　Ｎ　ｌ”ｌ　Ｍ　ｆ　ｆｆｌ 叉」虻１−二一一　に　、の　１　に　づ　ＨＤＬ　コ　レスチロールの　アッ セイ 沈殿試薬デキストランサルフェート及びＭｇＣｌは、共に、血清中のＬＤＬ及び ＶＬＤＬを沈殿させる。このアッセイにおいて、磁気的に反応性の粒子、好まし くポリアクロレイン−鉄粒子（ポリアクロレイン：酸化鉄（Ｆｅ、０４）＝４０ 　：　６０）（直径１−１０　ｕ　）及び沈殿試薬を同時に試料に加える。沈殿 の後に、ＬＤＬ及びＶＬＤＬを、試料に磁場をかけることによりペレット化する 。ＨＤＬは上清中に残る。次いで、ＨＤＬコレステロールの量を、総コレステロ ールを測定する酵素試薬を用いてアッセイする。反応において生じた色の強度は ＨＤＬコレステロールの濃度に比例する。このアッセイを以下に詳細に述べる。

好ましい試料は、ＥＤＴＡ血漿を用いることが出来るにもかかわらず、血清であ る。血ｆｆ１（又は血清）は、種々の変化が貯蔵中に起こり得るので、採取後出 来るだけ速やかに赤血球から分離すべきである。血漿試料中のＨＤＬコレステロ ールは、４〜８℃で少な（とも４日間（−２０℃で２週間まで）安定である。

沈殿及び分画は、下記のように行なう：ａ、０．５０ｍＬの各血清試料及びコン トロールを適当に標識した試験管に分配する； ｂ、０．１０ｍＬの組合せた磁気的粒子／沈殿試薬（デキストランサルフェート （０，１ｍモル／１）、Ｍ　ｇ　Ｃｌ　ｘ　（２５０ｍモル／１））及び磁気的 に反応性の粒子（ｌｏｇ／ｌ）を試料に加え、直ちに１０秒間ポルテックスミキ サーにかける； ０．１５〜３０℃で１〜１０分間インキュベートするｄ、試験管を磁気的表面に 置いて、磁気的に反応性の粒子の沈降を達成するために約３分間待つ。試料が高 レベルのトリグリセリドを有するならば、より長い沈降時間が必要であろう（下 記参照）。任意の場合において、当業者に公知の方法によって、沈降時間を確立 することが出来る。これらのアッセイは、１０１０Ｘ７５又は１２Ｘ７５ｍｍの 丸底試験管において行なう、丸底試験管は、試料の一層大きい割合を磁気源の一 層近くに保つので、尖った試験管又はテーパー付き試験管より好ましい。これら の試験管を底に磁石を含むラック中に置（。

この発明の方法において用いるのに適した磁気ラックは５ｅｒｏｎｏ　Ｄｉａｇ ｎｏｓｔｉｃｓ　（ペンシルベニア州、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ在）　；　Ｇｅｎ− Ｐｒｏｂｅ、　Ｉｎｃ、　（カリフォルニア州、ＳａｎＤｉｅｇｏ在）　；　Ｃ ｉｂａ−Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　（マサチューセッツ州、Ｅ 、　Ｗａｌｐｏｌｅ在）　；　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎ ｃ。

（マサチューセッツ州、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ在）及びＡｍｅｒｓｈａｍＣｏｒｐ 、（イリノイ州、ＡｒｌｉＡｒｌｌｎ　Ｈｔｓ、在）から入手することが出来る 。適当なラックは、試料管の底が位置している面から０．５インチにおいて約１ ７５〜２６５ガウスの磁束密度を働かせる。

ｅ、上清溶液を分析用の第二の標識した試験管に移すことにより、コレステロー ルアッセイ用の澄んだ上清のアリコートを得る。上清中のＨＤＬコレステロール は、２〜８℃で貯蔵した場合少な（とも７２時間にわたって安定である。

ｆ、コレステロール含量を、例えば、ＤＭＡ　ＥｎｚｙｍａｔｉｃＣｈｏｌｅｓ ｔｅｒｏｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｓｅｔ　（ＤＭＡ　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　２３４０ 　）等のコレステロール同定剤を用いて測定する。測定値は、例えばＤＭＡＨＤ 　Ｌコレステロール標１！　（ＤＭＡ　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　２３３１−１５３　 ）を用いて、既知の目盛り測定器との比較によりコレステロール濃度に変換する ことが出来る。

ｇ、沈殿ステップの間の試料の希釈のために、ＨＤＬコレステロール濃度を１． ２だけ増して最終結果を得る。

期待されるＨＤＬ値は、典型的に、男性では、３０〜７０　ｍ　ｇ　／　ｄ　Ｌ の範囲にあり、女性では、３０〜８５ｍｇ／ａｔ、である。しかしながら、各研 究室は、自身の期待される値の範囲を確立すべきである。

レベルのトリグリセリドを　る・　のＨＤＬ−コレステロールの゛ 多くの沈殿試薬及び沈降方法は、沈殿及び遠心分離の後に上清が曇り又は濁って いるときに沈降のために遠心分離を用いる場合、高レベルのトリグリセリド（約 ３゜Ｏ〜５００ｍｇ／ｄｉより多い）を含む試料について用いるのに適当でない 。これらの場合、高レベルのトリグリセリドを有する試料を、沈殿の前に希釈し て誤ったコレステロール測定を避けなければならない、しかしながら、この発明 の方法は、高トリグリセリド試料は通常の試料について用いるよりも僅かに長い 沈降時間を必要とするにもかかわらず、１０００〜１３００ｍｇ／ｄｉ程の高レ ベルのトリグリセリドを有する試料について、試料を希釈することなく、用いる ことが出来る。

他の実施態様は、請求の範囲にある。

国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｗ 　８３１０−２Ｊ３３１５５３　８３１０−２Ｊ Ｉ

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中の第一のクラスのリポ蛋白質を該試料中の第二のクラスのリポ蛋白質 から分離する方法であって、該第二のクラスのリポ蛋白質を沈殿させて、該試料 を磁気的に反応性の粒子と接触させ、 そして、該試料を、該磁気的に反応性の粒子が沈降するまで磁場内に置いて該沈 殿した第二のクラスのリポ蛋白質を沈降させ、該第一のクラスのリポ蛋白質を該 試料の上清中に残す ことを含む、上記の方法。
2. ２．前記の第二のクラスのリポ蛋白質を、前記の試料を沈殿試薬に接触させるこ とにより沈殿させる、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記の沈殿試薬を、前記の試料を前記の磁気的に反応性の粒子と接触させる 前に、前記の試料と接触させる、請求項２に記載の方法。
4. ４．前記の沈殿試薬及び前記の磁気的に反応性の粒子を前記の試料に同時に接触 させる、請求項２に記載の方法。
5. ５．前記の沈殿試薬がデキストランサルフェート及びＭｇＣ１２を含む、請求項 ２に記載の方法。
6. ６．前記の沈殿試薬が燐タングステン酸及びＭｇＣ１２を含む、請求項２に記載 の方法。
7. ７．前記の磁気的に反応性の粒子がポリアクロレイン及び鉄を含む、請求項１に 記載の方法。
8. ８．前記の第一のクラスのリポ蛋白質がＨＤＬを含む、請求項１に記載の方法。
9. ９．前記の試料が１，３００ｍｇ／ｄｌまでのトリグリセリドを含む、請求項１ に記載の方法。
10. １０．試料中の第一のクラスのリポ蛋白質の一成分の量を測定する方法であって 、該試料は第一及び第二のクラスのリポ蛋白質を含み、 前記の第二のクラスのリポ蛋白質を沈殿させ、前記の試料を磁気的に反応性の粒 子と接触させ、前記の試料を、前記の磁気的に反応性の粒子が沈降するまで磁場 内に置き、それにより、前記の沈殿した第二のクラスのリポ蛋白質を沈降させ、 前記の第一のクラスのリポ蛋白質を前記の試料の上清中に残し、そして前記の第 一のクラスのリポ蛋白質中の前記の成分の量を測定する ことを含む、上記の方法。
11. １１．前記の第一のクラス中の前記の成分の量の測定を、前記の上清中に存在す る前記の成分の量を測定することにより行なう、請求項１０に記載の方法。
12. １２．前記の第一のクラス中の前記の成分の量の測定を、前記の試料中の前記の 成分の総量を測定し、前記の沈降したクラス中の前記の成分の量を測定し、そし て前記の沈降したクラス中の前記の量を前記の総量から引くことにより行なう、 請求項１０に記載の方法。
13. １３．前記の成分がコレステロールである、請求項１０に記載の方法。
14. １４．前記の第二のクラスのリポ蛋白質を、前記の試料を沈殿試薬と接触させる ことにより沈殿させる、請求項１０に記載の方法。
15. １５．前記の沈殿試薬を、前記の試料を前記の磁気的に反応性の粒子に接触させ る前に、前記の試料に接触させる、請求項１４に記載の方法。
16. １６．前記の沈殿試薬及び前記の磁気的に反応性の粒子を前記の試料に同時に接 触させる、請求項１４に記載の方法。
17. １７．前記の沈殿試薬がデキストランサルフェート及びＭｇＣ１２を含む、請求 項１４に記載の方法。
18. １８．前記の沈殿試薬が燐タングステン酸及びＭｇＣ１２を含む、請求項１４に 記載の方法。
19. １９．前記の磁気的に反応性の粒子がポリアクロレイン及び鉄を含む、請求項１ ０に記載の方法。
20. ２０．前記の第一のクラスのリポ蛋白質がＨＤＬを含む、請求項１０に記載の方 法。
21. ２１．前記の試料が１，３００ｍｇ／ｄｌまでのトリグリセリドを含む、請求項 １０に記載の方法。
22. ２２．前記の測定を、自動式装置により行なう、請求項１０に記載の方法。
23. ２３．試料中の第一のクラスのリポ蛋白質の一成分の量を測定する方法であって 、該試料は第一及び第二のクラスのリポ蛋白質を含み、 前記の第一のクラスのリポ蛋白質を沈殿させ、前記の試料を磁気的に反応性の粒 子と接触させ、前記の試料を、前記の磁気的に反応性の粒子が沈降するまで磁場 内に置き、それにより、前記の沈殿した第一のクラスのリポ蛋白質を沈降させ、 前記の第二のクラスのリポ蛋白質を前記の試料の上清中に残し、そして前記の第 一のクラスのリポ蛋白質中の前記の成分の量を測定する ことを含む、上記の方法。
24. ２４．前記の第一のクラス中の前記の成分の量の測定を、前記の沈殿した第一の クラスのリポ蛋白質中に存在する前記の成分の量を測定することにより行なう、 請求項２３に記載の方法。
25. ２５．前記の第一のクラス中の前記の成分の量の測定を、前記の試料中の前記の 成分の総量を測定し、前記の上清中の前記の成分の量を測定し、そして前記の上 清中の量を前記の総量から引くことによりおこなう、請求項２３に記載の方法。
26. ２６．前記の成分がコレステロールである、請求項２３に記載の方法。
27. ２７．前記の第一のクラスのリポ蛋白質を、前記の試料を沈殿試薬と接触させる ことにより沈殿させる、請求項２３に記載の方法。
28. ２８．前記の沈殿試薬を、前記の試料を前記の磁気的に反応性の粒子と接触させ る前に、前記の試料と接触させる、請求項２７に記載の方法。
29. ２９．前記の沈殿試薬及び磁気的に反応性の粒子を前記の試料に同時に接触させ る、請求項２７に記載の方法。
30. ３０．前記の沈殿試薬がデキストランサルフェート及びＭｇＣ１２を含む、請求 項２７に記載の方法。
31. ３１．前記の沈殿試薬がヘパリン及びシトレートを含む、請求項２７に記載の方 法。
32. ３２．前記の磁気的に反応性の粒子がポリアクロレイン及び鉄を含む、請求項２ ３に記載の方法。
33. ３３．前記の第一のクラスのリポ蛋白質がＬＤＬを含む、請求項２３に記載の方 法。
34. ３４．前記の試料が１，３００ｍｇ／ｄｌまでのトリクリセリドを含心、請求項 ２３に記載の方法。
35. ３５．前記の測定を、自動式装置により行なう、請求項２３に記載の方法。