WO2022255351A1 - 新規のコレステロール引き抜き能測定法 - Google Patents

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WO2022255351A1
WO2022255351A1 PCT/JP2022/022081 JP2022022081W WO2022255351A1 WO 2022255351 A1 WO2022255351 A1 WO 2022255351A1 JP 2022022081 W JP2022022081 W JP 2022022081W WO 2022255351 A1 WO2022255351 A1 WO 2022255351A1
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cholesterol
magnetic beads
hdl
immobilized
solution
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PCT/JP2022/022081
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龍之介 大川
優芽 陸田
優奈 堀内
貴寛 亀田
実 戸塚
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国立大学法人 東京医科歯科大学
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2446/00—Magnetic particle immunoreagent carriers
    • G01N2446/80—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids

Definitions

  • the present invention relates to a novel method for measuring cholesterol abstraction ability, and particularly to a method for measuring cholesterol abstraction ability using magnetic beads.
  • HDL-C high density lipoprotein cholesterol
  • Non-Patent Document 1 suggests that cholesterol extraction ability is useful as a biomarker independent of HDL-C concentration in cohort studies, that CEC is inversely correlated with the onset of cardiovascular events, and the like. .
  • Non-Patent Document 2 As a method for measuring the ability to extract cholesterol (CEC evaluation method), a method using cultured cells (macrophages) that have taken up cholesterol labeled with a radioactive substance or a fluorescent substance is known (Non-Patent Document 2). However, such previously reported CEC evaluation methods use cultured cells and radioactive materials, and therefore have the problem of being difficult to introduce into routine clinical examinations.
  • Non-Patent Document 3 as a CEC evaluation method that does not use radiolabeled cholesterol and cultured macrophages, a method of evaluating cholesterol uptake capacity using fluorescently labeled cholesterol and anti-apolipoprotein A1 antibody is proposed. Proposed. In this method, (i) HDL is incubated with BODIPY-labeled cholesterol, (ii) HDL containing BODIPY-labeled cholesterol is captured with a specific antibody (anti-apoA1 antibody) immobilized on a microplate, (iii) HDL Measure the fluorescence intensity of the labeled cholesterol incorporated into (Fig. 1). That is, the method of Non-Patent Document 3 is a method of evaluating the ability of HDL to take up labeled cholesterol free in solution.
  • Non-Patent Document 4 liposome-bound gel beads, in which liposomes prepared by adding a small amount of fluorescence-labeled cholesterol to lecithin and cholesterol are immobilized on gel beads, are incubated with apoB-depleted serum (BDS) as a cholesterol acceptor, and then centrifuged to bind to liposomes. Separate the gel beads and measure the fluorescence intensity in the supernatant.
  • BDS apoB-depleted serum
  • this method is a method for directly evaluating the ability of HDL to extract cholesterol.
  • the present inventors have found that this new CEC measurement method using liposome-bound gel beads (ILG) is superior to the conventional CEC evaluation method using [ 3 H]cholesterol and macrophages differentiated from THP-1 cells. It has been clarified that it shows a correlation.
  • Non-Patent Document 5 shows that apoB deleted serum (BDS), which is easy to prepare, can be evaluated as a cholesterol acceptor in a CEC measurement method using liposome-bound gel beads in the same manner as HDL. ing.
  • BDS apoB deleted serum
  • the present invention has been made in view of the above problems, and aims to provide a method for measuring the ability of HDL to extract cholesterol, which is clinically applicable and easily applied to an automatic analyzer.
  • a method for measuring the cholesterol abstraction capacity of HDL comprising: a step of preparing magnetic beads on which cholesterol is immobilized; a step of contacting the magnetic beads on which cholesterol is immobilized and an HDL-containing sample to be measured in a solution; and a step of separating the magnetic beads from the solution and measuring the amount of cholesterol in the solution after separation of the magnetic beads. including, method.
  • the step of preparing the magnetic beads on which the cholesterol is immobilized is 3.
  • the method according to aspect 1 or 2 comprising the steps of preparing liposomes containing cholesterol, and freezing and thawing a solution containing the liposomes and magnetic beads.
  • a method for measuring the cholesterol abstraction capacity of HDL comprising: A step of preparing magnetic beads on which cholesterol is immobilized by a step of preparing a liposome containing at least partially labeled cholesterol, and freezing and thawing a solution containing the liposome and porous magnetic particles.
  • a step of contacting the magnetic beads on which cholesterol is immobilized and an HDL-containing sample to be measured in a solution comprising separating magnetic beads from the solution, and measuring the amount of cholesterol in the solution after magnetic bead separation based on the labeling intensity of the solution.
  • the cholesterol-immobilized magnetic beads have storage stability represented by the fact that the labeling intensity of the suspension medium collected from the suspension of the magnetic beads does not substantially change for at least 10 days. the method of.
  • the magnetic beads are magnetic ceramic particles.
  • the HDL-containing sample to be measured is whole blood, serum, plasma, apoB-depleted serum, or a solution containing purified HDL.
  • the method is performed in a cell-free system.
  • the method has a reproducibility represented by a coefficient of variation of 10% or less for cholesterol level measurements of the same sample over at least 10 days.
  • a method for measuring the ability of HDL to extract cholesterol which is clinically applicable and easily applicable to automatic analyzers.
  • 2 is a graph showing the relationship between the amount of fluorescent liposomes immobilized on magnetic beads and the number of freezing and thawing cycles in Examples.
  • 1 is a fluorescence micrograph of magnetic beads on which fluorescent liposomes are immobilized in Examples.
  • 2 is a graph showing the immobilization efficiency of fluorescent liposomes of magnetic beads and gel beads in Examples.
  • 4 is a graph showing the relationship between the amount of cholesterol extracted from magnetic beads (fluorescence intensity) and the concentration of HDL used in Examples. 4 is a graph showing the correlation between the CEC evaluation method of the present invention and the CEC evaluation method using ILG. 4 is a graph showing the storage stability of immobilized liposome-bound magnetic beads in Examples.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of washing magnetic beads before CEC measurement and the effect of blank correction in Examples.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of a CEC linearity test using diluted HDL samples in Examples.
  • FIG. 10 is a graph showing the correlation of CEC between ILM and ILG methods with serially diluted HDL and BDS.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between CEC and HDL-C in healthy BDS by the ILM method and the correlation with the ILG method.
  • a liposome containing at least partially labeled cholesterol (hereinafter, "at least partially labeled cholesterol” may be referred to as “labeled cholesterol” or simply “cholesterol”). It is characterized by using immobilized magnetic beads.
  • labeled cholesterol is extracted from the liposomes immobilized on the magnetic beads due to the ability of HDL to extract cholesterol, and the extracted labeled cholesterol is transferred to HDL. It is taken up and moves into solution.
  • the ability of HDL to extract cholesterol can be measured by measuring the labeling intensity of the solution and measuring the concentration of labeled cholesterol incorporated into HDL in the solution.
  • centrifugation is required to separate the gel beads, making it difficult to install on an automatic analyzer.
  • the separation is more reliable in a shorter process, and since no centrifugation is required, the HDL in the solution is stably separated. It also has the advantage of being separable.
  • the method for measuring the cholesterol abstraction ability of the present embodiment unlike the CEC evaluation method using an antibody in the previous report (Non-Patent Document 3), the ability of free cholesterol in a solution to bind to HDL is evaluated. , directly assessing the ability of HDL to extract cholesterol. Therefore, the method for measuring cholesterol abstraction ability of the present embodiment is more suitable for evaluating cholesterol abstraction ability in vivo.
  • the method for measuring cholesterol abstraction ability of the present embodiment does not use an antibody, so it is low cost.
  • CEC measurement method or “CEC evaluation method”
  • cholesterol in the CEC measurement method of the present embodiment, it is preferred that at least partially labeled cholesterol is complexed with liposomes and immobilized on magnetic beads.
  • Liposomes are preferred particles for CEC measurements because they can contain labeled cholesterol and HDL can abstract cholesterol.
  • liposomes composed of phospholipids and cholesterol have a structure similar to that of cell membranes and are similar to the in vivo environment, they can more accurately reflect the extraction ability in vivo.
  • cholesterol-containing liposomes mean liposomes in which cholesterol molecules are embedded on the membrane surface or in the membrane of the liposome.
  • the liposomes in this embodiment are not particularly limited, and include small unilamellar vesicles (SUV, average particle size of 100 nm or less), large unilamellar vesicles (LUV, average particle size of 100-500 nm). , and multilamellar vesicles (MLV, average particle size 200 to 1000 nm), but the average particle size is generally 10 to 300 nm, preferably 20 to 100 nm, more preferably about 50 nm. are preferred.
  • SUV small unilamellar vesicles
  • LUV large unilamellar vesicles
  • MLV multilamellar vesicles
  • Cholesterol used in the preparation of liposomes may be cholesterol having a natural structure or one having a modified structure.
  • the cholesterol contained in the liposomes immobilized on the magnetic beads is extracted by the HDL to be measured, it moves into the solution while being incorporated into the HDL.
  • the ability of HDL to extract cholesterol is measured by measuring the amount (concentration) of cholesterol in a solution after separation of magnetic beads (in this specification, the solution after separation of magnetic beads is sometimes referred to as "supernatant"). can be evaluated by Therefore, in the measurement method of this embodiment, at least partially labeled cholesterol is used to measure the cholesterol concentration in the supernatant.
  • Methods for labeling cholesterol include, but are not limited to, fluorescent substances, chromogenic substances, luminescent substances, radioactive substances, and stable isotopes. is preferred, and a fluorescent substance is more preferred.
  • the labeled cholesterol a commercially available one may be used as appropriate.
  • the phospholipid used for preparing liposomes is not particularly limited, but one or more of various phospholipids such as egg yolk lecithin, soybean lecithin, and hydrogenated soybean lecithin can be used.
  • the method for producing the cholesterol-containing liposome is not particularly limited, and it can be produced by a known production method using one or more phospholipids and at least partially labeled cholesterol.
  • Examples of methods for preparing cholesterol-containing liposomes include those described in Yoshimoto et al., Biotechnol. Prog. 2006, 22, 459-464.
  • the ratio of cholesterol and phospholipid can be selected as appropriate. ratio).
  • the magnetic beads used in the CEC measurement method of the present embodiment are not particularly limited as long as they can immobilize the above-described cholesterol-containing liposomes. , composite particles of a magnetic material, an organic polymer compound, an inorganic compound, a biopolymer, and the like.
  • Magnetic materials constituting magnetic beads or contained in magnetic beads include iron oxide (Fe 3 O 4 , ⁇ -Fe 2 O 3 ), various ferrites (magnetic ceramics), iron, manganese, nickel, cobalt, chromium, and the like. metals and alloys thereof.
  • composite particles containing a magnetic material include, for example, particles of an organic polymer compound in which a magnetic material is dispersed, or a core (core portion) made of or containing a magnetic material and an organic polymer compound or an inorganic compound. and particles having a shell (film) of
  • the shape of the magnetic beads is not particularly limited, and may be spherical, substantially spherical, flattened spherical, amorphous, etc., but spherical or substantially spherical is preferable from the viewpoint of dispersibility.
  • the size of the magnetic beads is also not particularly limited, but can be, for example, 5 to 400 ⁇ m, preferably 10 to 200 ⁇ m, more preferably 20 to 100 ⁇ m.
  • the magnetic beads are preferably porous magnetic particles.
  • the porous magnetic particles can be freeze-thawed so that cholesterol can be efficiently immobilized in a simple manner.
  • the pore size of the porous magnetic particles can be appropriately selected according to the size of the liposomes to be immobilized. , and more preferably 1 ⁇ m or less. When the pore diameter (minor diameter) of the porous magnetic beads is 100 nm or more, the liposomes can easily enter the pores. It can be immobilized efficiently.
  • magnétique porous particles include, but are not limited to, magnetic ceramics (ferrite) particles, and composite particles such as magnetic silica in which a magnetic material is coated with a porous substance such as silica.
  • ferrite magnetic ceramics
  • composite particles such as magnetic silica in which a magnetic material is coated with a porous substance such as silica.
  • Magnetic beads include magnetic beads that have a surface structure that allows liposomes to bind.
  • the method for immobilizing cholesterol-containing liposomes on magnetic beads is not particularly limited, and can be appropriately selected in consideration of the type of magnetic beads.
  • liposomes are brought into contact with magnetic beads having a surface structure to which liposomes easily bind in an appropriate medium such as an aqueous medium, and the liposomes are adsorbed to the magnetic beads.
  • the inventors when the above-described porous magnetic particles are used as magnetic beads, the inventors have found that the liposomes containing cholesterol can be magnetically treated by a simple method of repeating freeze-thaw cycles of a solution containing the liposomes containing cholesterol and the magnetic beads. We have found that it can be efficiently immobilized on beads.
  • magnetic beads are dispersed and mixed in a liposome suspension containing cholesterol, and the mixture is heated at 10 to 50° C., preferably room temperature (20 to 30° C.) for 5 minutes to 16 hours, preferably 10 minutes to 2 hours. Allow time to stand or stir to react.
  • a medium for the liposome suspension hereinafter also referred to as "suspension medium"
  • an aqueous medium such as water, physiological saline, and various buffer solutions can be used.
  • the reaction solution is subjected to a freeze-thaw cycle, for example, a freeze-thaw cycle of freezing (eg, ⁇ 60° C.
  • thawing eg, water bath/room temperature 3 times or more, preferably 5 times or more, and 20 times or less, preferably is repeated 15 times or less to immobilize liposomes on magnetic beads.
  • thawing eg, water bath/room temperature 3 times or more, preferably 5 times or more, and 20 times or less, preferably is repeated 15 times or less to immobilize liposomes on magnetic beads.
  • the reason why cholesterol-containing liposomes can be efficiently immobilized on magnetic beads by such a process is that porous magnetic beads having an appropriate pore size are mixed and reacted with a cholesterol-containing liposome suspension. When the liposomes enter the pores of the porous magnetic beads and are repeatedly frozen and thawed in this state, the liposomes increase in size and become clogged in the pores. It is considered possible.
  • the ratio of the cholesterol-containing liposomes to the magnetic beads is 20:1 to 20:20, preferably 10:1 to 10:6, more preferably 7:2 to 20:20 for the cholesterol-containing liposome suspension:magnetic beads. It can be in the range of 7:3 (mL:g).
  • the liposome (phospholipid and cholesterol) content: magnetic beads is 1:50 to 1:1000, preferably 1:100 to 1:500, more preferably 1:150 to 1:300 (g:g). can be a range. With such a range, it is possible to analyze the solution after separation from the magnetic beads, that is, to evaluate the ability of the HDL-containing sample to extract cholesterol. Note that the above ratio may be appropriately changed in consideration of the phospholipid used in the liposome, the type of magnetic beads, and the like.
  • Magnetic beads (hereinafter also referred to as "ILM: immobilized liposome-bound magnetic beads") on which cholesterol-containing liposomes prepared in this manner are immobilized can be stored in a suspension state after purification.
  • the suspension medium for the ILM suspension the same medium as the medium for the liposome suspension described above can be used.
  • the magnetic beads on which cholesterol-containing liposomes thus prepared are immobilized are stable in a cool and dark place (usually at 4° C. or below, and in some cases preferably under light shielding), and are suitable for use in routine clinical examinations. ing.
  • the storage stability of magnetic beads on which cholesterol-containing liposomes are immobilized can be evaluated by the change in labeling substance intensity in the suspension medium (for example, the supernatant) of the ILM suspension. For example, if the storage stability of the ILM is good, the amount of labeling substance (eg, fluorescently labeled cholesterol) liberated from the magnetic beads into the suspension medium during storage is small.
  • the suspension medium taken from the ILM suspension for at least 10 days, preferably at least 20 days, more preferably at least 30 days, even more preferably at least 40 days under desired storage conditions (e.g. 4° C.) labeling intensity (eg fluorescence intensity) does not significantly increase (substantially does not change).
  • desired storage conditions e.g. 4° C.
  • labeling intensity eg fluorescence intensity
  • the magnetic beads on which cholesterol-containing liposomes are immobilized are sometimes simply referred to as "magnetic beads on which cholesterol is immobilized.”
  • Cholesterol is extracted from the liposomes immobilized on the magnetic beads by bringing the magnetic beads prepared as described above onto which the cholesterol-containing liposomes are immobilized are brought into contact with the HDL-containing sample to be measured in a solution.
  • the HDL-containing sample to be measured in the measurement method of the present embodiment is derived from mammals (e.g., humans, bovines, pigs, horses, dogs, cats, sheep, goats, rabbits, hamsters, guinea pigs, mice, rats, etc.), A human-derived isolated HDL-containing sample is preferred.
  • blood samples such as whole blood, serum, and plasma, apoB-deleted serum (BDS), purified HDL, and the like can be used.
  • HDL can be classified into a plurality of subclasses according to size, density, charge, composition of apolipoproteins, etc., but the measurement method of the present embodiment can be used for subclasses of HDL (HDL 2 , HDL 3 , apoE-containing HDL , homocysteine-modified HDL, etc.). Purified HDL and its subfractions can be purified using known methods such as ultracentrifugation.
  • ApoB deleted serum is obtained by removing the lipoprotein fraction containing apolipoprotein B (apoB) by polyethylene glycol (PEG) precipitation.
  • ApoB-depleted serum has been reported in the present inventors' previous report (Non-Patent Document 5) to be correlated with CEC of purified HDL, and is easier to prepare than purified HDL, so it is suitable as a test sample for clinical examination. can be used for
  • the HDL-containing sample to be measured the above-mentioned blood sample, apoB-depleted serum (BDS), or purified HDL diluted with an aqueous medium can be used.
  • Aqueous media include water, physiological saline, various buffers (phosphate buffered saline (PBS), Tris-HCl, etc.), and the like.
  • the concentration of the HDL-containing sample can be appropriately selected in consideration of the type of sample, the scale of the reaction system, etc.
  • the final total cholesterol concentration is 0.1 to 100 mg/dL, preferably 1 to 50 mg/dL.
  • BDS can be adjusted to a final serum concentration of 0.1-10%, preferably 1-5%.
  • the reaction between the cholesterol-immobilized magnetic beads and the HDL-containing sample to be measured is, for example, 0 to 50°C, preferably 10 to 40°C, more preferably room temperature (20 to 30°C), for 1 to 72 hours. , preferably 4-48 hours, more preferably 8-24 hours. From the viewpoint of shortening the measurement time, the reaction time may be 1 to 16 hours, preferably 1 to 8 hours, more preferably 2 to 4 hours. During this time, the reaction solution may be left still, or may be stirred or shaken.
  • the magnetic beads on which cholesterol is immobilized may be washed before the CEC measurement.
  • the washing operation can be performed by recovering the ILM from the ILM suspension by centrifugation or using a magnet or the like, and resuspending the recovered ILM in a desired volume of the suspension medium.
  • blank correction may be performed instead of the washing operation, as shown in the examples below. By performing blank correction, it is possible to perform CEC measurement with the same accuracy as when cleaning operation is performed without performing cleaning operation.
  • CEC is measured using a dilution medium (for example, the above aqueous medium) of the HDL-containing sample as a blank sample, and the value is can be performed by subtracting a blank from the CEC measurement value of .
  • a dilution medium for example, the above aqueous medium
  • centrifugal separation operation may be performed in addition to separation by magnetic force such as a magnet, or in some cases instead of separation by magnetic force.
  • the gel beads used in the ILG method have a problem that light gel beads tend to scatter when recovering the supernatant after centrifugation and are affected by error, but the magnetic beads (ILM) of this embodiment are: It can be easily separated using a magnet, and because it is heavy and can be strongly attracted by a magnet, it does not fly around like gel beads, making it easier to process and more accurate measurement is possible. There are advantages.
  • the cholesterol concentration in the supernatant obtained by separating the magnetic beads is measured.
  • the cholesterol concentration in the supernatant can be determined by measuring the signal derived from the cholesterol labeling substance in the supernatant by a method according to the type of labeling.
  • Cholesterol abstraction ability is obtained by determining the amount of cholesterol extracted from the measured cholesterol concentration in the supernatant and converting it to per unit amount of HDL (per 20 mg HDL protein/mL or per 1 mg HDL-C/dL). can be quantified (HDL-to-HDL comparison).
  • HDL-to-HDL comparison by using a specific reference serum or apoB-depleted serum (BDS) sample as a reference sample, the CEC represented by the amount of cholesterol extracted by HDL is normalized and/or the influence of the difference between lots of magnetic beads can also be excluded.
  • CEC In the CEC measurement method using ILM of the present embodiment, linearity is recognized in a wide HDL concentration range, and highly accurate CEC measurement can be performed, as shown in Examples below.
  • CEC can be measured in a concentration range of 50 to 200 mg/dL, preferably 30 to 220 mg/dL, in terms of the serum HDL cholesterol concentration of the subject. Sufficient measurement is possible.
  • the CEC measurement method using the ILM of this embodiment has high reproducibility as shown in Examples below.
  • the coefficient of variation (CV%) of the CEC measurement value of at least 10 replicate measurements, preferably at least 20 replicate measurements of the same sample on the same day is 10% or less, preferably 7% or less. be.
  • the coefficient of variation (CV%) of the CEC measurement values of the same sample over at least 10 days, preferably at least 20 days is 10% or less.
  • the CEC measurement method of the present embodiment can perform CEC measurement with high reproducibility as compared with the conventional cell method.
  • the CEC measurement method of the present embodiment can accurately evaluate differences in the ability of HDL to extract cholesterol. Therefore, in one aspect of the present invention, the results of the CEC measurement method of the present embodiment can be used to obtain information on a condition related to the ability of a subject to extract cholesterol or the risk thereof. In addition, by comparing and/or accumulating data obtained from HDL-containing samples (apoB-depleted serum (BDS) samples, purified HDL samples, etc.) of healthy subjects and patients, conditions related to cholesterol abstraction ability or risks thereof can be obtained.
  • HDL-containing samples apoB-depleted serum (BDS) samples, purified HDL samples, etc.
  • Conditions related to cholesterol efflux include dyslipidemia, atherosclerosis, familial cholesterolemia, inflammatory diseases (particularly inflammatory diseases associated with decreased cholesterol efflux, etc.), diabetes, and heart disease. Examples include the risk of developing a vascular disease event.
  • the measurement method of this embodiment is an in vitro method that can be performed in a cell-free system.
  • one aspect of the present invention relates to a test method for evaluating the ability of HDL to extract cholesterol using magnetic beads on which cholesterol is immobilized.
  • one aspect of the present invention relates to a test method for evaluating the ability of HDL to extract cholesterol using magnetic beads on which cholesterol is immobilized.
  • one aspect of the present invention relates to a reagent kit for measuring cholesterol withdrawal ability used in the method for measuring CEC of the present embodiment.
  • the CEC measurement reagent kit of the present embodiment includes at least magnetic beads on which cholesterol is immobilized, or magnetic beads for use in producing magnetic beads on which cholesterol is immobilized.
  • the reagent kit for measuring CEC of the present embodiment further includes cholesterol for use in producing magnetic beads on which cholesterol is immobilized, various reagents for use in preparing an HDL-containing sample, and magnetic beads on which cholesterol is immobilized.
  • Arbitrary reagents used in the CEC measurement method of the present embodiment such as a medium for reaction with an HDL-containing sample, various reagents for use in measuring the amount of labeled cholesterol, and storage and reaction of these reagents It can include containers and the like.
  • One aspect of the present invention further provides a method for measuring CEC, a test method for evaluating CEC, a test method for evaluating CEC, and in manufacturing a reagent kit for CEC measurement. Regarding the use of beads.
  • a reagent containing magnetic beads on which cholesterol is immobilized A simple process of contacting the HDL-containing sample of interest under desired conditions, separating the magnetic beads, and measuring the cholesterol concentration in the supernatant, that is, the magnetic beads in the separated solution, in a cell-free system. , the cholesterol efflux capacity of HDL can be assessed and/or information can be obtained regarding a condition or risk associated with cholesterol efflux capacity in a subject.
  • the method for measuring CEC, the test method for evaluating CEC, the test method for evaluating CEC, and the reagent kit for measuring CEC according to the present invention can be easily applied to automatic analyzers, and can be used in daily clinical practice. Suitable for inspection applications.
  • Preparation Example 1 Preparation of immobilized liposome-bound beads
  • Egg lecithin (10.6 mg) and cholesterol (2.3 mg) were dissolved in 6 mL of chloroform, and 30 ⁇ L of 0.5 mM fluorescence-labeled cholesterol (4,4-difluoro-4-bora-3a , 4a-s-indacene-labeled cholesterol, Avanti Polar Lipids) was added to the solution.
  • the lipid film formed under nitrogen gas was dissolved in ether and the solvent was removed by evaporation.
  • the lipid film was completely dried under nitrogen gas and suspended in 7 mL of 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) containing 150 mM NaCl and 1 mM EDTA-2Na (Buffer A). (liposome suspension).
  • 2 g of magnetic beads core-shell ferrite powder, MTFH-35, POWDERTECH, particle size: 40.2 ⁇ m, pore size: 0.8 ⁇ m
  • the mixture was subjected to 3, 5, 7, and 9 cycles of freezing ( ⁇ 80° C.) and thawing (room temperature, water) repeatedly to induce immobilization of the liposomes into the beads.
  • the bead suspension was stored in the dark at 4°C.
  • CEC cholesterol efflux capacity
  • 150 ⁇ L of diluted HDL (measurement sample) or BDS (reference sample) was added to Comparative Preparation Example 1), and the final total cholesterol concentration was 4-15 mg/dL (for HDL) and the final serum concentration was 2% ( for BDS).
  • the solid-phase liposome-bound magnetic beads were separated from the reaction solution using a magnet, and the solid-phase liposome-bound gel beads were separated from the reaction solution using centrifugation. Fluorescence intensity (Ex: 485 nm, Em: 538 nm) of 75 ⁇ L was measured.
  • the CEC measurement was performed in the same manner as in the present example also in the examples after (4).
  • FIG. 3 shows the result of comparing the liposome immobilization efficiency between the magnetic beads of the present invention and the conventional gel beads.
  • M is the amount of immobilized liposome-bound magnetic beads prepared in the same manner as in Preparation Example 1 (freezing and thawing 5 times) (2 times (3 tubes each time, 6 tubes in total)).
  • IDG is the amount of immobilized liposome-bound gel beads prepared in the same manner as in Comparative Preparation Example 1 (freezing and thawing 7 times) (2 times (2 tubes each time, 4 tubes in total)). average). It was confirmed that liposomes could be immobilized on magnetic beads with an efficiency equal to or higher than that of gel beads.
  • ILM Immobilized Liposome-Binding Magnetic Beads
  • the CEC evaluation method of the present invention using magnetic beads with immobilized cholesterol shows a high correlation with the conventional CEC evaluation method, and is a simple process that does not use cultured cells or centrifugation. Since CEC can be evaluated, it was shown that automation is easy and that it can be easily applied to routine clinical examinations.

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Abstract

本発明は、新規なコレステロール引き抜き能測定法を提供する。本発明によれば、ＨＤＬのコレステロール引き抜き能を測定する方法であって、コレステロールを固相化した磁気ビーズを用意する工程、前記コレステロールを固相化した磁気ビーズと測定対象のＨＤＬ含有試料とを溶液中で接触させる工程、及び前記溶液から磁気ビーズを分離し、磁気ビーズ分離後の溶液中のコレステロール量を測定する工程を含む、方法が提供される。

Description

新規のコレステロール引き抜き能測定法
　本発明は、新規のコレステロール引き抜き能の測定法に関し、特には、磁性ビーズを用いたコレステロール引き抜き能測定法に関する。
　現在、脂質異常症の指標として、高比重リポタンパクコレステロール（ｈｉｇｈ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：ＨＤＬ－Ｃ）濃度の測定が広く行われている。しかしながら、ＨＤＬは、構造、組成、生物学的活性などの点で不均一な粒子であり、ＨＤＬの総量をコレステロール定量で評価する方法では、一部の患者でしか正確な脂質異常の状態を反映できないという問題があった。
　近年、ＨＤＬの量に加えて質（機能）を評価する研究が世界で注目を集めている。例えば、ＨＤＬの代表的な機能として、動脈内皮下に粥状硬化層を形成する泡沫細胞に過剰蓄積されたコレステロールを肝臓に運ぶコレステロール逆転送系（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ：ＲＣＴ）があるが、このコレステロール逆輸送系の主要ステップであるＨＤＬがマクロファージからコレステロールを引き抜く能力として、コレステロール引き抜き能（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ　ｅｆｆｌｕｘ　ｃａｐａｃｉｔｙ：ＣＥＣ）を評価することが提唱されている。例えば、非特許文献１では、コホート研究において、コレステロール引き抜き能がＨＤＬ－Ｃ濃度とは独立したバイオマーカーとして有用であること、ＣＥＣが心血管イベントの発症に逆相関すること等が示唆されている。
　コレステロール引き抜き能の測定方法（ＣＥＣ評価法）としては、放射性物質又は蛍光物質で標識したコレステロールを取り込ませた培養細胞（マクロファージ）を用いる方法等が知られている（非特許文献２）。しかし、このような既報のＣＥＣ評価法は、培養細胞や放射性物質を用いるため、臨床における日常検査への導入が難しいという問題がある。
　これに対して、非特許文献３では、放射線標識コレステロールと培養マクロファージを用いないＣＥＣ評価法として、蛍光標識コレステロールと抗アポリポタンパク質Ａ１抗体を用いて、コレステロール取り込み能（ｕｐｔａｋｅ　ｃａｐａｃｉｔｙ）を評価する方法が提案されている。この方法では、（ｉ）ＨＤＬをＢＯＤＩＰＹ標識コレステロールとインキュベートし、（ｉｉ）ＢＯＤＩＰＹ標識コレステロールを含んだＨＤＬを、マイクロプレート上に固定した特異的抗体（抗ａｐｏＡ１抗体）で捕捉し、（ｉｉｉ）ＨＤＬに取り込まれた標識コレステロールの蛍光強度を測定する（Ｆｉｇ．１）。すなわち、非特許文献３の方法は、ＨＤＬが、溶液中に遊離している標識コレステロールを取り込む能力を評価する方法である。
　一方、本発明者らは、従来のＣＥＣ評価法で用いられる放射性物質や培養細胞を用いない新たなＣＥＣ測定法として、リポソーム結合ゲルビーズ（ＩＬＧ：ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｂｏｕｎｄ　ｇｅｌ　ｂｅａｄｓ）を用いた方法を開発している（非特許文献４）。この方法では、レシチン及びコレステロールに微量の蛍光標識コレステロールを加えて作製したリポソームをゲルビーズに固定化したリポソーム結合ゲルビーズを、コレステロールアクセプターとしてのａｐｏＢ除去血清（ＢＤＳ）とインキュベート後、遠心操作によりリポソーム結合ゲルビーズを分離し、上清中の蛍光強度を測定する。すなわち、この方法は、ＨＤＬのコレステロール引き抜き能を直接評価する方法である。本発明者らは、このリポソーム結合ゲルビーズ（ＩＬＧ）を用いた新たなＣＥＣ測定法が、［３Ｈ］コレステロールとＴＨＰ－１細胞から分化させたマクロファージとを用いた従来のＣＥＣ評価法と良好な相関性を示すことを明らかにしている。また、非特許文献５では、リポソーム結合ゲルビーズを用いたＣＥＣ測定法におけるコレステロールアクセプターとして、作製の簡便なａｐｏＢ除去血清（ａｐｏＢ　ｄｅｌｅｔｅｄ　ｓｅｒｕｍ：ＢＤＳ）がＨＤＬと同様に評価可能であることが示されている。
Rohatgi A et al.  HDL cholesterol efflux capacity and incident cardiovascular events.  N Engl J Med. 2014;371(25):2383-93. Sankaranarayanan et al.  J Lipid Res, 2011;52:2332-40 A. Harada et al.  Cholesterol uptake capacity: A new measure of hdl functionality for coronary risk assessment.  J. Appl. Lab. Med. 2017;2(2):186-200 Horiuchi Y et al.  Validation and application of a novel cholesterol efflux assay using immobilized liposomes as a substitute for cultures cells.  Biosci Rep. 2018;38(2): BSR20180144 Horiuchi Y et al.  Usefulness of apolipoprotein B-depleted serum in cholesterol efflux capacity assay using immobilized liposome-bound gel beads.  Biosci Rep. 2019;39(4): BSR20190213
　しかしながら、リポソーム結合ゲルビーズ（ＩＬＧ）を用いたＣＥＣ評価法では、ゲルビーズを遠心操作により分離する必要があるため、サンプル採取から測定までの全自動化は困難であり、自動化（自動分析装置への搭載）にはさらなる開発が必要であるという課題があった。
　本発明は上記の課題を鑑みてなされたものであり、臨床応用が可能で、自動分析装置への適用が容易なＨＤＬのコレステロール引き抜き能測定方法を提供することを目的とする。
　本発明は、以下の事項に関する。
［１］
　ＨＤＬのコレステロール引き抜き能を測定する方法であって、
　コレステロールを固相化した磁気ビーズを用意する工程、
　前記コレステロールを固相化した磁気ビーズと測定対象のＨＤＬ含有試料とを溶液中で接触させる工程、及び
　前記溶液から磁気ビーズを分離し、磁気ビーズ分離後の溶液中のコレステロール量を測定する工程
を含む、方法。
［２］
　磁気ビーズが多孔質磁気粒子である、態様１に記載の方法。
［３］
　前記コレステロールを固相化した磁気ビーズを用意する工程が、
コレステロールを含むリポソームを調製する工程、及び
前記リポソームと磁気ビーズとを含む溶液を凍結融解させる工程
を含む、態様１又は２に記載の方法。
［４］
　磁気ビーズに固相化されたコレステロールの少なくとも一部が蛍光標識されている、態様１～３のいずれかに記載の方法。
［５］
　ＨＤＬのコレステロール引き抜き能を測定する方法であって、
　少なくとも一部が標識されたコレステロールを含むリポソームを調製する工程、及び
　前記リポソームと多孔質磁気粒子とを含む溶液を凍結融解させる工程
を含む工程により、コレステロールを固相化した磁気ビーズを用意する工程と、
　前記コレステロールを固相化した磁気ビーズと測定対象のＨＤＬ含有試料とを溶液中で接触させる工程と、
　前記溶液から磁気ビーズを分離し、磁気ビーズ分離後の溶液中のコレステロール量を、溶液の標識強度に基づき測定する工程と
を含む、態様１～４のいずれかに記載の方法。
［６］
　コレステロールを固相化した磁気ビーズが、該磁気ビーズの懸濁液から採取した懸濁媒体の標識強度が少なくとも１０日間実質的に変化しないことによって表される保存安定性を有する、態様５に記載の方法。
［７］
　磁気ビーズが磁性セラミックス粒子である、態様１～６のいずれかに記載の方法。
［８］
　溶液から磁気ビーズを分離する工程が、遠心分離操作を含まない、態様１～７のいずれかに記載の方法。
［９］
　測定対象のＨＤＬ含有試料のコレステロール量測定値から、ブランク試料のコレステロール量測定値を差し引くことで、ブランク補正を行う工程をさらに含む、態様１～８のいずれかに記載の方法。
［１０］
　コレステロールを固相化した磁気ビーズと測定対象のＨＤＬ含有試料とを溶液中で接触させる工程の前に、コレステロールを固相化した磁気ビーズを洗浄する工程を含まない、態様９に記載の方法。
［１１］
　測定対象のＨＤＬ含有試料が、全血、血清、血漿、ａｐｏＢ除去血清、又は精製ＨＤＬを含む溶液である、態様１～１０のいずれかに記載の方法。
［１２］
　無細胞系で実施される、態様１～１１のいずれかに記載の方法。
［１３］
　同一サンプルの少なくとも１０日間にわたるコレステロール量測定値の変動係数が１０％以下であることによって表される再現性を有する、態様１～１２のいずれかに記載の方法。
［１４］
　コレステロールを固相化した磁気ビーズを含む、ＨＤＬのコレステロール引き抜き能測定用試薬キット。
［１５］
　コレステロールを固相化した磁気ビーズを用いて、被験者由来のＨＤＬ含有試料のコレステロール引き抜き能を測定する工程を含む、被験者のコレステロール引き抜き能に関連する状態又はそのリスクに関する情報を取得する方法。
　本発明によれば、臨床応用が可能で、自動分析装置への適用が容易なＨＤＬのコレステロール引き抜き能測定方法が提供される。
実施例における、磁気ビーズへの蛍光リポソームの固相化量と凍結融解回数との関係を表すグラフである。 実施例における、蛍光リポソームを固相化した磁気ビーズの蛍光顕微鏡写真である。 実施例における、磁気ビーズとゲルビーズの蛍光リポソームの固相化効率を表すグラフである。 実施例における、磁気ビーズから引き抜かれたコレステロール量（蛍光強度）と、用いたＨＤＬ濃度との関係を示すグラフである。 本発明のＣＥＣ評価法とＩＬＧを用いたＣＥＣ評価法との相関を示すグラフである。 実施例における、固相化リポソーム結合磁気ビーズの保存安定性を示すグラフである。 実施例における、ＣＥＣ測定前の磁気ビーズの洗浄効果およびブランク補正の効果を示すグラフである。 実施例における、希釈したＨＤＬ検体を用いたＣＥＣの直線性試験の結果を示すグラフである。 段階希釈したＨＤＬおよびＢＤＳによるＩＬＭ法とＩＬＧ法のＣＥＣの相関性を示すグラフである。 ＩＬＭ法による健常者ＢＤＳ中のＣＥＣとＨＤＬ－Ｃの関係、およびＩＬＧ法との相関性を示すグラフである。
　本実施形態のＨＤＬのコレステロール取り込み能の測定方法について説明する。
　本実施形態の測定方法では、少なくとも一部が標識されたコレステロール（以下、「少なくとも一部が標識されたコレステロール」を「標識コレステロール」又は単に「コレステロール」と記載することもある）を含むリポソームを固相化した磁気ビーズを用いることを特徴とする。この磁気ビーズに測定対象のＨＤＬ含有試料を溶液中で接触させると、ＨＤＬのコレステロール引き抜き能により、磁気ビーズに固相化されたリポソームから標識コレステロールが引き抜かれ、引き抜かれた標識コレステロールは、ＨＤＬに取り込まれ、溶液中に移動する。したがって、溶液の標識強度を測定して、溶液中のＨＤＬに取り込まれた標識コレステロール濃度を測定することで、ＨＤＬのコレステロール引き抜き能を測定することができる。
　ここで、溶液中の標識コレステロール量を測定するためには、溶液中の磁気ビーズを分離する必要がある。コレステロールの固相化にゲルビーズ（ＩＬＧ）を用いていた既報（非特許文献４、５）のＣＥＣ評価法では、ゲルビーズを分離するために遠心操作が必要であり、自動分析装置への搭載が困難であるという課題があった。一方、本実施形態の方法では、マグネットなどの磁力を用いて磁気ビーズを分離可能であるため、磁気ビーズを操作可能な分析装置を用いれば自動化が容易であり、臨床における日常検査への導入に適している。
　また、磁気ビーズを磁気で分離する場合、ゲルビーズを遠心分離で分離する場合にくらべて、より短時間の工程で、より確実に分離できるとともに、遠心操作が必要ないので溶液中のＨＤＬから安定に分離できるというメリットもある。
　また、本実施形態のコレステロール引き抜き能の測定方法では、既報（非特許文献３）の抗体を用いたＣＥＣ評価法のように、溶液中の遊離コレステロールのＨＤＬへの結合能を評価するのではなく、ＨＤＬによるコレステロールの引き抜き能を直接評価している。このため、本実施形態のコレステロール引き抜き能の測定方法は、生体内におけるコレステロール引き抜き能の評価により適している。
　また、本実施形態のコレステロール引き抜き能の測定方法は、抗体を用いないため、低コストである。
　本実施形態のコレステロール引き抜き能の測定方法（以下、「ＣＥＣ測定方法」又は「ＣＥＣ評価法」とも記載する）の各工程について、以下により詳細に説明する。
＜コレステロールを固相化した磁気ビーズを用意する工程＞
　本実施形態のＣＥＣ測定方法では、まず、コレステロールを固相化した磁気ビーズを用意する。
（コレステロール）
　本実施形態のＣＥＣ測定方法では、少なくとも一部が標識されたコレステロールをリポソームに複合化して、磁性ビーズに固相化することが好ましい。
　リポソームは、標識コレステロールを含ませることができ、かつＨＤＬがコレステロールを引き抜くことが可能であるため、ＣＥＣ測定に好適な粒子である。また、リン脂質とコレステロールからなるリポソームは細胞膜の構造に近く、生体内の環境に類似しているため、生体内における引き抜き能をより正確に反映することができる。
　また、一実施形態では、コレステロールをリポソームに含有させることで、後述するように、凍結融解などの簡便な方法でコレステロールを磁気ビーズに効率的に固相化することができるという利点もある。
　なお、本明細書において、コレステロールを含むリポソームとは、コレステロール分子がリポソームの膜表面又は膜中に包埋されたリポソームを意味する。
　本実施形態におけるリポソームとしては特に限定されず、小さい一枚膜リポソーム（ｓｍａｌｌ　ｕｎｉｌａｍｅｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ：ＳＵＶ、平均粒径１００ｎｍ以下）、大きな一枚膜リポソーム（ｌａｒｇｅ　ｕｎｉｌａｍｅｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ：ＬＵＶ、平均粒径１００－５００ｎｍ）、及び多重層リポソーム（ｍｕｌｔｉ　ｌａｍｅｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ：ＭＬＶ、平均粒径２００～１０００ｎｍ）のいずれでもあってもよいが、平均粒径が、一般には１０～３００ｎｍ、好ましくは２０～１００ｎｍ、より好ましくは５０ｎｍ程度のリポソームが好ましい。
　リポソームの調製に用いるコレステロールは、天然の構造を有するコレステロールでもよいし、修飾された構造を有するものであってもよい。
　磁気ビーズに固相化されたリポソームに包含されたコレステロールは、測定対象のＨＤＬに引き抜かれると、ＨＤＬに取り込まれた状態で溶液中に移動することとなる。ＨＤＬのコレステロール引き抜き能は、磁気ビーズを分離後の溶液（本明細書では、磁気ビーズを分離後の溶液を「上清」と記載することもある。）中のコレステロール量（濃度）を測定することで評価することができる。したがって、本実施形態の測定方法では、上清中のコレステロール濃度の測定のために、少なくとも一部が標識されたコレステロールを用いる。
　コレステロールの標識方法としては、特に限定されないが、蛍光物質、発色物質、発光物質、放射線物質、安定同位体などが挙げられるが、日常検査への導入の観点では、蛍光物質、発色物質、発光物質が好ましく、蛍光物質がより好ましい。
　標識コレステロールとして、市販のものを適宜利用してもよい。
　リポソームの調製に用いるリン脂質としては、特に限定されないが、卵黄レシチン、大豆レシチン、水添大豆レシチン等の各種リン脂質の１又は２種以上を用いることができる。
　コレステロールを含むリポソームの製造方法は特に制限されず、１種以上のリン脂質及び少なくとも一部が標識されているコレステロールを用いて、公知の製造方法によって製造することができる。
　コレステロールを含有させたリポソームの調製方法の例としては、例えば、Yoshimoto et al., Biotechnol. Prog. 2006, 22, 459-464に記載の方法が挙げられる。
　コレステロールとリン脂質との比率は適宜選択できるが、例えば、リン脂質：コレステロール＝５０：１～１：２、好ましくは２０：１～１：１、より好ましくは１０：１～２：１（重量比）とすることができる。
（磁気ビーズ）
　本実施形態のＣＥＣ測定方法で用いる磁気ビーズは、上述のコレステロールを含むリポソームを固相化し得るものであれば特に限定されず、例えば、磁性材料からなる粒子の他、磁性材料を含む粒子、例えば、磁性材料と、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子等との複合粒子等が挙げられる。
　磁気ビーズを構成する、又は磁気ビーズに含まれる磁性材料としては、酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４、γ－Ｆｅ２Ｏ３）、各種フェライト（磁性セラミックス）、鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、クロムなどの金属及びその合金が挙げられる。
　磁性材料を含む複合粒子の例としては、例えば、磁性材料が分散した有機高分子化合物の粒子、あるいは、磁性材料からなる、又は磁性材料を含むコア（芯部）と有機高分子化合物又は無機化合物のシェル（皮膜）を有する粒子等が挙げられる。
　磁性ビーズの形状は特に限定されず、球状、略球状、扁平球状、不定形状等が挙げられるが、分散性の観点では球状又は略球状が好ましい。また、磁性ビーズの大きさも特に限定されないが、例えば、５～４００μｍ、好ましくは１０～２００μｍ、より好ましくは２０～１００μｍとすることができる。
　一実施形態において、磁性ビーズは、多孔質磁気粒子であることが好ましい。
　多孔質磁気粒子は、後述するように、凍結融解を行うことにより、簡便な方法で、効率よくコレステロールを固相化することができる。
　多孔質磁気粒子の孔径は、固相化するリポソームのサイズにあわせて適宜選択できるが、例えば、１００ｎｍ以上、好ましくは３００ｎｍ以上、より好ましくは５００ｎｍ以上であり、また、５μｍ以下、好ましくは２μｍ以下、より好ましくは１μｍ以下とすることができる。多孔質磁気ビーズの孔径（短径）が１００ｎｍ以上であるとリポソームが容易に孔内に入りこむことができ、５μｍ以下であると、後述する凍結融解の工程の後にリポソームが孔内にとどまり易く、効率よく固相化することができる。
　磁性多孔質粒子としては、限定されるものではないが、例えば、磁性セラミックス（フェライト）粒子、磁性材料をシリカなどの多孔質物質で被覆した磁性シリカなどの複合粒子等が挙げられる。
　その他の磁気ビーズとしては、リポソームが結合するような表面構造を有する磁気ビーズなどが挙げられる。
（磁気ビーズへの固相化）
　コレステロールを含むリポソームを磁気ビーズに固相化する方法は、特に限定されず、磁気ビーズの種類などを考慮して適宜選択することができる。
　例えば、リポソームが結合し易い表面構造を有する磁気ビーズにリポソームを水性媒体などの適当な媒体中で接触させて、磁気ビーズにリポソームを吸着させる方法が挙げられる。
　特に、発明者らは、磁気ビーズとして上述の多孔質磁性粒子を用いる場合、コレステロールを含むリポソームと磁気ビーズとを含む溶液の凍結融解サイクルを繰り返すこという簡便な方法で、コレステロールを含むリポソームを磁気ビーズに効率的に固相化できることを見出した。
　具体的には、コレステロールを含むリポソームの懸濁液に磁気ビーズを分散・混合し、１０～５０℃、好ましくは室温（２０～３０℃）で、５分～１６時間、好ましくは１０分～２時間、静置又は撹拌して反応させる。リポソーム懸濁液の媒体（以下「懸濁媒体」とも記載する）としては、水、生理食塩水、各種緩衝液等の水性媒体を用いることができる。その後、反応液の凍結融解サイクル、例えば、凍結（例えば、－６０℃以下）と解凍（例えば、水浴・室温）の凍結融解サイクルを、３回以上、好ましくは５回以上、２０回以下、好ましくは１５回以下繰り返すことによって、リポソームを磁気ビーズに固相化する。
　このような工程によりコレステロールを含むリポソームを磁気ビーズに効率的に固相化できる理由としては、コレステロールを含むリポソームの懸濁液に、適切な孔径を有する多孔質磁気ビーズを混合・反応させることにより、リポソームが多孔質の磁気ビーズの孔内に入りこみ、この状態で凍結融解を繰り返すと、リポソームのサイズが大きくなり孔内に詰まった状態になるため、磁気ビーズにリポソームを効率的に固相化できるものと考えられる。
　コレステロールを含むリポソームと磁気ビーズとの比率としては、コレステロールを含むリポソーム懸濁液：磁気ビーズが、２０：１～２０：２０、好ましくは１０：１～１０：６、より好ましくは７：２～７：３（ｍＬ：ｇ）の範囲とすることができる。また、リポソーム（リン脂質とコレステロール）含有量：磁気ビーズが、１：５０～１：１０００、好ましくは１：１００～１：５００、より好ましくは１：１５０～１：３００（ｇ：ｇ）の範囲とすることができる。このような範囲とすることで、磁気ビーズとの分離後の溶液の分析すなわちＨＤＬ含有試料のコレステロール引き抜き能の評価をすることができる。なお、上記の比率は、リポソームに用いるリン脂質や、磁気ビーズの種類等を考慮して適宜変更してもよい。
　このようにして作製したコレステロールを含むリポソームが固相化された磁気ビーズ（以下「ＩＬＭ：ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｂｏｕｎｄ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ」とも記載する）は、精製後、懸濁液の状態で保存することができる。ＩＬＭ懸濁液の懸濁媒体としては、上述のリポソーム懸濁液の媒体と同様の媒体を使用することができる。
　このようにして作製したコレステロールを含むリポソームが固相化された磁気ビーズは、冷暗所（通常、４℃以下、場合により好ましくは遮光下）にて安定であり、臨床における日常検査に用いるのに適している。
　コレステロールを含むリポソームが固相化された磁気ビーズの保存安定性は、ＩＬＭ懸濁液の懸濁媒体中（例えば上清中）の標識物質強度の変化で評価することができる。例えば、ＩＬＭの保存安定性が良好であれば、保存中に磁気ビーズから懸濁媒体中に遊離する標識物質（例えば、蛍光標識コレステロール）が少ない。一実施形態では、所望の保存条件（例えば４℃）において、少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間、より好ましくは少なくとも３０日間、さらに好ましくは少なくとも４０日間、ＩＬＭ懸濁液から採取した懸濁媒体の標識強度（例えば蛍光強度）が有意差をもって増加しない（実質的に変化しない）。
　なお、本明細書において、コレステロールを含むリポソームを固相化した磁気ビーズを単に「コレステロールを固相化した磁気ビーズ」と記載することもある。
＜コレステロールを固相化した磁気ビーズと、測定対象のＨＤＬ含有試料とを接触させる工程＞
　上記のとおり調製したコレステロールを含むリポソームを固相化した磁気ビーズを、測定対象のＨＤＬ含有試料と溶液中で接触させることにより、磁気ビーズに固定されたリポソームからコレステロールを引き抜く。
　本実施形態の測定方法において測定対象となるＨＤＬ含有試料は、哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、モルモット、マウス、ラット等）由来、好ましくはヒト由来の単離されたＨＤＬ含有試料である。
　ＨＤＬ含有試料としては、全血、血清、血漿等の血液試料、ａｐｏＢ除去血清（ａｐｏＢ　ｄｅｌｅｔｅｄ　ｓｅｒｕｍ：ＢＤＳ）、精製ＨＤＬ等を用いることができる。
　ＨＤＬは、サイズ、密度、電荷、アポリポタンパク質の組成等により、複数のサブクラスに分類することができるが、本実施形態の測定方法は、ＨＤＬの亜分画（ＨＤＬ２、ＨＤＬ３、ａｐｏＥ含有ＨＤＬ、ホモシステイン修飾ＨＤＬ等）のコレステロール引き抜き能の測定にも用いることができる。精製ＨＤＬ及びその亜分画は、超遠心分離法など公知の方法を用いて精製することができる。
　ａｐｏＢ除去血清（ａｐｏＢ　ｄｅｌｅｔｅｄ　ｓｅｒｕｍ：ＢＤＳ）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法によってアポリポタンパク質Ｂ（ａｐｏＢ）を含むリポタンパク質画分を除去したものである。ａｐｏＢ除去血清は本発明者らの既報（非特許文献５）において精製ＨＤＬのＣＥＣとの相関が報告されており、かつ精製ＨＤＬに比べて調製が簡単であるため、臨床検査の被験試料として好適に用いることができる。
　測定対象となるＨＤＬ含有試料は、上記の血液試料、ａｐｏＢ除去血清（ＢＤＳ）、又は精製ＨＤＬを水性媒体で希釈したものを用いることができる。水性媒体としては、水、生理食塩水、各種緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌなど）等が挙げられる。ＨＤＬ含有試料の濃度は、試料の種類、反応系のスケール等を考慮して適宜選択できるが、精製ＨＤＬであれば最終総コレステロール濃度が０．１～１００ｍｇ／ｄＬ、好ましくは１～５０ｍｇ／ｄＬ、ＢＤＳであれば最終血清濃度が０．１～１０％、好ましくは１～５％となるように調整することができる。
　コレステロールを固相化した磁気ビーズと測定対象のＨＤＬ含有試料との反応は、例えば、０～５０℃、好ましくは１０～４０℃、より好ましくは室温（２０～３０℃）で、１～７２時間、好ましくは４～４８時間、より好ましくは８～２４時間インキュベートすることができる。また、測定時間の短縮の観点では、反応時間を１～１６時間、場合により好ましくは１～８時間、より好ましくは２～４時間としてもよい。この間、反応液は、静置しておいてもよいし、撹拌又は振とうしてもよい。
　なお、ＣＥＣ測定を行う前に、コレステロールを固相化した磁気ビーズの洗浄操作を行ってもよい。洗浄操作を行うことで、該磁気ビーズから遊離した標識物質の測り込みを低減することができる。洗浄操作は、遠心操作により、またはマグネットなどを用いて、ＩＬＭ懸濁液からＩＬＭを回収し、回収したＩＬＭを所望の容量の懸濁媒体に再度懸濁することで行うことができる。
　また一実施形態では、後述の実施例に示すように、洗浄操作に代えて、ブランク補正を行ってもよい。ブランク補正を行うことにより、洗浄操作を行わなくても、洗浄操作を行った場合と同等の精度でＣＥＣ測定を行うことができうる。ブランク補正は、例えば、ＣＥＣ測定において、測定対象のＨＤＬ含有試料に代えて、ＨＤＬ含有試料の希釈媒体（例えば上記の水性媒体）をブランク試料として用いてＣＥＣを測定し、その値を、測定対象のＣＥＣ測定値から、ブランクとして差し引くことで行うことができる。
＜磁気ビーズを分離し、磁気ビーズ分離後の溶液中のコレステロール濃度を測定することにより、コレステロール引き抜き能を評価する工程＞
　コレステロールを固相化した磁気ビーズと測定対象のＨＤＬ含有試料とを上記のとおり反応させると、溶液中のＨＤＬの働きにより、磁気ビーズに固相化されたリポソームからコレステロールが引き抜かれて、ＨＤＬに取り込まれた状態で溶液中に移動することになる。
　この引き抜かれたコレステロールを測定するために、まず、磁気ビーズを分離する。磁気ビーズの分離は、マグネットなどの磁力を用いて行えばよい。このように、本実施形態のＣＥＣ測定方法は、遠心分離操作を必要としないため、自動分析装置への適用が容易である。
　また、磁気ビーズは、迅速な分離が可能なので測定時間の短縮が可能である。また、ゲルビーズは、遠心操作後に上清を分取する際、ゲルが浮遊して上清に混入する場合があるが、磁気ビーズであれば、磁気を用いて固定することにより、溶液から磁気ビーズを確実に分離することができる。
　さらに、遠心操作が必要でないため、安定に分離できるというメリットもある。
　なお、マグネットなどの磁力による分離に追加して、又は場合によっては磁力による分離に代えて、遠心分離操作を行ってもよい。
　このように、ＩＬＧ法において用いるゲルビーズは、遠心後、上清を回収する際に軽いゲルビーズが舞いやすく、正誤差の影響を受けるという課題があるが、本実施形態の磁気ビーズ（ＩＬＭ）は、磁石を用いて容易に分離が可能であり、また、重く、かつ磁石で強く引き寄せることができるため、ゲルビーズのように舞うことがなく、より容易なプロセスで、より正確な測定が可能であるという利点がある。
　次に、磁気ビーズを分離して得られる上清中のコレステロール濃度を測定する。上清中のコレステロール濃度は、上清中のコレステロールの標識物質に由来するシグナルを、標識の種類に応じた方法で測定すればよい。
　コレステロール引き抜き能は、測定した上清中のコレステロール濃度から引き抜かれたコレステロール量を求め、ＨＤＬの単位量当たり（２０ｍｇ　ＨＤＬ　ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ当たり、または１ｍｇ　ＨＤＬ－Ｃ／ｄＬ当たりなど）に換算することで数値化することができる（ＨＤＬ同士の比較）。また、特定の参照血清またはａｐｏＢ除去血清（ＢＤＳ）試料を参照用試料として用いることにより、ＨＤＬにより引き抜かれたコレステロール量で表されるＣＥＣを規格化し、かつ／または磁気ビーズのＬｏｔ間差による影響を排除することもできる。
　本実施形態のＩＬＭを用いたＣＥＣ測定方法では、後述の実施例に示すように、広いＨＤＬ濃度範囲で直線性が認められ、正確性の高いＣＥＣ測定を行うことができる。一実施形態では、被検者の血清ＨＤＬコレステロール濃度換算で、５０～２００ｍｇ／ｄＬ、好ましくは３０～２２０ｍｇ／ｄＬの濃度範囲でＣＥＣ測定を行うことが可能であり、健常者および患者の検体を十分に測定することが可能である。
　また、本実施形態のＩＬＭを用いたＣＥＣ測定方法は、後述の実施例に示すように高い再現性を有する。例えば、本実施形態のＣＥＣ測定方法では、同一サンプルの同日中の少なくとも１０重測定、好ましくは少なくとも２０重測定のＣＥＣ測定値の変動係数（ＣＶ％）が１０％以下、好ましくは７％以下である。また、同一サンプルの少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも２０日間にわたるＣＥＣ測定値の変動係数（ＣＶ％）が１０％以下である。このように、本実施形態のＣＥＣ測定方法では、従来の細胞法と比較して、高い再現性をもってＣＥＣ測定を行うことができる。
　さらに、後述の実施例に示すように、本実施形態のＣＥＣ測定方法では、同程度のＨＤＬ－Ｃ濃度であっても、ＨＤＬのコレステロール引き抜き能が異なれば、ＣＥＣ測定値が異なる。このように本実施形態のＣＥＣ測定方法では、ＨＤＬのコレステロール引き抜き能の違いを精度よく評価できる。このため、本発明の一態様では、本実施形態のＣＥＣ測定方法の結果を用いて、被験者のコレステロール引き抜き能に関連する状態又はそのリスクに関する情報を取得することができる。また、健常者及び患者のＨＤＬ含有試料（ａｐｏＢ除去血清（ＢＤＳ）試料、精製ＨＤＬ試料等）から得た結果のデータを比較及び／又は蓄積することによって、コレステロール引き抜き能に関連する状態又はそのリスクに関するコレステロール引き抜き能の閾値又は基準範囲を定めること、及び被験者のコレステロール引き抜き能が基準の範囲内であるか判定することができる。
　コレステロール引き抜き能に関連する状態としては、脂質異常症、粥状動脈硬化症、家族性コレステロール血症、炎症性疾患（特には、コレステロール引き抜き能の低下が関与する炎症性疾患等）、糖尿病、心血管疾患イベント発症リスク等が挙げられる。
　本実施形態の測定方法は、無細胞系で実施することができる、ｉｎ　ｖｉｔｒｏの方法である。
　さらに、本発明の一態様は、コレステロールを固相化した磁気ビーズを用いた、ＨＤＬのコレステロール引き抜き能の評価のための検査方法に関する。
　さらに、本発明の一態様は、コレステロールを固相化した磁気ビーズを用いた、ＨＤＬのコレステロール引き抜き能の評価のための試験方法に関する。
　さらに、本発明の一態様は、本実施形態のＣＥＣ測定方法に用いられるコレステロール引き抜き能測定用試薬キットに関する。
　本実施形態のＣＥＣ測定用試薬キットは、コレステロールを固相化した磁気ビーズ、又はコレステロールを固相化した磁気ビーズの製造に用いるための磁気ビーズを少なくとも含む。本実施形態のＣＥＣ測定用試薬キットは、さらに、コレステロールを固相化した磁気ビーズの製造に用いるためのコレステロール、ＨＤＬ含有試料の調製に用いるための各種試薬、コレステロールを固相化した磁気ビーズとＨＤＬ含有試料との反応に用いるための媒体、標識コレステロール量の測定に用いるための各種試薬等の本実施形態のＣＥＣ測定方法に用いられる任意の試薬、並びにそれらの試薬の保管及び反応のための容器等を含み得る。
　本発明の一態様は、さらに、ＣＥＣ測定方法、ＣＥＣの評価のための検査方法、及びＣＥＣの評価のための試験方法における、並びにＣＥＣ測定用試薬キットの製造における、コレステロールを固相化した磁気ビーズの使用に関する。
　本実施形態のＣＥＣ測定方法、ＣＥＣの評価のための検査方法、ＣＥＣの評価のための試験方法、及びＣＥＣ測定用試薬キットによれば、コレステロールを固相化した磁気ビーズを含む試薬と、測定対象のＨＤＬ含有試料とを所望の条件下で接触させ、磁気ビーズを分離し、上清、すなわち磁気ビーズを分離後の溶液中のコレステロール濃度を測定とするという簡便なプロセスで、無細胞系で、ＨＤＬのコレステロール引き抜き能を評価し、かつ／又は被験者のコレステロール引き抜き能に関連する状態又はそのリスクに関する情報を取得することができる。
　したがって、本発明に係るＣＥＣ測定方法、ＣＥＣの評価のための検査方法、ＣＥＣの評価のための試験方法、及びＣＥＣ測定用試薬キットは、自動分析装置への適用が容易であり、臨床における日常検査への適用に適している。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。
＜方法＞
（1）　固相化リポソーム結合ビーズの作製法
（調製例１）
固相化リポソーム結合磁気ビーズの作製
　卵レシチン（10.6 mg）とコレステロール（2.3 mg）を6 mLのクロロホルムに溶解し、30 μLの0.5 mM蛍光標識コレステロール（4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-s-indacene-labeled cholesterol，Avanti Polar Lipids）を溶液に加えた。窒素ガス下で形成された脂質膜をエーテルに溶解し、溶媒を蒸発により除去した。この工程を2回行った後、脂質膜を窒素ガス下で完全に乾燥させ、7 mLの10 mM Tris-HCl（pH 7.4）containing 150 mM NaCl and 1 mM EDTA-2Na（Buffer A）に懸濁した（リポソーム懸濁液）。その後、2.45 gの磁気ビーズ（コアシェル形状フェライト粉・MTFH-35，POWDERTECH、粒子サイズ：40.2 μm、孔径：0.8 μm）をリポソーム懸濁液に加え、室温で30分間反応させた。混合物に対して3, 5, 7, 9サイクルの凍結（-80℃）及び解凍（室温、水中）を繰り返し、ビーズ内へのリポソームの固相化を誘導した。最後に、Buffer Aで洗浄を5回行い、Buffer A 5 mLに再懸濁した。ビーズ混濁液は4℃の暗所で保存した。
（比較調製例１）
ILG（固相化リポソーム結合ゲルビーズ）の作製
　2.45 gの磁気ビーズに代えて0.35 gの乾燥したゲルビーズ（Sephacryl S-300 gel beads，GE Healthcare）をリポソーム懸濁液に加えたこと、及び、凍結・解凍を７サイクル行ったこと以外は、調製例１と同様にして、ILG（固相化リポソーム結合ゲルビーズ）を調製した。
（2）　沈殿法によるBDSの回収
　血清に20％ポリエチレングリコール溶液（200 mM glycine buffer; pH 7.4）を血清に対し100:40の割合で添加し、インキュベーション後（20 min, 室温）、遠心（10,000 rpm, 30 min, 4℃）し、上清をBDSとして回収した。
（3）　コレステロール引き抜き能（cholesterol efflux capacity; CEC）の測定
　蛍光標識コレステロールを含む固相化リポソーム結合磁気ビーズ懸濁液100 μL（調製例１）又は固相化リポソーム結合ゲルビーズ懸濁液100 μL（比較調製例１）に対し、希釈したHDL（測定試料）又はBDS（参照試料）を150 μL添加し、それぞれ最終総コレステロール濃度 4～15 mg/dL（HDLの場合）、最終血清濃度2%（BDSの場合）になるようにした。遮光条件下でインキュベーション（16h、30℃）し、固相化リポソーム結合磁気ビーズはマグネットを用いて、固相化リポソーム結合ゲルビーズは遠心分離を用いて、反応溶液から分離し、得られた上清 75 μL の蛍光強度（Ex: 485 nm, Em: 538 nm）を測定した。
　なお、（4）以降の実施例においても、特記しない限り、CEC測定は本実施例と同様の方法で行った。
＜結果＞
（1）　凍結融解によるリポソームの固相化
　調製例１において、磁気ビーズに蛍光標識コレステロール含有リポソームが固相化されていることを確認するため、凍結融解後、洗浄前の上清を回収した。反応前のリポソーム懸濁液の蛍光強度と、磁気ビーズと反応後の上清の蛍光強度を比較することで、ビーズ内の蛍光強度を評価した。
　図1に示すのは、凍結回数を変え、固相化されたリポソームの量を比較したものである。結果は、凍結融解7回に対するビーズ内の蛍光強度の比で示す。凍結融解の繰り返しにより、リポソームが固相化された。
（2）　固相化リポソーム結合磁気ビーズの蛍光写真
　調製例１において、蛍光標識コレステロール含有リポソームを磁気ビーズに固相化、洗浄した後、固相化磁気ビーズを蛍光顕微鏡で観察した（図2）。磁気ビーズ内に蛍光が観察され、リポソームが固相化されていることが確認できた。
（3）　磁気ビーズとゲルビーズのリポソーム固相化効率の比較
　本発明の磁性ビーズと従来法のゲルビーズのリポソーム固相化効率を比較した結果を図3に示す。
　図3中、「M」は、調製例１（凍結融解5回）と同様にして調製した固相化リポソーム結合磁性ビーズの固相化量（調製2回（各回3チューブ、計6チューブ）の平均）を示し、「ILG」は、比較調製例１（凍結融解7回）と同様にして調製した固相化リポソーム結合ゲルビーズの固相化量（調製2回（各回2チューブ、計4チューブ）の平均）を示す。ゲルビーズと同等又はそれ以上の効率で、磁気ビーズにリポソームを固相化できることが確認された。
（4）　固相化リポソーム結合磁気ビーズによるコレステロール引き抜き能
　調製例１の凍結回数5回の磁気ビーズを用いて、濃度の異なるHDLのコレステロール引き抜き能を評価した。蛍光コレステロールの引き抜き能はHDL濃度依存的に増加した（図4）。
（5）　従来法との相関
　様々なHDL濃度（24系列、1～15 mg/mL）を用いて、ILGを用いた従来法と磁気ビーズを用いた本発明の方法のCECの相関性を調べた（図5）。各試料のCECは、同一の参照血清を用いて測定したCECで規格化した。本発明の方法は従来法と良好な相関性を示した（r = 0.987）。なお、本実施例に示したILGを用いた従来法は、培養細胞を用いた従来のCEC評価法との相関が高いことが報告されている（非特許文献４、r =0.932）。
（6）　固相化リポソーム結合磁気ビーズ（ILM）の保存安定性
　調製例１の凍結回数5回の磁気ビーズと同様にして蛍光コレステロール含有リポソームを磁気ビーズに固相化させた。このILMを4℃、暗所にて0～60日間まで保管し、それぞれの保存日数における上清の蛍光強度を測定した。上清の蛍光強度（保存中に遊離した蛍光コレステロール含有リポソーム量を反映）は60日間にかけて微増するものの、0日と比較して45日までは有意な差は認められなかった（図６）。それぞれの日数につき3つのチューブで保管し、さらにそれぞれの蛍光強度は3重測定した。* p < 0.05。
（7）　CEC測定前の磁気ビーズの洗浄効果およびブランク補正の効果
　調製例１の凍結回数5回の磁気ビーズと同様にして蛍光コレステロール含有リポソームを磁気ビーズに固相化させた。このILMを用いて、緩衝液のみ（blank）、参照血清、血清サンプルA, B, CのそれぞれのCECを測定した。CEC測定の際に、磁気ビーズを緩衝液で洗浄操作あり（白い棒グラフ）と洗浄なし（黒い棒グラフ）のCECを比較した（図７上図）。洗浄操作は、ILMをマグネットを用いて回収し、同容量のBuffer Aに再懸濁する操作を2回繰り返すことで行った。磁気ビーズを洗浄操作の有無によってほとんどのサンプル（血清B以外）でCECに有意な差が認められた（*p < 0.05, **p < 0.01）。これは、洗浄しない場合、磁気ビーズから遊離した蛍光強度を測り込むからである。一方、参照血清、血清A, B, CのCECをブランクの値で差し引くと（ブランク補正）（図７下図）、洗浄操作の有無で有意差は認められなかった。つまり、洗浄操作をしなくても、ブランク補正を行うことにより、CECの測定が可能である。
（8）　希釈したHDLおよびBDS検体を用いたCECの直線性試験
　超遠心で得られたHDLを0.6 - 9.0 mg cholesterol/dLの範囲で24系列希釈した後、それぞれの希釈したHDLのCECを測定したところ、1.2 - 7.8 mg/dLまで直線性が認められた（図８上図、TC：トータルコレステロール）。同様にBDSを0.2 - 5.0%の範囲に希釈し、測定すると、1.0 - 5.0%の範囲まで直線性が認められた（図８下図）。これは血清HDLコレステロール濃度に換算すると、およそ34 - 223 mg/dLまで測定できることを意味し、健常者および患者検体を十分に測定することが可能である。
（9）　段階希釈したHDLおよびBDSによるILM法とILG法のCECの相関性
　上記（8）において直線性の認められた濃度範囲のサンプルを用いて、ILG法とILM法の相関性試験を行った（図９上図：HDL、図９下図：BDS）。どちらも良好な相関性が認められた。
（10）　ILM法による健常者BDS中のCECとHDL-Cの関係およびILG法との相関性
　15名の健常者BDS中のCECをILM法で測定し（3重測定）、それぞれのHDL-C濃度との相関性を確認した。CECとHDL-Cには正の相関性が認められるが、中には同程度のHDL-C濃度であってもCECが異なる検体があり、HDLの能力の違いを反映するものと考えられる（図１０上図）。また、ILM法とILG法は良好な相関性を示した（図１０下図）。
（11）　再現性
　3種類の濃度の異なるBDSのCECをILM法において、同日中にそれぞれ20重測定したところ，CV%はいずれも7%以内であった（表１：Sample 1-3）。また、同様に3種類のBDSを20日間測定したところ、CV%は10%以内であった（表１：Sample 4-6）。従来の細胞法を用いた場合、これらのCV%は10%を超え（データ図示せず）、本発明のILM法の再現性が従来法に比べて良好であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　これらの結果より、コレステロールを固相化した磁気ビーズを用いた本発明のＣＥＣ評価法は、従来のＣＥＣ評価法と高い相関を示し、かつ、培養細胞や遠心分離操作を用いない簡便なプロセスでＣＥＣの評価が可能であることから、自動化が容易であり、臨床における日常検査に容易に適用できることが示された。

Claims (15)

  1. 　ＨＤＬのコレステロール引き抜き能を測定する方法であって、
    　コレステロールを固相化した磁気ビーズを用意する工程、
    　前記コレステロールを固相化した磁気ビーズと測定対象のＨＤＬ含有試料とを溶液中で接触させる工程、及び
    　前記溶液から磁気ビーズを分離し、磁気ビーズ分離後の溶液中のコレステロール量を測定する工程
    を含む、方法。
  2. 　磁気ビーズが多孔質磁気粒子である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記コレステロールを固相化した磁気ビーズを用意する工程が、
    コレステロールを含むリポソームを調製する工程、及び
    前記リポソームと磁気ビーズとを含む溶液を凍結融解させる工程
    を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　磁気ビーズに固相化されたコレステロールの少なくとも一部が蛍光標識されている、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　ＨＤＬのコレステロール引き抜き能を測定する方法であって、
    　少なくとも一部が標識されたコレステロールを含むリポソームを調製する工程、及び
    　前記リポソームと多孔質磁気粒子とを含む溶液を凍結融解させる工程
    を含む工程により、コレステロールを固相化した磁気ビーズを用意する工程と、
    　前記コレステロールを固相化した磁気ビーズと測定対象のＨＤＬ含有試料とを溶液中で接触させる工程と、
    　前記溶液から磁気ビーズを分離し、磁気ビーズ分離後の溶液中のコレステロール量を、溶液の標識強度に基づき測定する工程と
    を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　コレステロールを固相化した磁気ビーズが、該磁気ビーズの懸濁液から採取した懸濁媒体の標識強度が少なくとも１０日間実質的に変化しないことによって表される保存安定性を有する、請求項５に記載の方法。
  7. 　磁気ビーズが磁性セラミックス粒子である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　溶液から磁気ビーズを分離する工程が、遠心分離操作を含まない、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　測定対象のＨＤＬ含有試料のコレステロール量測定値から、ブランク試料のコレステロール量測定値を差し引くことで、ブランク補正を行う工程をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　コレステロールを固相化した磁気ビーズと測定対象のＨＤＬ含有試料とを溶液中で接触させる工程の前に、コレステロールを固相化した磁気ビーズを洗浄する工程を含まない、請求項９に記載の方法。
  11. 　測定対象のＨＤＬ含有試料が、全血、血清、血漿、ａｐｏＢ除去血清、又は精製ＨＤＬを含む溶液である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　無細胞系で実施される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　同一サンプルの少なくとも１０日間にわたるコレステロール量測定値の変動係数が１０％以下であることによって表される再現性を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　コレステロールを固相化した磁気ビーズを含む、ＨＤＬのコレステロール引き抜き能測定用試薬キット。
  15. 　コレステロールを固相化した磁気ビーズを用いて、被験者由来のＨＤＬ含有試料のコレステロール引き抜き能を測定する工程を含む、被験者のコレステロール引き抜き能に関連する状態又はそのリスクに関する情報を取得する方法。
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