JP2575825B2 - チロキシン取込量および自由チロキシン指数の測定方法 - Google Patents
チロキシン取込量および自由チロキシン指数の測定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本願発明は、固相チロキシン（T4）および標識抗TBG
抗体を用いた試料血清のチロキシン取込量の測定方法に
関する。
抗体を用いた試料血清のチロキシン取込量の測定方法に
関する。
（従来の技術） チロキシン結合グロブリン（TBG）は、チロキシン（T
4）およびトリヨードチロニン（T3）の主要な血清担体
タンパク質である。TBGの生理学的役割はT4の運搬およ
び代謝の状況において最も良く理解される。T4が遊離さ
れて循環に入るとすぐに３つのチロキシン結合タンパク
質にほぼ完全に結合する。この３つのチロキシン結合タ
ンパク質はアルブミン、プレアルブミンそして主にTBG
である。T4の非結合画分（自由T4）は患者の甲状腺代謝
状態の正確な評価を提供する。自由T4の濃度は全血清T4
濃度およびT4結合タンパク質濃度両方の関数である。上
記３つの結合タンパク質のうち、TBG濃度の変化が全T4
濃度に最も影響する。
4）およびトリヨードチロニン（T3）の主要な血清担体
タンパク質である。TBGの生理学的役割はT4の運搬およ
び代謝の状況において最も良く理解される。T4が遊離さ
れて循環に入るとすぐに３つのチロキシン結合タンパク
質にほぼ完全に結合する。この３つのチロキシン結合タ
ンパク質はアルブミン、プレアルブミンそして主にTBG
である。T4の非結合画分（自由T4）は患者の甲状腺代謝
状態の正確な評価を提供する。自由T4の濃度は全血清T4
濃度およびT4結合タンパク質濃度両方の関数である。上
記３つの結合タンパク質のうち、TBG濃度の変化が全T4
濃度に最も影響する。
不飽和TBGの量および自由T4指数（FTI）は、しばしば
甲状腺の状態の指標として使用されている。FTIは通常
全T4の量およびT3取込テストから計算される値から得ら
れる。全T4は競合的タンパク質結合、置換分析またはラ
ジオイムノアッセイにより測定できる。不飽和TBG量を
判断するために選択される方法はT3取込テストであっ
た。T3取込テストにおいて、患者の血清、加えた標識T3
および該標識T3の外因性不活性バインダー（分離剤）の
間に平衡が形成される。TBGの結合部位を飽和するため
に十分な量の標識T3を加えなければならず、その後非結
合の標識T3は分離剤に吸収されてカウントされる。従っ
て、例えば甲状腺亢進症のように内因性チロキシン量が
増加すると血清TBGが比較的飽和となり、T3取込が多く
なる。一方、甲状腺機能低下状態において、チロキシン
分泌が低い場合、外因性標識T3は比較的不飽和なTBGに
結合して低いT3取込となる。
甲状腺の状態の指標として使用されている。FTIは通常
全T4の量およびT3取込テストから計算される値から得ら
れる。全T4は競合的タンパク質結合、置換分析またはラ
ジオイムノアッセイにより測定できる。不飽和TBG量を
判断するために選択される方法はT3取込テストであっ
た。T3取込テストにおいて、患者の血清、加えた標識T3
および該標識T3の外因性不活性バインダー（分離剤）の
間に平衡が形成される。TBGの結合部位を飽和するため
に十分な量の標識T3を加えなければならず、その後非結
合の標識T3は分離剤に吸収されてカウントされる。従っ
て、例えば甲状腺亢進症のように内因性チロキシン量が
増加すると血清TBGが比較的飽和となり、T3取込が多く
なる。一方、甲状腺機能低下状態において、チロキシン
分泌が低い場合、外因性標識T3は比較的不飽和なTBGに
結合して低いT3取込となる。
T3取込法の主要なバリエーションは分離剤の化学特性
に中心を置いてきた。例えばイオン交換樹脂、ヘモグロ
ビン飽和木炭、セファデックス（Sephadex）Ｇ−25、ナ
イロン、無機結晶性物質、ポリマー被覆試験チューブま
たは粒子の壁に固定されたT3抗体、および樹脂に固定さ
れたT3抗体など、全てが標識T3の不活性バインダーとし
て使用されてきた。米国特許第4,225,412号を参照のこ
と。
に中心を置いてきた。例えばイオン交換樹脂、ヘモグロ
ビン飽和木炭、セファデックス（Sephadex）Ｇ−25、ナ
イロン、無機結晶性物質、ポリマー被覆試験チューブま
たは粒子の壁に固定されたT3抗体、および樹脂に固定さ
れたT3抗体など、全てが標識T3の不活性バインダーとし
て使用されてきた。米国特許第4,225,412号を参照のこ
と。
米国特許第4,032,626号には、放射性標識T4および不
溶性支持物質に固定された抗TBG抗体を用いた液体試料
中のTBG濃度の測定方法が開示されている。該試料は標
識T4および固定抗TBG抗体と共に培養される。TBG濃度
は、非結合標識T4から標識複合物を分離し、結合標識T4
をカウントすることによって測定できる。
溶性支持物質に固定された抗TBG抗体を用いた液体試料
中のTBG濃度の測定方法が開示されている。該試料は標
識T4および固定抗TBG抗体と共に培養される。TBG濃度
は、非結合標識T4から標識複合物を分離し、結合標識T4
をカウントすることによって測定できる。
（発明の目的） 不飽和TBGの量および試料血清の自由チロキシン指数
を測定するために試料血清チロキシン取込量を測定する
新規な方法を提供することが本願発明の目的である。
を測定するために試料血清チロキシン取込量を測定する
新規な方法を提供することが本願発明の目的である。
（発明の構成） 本願発明は、 ａ）試料血清をｉ）不溶性担体物質に固定されたチロキ
シン（T4）から成る複合物、およびii）内因性TBGより
過剰の、TBG（抗TBG）に対する標識抗体と共に培養して
錯体複合物を形成し、 ｂ）非結合標識抗体から前記錯体複合物を分離し、 ｃ）前記錯体複合物に結合した標識の量を測定し、 ｄ）工程ｃ）の測定値を対照血清の測定値と比較して試
料血清のチロキシン取込比を決定する。各工程から成る
試料血清のチロキシン取込量（TU）の測定方法に関す
る。
シン（T4）から成る複合物、およびii）内因性TBGより
過剰の、TBG（抗TBG）に対する標識抗体と共に培養して
錯体複合物を形成し、 ｂ）非結合標識抗体から前記錯体複合物を分離し、 ｃ）前記錯体複合物に結合した標識の量を測定し、 ｄ）工程ｃ）の測定値を対照血清の測定値と比較して試
料血清のチロキシン取込比を決定する。各工程から成る
試料血清のチロキシン取込量（TU）の測定方法に関す
る。
T4は、TBGが結合できる固定T4を与えるどんな方法に
よっても不溶性担体物質に固定することができる。例え
ば、二官能価試薬を用いたClinica Chimica Acta,1977
年78巻,103−111ページに記載されたカゲダル（Ｋged
al）等の方法は本願発明の目的に合ったT4の固定に有用
である。
よっても不溶性担体物質に固定することができる。例え
ば、二官能価試薬を用いたClinica Chimica Acta,1977
年78巻,103−111ページに記載されたカゲダル（Ｋged
al）等の方法は本願発明の目的に合ったT4の固定に有用
である。
不溶性担体物質には、セルロース、セファデックス、
ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ラテッ
クス、ガラス、イオン酸化物粒子等の磁化し得る粒子な
どの既知の支持物質が使用できる。好ましくは、培養時
間に亘って重量沈降（gravimetric settling）を制限す
る平均粒径（例えば0.01−10ミクロン）を有する大表面
積をもった粒状不溶性担体物質にT4は固定される。粒径
は、可能な実験室工程を用いて容易に迅速に分離できる
程大きいことが好ましい。
ポリスチレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、ラテッ
クス、ガラス、イオン酸化物粒子等の磁化し得る粒子な
どの既知の支持物質が使用できる。好ましくは、培養時
間に亘って重量沈降（gravimetric settling）を制限す
る平均粒径（例えば0.01−10ミクロン）を有する大表面
積をもった粒状不溶性担体物質にT4は固定される。粒径
は、可能な実験室工程を用いて容易に迅速に分離できる
程大きいことが好ましい。
常磁性粒子は好ましい担体物質である。これらの粒子
は重合化シラン被覆（例えば米国特許第4,554,088号参
照）に取り巻かれた酸化第二鉄コアから成る。T4は、ま
ず糖タンパク質（例えばα１−酸糖タンパク質またはム
チン）を粒子に固定し、次にT4を二官能価エポキシドと
共に糖タンパク質に固定する（カゲダル等の方法参照）
ことにより粒子の表面に固定し得る。
は重合化シラン被覆（例えば米国特許第4,554,088号参
照）に取り巻かれた酸化第二鉄コアから成る。T4は、ま
ず糖タンパク質（例えばα１−酸糖タンパク質またはム
チン）を粒子に固定し、次にT4を二官能価エポキシドと
共に糖タンパク質に固定する（カゲダル等の方法参照）
ことにより粒子の表面に固定し得る。
単位試料血清当りの固定T4量は変化し得るが、TBG結
合の能力が臨床試験中の自由TBGの生理的範囲を識別す
るのに十分であるような量としなければならない。正常
なヒトの血清は、血清1ml当り15ug−約34ugのTBGを含
み、病的な状態でこの量は10ug未満から約60ugまで変化
し得る。必要な固定T4の量は、自由TBGの種々の既知量
を有する試料に対して固定T4を滴定する既知の方法を用
いて経験的に決定し得る。この滴定は、自由TBGの上限
生理的範囲とその下限生理的範囲を識別するのに必要な
固定T4の量を決定する。試料血清10ulにつき、担体物質
に固定された好ましくは約0.1−1.0ug、更に好ましくは
約0.5ugのT4を使用する。粒子に固定されたT4の量は製
造条件により変え得る。従って実際問題としては試料中
の粒子の量を増やしたり減らしたりすることによって試
料中の固定T4の量を調整する。
合の能力が臨床試験中の自由TBGの生理的範囲を識別す
るのに十分であるような量としなければならない。正常
なヒトの血清は、血清1ml当り15ug−約34ugのTBGを含
み、病的な状態でこの量は10ug未満から約60ugまで変化
し得る。必要な固定T4の量は、自由TBGの種々の既知量
を有する試料に対して固定T4を滴定する既知の方法を用
いて経験的に決定し得る。この滴定は、自由TBGの上限
生理的範囲とその下限生理的範囲を識別するのに必要な
固定T4の量を決定する。試料血清10ulにつき、担体物質
に固定された好ましくは約0.1−1.0ug、更に好ましくは
約0.5ugのT4を使用する。粒子に固定されたT4の量は製
造条件により変え得る。従って実際問題としては試料中
の粒子の量を増やしたり減らしたりすることによって試
料中の固定T4の量を調整する。
非標識抗TBG抗体は、既知のモノクローナル抗体生成
方法を用いて得られる。（例えば、G.KohlerおよびC.Mi
lsteinによるEur.J.Immunology,1976年６巻,511−519ペ
ージ参照）次に、抗TBG抗体を純化し、既知の方法で標
識化する。（例えば酵素、フルオロジェニック、ラジオ
メトリック、バイオルミネセント、ケミルミネセント等
の標識およびマーカー）（例えばWoodhead等のClinical
Chemistry1983年29（８）巻、1474−1479ページ参照）
好ましくは、抗TBG抗体をアクリジニウム エステル（a
cridinium ester）で標識化する。あらゆる適したアク
リジニウム エステルが本願発明の方法に使用できる。
有用なアクリジニウム エステルは同時係属出願の米国
出願第915,527号に記載されており、ここに参考のため
述べておく、特に好ましいものは、２′,6′−ジメチル
−４′−（Ｎ−サクシンイミジロキシカルボニル）フェ
ニル アクリジン−９−カルボキシレート［２′,6′−
dimethyl−４′−（Ｎ−Succinimidyloxycarbonyl）phe
nyl acridine−９−carboxylate］である。
方法を用いて得られる。（例えば、G.KohlerおよびC.Mi
lsteinによるEur.J.Immunology,1976年６巻,511−519ペ
ージ参照）次に、抗TBG抗体を純化し、既知の方法で標
識化する。（例えば酵素、フルオロジェニック、ラジオ
メトリック、バイオルミネセント、ケミルミネセント等
の標識およびマーカー）（例えばWoodhead等のClinical
Chemistry1983年29（８）巻、1474−1479ページ参照）
好ましくは、抗TBG抗体をアクリジニウム エステル（a
cridinium ester）で標識化する。あらゆる適したアク
リジニウム エステルが本願発明の方法に使用できる。
有用なアクリジニウム エステルは同時係属出願の米国
出願第915,527号に記載されており、ここに参考のため
述べておく、特に好ましいものは、２′,6′−ジメチル
−４′−（Ｎ−サクシンイミジロキシカルボニル）フェ
ニル アクリジン−９−カルボキシレート［２′,6′−
dimethyl−４′−（Ｎ−Succinimidyloxycarbonyl）phe
nyl acridine−９−carboxylate］である。
固定TBGに比較して過剰の標識抗TBG抗体が必要であ
る。必要な抗TBG抗体の量は、種々のTBG既知量を有する
試料に対して抗TBG抗体を滴定する既知の方法を用いて
経験的に決定し得る。この滴定は、臨床試料で通常遭遇
する量のTBGを識別するのに必要な抗TBG抗体の量を決定
する。標識抗TBGの取込量が錯体複合物に結合したTBGの
量と直接関連するので、過剰な抗TBG抗体が必要であ
る。試料血清10ulにつき、好ましくは約10ug−約100ng,
更に好ましくは約50ngの標識抗TBG抗体が使用される。
る。必要な抗TBG抗体の量は、種々のTBG既知量を有する
試料に対して抗TBG抗体を滴定する既知の方法を用いて
経験的に決定し得る。この滴定は、臨床試料で通常遭遇
する量のTBGを識別するのに必要な抗TBG抗体の量を決定
する。標識抗TBGの取込量が錯体複合物に結合したTBGの
量と直接関連するので、過剰な抗TBG抗体が必要であ
る。試料血清10ulにつき、好ましくは約10ug−約100ng,
更に好ましくは約50ngの標識抗TBG抗体が使用される。
時間、温度および最終培養容積により、培養条件は変
更し得るが、室温で15分間以上培養することが好まし
い。
更し得るが、室温で15分間以上培養することが好まし
い。
培養後、錯体複合物を培養基から分離する。該複合物
は、使用する不溶性担体物質により沈降、遠心、磁気な
どの従来方法で分離できる水不溶性固相上に形成され
る。好ましい実施態様においては、担体物質が磁化し得
る粒子であり、分離が好ましくは前記粒子を磁界に置く
ことにより行われる。
は、使用する不溶性担体物質により沈降、遠心、磁気な
どの従来方法で分離できる水不溶性固相上に形成され
る。好ましい実施態様においては、担体物質が磁化し得
る粒子であり、分離が好ましくは前記粒子を磁界に置く
ことにより行われる。
標識抗TBG抗体の取込は錯体複合物上に錯体化されたT
BGの量と直接関連する。錯体複合物に接合された標識の
量は少なくとも次の２つの方法で測定できる。
BGの量と直接関連する。錯体複合物に接合された標識の
量は少なくとも次の２つの方法で測定できる。
１）錯体複合物に結合した標識の量を直接測定する方
法。
法。
２）分離後、培養基中の残留標識の量を測定し、用いた
全標識の量からこの残留標識の量を引いて間接的に測定
する方法。適した測定方法は、使用する標識に大きく依
存する。例えば、使用した標識がアクリジニウム エス
テルの場合、直接測定が好ましく、アクリジニウム エ
ステルのケミルミネセント反応により遊離した光子を測
定することによりルミノメーターを使用して測定でき
る。光子により発生するシグナルを相対光量単位［rela
tive light units（RLU）］で測定する。この単位は抗T
BG抗体上のアクリジニウム エステル標識の酸化から放
射される光の量を数値化する。
全標識の量からこの残留標識の量を引いて間接的に測定
する方法。適した測定方法は、使用する標識に大きく依
存する。例えば、使用した標識がアクリジニウム エス
テルの場合、直接測定が好ましく、アクリジニウム エ
ステルのケミルミネセント反応により遊離した光子を測
定することによりルミノメーターを使用して測定でき
る。光子により発生するシグナルを相対光量単位［rela
tive light units（RLU）］で測定する。この単位は抗T
BG抗体上のアクリジニウム エステル標識の酸化から放
射される光の量を数値化する。
本願発明の方法における錯体複合物と結合した、測定
された標識の量は、対照血清（例えば正常なヒト血清）
からのシグナルを試料血清からのシグナルで割ることに
より、チロキシン取込比に変換される。すなわち、 となる。
された標識の量は、対照血清（例えば正常なヒト血清）
からのシグナルを試料血清からのシグナルで割ることに
より、チロキシン取込比に変換される。すなわち、 となる。
対照血清から発せられたシグナルは、試料血清からの
シグナルを得るために使用するものと同じ標識、手順お
よび反応条件を用いて得られる。
シグナルを得るために使用するものと同じ標識、手順お
よび反応条件を用いて得られる。
もしチロキシン取込比が１ならば、試料血清中の不飽
和TBGの量は対照血清中の不飽和TBGの量に最も等しい。
もしチロキシン取込比が１未満ならば、試料血清中の不
飽和TBGの量は対照血清の不飽和TBGの量より多い。ま
た、もしチロキシン取込比が１より大きいならば、試料
血清中の不飽和TBGの量は対照血清中の不飽和TBGの量よ
り少ない。
和TBGの量は対照血清中の不飽和TBGの量に最も等しい。
もしチロキシン取込比が１未満ならば、試料血清中の不
飽和TBGの量は対照血清の不飽和TBGの量より多い。ま
た、もしチロキシン取込比が１より大きいならば、試料
血清中の不飽和TBGの量は対照血清中の不飽和TBGの量よ
り少ない。
このチロキシン取込比は、下記の等式を用いて試料の
自由チロキシン指数の計算にも使用できる。
自由チロキシン指数の計算にも使用できる。
全T4は、例えばMAGIC T4ラジオイムノアッセイ キ
ット［チバ コーニング ダイアグノスティックス社
（Ciba Corning Diagnostics Oorp.）］を利用するなど
既知の方法で測定し得る。
ット［チバ コーニング ダイアグノスティックス社
（Ciba Corning Diagnostics Oorp.）］を利用するなど
既知の方法で測定し得る。
（実 施 例） 以下、実施例に基づいて本願発明を詳細に説明する。
実施例１ A.常磁性粒子をアドバンスト マグネティックス社（Ad
vanced Magnetics Inc.）から得た。250mgの常磁性粒子
を円錐形の遠心分離チューブに入れ、25mlの水で５回洗
浄した。pH5.5の10m M酢酸塩緩衝液中の2.5％グルタル
アルデヒド溶液25mlを前記チューブに加え、チューブの
内容物を３時間室温でゆっくりと混合した。このチュー
ブを磁界中に置き、前記粒子をグルタルアレデヒド溶液
から分離し、次にグルタルアルデヒド溶液をデカントし
た。粒子をpH5.5の10m M酢酸塩緩衝液25mlで１回洗浄し
た。次にpH5.5の10m M酢酸塩緩衝液中のα１−１−酢グ
リコプロテインの5mg/ml溶液25mlをチューブに加え、内
容物を室温で１晩ゆっくりと混合した。粒子を磁界中で
分離し、上清液をデカントした。粒子を25mlの水で４回
洗浄した。pH7.4の30m Mリン酸ナトリウム緩衝液20mlお
よび1,4−ブタンジオール ジグリシジル エーテル
（1,4−butanediol diglycidyl ether）20ulをチューブ
に加え、内容物を室温で１晩ゆっくりと混合した。粒子
を磁界中で分離し、上清液をデカントした。次に粒子を
25mlの水で５回洗浄した。
vanced Magnetics Inc.）から得た。250mgの常磁性粒子
を円錐形の遠心分離チューブに入れ、25mlの水で５回洗
浄した。pH5.5の10m M酢酸塩緩衝液中の2.5％グルタル
アルデヒド溶液25mlを前記チューブに加え、チューブの
内容物を３時間室温でゆっくりと混合した。このチュー
ブを磁界中に置き、前記粒子をグルタルアレデヒド溶液
から分離し、次にグルタルアルデヒド溶液をデカントし
た。粒子をpH5.5の10m M酢酸塩緩衝液25mlで１回洗浄し
た。次にpH5.5の10m M酢酸塩緩衝液中のα１−１−酢グ
リコプロテインの5mg/ml溶液25mlをチューブに加え、内
容物を室温で１晩ゆっくりと混合した。粒子を磁界中で
分離し、上清液をデカントした。粒子を25mlの水で４回
洗浄した。pH7.4の30m Mリン酸ナトリウム緩衝液20mlお
よび1,4−ブタンジオール ジグリシジル エーテル
（1,4−butanediol diglycidyl ether）20ulをチューブ
に加え、内容物を室温で１晩ゆっくりと混合した。粒子
を磁界中で分離し、上清液をデカントした。次に粒子を
25mlの水で５回洗浄した。
以下のようなT4溶液を調整した。
pH9.5の50m M重炭酸ナトリウム40ml ジメチルホルムアミド10ul 0.1N水酸化ナトリウム中の20mg/ul T4溶液1ml このT4溶液を常磁性粒子含有チューブに加え、内容物
を室温で１晩ゆっくりと混合した。チューブを磁界中に
置いて粒子をT4溶液から分離し、T4溶液をデカントし
た。粒子を25mlの水で５回洗浄した。50m M重炭酸緩衝
液中の2Mグリシン溶液25mlをチューブに加え、内容物を
室温で１晩ゆっくり混合した。粒子を磁界中で分離し、
グリシン緩衝液をデカントし、次に粒子を25mlの水で３
回洗浄した。pH7.4の10m Mリン酸塩緩衝溶液中の2.5％
ウシ血清アルブミン（BSA）溶液25mlをチューブに加
え、内容物を室温で１晩ゆっくり混合した。粒子を磁界
分離し、BSA溶液をデカントし、次に粒子を25mlの水で
３回洗浄した。得られた粒子を10m Mリン酸ナトリウム
緩衝液中に再懸濁させ、最終濃度を10mg/mlとした。B.
抗ヒトTBG抗体含有腹水をメロイ研究所（Meloy Laborat
ories）から得た。モノクローナル抗体をAffi−gel Pro
tein A MAPS IIキット［バイオーラッド研究所（Bio−R
ad Laboratories）］を用いた以下の手順で腹水から純
化した。
を室温で１晩ゆっくりと混合した。チューブを磁界中に
置いて粒子をT4溶液から分離し、T4溶液をデカントし
た。粒子を25mlの水で５回洗浄した。50m M重炭酸緩衝
液中の2Mグリシン溶液25mlをチューブに加え、内容物を
室温で１晩ゆっくり混合した。粒子を磁界中で分離し、
グリシン緩衝液をデカントし、次に粒子を25mlの水で３
回洗浄した。pH7.4の10m Mリン酸塩緩衝溶液中の2.5％
ウシ血清アルブミン（BSA）溶液25mlをチューブに加
え、内容物を室温で１晩ゆっくり混合した。粒子を磁界
分離し、BSA溶液をデカントし、次に粒子を25mlの水で
３回洗浄した。得られた粒子を10m Mリン酸ナトリウム
緩衝液中に再懸濁させ、最終濃度を10mg/mlとした。B.
抗ヒトTBG抗体含有腹水をメロイ研究所（Meloy Laborat
ories）から得た。モノクローナル抗体をAffi−gel Pro
tein A MAPS IIキット［バイオーラッド研究所（Bio−R
ad Laboratories）］を用いた以下の手順で腹水から純
化した。
0.1mlの腹水をAff−gel Protein A MAPS IIキットか
らの結合緩衝液0.1mlで希釈した。希釈した腹水を、結
合緩衝液で予備洗浄したAffi−gel Protein A MAPS II
キットからのタンパク質−ゲル懸濁液1mlと混合した。
このゲル混合物を１×5cmカラムにつめ、結合緩衝液を
含有したゲル混合物の床容積（bed volume）の15倍で洗
浄した。抗ヒトTBG抗体を、pH6.0でAffi−gel Protein
A MAPS IIキットからの溶離緩衝液を用いてゲル混合物
から溶離した。溶離は280Aの波長で監視され、抗体の溶
離ポイントを決定した。次に、抗体をPBS緩衝液に対す
る透析により溶離緩衝液から分離した。
らの結合緩衝液0.1mlで希釈した。希釈した腹水を、結
合緩衝液で予備洗浄したAffi−gel Protein A MAPS II
キットからのタンパク質−ゲル懸濁液1mlと混合した。
このゲル混合物を１×5cmカラムにつめ、結合緩衝液を
含有したゲル混合物の床容積（bed volume）の15倍で洗
浄した。抗ヒトTBG抗体を、pH6.0でAffi−gel Protein
A MAPS IIキットからの溶離緩衝液を用いてゲル混合物
から溶離した。溶離は280Aの波長で監視され、抗体の溶
離ポイントを決定した。次に、抗体をPBS緩衝液に対す
る透析により溶離緩衝液から分離した。
抗ヒトTBG抗体をウッドヘッド（Woodhead）等のClini
cal Chemistry 1983年29（８）巻,1474−1479ページに
記載された手順で、２′,6′−ジメチル−４′−（Ｎ−
サクシンイミジロキシカルボニル）フェニル アクリジ
ン−９−カルボキシレートを出発アクリジニウム エス
テルとして使用することにより、アクリジニウム エス
テルで標識化した。使用した手順は以下の通りである。
cal Chemistry 1983年29（８）巻,1474−1479ページに
記載された手順で、２′,6′−ジメチル−４′−（Ｎ−
サクシンイミジロキシカルボニル）フェニル アクリジ
ン−９−カルボキシレートを出発アクリジニウム エス
テルとして使用することにより、アクリジニウム エス
テルで標識化した。使用した手順は以下の通りである。
250ugの抗体を、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液/0.15M
水酸化ナトリウム、pH8.0の溶液1ml中で希釈した。20ug
のアクリジニウム エステルを200mlのジメチルホルム
アミド中で希釈した。希釈アクリジニウム エステルを
希釈抗体溶液に加え、室温で15分間反応させた。10mg/m
lリシン溶液0.5mlをアクリジニウム エステル−抗体反
応混合物に加え、この反応混合物を２×20cm Sephadex
G−100（ファーマシア社製）カラムに通した。標識抗体
を溶離緩衝液を用いて溶離した。溶離は280Aの波長で監
視された。標識抗体が空隙容積中に出現した。
水酸化ナトリウム、pH8.0の溶液1ml中で希釈した。20ug
のアクリジニウム エステルを200mlのジメチルホルム
アミド中で希釈した。希釈アクリジニウム エステルを
希釈抗体溶液に加え、室温で15分間反応させた。10mg/m
lリシン溶液0.5mlをアクリジニウム エステル−抗体反
応混合物に加え、この反応混合物を２×20cm Sephadex
G−100（ファーマシア社製）カラムに通した。標識抗体
を溶離緩衝液を用いて溶離した。溶離は280Aの波長で監
視された。標識抗体が空隙容積中に出現した。
C.対照血清を、以下の手順により脂質を除去し、電解質
を調整することによって正常なヒト血清から調整した。
を調整することによって正常なヒト血清から調整した。
プールドヒト血清（pooled human serum）を、アエロ
シル（Aerosil）380［デグサ社（Degussa Corp）］（20
g/血清１）を用いて吸着処理し、脂質を除去した。次
に、得られた血清を0.22ミクロン膜フィルターに通し
た。血清のpHを希釈MClまたはNa OHで7.45と7.55の間に
調整した。
シル（Aerosil）380［デグサ社（Degussa Corp）］（20
g/血清１）を用いて吸着処理し、脂質を除去した。次
に、得られた血清を0.22ミクロン膜フィルターに通し
た。血清のpHを希釈MClまたはNa OHで7.45と7.55の間に
調整した。
D.自由TBGの低下した量（表１参照）を含む試料血清の
シリーズを次のように調整した。ヒト血清のプールは、
まず血清のpHを10NNa OHを用いて10.5に調整し、次にこ
の血清を0.22ミクロン膜フィルターで濾過することによ
り、T4ホルモンを涸渇した。次にこの血清をポンピング
し、ダウエックス（Dowex）１×２アニオン交換樹脂中
を数回循環させてT4を除去した。次に、10NHClを用いて
血清のpHを7.35−7.45に調整した。このT4涸渇調整品中
のTBGは完全に不飽和であった。全TBG濃度は、IMMOPHAS
E TBGラジオイムノアッセイ キット（チバ コーニン
グ ダイアグノスティックス社）を用いたラジオイムノ
アッセイにより測定した。既知量のT4をこの血清調整品
に加え、種々の飽和レベルでTBGを含む試料血清のシリ
ーズを調整した。
シリーズを次のように調整した。ヒト血清のプールは、
まず血清のpHを10NNa OHを用いて10.5に調整し、次にこ
の血清を0.22ミクロン膜フィルターで濾過することによ
り、T4ホルモンを涸渇した。次にこの血清をポンピング
し、ダウエックス（Dowex）１×２アニオン交換樹脂中
を数回循環させてT4を除去した。次に、10NHClを用いて
血清のpHを7.35−7.45に調整した。このT4涸渇調整品中
のTBGは完全に不飽和であった。全TBG濃度は、IMMOPHAS
E TBGラジオイムノアッセイ キット（チバ コーニン
グ ダイアグノスティックス社）を用いたラジオイムノ
アッセイにより測定した。既知量のT4をこの血清調整品
に加え、種々の飽和レベルでTBGを含む試料血清のシリ
ーズを調整した。
（表１参照） それぞれの試料について、従来の前述したラジオイム
ノアッセイ法を用いてT4および全TBGを測定した。それ
ぞれの試料のT3取込比は、従来のラジオイムノアッセイ
（MAGIC T3取込、チバ コーニング ダイアグノステ
ィックス社）を用いて測定された。それぞれの試料につ
いてのＴ取込比は以下の手順を用いて測定した。
ノアッセイ法を用いてT4および全TBGを測定した。それ
ぞれの試料のT3取込比は、従来のラジオイムノアッセイ
（MAGIC T3取込、チバ コーニング ダイアグノステ
ィックス社）を用いて測定された。それぞれの試料につ
いてのＴ取込比は以下の手順を用いて測定した。
それぞれの試料10ul、およびＢで調整したアクリジニ
ウム エステル標識抗ヒトTBG抗体（150ng/ml）の溶液1
00ulをＡで調整したT4常磁性粒子（100ug/ml）の懸濁液
500ulを含む試験チューブに加えた。得られた懸濁液を
室温で15分間培養した。次に、この懸濁液を、試験チュ
ーブ中の常磁性粒子の磁性分離に有用な特殊設計ラック
（チバ コーニング ダイアグノスティックス社）中に
試験チューブを置くことにより磁界中に置いた。磁界が
粒子を懸濁液の残りの部分から分離し、次に上清をデカ
ントした。
ウム エステル標識抗ヒトTBG抗体（150ng/ml）の溶液1
00ulをＡで調整したT4常磁性粒子（100ug/ml）の懸濁液
500ulを含む試験チューブに加えた。得られた懸濁液を
室温で15分間培養した。次に、この懸濁液を、試験チュ
ーブ中の常磁性粒子の磁性分離に有用な特殊設計ラック
（チバ コーニング ダイアグノスティックス社）中に
試験チューブを置くことにより磁界中に置いた。磁界が
粒子を懸濁液の残りの部分から分離し、次に上清をデカ
ントした。
粒子を50ulの水で１回洗浄し、磁界分離さて水をデカ
ントした。0.1NHNO3中の0.1％過酸化水素溶液0.3mlをチ
ューブに加え、洗浄含有の0.25N Na OH 0.3mlを注入
することによって誘発される光放射をルミノメーター
［フォトン カウンター、ラボラトリウム バーソルド
（Laboratorium Berthold）］で検出した。放射された
光は相対光量単位［relative light units（RLU）とし
て記録された。RLUは次の等式を用いてＴ取込比に変換
された。
ントした。0.1NHNO3中の0.1％過酸化水素溶液0.3mlをチ
ューブに加え、洗浄含有の0.25N Na OH 0.3mlを注入
することによって誘発される光放射をルミノメーター
［フォトン カウンター、ラボラトリウム バーソルド
（Laboratorium Berthold）］で検出した。放射された
光は相対光量単位［relative light units（RLU）とし
て記録された。RLUは次の等式を用いてＴ取込比に変換
された。
MAGIC T3取込ラジオイムノアッセイを用いて試験さ
れた試料のそれぞれについて、放射されたラジオメトリ
ック シグナルをシンチレーション カウンターで検出
し、１分間当りのカウント数（CPM）で記録した。（表
１参照） CPMは、次の等式を用いてT3取込比に変換さ
れた。
れた試料のそれぞれについて、放射されたラジオメトリ
ック シグナルをシンチレーション カウンターで検出
し、１分間当りのカウント数（CPM）で記録した。（表
１参照） CPMは、次の等式を用いてT3取込比に変換さ
れた。
実施例２ T3取込比およびＴ取込比を測定するための実施例1Dに
記載した方法を用いて20人の患者からの血清を測定し
た。結果を表２に示す。
記載した方法を用いて20人の患者からの血清を測定し
た。結果を表２に示す。
実施例１および２から明らかなように、当業者の認め
るT3取込法と本願発明の方法の間に優れた相関性のある
ことがわかる。
るT3取込法と本願発明の方法の間に優れた相関性のある
ことがわかる。
以下、本発明の実施態様を項分け記載する。
１）ａ）試料血清をｉ）不溶性担体物質に固定されたチ
ロキシンから成る複合物およびii）内因性チロキシン結
合グロブリンより過剰のチロキシン結合グロブリンに対
する標識抗体と共に培養して錯体複合物を形成し、 ｂ）該錯体複合物をあらゆる非結合標識抗体から分離
し、 ｃ）該錯体複合物に結合した標識の量を測定し、 ｄ）工程ｃ）の測定値と対照血清の測定値を関連づける
ことにより試料血清のチロキシン取込比を計算する、各
工程から構成される試料血清のチロキシン取込量の測定
方法。
ロキシンから成る複合物およびii）内因性チロキシン結
合グロブリンより過剰のチロキシン結合グロブリンに対
する標識抗体と共に培養して錯体複合物を形成し、 ｂ）該錯体複合物をあらゆる非結合標識抗体から分離
し、 ｃ）該錯体複合物に結合した標識の量を測定し、 ｄ）工程ｃ）の測定値と対照血清の測定値を関連づける
ことにより試料血清のチロキシン取込比を計算する、各
工程から構成される試料血清のチロキシン取込量の測定
方法。
２）不溶性担体物質が、直径約0.01−約10ミクロンの平
均粒径を有する大表面積を持った粒状不溶性物質である
ことを特徴とする実施態様１記載のチロキシン取込量の
測定方法。
均粒径を有する大表面積を持った粒状不溶性物質である
ことを特徴とする実施態様１記載のチロキシン取込量の
測定方法。
３）不溶性担体物質が常磁性粒子から構成されることを
特徴とする実施態様１記載のチロキシン取込量の測定方
法。
特徴とする実施態様１記載のチロキシン取込量の測定方
法。
４）チロキシン結合グロブリンに対する標識抗体が、酵
素標識、フルオロジェニック標識、ラジオメトリック標
識、バイオルミネセント標識またはケミルミネセント標
識で標識化されていることを特徴とする実施態様１記載
のチロキシン取込量の測定方法。
素標識、フルオロジェニック標識、ラジオメトリック標
識、バイオルミネセント標識またはケミルミネセント標
識で標識化されていることを特徴とする実施態様１記載
のチロキシン取込量の測定方法。
５）標識が２′,6′−ジメチル−４′−（Ｎ−サクシン
イミジロキシカルボニル）フェニル アクリジン−９−
カルボキシレートから誘導されるアクリジニウム エス
テル標識のケミルミネセント標識であることを特徴とす
る実施態様４記載のチロキシン取込量の測定方法。
イミジロキシカルボニル）フェニル アクリジン−９−
カルボキシレートから誘導されるアクリジニウム エス
テル標識のケミルミネセント標識であることを特徴とす
る実施態様４記載のチロキシン取込量の測定方法。
６）不溶性担体物質が常磁性粒子から成り、チロキシン
結合グロブリンに対する標識抗体が抗チロキシン結合ブ
ロブリン抗体およびアクリジニウム エステルから得ら
れることを特徴とする実施態様１記載のチロキシン取込
量の測定方法。
結合グロブリンに対する標識抗体が抗チロキシン結合ブ
ロブリン抗体およびアクリジニウム エステルから得ら
れることを特徴とする実施態様１記載のチロキシン取込
量の測定方法。
７）試料血清10ul当り常磁性粒子に固定されたチロキシ
ン約0.1−1.0ugが存在し、試料血清10ul当りチロキシン
結合グロブリンに対する標識抗体約10ng−約100ngが存
在することを特徴とする実施態様６記載のチロキシン取
込量の測定方法。
ン約0.1−1.0ugが存在し、試料血清10ul当りチロキシン
結合グロブリンに対する標識抗体約10ng−約100ngが存
在することを特徴とする実施態様６記載のチロキシン取
込量の測定方法。
８）試料血清10ul当り常磁性粒子に固定されたチロキシ
ン約5ugが存在し、試料血清10ul当りチロキシン結合グ
ロブリンに対する標識抗体約50ngが存在することを特徴
とする実施態様７記載のチロキシン取込量の測定方法。
ン約5ugが存在し、試料血清10ul当りチロキシン結合グ
ロブリンに対する標識抗体約50ngが存在することを特徴
とする実施態様７記載のチロキシン取込量の測定方法。
９）工程ｄ）が、 の等式を使用して行われることを特徴とする実施態様１
記載のチロキシン取込量の測定方法。
記載のチロキシン取込量の測定方法。
10）ａ）試料血清の全T4を測定し、 ｂ）実施態様９に記載の方法に従ってチロキシン取込比
を測定し、 の等式を使用して自由チロキシン指数を測定するために
ａ）の測定値とｂ）の測定値を関係づける、各工程より
成る試料血清の自由チロキシン指数の測定方法。
を測定し、 の等式を使用して自由チロキシン指数を測定するために
ａ）の測定値とｂ）の測定値を関係づける、各工程より
成る試料血清の自由チロキシン指数の測定方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 エリザベス ケイ クローデル アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02174 アーリントン オウバールック ロード 84
Claims (4)
- 【請求項１】ａ）試料血清をｉ）不溶性担体物質に固定
されたチロキシンから成る複合物およびii）内因性チロ
キシン結合グロブリンより過剰のチロキシン結合グロブ
リンに対する標識抗体と共に培養して錯体複合物を形成
し、 ｂ）該錯体複合物をあらゆる非結合標識抗体から分離
し、 ｃ）該錯体複合物に結合した標識の量を測定し、 ｄ）工程ｃ）の測定値と対照血清の測定値を関連づける
ことにより試料血清のチロキシン取込比を計算する、各
工程から構成される試料血清のチロキシン取込量の測定
方法。 - 【請求項２】不溶性担体物質が常磁性粒子から成り、チ
ロキシン結合グロブリンに対する標識抗体が抗チロキシ
ン結合グロブリン抗体およびアクリジニウムエステルか
ら得られることを特徴とする請求項１記載のチロキシン
取込量の測定方法。 - 【請求項３】工程ｄ）が、 の等式を使用して行われることを特徴とする請求項１記
載のチロキシン取込量の測定方法。 - 【請求項４】ａ）試料血清の全T4を測定し、 ｂ）請求項３に記載の方法に従ってチロキシン取込比を
測定し、 の等式を使用して自由チロキシン指数を測定するために
ａ）の測定値とｂ）の測定値を関係づける、各工程より
成る試料血清の自由チロキシン指数の測定方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/071,661 US4824777A (en) | 1987-07-08 | 1987-07-08 | Method for determining thyroxine uptake |
| US71661 | 1987-07-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6435371A JPS6435371A (en) | 1989-02-06 |
| JP2575825B2 true JP2575825B2 (ja) | 1997-01-29 |
Family
ID=22102776
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63170757A Expired - Lifetime JP2575825B2 (ja) | 1987-07-08 | 1988-07-08 | チロキシン取込量および自由チロキシン指数の測定方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4824777A (ja) |
| EP (1) | EP0298708B1 (ja) |
| JP (1) | JP2575825B2 (ja) |
| AU (1) | AU603686B2 (ja) |
| CA (1) | CA1301062C (ja) |
| DE (1) | DE3875825T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5196349A (en) * | 1987-12-01 | 1993-03-23 | Ciba Cornign Diagnostics Corp. | Immunoassays for thyroid hormones using thyroglobulin |
| DE3812610A1 (de) * | 1988-04-15 | 1989-10-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung der thyroxinbindekapazitaet und dazu geeignete standardloesung |
| DE3812609A1 (de) * | 1988-04-15 | 1989-11-09 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung von thyroxin und dazu geeignete standardloesung |
| US5364796A (en) * | 1989-07-11 | 1994-11-15 | Pb Diagnostics Systems, Inc. | Diagnostic assay system |
| US5817527A (en) * | 1995-11-06 | 1998-10-06 | Chiron Diagnostics Corporation | Conjugation of ligand to immobilized protein in organic solvent |
| US7271009B1 (en) * | 1997-11-18 | 2007-09-18 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multi-analyte diagnostic test for thyroid disorders |
| US6689566B1 (en) * | 1999-01-14 | 2004-02-10 | Scantibodies Laboratory, Inc. | Methods, kits, and antibodies for detecting parathyroid hormone |
| US7820393B2 (en) * | 1999-01-14 | 2010-10-26 | Scantibodies Laboratory, Inc. | Methods, kits and antibodies for detecting parathyroid hormone |
| EP1272855B1 (en) * | 2000-04-13 | 2007-06-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multi-analyte diagnostic test for thyroid disorders |
| CN101201354B (zh) * | 2006-12-14 | 2011-11-02 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 甲状腺素化学发光免疫分析定量测定试剂盒及制备方法 |
| CN105137095B (zh) * | 2015-08-21 | 2016-05-04 | 陈立国 | 游离甲状腺素的免疫分析试剂盒 |
| CN105372428B (zh) * | 2015-12-08 | 2016-08-24 | 陈立国 | 糖链抗原125的定量检测试剂盒 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4032626A (en) * | 1976-06-30 | 1977-06-28 | Corning Glass Works | Reagent and method for tbg assay |
| US4347059A (en) * | 1980-09-15 | 1982-08-31 | Beckman Instruments, Inc. | T3 Uptake polarization fluoroimmunoassay |
| US4476228A (en) * | 1982-11-08 | 1984-10-09 | Abbott Laboratories | Determination of unsaturated thyroxine binding protein sites using fluorescence polarization techniques |
| US4554088A (en) * | 1983-05-12 | 1985-11-19 | Advanced Magnetics Inc. | Magnetic particles for use in separations |
| US4591569A (en) * | 1984-04-11 | 1986-05-27 | Becton Dickinson & Company | Homogeneous fluorescent triiodothyronine uptake test |
| AU4108085A (en) * | 1984-05-29 | 1985-12-05 | Warner-Lambert Company | Triiodothyronine uptake test |
| DE3504406A1 (de) * | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur bestimmung der bindungskapazitaet des thyroxin bindenden globulins |
| US4745181A (en) * | 1986-10-06 | 1988-05-17 | Ciba Corning Diagnostics Corp. | Polysubstituted aryl acridinium esters |
-
1987
- 1987-07-08 US US07/071,661 patent/US4824777A/en not_active Expired - Fee Related
-
1988
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- 1988-07-06 EP EP88306131A patent/EP0298708B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-07-06 DE DE8888306131T patent/DE3875825T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1988-07-06 AU AU18745/88A patent/AU603686B2/en not_active Ceased
- 1988-07-08 JP JP63170757A patent/JP2575825B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| AU1874588A (en) | 1989-01-12 |
| EP0298708A3 (en) | 1990-01-10 |
| EP0298708B1 (en) | 1992-11-11 |
| EP0298708A2 (en) | 1989-01-11 |
| JPS6435371A (en) | 1989-02-06 |
| DE3875825T2 (de) | 1993-03-18 |
| US4824777A (en) | 1989-04-25 |
| AU603686B2 (en) | 1990-11-22 |
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