DE3875825T2 - Verfahren zur bestimmung der absorption von thyroxin. - Google Patents
Verfahren zur bestimmung der absorption von thyroxin.Info
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Thyroxinaufnahme. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Thyroxinaufnahme aus einer Serumprobe unter Verwendung von Festphasen-Thyroxin (T&sub4;) und einem markierten Anti-TBG-Antikörper
- Das thyroxinbindende Globulin (TBG) ist das hauptsächliche Serum-Carrierprotein für Thyroxin (T&sub4;) und Triiodthyronin (T&sub3;). Die physiologische Rolle von TBG ist in Zusammenhang mit dem T&sub4;-Transport und T&sub4;-Metabolismus am besten verstanden. Sofort nachdem T&sub4; in den Kreislauf abgegeben wird, liegt es fast vollständig an den drei Thyroxinbindungsproteinen gebunden vor, nämlich Albumin, Präalbumin und, hauptsächlich, TBG. Die ungebundene T&sub4;-Fraktion (freies T&sub4;) ermöglicht eine genaue Einschätzung des Thyrometabolismus-Status eines Patienten. Die Konzentration an freiem T&sub4; ist eine Funktion sowohl der Gesamtserum T&sub4;- und T&sub4;-Bindungsproteinkonzentrationen. Von den drei Bindungsproteinen beeinflußt eine Veränderung in der TBG-Konzentration die Gesamt-T&sub4;-Konzentration am meisten.
- Ungesättigte TBG-Level und ein freier T&sub4;-Index (FTI) werden häufig als Indikatoren für den Thyroidstatus verwendet. FTI wird herkömmlicherweise dadurch erhalten, daß das Produkt von Gesamt-T&sub4; und einem T&sub3;-Aufnahmetest errechnet wird. Der Gesamt- T&sub4;-Gehalt kann durch kompetitive Proteinbindung, Umlagerungsanalyse oder Radioimmunoassay bestimmt werden. Zur Bestimmung gesättigter TBG-Level hat sich der T&sub3;-Aufnahmetest als insbesonders geeignetes Verfahren erwiesen.
- Beim T&sub3;-Aufnahmetest entwickelt sich ein Gleichgewicht zwischen dem Patientenserum, zugegebenem markierten T&sub3; und einem inerten exogenen Bindemittel (Trennmittel) des markierten T&sub3;. Hierzu muß eine ausreichende Menge an markiertem T&sub3; zugegeben werden, um die Bindungsstellen auf dem TBG zu sättigen, wonach das ungebundene, markierte T&sub3; durch das Trennmittel adsorbiert und gezählt wird. Aus diesem Grund ist, wenn der endogene Thyroxinlevel, beispielsweise bei Hyperthyroidismus, erhöht ist, das Serum-TBG relativ gesättigt, und die T&sub3;-Aufnahme wird dann hoch sein. Im Gegensatz dazu wird bei Hypothyroidismus, d. h., wenn die Thyroxinabgabe gering ist, das markierte endogene T&sub3; an das relativ ungesättigte TBG bilden, wodurch sich eine geringe T&sub3;-Aufnahme ergibt.
- Die hauptsächlichen Veränderungen bei den verschiedenen T&sub3;-Aufnahmeverfahren betreffen insbesondere die chemische Natur des Trennmittels. Als inerte Bindemittel für markiertes T&sub3; wurden beispielsweise Ionenaustauschharze, Hämoglobin-gesättigte Holzkohle, Sephade® G-25, Nylon, anorganische kristalline Materialien, T&sub3;-Antikörper, die an den Wänden von Polymer-beschichteten Teströhrchen oder an Teilchen immobilisiert sind und T&sub3;-Antikörper, die an bestimmten Harzen immobilisiert sind, verwendet. Ein allgemeiner Überblick hierzu ist in der US-Patentschrift No. 4,225,412 enthalten.
- Das US-Patent No. 4,032,626 beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von TBG in einer flüssigen Probe unter Verwendung von radiomarkiertem T&sub4; und Anti-TBG-Antikörpern, die auf unlöslichen Trägermaterialien immobilisiert sind. Die Probe wird mit markiertem T&sub4; und den immobilisierten Anti-TBG-Antikörpern inkubiert. Die Konzentration an TGB kann durch Abtrennen des markierten Verbundkörpers von ungebundenem markierten T&sub4; und durch Zählen von gebundenem markierten T&sub4; bestimmt werden.
- Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren zur Bestimmung der Thyroxinaufnahme aus einem Probenserum zur Bestimmung des Levels an ungesättigtem TBG und des freien Thyroxinindex aus einem Probenserum bereitzustellen.
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Thyroxinaufnahme (TA) aus einem Probenserum, umfassend die Schritte:
- (a) Inkubieren der Serumprobe mit (i) einem Verbundstoff enthaltend Thyroxin (T&sub4;), immobilisiert auf einem unlöslichen Trägermaterial, und (ii) einen Überschuß eines markierten Antikörpers gegen thyroxinbindendes Globulin über endogenes thyroxinbindendes Globulin, um einen komplexierten Verbundstoff zu bilden;
- (b) Abtrennen des komplexierten Verbundstoffes von allen ungebundenen markierten Antikörpern;
- (c) Messen der mit dem komplexierten Verbundstoff verbundenen Markierungsmenge und
- (d) Bestimmung eines Thyroxinaufnahmeverhältnisses aus der Serumprobe durch in Beziehung setzen der Messung (c) zur Messung eines Referenzserums.
- T&sub4; kann auf dem unlöslichen Trägermaterial durch beliebige Verfahren immobilisiert werden, die ein immobilisiertes T&sub4; ergeben, der an TBG binden kann. Beispielsweise ist das von Kägedal et al. in Clinica Chimica Acta 78, Seiten 103-111 (1977) (im folgenden Kägedal et al.), beschriebene Verfahren, welches ein bifunktionelles Reagenz verwendet, bei der Immobilisierung von T&sub4; zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar.
- Das unlösliche Trägermaterial kann aus beliebigen, bekannten Trägermaterialien bestehen, beispielsweise aus Cellulose, Sephade®, Polystyrol, Nylon, Polyacrylamid, Latex, Glas, magnetisierbaren Teilchen wie Eisenoxidteilchen, usw . . Bevorzugt wird T&sub4; auf einem unlöslichen Trägermaterial mit einer großen Oberfläche, in Teilchenform, bevorzugt mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von z. B. 0,01-10 um, immobilisiert, wodurch die gravimetrische Absenkung während der Inkubationszeit limitiert wird. Die Teilchengröße sollte bevorzugt groß genug sein, um eine leichte und schnelle Abtrennung unter Verwendung herkömmlicher Laborverfahren zu ermöglichen.
- Paramagnetische Teilchen sind das bevorzugte Trägermaterial. Diese Teilchen enthalten einen Eisenoxidkern, der von einer polymerisierten Silanbeschichtung umgeben ist (vgl. beispielsweise die US-Patentschrift No. 4,554,088). T&sub4; kann auf der Oberfläche dieser Teilchen dadurch immobilisiert werden, daß zunächst ein Glycoprotein (beispielsweise α&sub1;-saures Glycoprotein oder Mucin) auf den Teilchen immobilisiert wird und anschließend das T&sub4; auf dem Glycoprotein mit einem bifunktionellen Expoxid immobilisiert wird (vgl. hierzu Kägedal et al.).
- Die Menge an immobilisiertem T&sub4; pro Einheit Serumprobe kann variieren; sie muß jedoch derart sein, daß die Kapazität für die TBG-Bindung ausreichend ist, um den physiologischen Bereich an freiem TBG in klinischen Proben zu diskriminieren. Normale menschliche Seren enthalten etwa 15 ug bis etwa 34 ug an TBG pro ml Serum und bei pathologischen Zuständen kann die Menge von weniger als 10 ug bis etwa 60 ug TBG pro ml Serum variieren. Die Menge an benötigtem immobilisierten T&sub4; kann empirisch unter Verwendung bekannter Verfahren durch Titrieren des immobilisierten T&sub4; gegen Proben mit unterschiedlichen, bekannten Mengen an freiem TBG bestimmt werden. Durch diese Titration wird die Menge an immobilisiertem T&sub4; bestimmt, die notwendig ist, um das untere Ende des physiologischen Bereiches an freien TBG vom oberen Ende des physiologischen Bereiches an freiem TBG zu unterscheiden. Bevorzugt werden etwa 0,1-1,0 ug, insbesondere bevorzugt etwa 0,5 ug an auf dem Trägermaterial immobilisiertem T&sub4; pro 10 ul Serumprobe verwendet.
- Die Menge an auf einem Teilchen immobilisiertem T&sub4; kann in Abhängigkeit von den Präparationsbedingungen schwanken. Praktischerweise wird deshalb die Menge an immobilisiertem T&sub4; in einer Probe durch die Erhöhung oder Erniedrigung der Menge an Teilchen in der Probe eingestellt.
- Unmarkierter Anti-TBG-Antikörper kann unter Verwendung bekannter Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern hergestellt werden (vgl. beispielsweise G. Köhler und C. Milstein, Eur. J. Immunology, Vol. 6, 511-519, 1976). Der Anti- TBG-Antikörper wird anschließend gereinigt und durch bekannte Verfahren markiert (beispielsweise enzymatische, fluorogene, radiometrische, biolumineszierende, chemilumineszierende etc. Markierungen und Marker) (vgl. beispielsweise Woodhead et al., Clinical Chemistry 29(8), Seiten 1474-1479, 1983). Bevorzugt wird der Anti-TBG-Antikörper mit einem Acridiniumester markiert. Beliebige geeignete Acridiniumester können für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. Geeignete Acridiniumester sind beispielsweise in der US-Anmeldung 915,527, angemeldet am 6. Oktober 1986, veröffentlicht, auf die hier vollinhaltlich Bezug genommen wird. Insbesondere bevorzugt wird 2',6'-Dimethyl-4'-(N-succinimidyloxycarbonyl) phenyl-acridin-9-carboxylat.
- Im Vergleich zum immobilisierten TBG sollte ein Überschuß an markiertem Anti-TBG-Antikörper vorliegen. Die Menge an benötigtem Anti-TBG-Antikörper kann empirisch unter Verwendung bekannter Verfahren durch Titrieren des Anti-TBG-Antikörpers gegen Proben mit bekannten Mengen an TBG bestimmt werden. Durch diese Titration wird die Menge an Anti-TBG-Antikörper bestimmt, die notwendig ist, um TBG bei den im allgemeinen in klinischen Proben auftretenden Leveln zu diskriminieren. Der Überschuß an Anti-TBG-Antikörper ist notwendig, so daß die Aufnahme von markiertem Anti-TBG direkt zur Menge an auf dem komplexierten Komposit gebundenem TBG in Beziehung steht. Bevorzugt werden etwa 10 ng bis etwa 100 ng, insbesondere bevorzugt etwa 50 ng, an markiertem Anti-TBG-Antikörper pro 10 ul Serumprobe verwendet.
- Die Inkubationsbedingungen können in Abhängigkeit von der Zeit, der Temperatur und dem Endinkubationsvolumen variieren; bevorzugt sollte die Inkubation jedoch wenigstens 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stattfinden.
- Nach der Inkubation wird der komplexierte Verbundstoff (Komposit) vom Inkubationsmedium abgetrennt. Das Komposit wird auf einer wasser-unlöslichen Festphase gebildet, welches durch herkömmliche Mittel, beispielsweise durch Sedimentation, Zentrifugation oder Magnetismus, abtrennbar ist, und zwar in Abhängigkeit vom verwendeten unlöslichen Trägermaterial. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, in welcher als Trägermaterial magnetisierbare Teilchen verwendet werden, wird die Abtrennung in einem magnetischen Feld durchgeführt.
- Die Aufnahme an markiertem Anti-TBG-Antikörper steht direkt in Beziehung mit der Menge an auf dem komplexierten Komposit komplexierten TBG. Die Markierungsmenge, die mit dem komplexierten Komposit verbunden ist, kann durch wenigstens zwei Methoden bestimmt werden: 1) direkte Quantifizierung der mit dem komplexierten Komposit verbundenen Markierung oder 2) indirekte Quantifizierung der im Inkubationsmedium nach der Abtrennung verbleibenden Markierung und anschließend Subtraktion dieser Menge von der eingesetzten Gesamtmarkierung. Das geeignete Quantifizierungsverfahren hängt insbesondere von der verwendeten Markierung ab. Wenn beispielsweise als Markierung Acridiniumester verwendet wird, wird bevorzugt die direkte Quantifizierung der mit dem komplexierten Komposit verbundenen Markierung verwendet, und die Markierungsmenge kann in einem Luminometer durch Messung der durch die chemilumineszierende Reaktion des Acridiniumesters freigesetzten Photonen gemessen werden. Das durch die Photonen verursachte Signal wird in relativen Lichteinheiten (RLU), gemessen, welche das Licht quantifizieren, welches von der Oxidation der Acidiniumestermarkierung auf dem Anti-TBG-Antikörper emitiert wird.
- Die Markierungsmenge, von der bestimmt wurde, daß sie mit dem komplexierten Komposit im erfindungsgemäßen Verfahren assoziiert ist, wird in ein Thyroxin-Aufnahme (T-Aufnahme)-Verhältnis durch Division des Signals aus einem Referenzserum (beispielsweise normales menschliches Serum) durch das Signal aus dem Serumprobentest, umgewandelt, d. h.:
- T-Aufnahmeverhältnis = Signal aus dem Referenzserum/Signal aus dem Probenserum
- Das vom Referenzserum verursachte Signal wird unter Verwendung der gleichen Markierungs-, Verfahrens- und Reaktionsbedingungen erhalten, die verwendet werden, um das Signal aus dem Probenserum zu erhalten.
- Falls das T-Aufnahmeverhältnis 1 ist, dann ist die Menge an ungesättigtem TBG im Probenserum die gleiche wie die Menge an ungesättigtem TBG im Referenzserum. Falls das T-Aufnahmeverhältnis kleiner als 1 ist, dann ist die Menge an ungesättigtem TBG im Probenserum größer als die Menge an ungesättigtem TBG im Referenzserum. Falls das T-Aufnahmeverhältnis größer als 1 ist, dann ist die Menge an ungesättigtem TBG im Probenserum geringer als die Menge an ungesättigtem TBG im Referenzserum.
- Dieses T-Aufnahmeverhältnis kann verwendet werden, um den freien Thyroxin-Index der Probe unter Verwendung der folgenden Gleichung zu berechnen:
- Gesamt T&sub4; · T-Aufnahmeverhältnis/100 = FTI
- Das Gesamt-T&sub4; kann unter Verwendung beliebiger, an sich bekannter Verfahren bestimmt werden, beispielsweise durch Verwendung eines MAGIC T&sub4;-Radioimmunoassay Kits (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, Massachusetts).
- Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
- A. Paramagnetische Teilchen wurden von Advanced Magnetics, Inc. (Cambridge, Massachusetts) erhalten.
- 250 mg an Teilchen wurden in ein konisches Zentrifugenröhrchen gegeben und fünfmal mit 25 ml Wasser gewaschen. 25 ml einer Lösung aus 2,5% Glutaraldehyd in 10 mM Acetatpuffer, pH 5,5, wurden anschließend zum Röhrchen zugegeben und der Inhalt des Röhrchens wurde anschließend sanft bei Raumtemperatur 3 Stunden lang vermischt. Das Röhrchen wurde in ein magnetisches Feld gegeben, um die Teilchen von der Glutaraldehydlösung abzutrennen, und anschließend wurde die Glutaraldehydlösung dekantiert. Die Teilchen wurden anschließend einmal mit 25 ml 10 mM Acetatpuffer pH 5,5 gewaschen, und anschließend wurden 25 ml einer 5 mg/ml Lösung an α&sub1;-l-saurem Glycoprotein in 10 mM Acetatpuffer, pH 5,5, zum Röhrchen zugegeben, und der Inhalt des Röhrchens wurde anschließend leicht über Nacht bei Raumtemperatur vermischt. Die Teilchen wurden in einem magnetischen Feld abgetrennt, und der Überstand wurde dekantiert. Die Teilchen wurden viermal in 25 ml Wasser gewaschen. Zum Röhrchen wurden anschließend 20 ml 30 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,4 und 20 ul 1,4-Butandioldiglycidyl-ether gegeben, und der Inhalt des Röhrchens wurde anschließend sanft über Nacht bei Raumtemperatur vermischt. Die Teilchen wurden in einem magnetischen Feld abgetrennt, und der Überstand wurde dekantiert. Die Teilchen wurden anschließend fünfmal mit 25 ml Wasser gewaschen.
- Die folgende T&sub4;-Lösung wurde hergestellt:
- 40 ml an 50 mM Natriumbicarbonat, pH 9,5
- 10 ul Dimethylformamid
- 1 ml 20 mg/ul Lösung an T&sub4; in 0,1 N NaOH.
- Die T&sub4;-Lösung wurde zum die Teilchen enthaltenden Röhrchen gegeben, und der Inhalt des Röhrchens wurde anschließend sanft über Nacht bei Raumtemperatur vermischt. Das Röhrchen wurde in ein magnetisches Feld gegeben, um die Teilchen von der T&sub4;-Lösung abzutrennen, und die T&sub4;-Lösung wurde dekantiert. Die Teilchen wurden fünfmal mit 25 ml Wasser gewaschen. Eine 25 ml Lösung an 2 M Glycin in 50 mM Bicarbonatpuffer wurden zum Röhrchen zugegeben, und der Inhalt des Röhrchens wurde sanft über Nacht beim Raumtemperatur vermischt. Die Teilchen wurden magnetisch abgetrennt, der Glycinpuffer dekantiert und die Teilchen wurden dreimal mit 25 ml Wasser gewaschen. Eine 25 ml Lösung an 2,5% Rinderserumalbumin (BSA) in 10 mM phosphatgepufferter Saline, pH 7,4, wurden zum Röhrchen gegeben, und der Inhalt des Röhrchens wurde sanft über Nacht bei Raumtemperatur vermischt. Die Teilchen wurden magnetisch abgetrennt, die BSA-Lösung dekantiert, und die Teilchen wurden dreimal mit 25 ml Wasser gewaschen. Die resultierenden Teilchen wurden anschließend in 10 mM Natriumphosphatpuffer auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml resuspendiert.
- B. Ascitesflüssigkeit, enthaltend Anti-menschlichen-TBG-Antikörper, wurde von den Meloy Laboratorien (Springfield, Virginia) bezogen. Der monoklonale Antikörper wurde aus der Ascitesflüssigkeit durch das folgende Verfahren unter Verwendung eines Affi-Gel Protein A MAPS II Kit (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) gereinigt. 0,1 ml der Ascitesflüssigkeit wurden mit 0,1 ml des Bindungspuffers aus dem Affi-Gel Protein A MAPS II Kit verdünnt. Die verdünnte Ascitesflüssigkeit wurde anschließend mit 1 ml der Protein-A-Gel-Suspension aus dem Affi-Gel Protein A MAPS II Kit, vorgewaschen mit dem Bindungspuffer, vermischt. Diese Gelmischung wurde anschließend in eine 1·5 cm Säule gepackt und anschließend mit 15 · Bettvolumen der Gelmischung mit Bindungspuffer gewaschen. Der Antimenschliche TBG-Antikörper wurde von der Gelmischung unter Verwendung des Elutionspuffers aus dem Affi-Gel Protein A MAPS II Kit bei pH 6,0 eluiert. Die Elution wurde bei einer Wellenlänge von 0,028 um (280 Å) beobachtet, um den Punkt der Elution des Antikörpers zu bestimmen. Der Antikörper wurde anschließend vom Elutionspuffer durch Dialyse gegen PBS-Puffer abgetrennt.
- Der Anti-menschliche-TBG-Antikörper wurde mit Acridiniumester unter Verwendung des in Woodhead, et al. Clinical Chemistry 29(8), 1474-1479 (1983) beschriebenen Verfahrens unter Verwendung von 2',6'-Dimethyl-4'-(N-succinimidyloxycarbonyl)phenyl-acridin-9-carboxylat als Starter- Acridiniumester markiert. Das verwendete Verfahren war wie folgt:
- 250 ug des Antikörpers wurden in 1 ml einer Lösung aus 0,1 M Natriumphosphatpuffer/0,15 M NaCl, pH 8,0, verdünnt. 20 ul des Ancridiniumesters wurden in 200 ul Dimethylformamid verdünnt. Der verdünnte Acridiniumester wurde zur verdünnten Antikörperlösung zugegeben und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Anschließend wurden 0,5 ml einer 10 mg/ml Lysin-Lösung zur Acridiniumester-Antikörperreaktionsmischung zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde anschließend über eine 2·20 cm Sephade® G-100-Säule (Pharmacia Ltd., Uppsala, Schweden), geschickt. Der markierte Antikörper wurde unter Verwendung des Elutionspuffers eluiert. Der Eluent wurde bei einer Wellenlänge von 0,028 um (280 verfolgt. Der markierte Antikörper erschien im Porenvolumen.
- C. Das Referenzserum wurde aus normalem menschlichen Serum durch Entfernen der Lipide und Einstellen der Elektrolyte nach dem folgenden Verfahren hergestellt:
- Vereinigtes menschliches Serum wurde mit Aerosil 380 (erhältlich von der Fa. Degussa Corp., Peterboro, N.J.) (20 g/l Serum) durch Adsorption behandelt, um die Lipide zu entfernen. Das Serum wurde anschließend durch ein 0,22 um Membranfilter passiert. Der pH des Serum wurde anschließend zwischen 7,45 und 7,55 mit verdünnter HCl oder NaOH eingestellt.
- D. Eine Serie an Serumproben, die abnehmende Mengen an freiem TBG enthielten (vgl. Tabelle 1), wurde wie folgt hergestellt:
- Ein Pool an menschlichem Serum wird von T&sub4;-Hormonen durch Einstellen des pH des Serums auf 10,5 mit 10 N NaOH und anschließendes Filtrieren des Serums durch ein 0,22 um Membranfilter befreit. Das Serum wird anschließend mehrere Male über ein Dowex 1·2 Anionenaustauscher gepumpt und recyled, um T&sub4; zu entfernen. Das Serum wurde anschließend auf pH 7,35-7,45 mit 10 N HCl eingestellt. Das TBG in dieser T&sub4;-verarmten Zubereitung war vollständig ungesättigt. Die Gesamt-TBG-Konzentrationen wurden durch einen Radioimmunoassay unter Verwendung eines IMMOPHASE TBG Radioimmunoassay Kits (Ciba Corning Diagnostic Corp., Medfield, MA) bestimmt. Bekannte Mengen an T&sub4; wurden zu dieser Serumpräparation zugegeben, und eine Serie an Serumproben, die TBG in verschiedenen Sättigungsmengen enthielt, wurde hergestellt (vgl. Tabelle 1).
- Jede Probe wurde anschließend auf T&sub4; und Gesamt-TBG unter Verwendung herkömmlicher Radioimmunoassay-Verfahren, wie sie oben beschrieben wurden, gemessen. Das T&sub3;-Aufnahmeverhältnis einer jeden Probe wurde unter Verwendung eines herkömmlichen Radioimmunoassays bestimmt (MAGIC T&sub3;-Uptake, Ciba Corning Diagnostic Corp., Medfield, MA). Das T-Aufnahmeverhältnis für jede Probe wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens bestimmt:
- Zu einem Teströhrchen, welches 500 ul einer Suspension der T&sub4;-Paramagnetischen Teilchen (100 ug/ml), hergestellt in A, enthielt, wurden 10 ul einer jeden Probe und 100 ul einer Lösung des Acridiniumester-markierten Anti-menschlichen-TBG-Antikörpers, hergestellt in B (150 ng/ml), zugegeben. Die resultierende Suspension wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Suspension wurde anschließend in ein magnetisches Feld gegeben, wobei das Teströhrchen in ein speziell geformtes Rack gegeben wurde, welches zur magnetischen Abtrennung paramagnetischer Teilchen in Teströhrchen speziell ausgebildet ist (erhältlich von Ciba Corning Diagnostics Corp., Medfield, MA). Im magnetischen Feld wurden die Teilchen vom Rest der Suspension abgetrennt, und der Überstand wurde anschließend dekantiert. Die Teilchen wurden einmal in 50 ul Wasser gewaschen, magnetisch abgetrennt, und das Wasser wurde dekantiert. 0,3 ml einer Lösung aus 0,1% Wasserstoffperoxid in 0,1 N HNO&sub3; wurde zum Röhrchen zugegeben, und die Lichtemission, getriggert durch die Injektion von 0,3 ml 0,25 N NaOH, enthaltend ein Detergenz, wurde in einem Luminometer (Photonzähler, Laboratorium Berthold, Wildbad, Westdeutschland) nachgewiesen. Das emittierte Licht wurde in Form relativer Lichteinheiten (RLU) aufgezeichnet. RLU wurde zum T-Aufnahmeverhältnis unter Verwendung der folgenden Gleichung umgewandelt:
- T-Aufnahmeverhältnis = RLU des Referenzserums/RLU des Probenserums
- Das radiometrische Signal, welches für jede unter Verwendung des MAGIC T&sub3;-Aufnahme-Radioimmunoassays getestete Probe emittiert wurde, wurde in einem Szintillationszähler nachgewiesen und in Form von Counts pro Minute (CPM) (vgl. Tabelle 1) aufgezeichnet. CPM wurde in das T&sub3;-Aufnahmeverhältnis unter Verwendung der folgenden Gleichung umgewandelt:
- T-Aufnahmeverhältnis = CPM des Referenzserums/CPM des Probenserums TABELLE 1 Vergleich des T-Aufnahmeverfahrens und des T&sub3;-Aufnahmeverfahrens Probe T&sub4; TBG RLU T-Aufnahmeverhältnis CPM T&sub3;-Aufnahmeverhältnis Referenzserum
- Serum von 20 Patienten wurde unter Verwendung des in Beispiel 1D beschriebenen Verfahrens zur Bestimmung der T&sub3;-Aufnahme und der T-Aufnahme gemessen. Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 2 aufgeführt. TABELLE 2 Vergleich des T-Aufnahmeverfahrens und des T&sub3;-Aufnahmeverfahrens unter Verwendung von Serum verschiedener Patienten Serumnummer RLU T-Aufnahmeverhältnis CPM T&sub3;-Aufnahmeverhältnis Referenzserum
- Wie aus den Beispielen 1 und 2 zu entnehmen ist, besteht eine ausgezeichnete Korrelation zwischen dem aus dem Stand der Technik bekannten T&sub3;-Aufnahmeverfahren und dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Claims (10)
1. Verfahren zur Bestimmung der Thyroxinaufnahme aus einer
Serumprobe,
dadurch gekennzeichnet, daß
es umfaßt:
(a) Inkubieren der Serumprobe mit (i) einem Verbundstoff
enthaltend Thyroxin T&sub4;, immobilisiert auf einem
unlöslichen Trägermaterial, und (ii) einen Überschuß
eines markierten Antikörpers gegen thyroxinbindendes
Globulin über endogenes thyroxinbindendes Globulin,
um einen komplexierten Verbundstoff zu bilden;
(b) Abtrennen des komplexierten Verbundstoffes von allen
ungebundenen markierten Antikörpern;
(c) Messen der mit dem komplexierten Verbundstoff
verbundenen Markierungsmenge und
(d) Bestimmung eines Thyroxinaufnahmeverhältnisses aus
der Serumprobe durch in Beziehung setzen der Messung
(c) zur Messung eines Referenzserums.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das unlösliche
Trägermaterial ein unlösliches Material in Teilchenform mit einem
hohen Oberflächenbereich ist, wobei die durchschnittliche
Teilchengröße von etwa 0,01 bis etwa
10 um im Durchmesser beträgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das unlösliche
Trägermaterial paramagnetische Teilchen umfaßt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der
markierte Antikörper gegen das thyroxinbindende Globulin
mit einer enzymatischen, fluorogenen, radiometrischen,
biolumineszierenden oder chemilumineszierenden Markierung
markiert ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei eine
Acridiniumestermarkierung verwendet wird, die hergeleitet ist aus 2',6'-
Dimethyl-4'-(N-succinimidyloxycarbonyl) phenyl acridin-9-
carboxylat.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das unlösliche
Trägermaterial parmagnetische Teilchen umfaßt und wobei der
markierte Antikörper gegen das thyroxinbindende Globulin
hergestellt wird aus einem Anti-thyroxin-bindenden
Globulinantikörper und einem Acridiniumester.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei etwa 0,1 bis etwa 1,0 ug
an Thyroxin T&sub4; auf den paramagnetischen Teilchen pro 10 ul
Serumprobe immobilisiert vorliegen und wobei etwa 10 ng
bis etwa 100 ng des markierten Antikörpers gegen das
thyroxinbindende Globulin pro 10 ul der Serumprobe
vorliegen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei 0,5 ug des auf den
paramagnetischen Teilchen immobilisierten Thyroxin T&sub4; pro 10
ul Serumprobe vorliegen und wobei etwa 50 ng des
markierten Antikörpers gegen das thyroxinbindende Globulin pro
10 ul der Serumprobe vorliegen.
9. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8,
wobei der Verfahrensschritt (d) den Gebrauch der
folgenden Gleichung umfaßt:
T-Aufnahmeverhältnis = Messung aus den Referenzserum/Messung aus dem Probenserum
10. Verfahren zur Bestimmung des freien Thyroxinindex aus
einer Serumprobe,
dadurch gekennzeichnet, daß
das Verfahren umfaßt:
(a) Bestimmen des Gesamtgehaltes an T&sub4; der Serumprobe;
(b) Bestimmen des T-Aufnahmeverhältnisses nach dem
Verfahren gemäß Anspruch 9 und
(c) in Beziehung setzen der Bestimmung von (a) zu
Bestimmung von (b), um den freien Thyroxinindex unter
Verwendung der folgenden Gleichung zu bestimmen:
FTI = Gesamt T&sub4; · T-Aufnahmeverhältnis/100.
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