JPH06506468A - メラニン系画像強調剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 メラニン系画像強調剤 本発明は、磁気共鳴イメージング（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｉ ｍａｇｉｎｇ：　ＭＲＩ）、磁気共鳴分光分析法（ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏ ｎａｎｃｅ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：　ＭＲ５）、放射性同位元素走差や高 周波イメージングに用いる、生きている動物由来の組織、器官の画像および核ス ペクトルを強調する画像強調剤、コントラスト剤ならびにスペクトルシフト剤に 関する。

磁気共鳴イメージングは、原子核の磁気スピン特性を利用して画像を作りだす、 基本的にはより有名なＸ線法ＣＴ走差に似ている医学上の手法である。原子核に は、中性子と陽子がある。原子が持つ中性子あるいは陽子の存在数は奇数倍であ るが、スピン量子数（１）はゼロ以外の値を有する。原子は、回転する小さな球 のように運動すると考えることができる。原子核には正の電荷があるので、電線 を輪に結んで電流を通したときのように、回転することによって磁気モーメント （Ｕ）が発生する。双極子は磁場に暴露されると、磁場に対して整列する。スピ ン（磁気モーメント）ベクトルが磁場の影響を受けるとトルクが発生する。この トルクのため、原子核は磁場の軸の周囲を次のラーモアの公式で表される速度で 運動する。

ｆ＝ｗ／２　ｙｒ　＝　７　Ｂｏ／２　ｙｒｆ　・　ヘルツ（Ｈｚ）単位による 磁気振動数Ｗ　・　ラジアン単位による秒当り角振動数γ　＝　磁気回転率（ｍ ａｇｎｅｔｉｃ　ｇｙｒｉｃ　ｒａｔｉｏ）Ｂｏ　・　静電気磁場 γ　−その同位元素固有の核定数 原子核の共鳴振動数は、核の磁気回転率（特定の核の定数）と印加された磁場の 強さくラーモアの公式）の関数である。原子核の磁気回転率は、磁気モーメント と原子核のスピン量子数（１）に関連している。また、スピン量子数は、−個の 原子核が持つことができるエネルギー状態の数を表す。即ち、原子核は、２Ｉ＋ １のエネルギー準位を有する。水素原子核（陽子）の核スピンは、ｌ／２であり 、したがって恐らくはスピン状態が二つあると思われる。核磁気共鳴分光分析法 （ｎｕｃｌｅａｒｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃ ｏｐｙ：　Ｎ　Ｍ　Ｒ）では、磁気モーメントは一定の磁場（図１）を一定の振 動数で回転するものとされている。一つの試料内でも、多数の原子核が二つある スピン状態のうちの一つの状態でこの磁場の周囲を回転して、磁場と平行に「巨 視的磁化」を作り出している。外部からの影響がないときには、低エネルギース ピン状態の原子核が増加する。

共鳴は、二つの異なるエネルギー状態間の転移の誘導である。磁気共鳴イメージ ングにとり最も有用な原子核は、水素の主な同位元素である陽子である。水素は 生物系の水分（ＥＩＯ２３７ｃｍ３）や、他の生化学分子にきわめて豊富に存在 し、必要とされる磁気モーメントも持っている。二つのスピン状態（＋１７２と 　−１７２）間の転移を誘導するためのエネルギーは、水素の二つのスピン状態 のエネルギー差（△Ｅ）である。Ｍ旧では、ラーモア振動数で高周波（ＲＦ）エ ネルギーを印加して、磁気モーメントをｍ・＋１７２状態（低エネルギー）がら ｍ＝＝１７２状態（高エネルギー）にフリップさせると、共鳴が発生する。磁気 共鳴が吸収されるのを検出するのは、横方向の磁化（Ｂｏに垂直な磁化）によっ てのみ可能である。横方向成分Ｍｘｙのみが時間依存性なので、ファラデーの誘 導法則により時間依存性の磁化のみが受信コイルに電圧を誘導することができる 。Ｂ振幅の高周波（ＲＦ）界を、運動しているスピンに合わせて回転させながら 印加すると、横方向の磁化が発生する。

高周波界を主磁場に対して垂直方向に働がせると、磁化を回転させながら静止状 態がら遠ざける効果が生まれる。巨視的磁化に、高周波界のトルクが発生し、こ の高周波界のトルクは、その周囲に磁化を回転させる働きをする。Ｂ振幅の高周 波界印加の期間が、有効磁化を９０°の角度で回転さるようなものである場合、 磁化は、高周波界に対して水平ま１こは垂直になる（図３）。

回転角度θ、ＲＦのフリップ角度は、次のエルンスト公式で表すことができる。

θ＝γＢ、τ Ｂ、＝　ＦＲ界の振幅 τ　・　期間 ＲＦ界を取り除くと、磁化は静電気磁場の影響を受けるようになって、その周囲 を運動する。検出コイルを、その軸がｙ軸と平行するように置いた場合、このコ イルに誘導されるＡＣ電圧は次の通りである。

γδＭｘｙ＠ＣＯ５ＷＴ Ｍｘｙ”　＝　９０度のＲＦパルス後の初期の横方向磁化 τ　−回転の間の時間間隔 横方向磁化は、時間定数Ｔ２”にしたがって経時減衰し、やがては零となる。

したがって、 γδＭｘｙ＠ｅ−””　ｃｏｓ　ｗｒ この式は誘導減衰あるいは自由誘導減衰（ＦＩＤ）と呼ばれる、振動減衰を表し ている。横方向の磁化が経時減衰して零になると、縦方向の磁化が増加してもと の平衡値に戻る。この平衡値に戻ることを緩和という。

ＲＦが原子核を刺激すると、原子核を励起状態に転移させようとしているエネル ギーを吸収する。原子核はエネルギーをいわゆる格子と呼ばれる周囲に放散して 、基底状態に戻ることができる。この緩和方法は、スピン格子緩和（Ｔ１）と呼 ばれている（図４参照）。Ｍの成分がｘ’ｙ’平面に対して回転した（図５）後 、　「スピン−スピン」緩和時間といわれるある時間（Ｔ２）内に、もとの磁化 値に戻る。Ｔ２緩和の過程では、励起状態の原子核と基底状態の原子核とが互い にエネルギーを交換する。したがって、Ｔ２は、原子核が互いに同一の位相から 脱して、ランダムな状態に戻るまでの時間量を示すことになる。Ｔ１、Ｔ２２緩 和間は、原子核それ自体や、核を取り巻く環境によって、ミリセカンドから分の オーダーまで、大きく異なっている。磁気共鳴イメージングの主な任務は、軟組 織のコントラストをめて、低コントラストの病変を検出することである。病変を 検出するのは、病変と周囲の正常組織との間のコントラストの差による。原子核 を共鳴させると、その周囲の組織、媒体によって、Ｔ１、Ｔ２２緩和間を変化さ せる示差効果が生まれる。しかしながら、一般に、体内で存在するような（組織 、器官）有機物質は、含水量が高いため、緩和時間に対してはほどんと均一の効 果しか持っていない。ＭＨＩで物質を走査する場合、緩和時間（ＴＩと７２）の 差を利用して、走査対称があたかも「スライス」されたような画像を作る。体内 の異なる、例えば器官の緩和時間に差によって、目視しうる画像を作ることがで きる。しかしながら、体のほどんとの部分の緩和時間に対して、はぼ均一の効果 しかないとなると、コントラストを欠くため目視は非常に難しくなる。ここに、 　「コントラスト剤」の必要性が存在する。

ＭＨＩでは、体内組織のコントラストを次の要因の差によって測定している。

１）　体内のスピン密度 ２）　縦緩和時間（Ｔ１） ３）　横緩和時間（Ｔ２） ４）　フロー コントラスト剤によって、コントラストが低い器官、病変の可視性を向」二させ ることができる。最も期待の高い薬剤は、緩和を増強して、信号に影響するもの である。コントラスト剤は、組織水分の陽子緩和能に対して高い示差効果がある 、１）常磁性金属イオン、２）遊離酸素、３）遊離ラジカル（不対電子）のいず れかである。優れたコントラスト剤は、標的領域（例えば、ガン腫瘍）に直接注 射するか、あるいは標的領域を目標にした抗体、受容体に付加して、コントラス トを鋭敏化したり、あるいは改善して、この領域のＭＨＩによる観察を可能にす る。

緩和を増強することは、薬理的には正の磁化率（Ｂ。

ｕｒｄｒｅａｕｘ、　Ｅ、Ａ、　ａｎｄ　Ｍｕｌａｐ、　Ｌ、Ｎ、：　Ｔｈｅｏ ｒｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐａｒａ ｍａｇｎｅｔｉｓｍ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７６、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅ ｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ））にその根拠を置イテイる。

物質を外部磁場におくと、磁場の磁化に加えて、この物質にも磁化が誘導される 。ある物質の磁化率とは、この物質に誘導された磁化と磁場の磁化との比である と定義されている。この磁化率を基準として、物質を次のように分類することが できる（表■参照）。

反磁性　電子対　−１０−４ 永久的なスピンモーメント かない 常磁性　不対電子　＋１０−１ 相互作用がない永久的な モーメントがある 超常磁性　不対電子　＋１０＋２ 相互作用のないドメイン がある 強磁性　不対電子　＋１ｏ＋２ 相互作用するドメインがある 反磁性物質の磁化率は負である。はどんどの有機、無機化合物は反磁性であり、 しがもすべての原子には電子の軌道運動により誘導される磁気の影響があるので 、物質すべてには反磁性成分が存在している。反磁性効果はきわめて弱いもので 、比較的に小数の不対電子のスピンによって拮抗できる程度のものである。一般 に反磁性物資は、コントラスト剤としてほどんと興味がない。

常磁性、超常磁性、強磁性物質は、不対電子のスピンの圧倒的な磁気効果によっ て正の磁化率と正の誘導磁化を形成していることを特徴とする。

常磁性は、個々の原子、分子の磁気モーメントが独立して作用することを特徴と している。

強磁性は、固相の微視的な容積、ドメインで不対電子スピンが永久的に整列して いることを特徴としている。多数のドメインが、等方性（磁化していない）ある いは異方性（磁化している）となる。

超常磁性物質は、単一のドメインからなる粒子と考えることができる。超常磁性 物質の原子１モル当りの磁化率は、磁気的秩序のため対応する溶解性を持つ常磁 性のものの磁化率より高い。

超常磁性、強磁性の磁化率は、磁場の強さに比例して直線的に増加する。超常磁 性物質は、強磁性物質と異なり、外側の磁場を取り除くと誘導磁化が零に戻るこ とを特徴としている。

１９４６年、ブロツクらは、硝酸第二鉄（常磁性溶質）を添加することによって 、水性１ＨのＴ１の観察所要時間を短縮する簡便な手法を完成し、原子核の緩和 を常磁性によって増強できることを初めて発表した（Ｂｌｏｃｋ。

Ｆ、、　Ｈａｎｓｅｎ、Ｗ、Ｎ、、　ａｎｄ　Ｐａｃｋａｒｄ、　Ｐ、：　”Ｔ ｈｅ　ｎｕｃｌｅａｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ”、　Ｐｈｙ ｓｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　７０°４７４−４８５゜１９４６）。

効果的な緩和には正の磁化率が必要であるが、それだけでは充分ではない。緩和 を増強できる範囲は、近接性（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）と相関時間（ｃｏｒｒｅｌ ａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ）によって左右される。ブロムベルゲンは、常磁性溶媒を 用いて緩和を増強する場合の数式を発表した（　Ｂ１ｏｅ＋ｎｂｅｒｇｅｎ、　 Ｎ、：　”Ｐｒｏｔｏｎ　ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅｓ　ｉｎ　ｐａｒａ ｍａｇｎｅｔｉｃ　５ｏｌｕｔｉｏｎ”、　Ｊ、　Ｃｈｅｗ、　Ｐｈｙｓ、　２ ７：５７２．１９５７）。彼らの等式を見ると、数個の機序が同時に働いて原子 核の緩和が形成されることがわかる。

原子核の緩和に対する常磁性の貢献度は次の事項に比例する。

１）　常磁性濃度 ２）　距離（γ−６） ３）　電子−陽子相互作用（相関時間）の動的性質を記述する時間定数 相関時間は、常磁性的タンプリング、電子のスピン・フリップあるいは化学交換 の最も早い速度によって支配される。生物系はスピン運動がより適切に相関して いるので、分子量が大きく、形態も非対称である緩和剤、言い替えると比較的に 長い回転相関時間を持つ物質を使って、生物系で原子核のＴ１緩和の増強をする とより効果的である。

超常磁性粒子の存在下で溶媒を使って緩和する場合、磁気モーメントの貢献度の 重さがきわめて高く、この点で常磁性の溶質の存在下で行う場合と大いに異なる 。

常磁性溶質と比較して、超常磁性粒子には次のような性質がある。

１）　有効磁気モーメントが増加している。

２）　分子運動の自由度が減っている。

３）　水の１Ｈ交換が減っている。

これらの要因が、極めて大きい有効磁気モーメントによって支配されており、且 つ混在し７ている異種の磁場から長期間効力を受ける結果として、Ｔ２が大幅に 短縮される。この種のコントラスト剤は、Ｔ１にも効果があるが、主な影響はＴ ２にある（例えば、Ｔ２コントラスト剤）。

生きている動物の内部構造や器官のイメージングは、Ｘ線が同じ目的のため初め て使用されて以来、医学の重要な一側面をなしてきた。近年開発されたイメージ ング技術のうちには、放射性同位元素を体内に置き、これから粒子を射出して走 査する方法がある。ガンマ粒子を射出する放射性同位元素を用いる診断術には共 通して、放射性物質を例えば腎臓によりむやみに分散させたり、早く排泄されな いようにして、走査しようとする部位にいかにして局在化させるかという問題が ある。また、この放射性同位元素を用いるイメージングでは、血清タンパク質（ 例えば、アルブミン）との結び付きを防止したり、逆にこの結び付き強めたり、 あるいは高分子担体や受容体結合物質と予め共役させたりして、半減期の循環を 至適化しようとする問題もある。

臨床使用が急速に伸びているもう−っの体内イメージング法として、高周波イメ ージングが挙げられる。

これは、高周波の音波に方向性を与えて、その体内速度（反射率）の差によって 検出しようとすものである。

組織間では本来、密度が異っているので、これらの組織と高周波の反射能との界 面で画像の輝度が違ってくる。現在の臨床上の問題としでは、胃、小腸、大腸、 膀胱、女性生殖路の空洞では、隣接する組織との間で超音波速度の差がほとんど 無く、これらの器官の病変を可視化するのが困難であることが挙げられる。密度 の高い、非放射性金属元素またはイオンを高濃度で使用すれば、超音波反射能に 有意の差が現れ、これまで検出できなかった腫瘍、炎症部位を可視化することが できる。

近年、ＮＭＲの強度および緩和の画像を用いて、生きている動物の内部構造、器 官のイメージングを実施する第三の重要な方法が完成された。臨床用磁気共鳴イ メージング（ＭＲＩ）は、脳、身体の新しい形式のイメージングとして急速に成 長している。ロー・フィールド（陽子）ＭＲＩにより、体内組織（相対的に豊富 な水の陽子が支配的である）の差により、陽子のすぐ周囲の環境から化学パラメ ーターを検出する。疾患のごく初期の段階からパラメーターに変化が現れるが、 この変化は電離放射線で検出される物理的密度とは別個のものである。脳中枢神 経系では、ＭＲＩは初期の臨床段階で腫瘍を検出することができ、しかもイメー ジングによる後遺症はＣＡ　Ｔ　（ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ　ａｘｉａｌ　ｔ ｏｍｏｇｒａｐｈｙ）よりも少ない（Ｒｕｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、　（１９６３ ）　Ａｍ。

Ｊ、　Ｒａｄｉｏｌ、　Ｖ　１４１．　Ｐ　１２０９）。至適条件下では、画像 の分解能はｍｍ以下の範囲である。

ＣＡＴで使われているような、毒性がないＭＲＩ画像画像強調用量発が重要であ るが、これについて七つの要因を次に掲げる。

１）ＭＨＩ診断の特異性を増進する。

２）より小さな病変の早期発見が可能となる。

３）画像強調剤によって、腫瘍塊を際だたせて、囲んでいる浮腫液、膿瘍と区別 できるようにする。これにより、腫瘍の範囲と侵襲の輪郭を正確に知ることがで きる。浸潤性の新生物を持つ病変（例えば、ある種の転移性癌と膠芽腫）では、 腫瘍と浮腫液との境界線をハツキリさせるためにコントラスト剤を必要とする（ Ｆｅｌｉｘ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　Ｐｒｏｅ、　Ｓｏｃ、　Ｒｅｓ、　Ｍ ｅｄ、　Ｖ　２．　Ｐ２Ｓ５）。

４）画像強調剤によって、再発性腫瘍と手術や照射による線維性組織の区別を向 上させることができる。

５）画像強調剤によって、走査−件当りの所要時間を減らすこができる。また、 可能性として−クール当りの走査数を減らし、クールの量を増やして費用を抑制 することができる。

６）脳のイメージングと比較すると、身体のイメージングの解像度（典型的には 、０．５−１．０ｃｍ）と感受性（信号対雑音の比の低下）がかなり低い（Ｗｅ ｓｂｅｙ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８３）　Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ　Ｖ　１４９．　ｐ　１７８）。このように 違ってしまう理由は、磁場が大きく均一性を欠いている、高周波コイルが大きい 、深部と浅部にある原子核について位相パルス化が同一でない、呼吸、心臓収縮 、胃腸管系の嬬動、自律的な筋肉運動によって形成された運動による人為的な要 素があることによるのであるが、コントラスト剤を使用すると特異的な構造や器 官の画像解像度を向上させることができる。

７）血流量や、組織かん流、拡散画像、関連したスペクル（位相）の情報を最善 の状態で得て、解釈するためには、進歩した（高分子的または微小球体の）形状 のコントラスト剤（下記参照）が必要である。

フーリエ変換による二次元画像の各種の強さを次の一般式（スピン−エコー配列 用）表すことができる。

強さ　＝　Ｎ（Ｈ）・ｆ（ｖ）・ｅｘｐ（−ＴＥ／Ｔ２）（１−ｅｘｐ（ＴＥ− ＴＲ）／ＴＩ）式中、 Ｎ　（Ｈ）　＝　各種組織容積中の陽子数（スピン密度）ｆ　（ｖ）　＝　陽子 速度と（例えば、血流のため）運動している陽子の割合の関数 ＴＥ　＝　高周波（ｒ　ｆ）パルスから信号（スピン−エコー）の検出までの時 間 ＴＲ＝　ｒｆパルスが繰り返される間隔Ｔｌ　＝　陽子エネルギーの周囲の化学 的環境への転移率に関連する時間間隔（スピン 格子または縦方向の緩和） Ｔ２　＝　陽子同土間のエネルギー移転（スピン−スピンまたは横方向緩和）の 率に関連する時間間隔 Ｔ１時間と１２時間の間には、画像の強さについてお互いに相互間の効果を持っ ている。所望の画像が陽子密度についてのものか、Ｔ１に重きをおいたものか、 Ｔ２に重きをおいたものかによって、Ｔ１を短縮したり、Ｔ２を延長したり、あ るいは逆の操作を行って強さを強くする。組織のコントラストは天然に存在し、 水分中の陽子（貢献度が高い）と脂質中の陽子（貢献度が低い）の周囲にある化 学環境中の変化に関連する。

これまでにも、この天然のコントラストを強調する目的で化学薬品が用いられて きた。現在、最も広く臨床応用されているのは、常磁性金属イオンであるガドリ ニウム（Ｇ　ｄ　”３）をキレート化して、適当な有機キレート剤としたもので ある（Ｒｕｎｇｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　ＡｍＪ、　Ｒａｄｉｏｌ、　 Ｖ　１４２．　ｐ　６１９）。ガドリニウムはＴ１．１２時間の両方を短縮する ことができる。実際の臨床使用では、上記の場合よりも投与量を下げて投与する のであるが、この場合一般にＴ１に対する効果が支配的で、しかも薬剤の影響を 受ける領域では画像の輝度が上昇する。さらに１．ｒｆパルス配列をコンピュー ターに登録しておいて、これによってＴ１の変化を強調して、Ｔ２による変化を 抑制することもできる（　Ｒｕｎｇｅｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　Ａｍ、　Ｊ 、　Ｒａｄｉｏｌ、　Ｖ　１４１．　ｐ１２０９））。このようにして、最も有 利なＧｄ投与量とｒｆパルス配列を選択することによってｒＴｌに重きを置いた 」増強を達成することができる。

不対電子と隣接する水分の陽子との間の双極子−双極子相互作用を介してＧｄに より陽子緩和時間が短縮される。Ｇｄの磁気双極子の効果は、陽子がらの距離の 関数（半径の６乗）として急速に消滅する（　Ｂｒｏｗｎ　（１９８５）　Ｍａ ｇ、　Ｒｅｓ、　Ｉｍａｇ、　Ｖ　３．　ｐ　３））。したがって、能率的に緩 和する陽子は、ｒｆパルスがら信号の検出までの間隔中に、Ｇｄの第一あるいは 第二の配位領域にはいることができるものに限られることとなる。この陽子の数 は、毎秒１０３〜１０６個の範囲である（　Ｂｒｏｗｎ（１９８５）　Ｍａｇ、 　Ｒｅｓ、　ＩＩ！ｌａｇ、　Ｖ　３．　ｐ’３）。さらに、Ｇｄは４ｆ軌道に 最も多くの不対電子（７個）を持ち、常磁性双極子数も最大で（７９ボーア磁子 ）、どの元素についても最大の緩和能を示すことができる（Ｒｕｎｇｅｅｔ　ａ ｌ、　（１９８３）　Ａｍ、　Ｊ、　Ｒａｄｉｏｌ、　Ｖ　１４１．　ｐ　１２ ０９　ａｎｄ　Ｗｅｉｎｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　Ａｍ、　Ｊ、　 Ｒａｄｉｏｌ、　Ｖ　１４２．　ｐ　６１９）。

したがって、Ｇｄは、どの元素の画像も強調できる可能性を持っている。しかし ながら、Ｇｄの遊離体はがなり毒性が強い。これは、体内ｐ　Ｈ値で（水酸化物 として）沈降することが一部の原因である。このため、Ｇｄを化学的手段でにキ レート化し、小さな有機分子にして溶解度を高めることによって、毒性を低くし てきた。今日までのところ、一般的有用性、活性、毒性の点から最も満足できる キレート化剤として、ジエチレントリアミン五酢酸（ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒ ｉａｍｉｎｅ　ｐｅｎｔａａｃｅｔｉｅ　ａｃｉｄ　（ＤＴＰＡ））を挙げるこ とができる（　Ｒｕｎｇｅ　ｅｔａｌ、（１９８３）Ａｍ、Ｊ、Ｒｅｔａｉｌ　 Ｖ　１４１．ｐ　１２０９　ａｎｄ　Ｖｅｉｎｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４ ）Ａｒｎ、Ｊ、Ｒｅｔａｉｌ　Ｖ　１４２．ｐ　６１９））。

シェーリング社（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　Ａｇ）は、初めてこのキレート化剤を製剤 化し、広範な臨床実験を行った。この製剤はＢｅｒｌｅｘ　Ｉｍａｇｉｎｇとい い、Ｇｒｉｅｓ、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、　Ｗｅｉｎｍａｎｎによって西独特許 が申請された（ＤＥ−Ｏ５３１２９９０６Ａ　１　（１９８１））。この製剤は Ｇ　ｄ　−Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａからなり、有機塩基であるＮ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇ ｌｕｃａｍｉｎｅ　（ｍｅｇｌｕｍｉｎｅ）で中和安定させたものである。この Ｓｅｈｅｒｉｎｇ−Ｂｅｒｌｅｘ剤ついては、米国その他の諸国のいくつかの機 関でフェーズＩＩＩ臨床試験を完了している。上記の試験、さらには現在進行中 の試験によると、はどんとすべてのヒト脳腫瘍において顕著な強調が達成されて いる（　Ｆｅ１ｉｘ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｓｏｃ、　Ｍａｇ、　Ｒｅ ｓ、　Ｍｅｄ、　Ｖ　２．　ｐ　８３１　ａｎｄ　Ｋ、　Ｍａｒａｖｉｌｌａ、 　ｐｅｒｓｏｎａｌ　ｅｏｍａ＋ｕｎｉｃａｔｉｏｎ）。対象疾患は、転移性癌 、随膜種、グリオーム、アデノーマおよび神経腫である。腎臓腫瘍についても、 満足すべき強調を実現している（Ｌａｎａｉｄｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５） 　ＰｒｏｃＳｏｃ、　Ｍａｇ、　Ｒｅｓ、　Ｍｅｄ、　Ｖ　２．ｐ　８７７　ａ ｎｄ　Ｂｒａｓｃｇ　ｅｔ　ａｌ（１８３）　Ａａ＋、　Ｊ、　Ｒｅｔａｉｌ、 　Ｖ　１４１．　ｐ　１０１９）。５ｃｈｅｒｌ　ｉｎｇ−Ｂｅｒｌｅｘ製剤（ ＭＡＧＮＡＶＩＳＴ）は１９８９年までに医薬品として−Ｌ市され、ＦＤＡの許 可も受けている。

この製剤は緩和能と毒性については満足すべきものではあるが、次の四つの大き な欠陥がある。

（１）Ｇｄのキレート化によって、著しく緩和能が低下した（大きさが１／２程 度）。これは、最強部分の常磁性双極子が最も強い部分に一致するＧｄの配位部 座が、はどんとすべて、キレート化剤によって占領されているからである（Ｋｏ ｅｎｉｇ　’（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｍａｇ。

Ｒｅｓ、　Ｍｅｄ、　Ｖ　２．　ｐ　８３３　ａｎｄ　Ｇｅｒａｌｄｅｓ　ｅｔ 　ａｌ、　（１９８５）Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｍａｇ、　Ｒｅｓ、　Ｍｅｄ、 　Ｖ　２．　ｐ　８６０）。

（２）すべての小さな常磁性金属キレート化化合物と同様に、Ｇ　ｄ　−Ｄ　Ｔ 　Ｐ　Ａジメグルミン（ｄｉｍｅｇｌｕｍｉｎｅ）は、臨床上、陽子イメージン グに使用される高い高周波領域において、緩和能が顕著に低下してしまう（典型 的には、８５　ＭＨｚ、　２Ｔ）　（Ｇｅｒａｌｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、　（１ ９８５）Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｒｅｓ、　Ｍｅｄ、　Ｖ　２．　ｐ　８６０） 。

（３）分子量が小さいため、Ｇ　ｄ　−Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａジメグルミンは、血流や 、組織病変（腫瘍）から急速に（血流において２０分以内のｔ、／２で）取り除 かれてしまう（Ｗｅｉｎｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　Ａｉｌ、　Ｊ、 　Ｒａｄｉｏｌ　Ｖ　１４２．ｐ　６１９）。これは画像化ウィンドウを限定し く約３０〜４５分）、注射−回につき最も適当な画像化の件数（約２件まで）も 限定してしまい、必要投与量ひいては毒性を上昇させることとなる。

（４）Ｇｄ−ＤＴＰＡの体内分布は、体（脳に比べて）の腫瘍、感染症の画像化 を実施する上で至適であるとは言えない。これは分子の大きさが小さいためであ る。

静注されたＧｄ−ＤＴＰＡはすぐに正常組織の細胞外水分と腫瘍、感染症の濃縮 物に転じてしまう。これは、Ｇｄ−ＤＴＰＡが健康な（疾患があるのに対して） 脳の細胞外水分に転するのを部分的に抑制する「血液−脳」血管バリアー（”ｂ ｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ”　ｖａｓｃｕｌａｒ　ｂａｒｒｉｅｒ）が体の器官にな いことが原因である。その結果、組織のうち正常領域と疾患領域とのＧｄ−ＤＴ ＰＡＡ濃度差が縮まり、したがって器官内の正常領域と疾患領域のコントラスト 差も小さくなってしまう。さらに、不釣合な量のＧｄ−ＤＴＰＡ　（＞９０％） を投与しても、すぐに腎臓により封鎖されてしまう（Ｗｅｉｎｍａｎ　ｅｔ　ａ ｌ　（１９８４）　Ａｍ、　Ｊ、　Ｒａｄｉｏｌ　Ｖ　１４２．　ｐ　６１９） 。体内ＭＨＩとして大きな興味を持てるのは、腫瘍、特に肝臓、肝臓、骨髄、結 腸、すい臓の腫瘍を腹腔内の部位で早期発見と病期の判定を行うことである。こ のことは、Ｇｄ−ＤＴＰＡでプローブしても成功することはできない。

これらの欠陥を克服するため、三つの試みを実施した。

（１）上記に代わるべき、小型のキレート分子を試験した。これによりＧｄは水 分の陽子に届き易くなり、しかも充分な親和力をもって金属をキレ−１・化して いて、インビボで毒性をコントロールできる。このキレート化剤のうち、最も効 果があるのはＤＯＴＡ、すなわちポリアゾ大環状リガンドである　１，４．７． １０−テトラアゾシクロドデカン−Ｎ、Ｎ’Ｎ”−四酢酸（１，４，７，１Ｏ− ｔｅｔｒａａｚｏｃｙｃｌｏｄｏｄｅｃａｎｅ−Ｎ、Ｎ’、Ｎ”−ｔｅｔｒａａ ｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）である（Ｇｅｒａｌｄｅｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５） Ｐｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｍａｇ、Ｒｅｓ、Ｍｅｄ、　Ｖ　２．ｐ　８６０）。緩和能 は、広いラーモア振動数範囲で、Ｇｄ−ＤＴＰＡの約二倍高い。しか【７、それ でも遊離Ｇｄより活性が劣る。

（２）ＧｄとＧｄ−キレートとは、主にタンパク質や、アルブミン（Ｂｕｌｔａ ａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１）　Ｈｅａｌｔｈ　ＰｈｙｓｉｃｓＶ　４０． 　ｐ　２２８　ａｎｄ　Ｌａｕｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｍａｇ 、　Ｒｅｓ。

Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｖ　３．　ｐ　１１）、ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ　（Ｂｕｌ ｍａｎ　ｅｔ　ａｌ。

（１９８１）　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　Ｖ　４０．　ｐ　２２８）や免 疫グロブリ　ン　（Ｌａｕｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｍａｇ、　 Ｒｅｓ、　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｖ３、　ｐＨａｎｄ　Ｂｒａｄｙ　ｅｔ　ａｌ、　 （１９８３）　Ｓｏｃ、　Ｍａｇ、　Ｒｅｓ、、　２ｎｄ　Ａｎｎ、　Ｍｔｇ、 、Ｗｏｒｋｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ。

ＣＡ）のような巨大分子と化学的に共役化されてきた。

このため、分子のタンプリング（回転相関時間）速度が遅くなり、Ｇｄの緩和能 が上昇した（Ｌａｕｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｍａｇ、　Ｒｅｓ 、　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｖ　３．　ｐ　１１）。このことはさらに、陽子とＧｄと のエネルギー移転プロセスの結び付きを向上させる（Ｇｅｒａｌｄｅｓ　ｅｔ　 ａｌ、、　（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｓａｃ、　Ｍａｇ、　Ｒｅｓ、　Ｍｅｄ 、　Ｖ　２．　ｐ　８６０．　Ｌａｕｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　 Ｍａｇ、　Ｒｅｓ、　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｖ　３．　ｐ　１１　ａｎｄ　Ｂｒｏｗ ｎｅｔ　ａｌ、　（１９７７）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｖ　１６．　ｐ　 ３８８３））。Ｇｄ−ＤＴＰＡの緩和能は、５〜１０倍（Ｇ　ｄ　１　ｍｍｏｌ 濃度のＲ１＝１／Ｔｌ値で比較）、さらに２．５〜５．　Ｑ倍（コントロール液 （生理食塩水）のＴ１か特定の減少をするに必要なＧｄモル濃度で比較）に増加 した。

後者の方法を使−っで比較する理由は、次の通りである。すなわち、１）Ｇｄは インビボではミリモル濃度にはならない。通常の画像強調で用いる実際の組織濃 度は、Ｇｄが２０〜１００マイクロモルである。２）Ｒ１グラフの傾斜が他の強 調剤と平行しない場合が多い。３）上記第二の方法の方が、薬剤の化学活性の比 を、より慣習的な手段によって比較することかできる。

言い替えればＴ１．（または、Ｔ２）緩和時間の減少をパーセントに換算し、そ の特定パーセントを達成するのに必要な濃度を比較することが出来る。これらの 点で第二の方法が好ましいと考えられている。欠点としては、ＮＭＲ画像の強調 に使用するため、ＤＴＰＡをタンパク質担体に共役しようとするとき、アルブミ ン分子−個につき、五個以上のＤＴＰＡ　（ｔ、たがって、Ｇｄ）からなる安定 した接合体を作るのが困難であることがある（Ｂｕｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（ １９８１）　Ｈｅａｌｔｈ　ＰｈｙｓｉｃｓＶ　４０．　ｐ２２８．　ｌ、ａｕ ｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｍａｇ、　Ｒｅｓ、　Ｉｍａｇｉｎｇ 　Ｖ　３．　ｐ　１１　ａｎｄ　Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８ ２）　Ｉｎｔ。

Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｒａｄｉｓｔ、　ｌ５ｏｔ、　Ｖ　３３．　ｐ　３２７　（ １９ｇ２））。

免疫グロブリンと（Ｌａｕｆｆｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　Ｍａｇ、　 Ｒｅｓ、　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｖ　３．　ｐ　１１　ａｎｄ　Ｂｒａｄｙ　ｅｔ　 ａｌ、　（１９８３）　Ｓ。

ｃ、　Ｍａｇ、　Ｒｅｓ、、　２ｎｄ　Ａｎｎ、　Ｍｔｇ、、　Ｗｏｒｋｓ　ｉ ｎ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ。

Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ）フィブリノーゲン（Ｌａｙｎｅ　ｅｔ　 ａｌ。

（１９８２）　Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、　Ｖ　２３．　ｐ　６２７）との置 換率（分子量に一ついて正規化したもの）が比較的に低いことが報告されている 。これは、アミド結合を形成するのが比較的に難しいこと、結合に利用できる代 表的なタンパク質上の暴露されているアミノ基が比較的に小数であること、およ び共役化の間のタンパク質の変成を抑制するために必要な水性溶媒中に生成する ＤＴＰＡ無水物結合基質が比較的急速に加水分解してしまうことに原因がある（ Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ａｐｐｉ 、　Ｒａｄｉａｔ、　１ｓｏｔ、　Ｖ　３３．　ｐ　２３７　（１９８２）　ａ ｎｄ　Ｋｒｅｊｃａｒｅｋ　ｅｔ　ａｌ、　（１９７７）　ＢＬｏｃｈｅｍ、　 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　Ｖ７７、　ｐ　５８１）。このよう に至適とはいえない条件全体としては、インビボで磁気共鳴画像に対して有意の 効果を挙げるためにはきわめて大きな量の担体材料が必要になるという影響がで る。大量の担体を投与すると被投与者の血液体積が浸透のメカニズムにより急激 に増加するので好ましくない。実際上でも、タンパク質−キレート化剤−金属錯 体の置換比が低いために、一般に、感受性が高い（投与量が低い）放射性医薬品 に使用することが限定されている（Ｌａｙｎｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　 Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、　Ｖ　２３．　ｐ　６２７）。最近では、アミン・ リガンドを用いる、いわゆる「非イオンＪＧｄキレート化剤が開発されて、投与 時の浸透度を向上させてはいるが、これとてもＧｄ−ＤＴＰＡキレート化剤以主 剤以上能を向上させるまでには至っていない。

ＤＴＰＡを非タンパク質担体であるセルロースと共役させて、この低い置換比を 克服する試みがなされてはいるが（Ｂｕｌｏ＋ａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８１ ）　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　Ｖ２Ｏ。ｐ　２２８）、用いられている化 学的な方法では、ＤＴＰＡが至適に担体へ置換されているとは言えない。セルロ ースとその水溶性誘導体が生物分解性を持っていないこと、ＣＮＢ　ｒ活性のセ ルロースが有機溶媒によって（ジメチルフ号ルム゛１ミドと）共役することから 、担体をＤＴＰＡに結び付けるジアミノヘキシル・スベサー基に向か−）て分子 が凝集することが報告されていること、こわらの理由からこの種の担体−共役体 を磁気品分−ｒコントラスト の画像を強調する場合のきわめて重要な要因として、薬剤を微小循環系から隣接 する疾患組織に能率的に浸み出（排出）させるためには、これらの薬剤は、完全 に溶解できなければならず、例えば、分子間あるいは分子にの微小凝集体によっ て汚染されていないことが挙げられる。至適に腫瘍に近づくこと、局在化するこ とのためには、薬剤の分子の大きさは約２，０００，０００ダルトン（分子の直 径か約２〜３ｎｍ）以下、好まｌ，　＜は５００、０００ダルトン（分子の直径 が約０　５〜１．０ｎｍ）である（Ｊａｉｎ　（＋９８５）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　Ｖ　１。

ｐ８１）。コンｌ−ラスト剤がこのクラスの粒子や微小凝集体（即ち、リボゾー ム、コロイド、乳剤、微粒子、微小球、微小凝集体からなる：下記参照）であれ ば、希な例外を除いては、はどんとの固形腫や炎症性病変で効率よく濃縮するこ とはない。そればかりでなく、この超分子大の薬剤は、静注後、ａ）まず、比較 的短い間隔で血流を循環するので（大きさによって、２２５分〜２４時間）、血 液貯留（プラズマ・コンパートメント）の画像を直接的に強調する可能性もある 、ｂ）続いて、網内細胞組織（肝臓、肝臓、骨随）の特定細胞（食細胞）によっ て除去されるので、これらの健康な組織について選択的な強調し、そ１７て（疾 患領域の薬剤が移転して来ることがないので）これらの健康な組織内の病変部に ついて間接的に（陰性的にまたは負の）画像強調を実施することが可能となる。

さらに、胃腸管系や他の体内空洞にこのクラスの微粒子、微小凝集体の薬剤を入 れると、これらの空洞内の体液の画像を直接的に強調できるので、内腔や空洞に 侵襲している病変部塊の輪郭を把握する可能性もある。微小球と微小凝集体は共 に超分子大である。微小凝集体クラスの薬剤は（意図的にそうするか、否かは別 として）次のどちらかの方法で製造されている。ａ）個々のポリマー分子を分子 架橋する、あるいはｂ）これまで単体（溶解性）であったポリマーを電荷で引き 伺けるか、疎水性結合メカニズムによって二次的に凝集させる。

微小凝集体クラスの薬剤は微小球クラスの薬剤よりも、粒子の大きさか小さく、 約２．０００，０００ダルトン（直径が約２〜３ナノメーター）から０　１マイ クロメーター（直径が１００ナノメーター）までの範囲である。微小凝集体は網 内細胞の食細胞によって除去されるが、その効率さ速度は微小球の場合よりもは るかに低いことは注目に値する。−股に、臨床イメージングは、注射俊速やかに コントラストを強調しなければならないと言う条件下で行われるので、この特性 がある微小凝集体クラスの薬剤はは肝臓、肝臓、骨髄の可視化用と（７ては特に 好ましいものではない。

３）　Ｇｄ−ＤＴＰＡをリボゾームに包埋して（　Ｂｕ。

ｎｏｃｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８５）　Ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｍａｇ． 　Ｒｅｓ　Ｍｅｄ．　Ｖ２、　ｐ　８３８）、網内細胞器官（肝臓、押嘘、骨髄 ）それにｃｉＪ能性と１，では肺の画像を選択的に強調するのに使用（−できた 。■（臓の浄化には、食細胞（　Ｋｕｐｆｆｅｒ　ｃｅｌｌＳ）が媒介（、、自 律的に血流からこれらの微粒子（Ｏ０５−１０１ｚｍ）を取り除いている（　Ｂ ｕｏｎｏｅｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ（１９８５）　Ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｍａｇ． 　Ｒｅｓ．　Ｍｅｄ．　Ｖ　２．　ｐ　８３８）。

（３〜　５μＩｎより大きい粒子は、肺の毛細血管か持つ塞栓閉］２込め機能に より、肺に選択的に局在化する）。

最近では、小型のＧｄリボゾームにより、肝臓のＴ１を効果的に低トさせること ができることか報告されている（画像化せずに、分光分析法により測定）　（Ｂ ｕｏｎｏｃｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９８５）　Ｐｒｏｃ．　Ｓａｃ．　Ｍａｇ ．　Ｒｅｓ．　Ｍｅｄ．　Ｖ　２。

ｐ　８３８）。また、不溶のＧｄ−ＤＴＰＡコロイドにより、インビボ条７１１ 下でラビットの肝臓の磁気共鳴画像を強調することができたことが報告されてい る（Ｗｏｌｆ　ｅｔａｌ．　（１９８４）　Ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃｓ　Ｖ　 ４，　ｐ　６６）。しかしながら、これの薬剤には大きな三つの問題があって、 診断用途における有用性を限定しているように思われる。

すなわち、リボゾームの多層の脂質包膜のため、担体中央の、疎水性の中心部ま で水分の陽子が拡散するのが妨げられ、Ｇ　ｄ　−Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａジメグルミン と同等のインビボ緩和能を得るためには、多量のＧｄを投与する必要があると考 えられる（Ｂｕｏｎｏｃｏｒｅ　ｅｔ　ａｌ．　（１．９８５）　Ｐｒｏｃ．　 Ｓｏｃ．　Ｍａｇ．　Ｒｅｓ．　Ｍｅｄ．　Ｖ　２．　ｐ　８３８）。これによ り相対的に毒性が上昇する。さらに重要なことは、この同じ脂質成分のため、担 体が標的器官の細胞膜と相互作用し、組織貯留を著しく長期化させることにある （浄化時間は数カ月程度）　（Ｇｒａｙｂｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ．　（１９８２） Ｊ．　Ｉｎｆｅｃｔ．　Ｄｉｓ．　Ｖ　１４５，　ｐ７４８，　ａｎｄ　Ｔａｙ ｌｏｒ　ｅｔ　ａｌ．。

１９８２　Ａｍ．　Ｒｅｖ．　Ｒｅｓｐ．　Ｄｉｓ．　ＶＩＺ５，　ｐ　６１０ ）。これには、好まし、くない二つの副作用がある。第一に、強調された画像は 、適時にベース・ラインまで戻って来ない。

このため、短い間隔（約１−〜３週間）をおいて再び画像化を実施することかで きなくなり、急性疾患の進行状態や治療効果を評価することができなくなって（ ２まう。第二には、リボゾームに包埋されているかなりの量のＧＤ−ＤＴＰＡが 直接、宿主の細胞膜に移転する可能性がある（Ｂｌａｎｋ　ｅｔ　ａｌ．　（１ ９８０）　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｈｙｓｉｃｓ　Ｖ３９、９１３；　Ｃｈａｎ　ｅｔ 　ａｌ．　（１９８５）　Ｐｒｏｃ．　Ｓｏｃ．　Ｍａｇ．　ＲｅｓＭｅｄ、　 Ｖ　２．　ｐ　８４６）。これによってリボゾーム剤の細胞貯留と毒性が増加す る。Ｇｄ毒性の結果についてはまだ報告されていない。ＧｄとＧｄキレート化剤 をタンパク質（アルブミノンに包埋した微小球を作り（Ｓａｉｎｔ　ｅｔ　ａｌ 、　（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｍａｇ、　Ｒｅｓ、　Ｍｅｄ、　Ｖ 　２゜ｐ８９６）、インビボにおいてこの微小球をＴ１の緩和能を用いて試験を 行ったが、中程度の効果しか認められなかった。Ｇｄと他の包埋材料のほどんと が（Ｗｊｄｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　Ｖ 　４０．　ｐ　３５１２）始めから球体内部に封止されてしまい、小球が水和す るにつれて（数時間程度のｔ、７２で）、薬剤がゆっくりと放出されるにとどま ったからである（Ｗｉｄｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８０）　Ｃａｎｃｅｒ　 Ｒｅｓ、　Ｖ　４０．３５１２）。

不溶性の酸化ガドリニウム粒子から乳剤を作り、実験動物に注射したところ、肝 臓に対して顕著な画像強調作用を認めた（Ｂｕｒｎｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ　（１９ ８５）　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓ、　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｖ　３．　ｐ　６５） 。しかしながら、この粒子は前掲の各種物質よりもはるかに毒性が強く、したが って人体用としては適当ではない。現在の磁気共鳴画像コントラスト剤には重大 な欠陥があるため、本出願人は、４性が低く、飛躍的に向上させた効果があり、 腫瘍、器官についての選択性か高く、血流の画像を強調できる有意の可能性があ る改良型、第二世代の典型となる薬剤を製剤化した。

本発明の核磁気共鳴画像強調剤（以下、ＮＭＲコントラスト剤または磁気共鳴（ ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：　ＭＲ）コンストラスト剤とも称する ）には多くの長所がある。

これらの長所は他の領域にも拡大することができる。

ガドリニウムとこれに関連する薬剤によって、ＮＭＲ感受性を持った隣接する原 子核のＮＭＲスペクトルを特徴的に変化させることができる。これらの変化とし ては、共鳴のピークの位置、幅、強さ、および緩和率（強さに影響する）を調整 することが挙げられる。したがって、このような化学的シフト−緩和剤でスペク トルを摂動させることによって、ＮＭＲ信号の発生源が何処なのか、どの器官な のか、組織のどの区分なのか（血管内か、血管外か）、組織内ではどのタイプの 細胞か、さらには可能性として薬品や疾病によって変わって行く細胞内のどの特 定代謝紅路なのかを捜し出して、これを確認することができる。さらに、特定の 状況下では、高周波イメージングを用いたり、放射性同位元素を放出してこれを 体内走査することは、内部構造を洞察する上で特に有用である。放射性同位元素 の放出物で最も走査頻度の高いものとして、放射性金属同位元素でガンマ粒子を 放出するものが挙げられるが、最近の臨床では陽電子放出断層撮影法の使用が増 加しつつある。放射性金属の分子配合と投与方法は、放射性同位元素の体内にお ける局在化と体内半減期に大きな影響を与えるので、このため診断用としては高 周波画像や、放出走査をつかうことが多くなるであろう。

本発明は、一定濃度の安定した遊離ラジカルを投入した信号誘導性（常磁性、超 常磁性または強磁性）の金属または金属粒子を有するか、あるいは金属と安定し た遊離ラジカルの双方を有する、合成または天然原料から誘導された生物分解性 であって、かつ、水溶性または不溶性のメラニン・ポリマーからなる画像強調剤 およびスペクトルシフト剤を提供するものである。

メラニンは、天然の数種の異なるアミノ酸基質から誘導される一部の色素である 。動物、植物、細菌は、それぞれ異なるタイプのメラニンによって着色されてい る。通常、メラニンは、髪、皮膚、羽毛に見られるものと、爬虫類、魚類の着色 料の一部をなすものからなるニーメラニン（ｅｕｍｅｌａｎｉｎｅ）　、ヒトの 赤毛や狐の赤い毛皮の原因であるフェオメラニン（ｐｈａｅｏＩＩｌｅｌａｎｉ ｎｅ）、細菌や植物に存在していることが最も多いアロメラニン（ａｌｌｏｍｅ ｌａｎｉｎｅ）の三つのグループのいずれか一つに分類される。ニーメラニンと フェオメラニンとが組み合わされると、熱帯産のある種の鳥の羽毛に見られるよ うな素晴らしい効果が生まれる。

メラニンは、酵素が数種のアミノ酸先駆物質に作用して作られる。例えば、はど んとのユウメラニンの先駆物質はチロシンである。しかしながら、アミノ酸がメ ラニンに変換する正確な過程は分かっていない。同じ基質から形成される場合で も、色素ごとに過程が異なっているように見える。一般的には、黒色素は３．４ −ジヒドロキシフェニルアラニン（３、４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａ ｌａｎｉｎｅ　（ＤＯＰＡ））、カテコール（ｃａｔｅｃｈｏｌ）、ジヒドロキ シ・インドール類（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ　１ｎｄｏｌｅｓ）、ソノ他各種のジヒ ドロキシ物質を含む先駆物質から形成される。

３．４−ジヒドロキシフェニルアラニン５．６−ヒドロキシインドール カテコール １．８−ジヒドロキシナフタレン これらの物質は、多くの活性中心を持っていて、これによって重合する。活性中 心の数が少ない化合物は、茶色、赤褐色、黄褐色のメラニンの先駆物質である。

純粋なメラニンは、水とほとんどの有機溶媒に不溶なので、加工が困難である。

このことが一部の理由となって、これまでメラニンの化学特性の全てが同定され “Ｃたわけではなかった。しかしながら、最近では電子スピン分光分析法を研究 に用いるようになってから、天然メラニンの遊離ラジカルの特性が同定された（ 表１）。

メーーー之−÷ン　且二値 カテコール−メラニン　２．００３８ Ｌ　−Ｄ　ＯＰ　Ａ−メラニン　２．００３６Ｄ−Ｄ　ＯＰ　Ａ−メラニン　２ ．００３８１４−アドレナリン・メラニン　２．００４０セピア・メラニン　２ 　ｏｏａ。

メラノーマ・メラニン　２．００３１ ヒト髪メラニン　２．００４１ ポテトメラニン　２．００４０ はとんど全ての化学オキシダントや、遊離ラジカル重合剤を用いることによって 、また場合によっては、単に溶解した基質を一晩空気曝すことによって、天然に 存在する全ての先駆物質、多数の異なる置換基を含有する広範囲のモ人　ジ、ポ リ・ヒドロキシル化された芳香族化合物から、各種分子量を持つ合成メラニンを 作ることができる。図ＩＡは、メラニンの合成経路の一例を示す概略図である。

本発明は、解離しない信号誘導性（常磁性、超常磁性、強磁性）の金属と結合し 、安定した遊離ラジカルを含有している、水溶性、常磁性メラニンまたはメラニ ン・ポリマーからなる画像強調剤に関する。−例において、ダラム当り金属を少 なくとも約０．１μｍｏｌμｍ型ることが好ましいが、この含有量は薬剤の合成 条件によって大きく変わる場合がある。重要な一例では、薬剤の合成条件によっ ては、金属を含有しないで、安定した遊離ラジカルにメラニンを投入するのが好 ましい。

本発明のメラニン−金属結合において、信号誘導性金属が持つメラニン結合の会 合定数は少なくとも１０２０である、つまり実際上解離不能である。この金属を 水に懸濁あるいは溶解しても、無限に解離しないままである。好ましい信号誘導 性金属は、言うまでもなく磁気共鳴イメージングに対して常磁性あるいは超常磁 性のものである。好ましい常磁性や超常磁性金属としては、ガドリニウム、鉄、 ニッケル、銅、エルビウム、ユーロピウム、プラセオジム、ジスプロシウム、ホ ルミウム、クロム、マンガンが挙げられる。金属として好ましいものはガドリニ ウムである。ある側面では、どの種類の金属も添加１２ていなくても、安定した 遊離ラジカルを含有していさいずれば、常磁性メラニンは、Ｇｄ−ＤＴＰＡ　（ ＭＡＧＮＡＶＩＳＴｏ）よりも効果的に陽子緩和能に作用することができる。

金属は、イオンを含み、電荷がない形、あるいは微粒子としてメラニンに没入す る。金属は、高周波音波の発信から得た画像や検出した画像を強調することによ って、高周波の画像を調整するのに使用するのに特に有用である。ガンマ粒子を 放出する金属は、ガンマ粒子放出走査の画像を強調するのに使用することができ る。”Ｃｒ％　６８Ｇ　ａ、９９１ＩＴ　ｃ、”’　Ｉ　ｎは、ガンマ粒子走査 用として好ましい金属である。

本発明の画像強調剤のうち最上のものは、好ましくは約１．．０００ダルトン〜 約１００，０００ダルトンの範囲の分子量を持つ。但し、これより大きい分子量 であっても特定の用途には適当である。この薬剤は、特定のメラニン先駆物質を 用いて、信号誘導性金属の存在下または不存在下で、メラニン合成を実施して得 たフェオメラニン、ニーメラニン、アロメラニンの形のメラニンを使用すること ができる。

合成パラメターをコントロールして溶解性メラニンを作ることできるし、また本 発明の薬剤の水溶度を強めたり、変えることもできる。例えば、錯体あるいは誘 導体形成の過程で、特定のメラニン（天然のメラニンを含む）を有機アミン類や 、酸類のような水可溶化剤に添加することができる。好ましい有機アミンはＮ− メチルグルカミンまたはトリエチルアミンで、好ましい酸はグルタミン酸である が、この他にも多くの好適な水可溶化剤がある。

さらに、本発明のメラニン、およびメラニン−信号誘導性金属結合を、知りたい 特定の生物部位に対して結合特異性を持つタンパク質、ペプチド、受容体あるい は抗体のような生物部位指向性の成分に付着（接合）させることができる。

本発明の上記画像強調剤の製法が、本発明開示の重要部分であることは言うまで もない。これらの製法は各種の信号誘導性金属の不存在下または存在下で、メラ ニン先駆物質からメラニンを形成することから構成されている。メラニン上に遊 離ラジカルをつけると、金属がなくても画像のコントラスト−雑音の比を向上さ せることができる。また、メラニン信号誘導性金属結合を形成するに充分な濃度 の金属を用いててメラニン類を作ると、遊離ラジカルを添加するまたは添加しな い、いずれの場合でも、所望の画像のコントラストを相乗的に強調することがで きる。一般に、メラニン先駆物質は、ヒドロキシフェニルあるいはジヒドロキシ フェニル部分からなっている。これらメラニン先駆物質としては、ヒドロキシフ ェニルアラニン、カテコール、ドーパミン、チロシン、５．６−ジヒドロキシイ ンドール、５．６−シヒドロキシインドールー２−カルボン酸、５．６−ドーパ クロム（５、６−ｄｏｐａｃｈｒｏｍｅ）、５゜６−インドールキノン、　ドー ノくキノン、　３−アミノチロシン、およびジヒドロキシフェニルエチルアミン を挙げることができるが、これらのみには限定されなｔ）０これらの化合物は単 独で使用することもできるし、併用することもできるし、あるいはグルタチオン や、システィンのようなチオール含有物質と混合することもできる。メラニンは 、酸化剤または遊離ラジカル形成剤に誘導されて、これらの先駆物質から形成さ れる。

遊離ラジカル形成剤としては、アゾ化合物、過硫酸塩、あるいは過酸化物か好ま しい。好ましく嘱遊離うジカル形成剤、酸化剤としては、過硫酸アンモニウム、 アゾビスイソブチロニトリル、過酸化水素、酸素、窒化ナトリウム、過酸化ベン ゾイル、およびｔ−ブチルヒドロペルオキシドを挙げることができるが、これら にｉｔ限定されない。また、メラニンは適当な基質であるメラニン先駆物質に、 特定の酵素を作用させて形成することも出来る。この酵素を使って、金属イオン の存在下でメラニン先駆物質を酵素変換させて、信号誘導性金属をメラニンに組 み入れるのである。ある条件下では金属イオンによって酵素のうちのあるもの力 （抑制される場合がある。しかしながら、メラニンと信号誘導性金属の結合との 構造が形成されるのを、この抑制によって妨げられない条件を設定することは容 易である。

これらの酵素のうち、最も典型的なものを２つ挙げるとすれば、それはポリフェ ノールオキシダーゼとチロシナーゼである。

本発明はさらに、本発明の（常磁性）メラニンおよび（常磁性）メラニン−信号 誘導性金属結合を用いるイメージング法を提供する。イメージング法には、例え ば磁気共鳴イメージング、ガンマ線放射走査、および高周波イメージングがある 。イメージング実施前に本発明の薬剤を、非経口、脈管内、腸管内などの適当な 方法で投与すると、画像が強調され、ノイズに対するコントラスト比が向上して 、より正確な画像を得ることができる。メラニンの常磁性は、薬剤がメラニン単 独の場合には、存在することが必要であり、常磁性金属が含有されている場合に は、存在することが好ましく、磁気共鳴イメージング以外のイメージング法の場 合には、存在することは必須ではない。

図ＩＡは、メラニンの合成経路を示す概略図である（図中、請求核物質） 図１は、磁気モーメントが一定の磁場を一定の振動数で回転しているのを示す図 である。

図２は、マクロ磁化（Ｍ　ｏ）で、低スピン状態の過剰な原子核が印加されたＢ ０磁場に対し７て整列しているのを示す図である。

図３は、発生した磁化ベクトル対して、Ｒｆパルスとしてもう一つの磁場（Ｂ１ ）を印加すると、Ｍがｙ軸に移転した後、ｘ’　ｙ’　平面で回転（摂動）する 効果があることを示す図である。

図４は、個々の磁気モーメントが、緩和後（Ｔ１と′ｒ２）にそれぞれもとの状 態に戻るところを示す図である。

図５は、一定時間（Ｔ２）後にＭ成分が部分的にもとの値に戻るところを示す図 である。

図６は、メラニンからなるＧｄ−メラニン剤の効力が、高濃度でＴ、緩和時間を かえようとしても、ガドリニウムの不存在下ではＴ、緩和時間に対する効果が低 下することを示す図である。

図７は、メラニンとガドリニウムの組み合わせよりなる製剤のＴ、緩和時間に対 する効果を示す図である。

（図７Ａ：合成１０、図７Ｂ二合成１２、図７０二合成１４） 図８は、Ｔ、緩和率に対する効果と、超常磁性鉄−メラニンの濃度との対比を示 す図である。

図９〜１２は、　（Ｉ、−ＤＯＰＡ）メラニン−ＧｄのＴ、緩和率に対する効果 と、四つの異なる分子量範囲のがトリニウム濃度との対比を示す図である。グラ フ下部の線は、参照のため、水分中における塩化がトリニウムの緩和能を示した ものである。

図１３は、３−アミノ−し−チロシンから生成したメラニン−ＧｄのＴ、緩和率 に対する効果を示す図である。

図１４は、アゾビスイソブチロニトリルを用いＬ−ＤＯＰＡ重合によって生成し たメラニン超常磁性鉄剤の、Ｔ２緩和率に対する効果を示す図である。

図１５は、　（Ｌ−ＤＯＰＡ）メラニン−ガドリニウム・コントラスト強調剤を 経口投与したときの効果を示す図である。図１５ＡとＢは、それぞれ０時とメラ ニン剤の巨丸薬を投与後におけるラットのコントロール写真である。図１５Ｃと Ｄは、上記時点の上記ラットを解剖したスライスである。

図１６は、　（Ｌ−ＤＯＰＡ）メラニン−ガドリニウム・コントラスト強調剤を ラットの腸に投与した時の効果を示す写真である。図１６Ａは、ラットにメラニ ン溶液を随意に飲ませ、その２４時間後に撮影したコントロール画像である。図 １６８．Ｃ，Ｄは、それぞれ摂取後４８．７８および１２０時間後のもので、薬 剤のクリアランスを示している。

図１７は、　（Ｌ−ＤＯＰＡ）メラニン−ガドリニウム・コントラスト強調剤２ ｍｌをラットの尾部静脈に注射した時の効果を示す写真である。図１７Ａは、注 射後３０分の冠状系の画像である。図１７Ｂは、注射後６８目の上記ラットの写 真で、この系から薬剤がクリアランスされていることを示している。図１７Ｃは 、図１７Ｂの陽画フォトコピーである０ 図１８Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄは、代表的な投与量（体重１ｋｇ当り０．１ｍｍｏ　ｌ　 ｅ）のＭＡＧＮＡＶ　Ｉ　ＳＴ＠をラビットに静注した時の効果を示す写真であ る。図１８Ａは、コントラスト剤投与前のラビ・ソトの腎臓の部位を示す写真で ある。図１８Ｂ、Ｃ，Ｄは、コントラスト剤注射後２．８および１３分時点の写 真である（上部左側から右側へと見た後、下部に移ること）。

図１９Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄは、ガドリニウム−メラニン・ポリマー（ＭＷ　（分子量 ）＝１．．０００ダルトン）体重１ｋｇ当り０．０３３ｍｍｏ　ｌ　ｅを図１８ と同じ時点で投与した時の効果を示す写真である。

図２０Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄは、ガドリニウム−メラニン・ポリマー（ＭＷ＝５０，０ ００ダルトン）体重１ｋｇ当り０．００２ｍｍｏｌｅを図１８．１９と同じ時点 で投与した時の効果を示す写真である。

図２１Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄは、ＭＡＧＮＡＶ　Ｉ　ＳＴと分子量が１．０００のＬ− ＤＯＰＡメラニン−ガドリニウム・ポリマーとの比較を示す写真である。図２１ Ａ。

２１Ｂ（上部左側と右側）は、それぞれＭ　ａ　ｇ　ｎ　ａ　ｖｉｓｔ投与後Ｏ および３分の状態を示す写真である。

図２ＩＣ，２１Ｄは、同じ時点でのメラニン・コントラスト剤により強調された 画像である。

図２２Δ、Ｂ、Ｃ，Ｄは、ＭＡＧＮＡＶ　Ｉ　ＳＴと分子量が５０．０００のＬ −ＤＯＰＡメラニン−ガドリニウム・ポリマーとの比較を示す写真である。時点 は図２１と同一である。

通常、天然由来のメラニン類は、非晶質、吸湿性の粒子からなるカルシウム−マ ンガン塩であって、水溶液にきわめて不溶である。大きな、分子量が高い粒子で あって、化学的に減衰させて部分的に溶解できるだけである。天然メラニンを、 メグルミンのような溶解補助剤で処理しても、画像化剤として使用できるのに充 分な溶解度をもたせることはできない。天然メラニンはメラノーマのＴ１緩和時 間に効果があることが認められていたが、それは天然メラニンの遊離ラジカル含 有量によるものだと考えられてきた。とこらが、エノックスら（ＷＳ　Ｅｎｏｃ ｋｓ、　ＷＢ　Ｈｙｓｌｏｐ、　ＨＦ　Ｂｅｎｎｅｔ、　ＲＤ　Ｂｒｏｗｎ、　 ＳＨＫｏｅｎｉｇ、　ａｎｄ　ＨＭ　Ｓｗａｒｔｚ、”　５ｏｕｒｃｅｓ　ｏｆ 　ｔｈｅ　Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ　Ｒｅ１ａｘａｔｉ ｏｎ　Ｒａｔｅｓ　０ｂｓｅｒｖｅｄ　ｉｎＭｅｌａｎｏｔｉｃ　Ｍｅｌａｎｏ ｍａ、　Ａｎ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　５ｙｎｔｈｅｔｉｅ　Ｍ ｅｌａｎｉｎｓ、”　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ、　２ ４．７９４−８０４、１９８９）は、研究結果にもとづいて、メラニンの遊離ラ ジカルがメラノーマ中の緩和率と因果関係をもっていないとの結論を得た。彼ら が試料として用いてのは、すべて粒子からなる凝集体を懸濁液にしもので、溶液 ではなかった。最近に至り、メラニン−マンガン系を可溶化すると、Ｔ１緩和率 が増大するのが観察されることが立証された（Ｓ　Ａｉｍｅ、　Ｍ　Ｆａｓａｎ ｏ、　Ｅ　Ｔｅｒｒｏｎｏ、　Ｃ５ａｒｙａｎＬｎｉ、　ａｎｄ　Ｅ　Ｍｅｎｔ ａｓｔｉ、　”Ａｎ　ＮＭＲ５ｔｕｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ 　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｍｅｌａｎｉｎ　Ｆｒｅｅ　Ａｃ１ｄ　ａｎｄ　ＭＮ”　Ｉ ｏｎｓ　ａｓ　ａ　Ｍｏｄｅｌ　ｔｏ　Ｍｉｎｉｃ　ｔｈｅ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ 　Ｐｒｏｔｏｎ　Ｒｅ１ａｘａｔｉｏｎ　Ｒａｔｅｓ　ｉｎ　Ｍｅｌａｎｏｔｉ ｃ　Ｍｅｌａｎｏｍａ、”　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｒｅ５ｏｎａｎｃｅ　Ｉｍａｇ ｉｎｇ、　９．９６３−９６８．１９９１）。本発明のあらゆる分子量範囲のメ ラニン・コントラスト剤は、従来品の合成または天然メラニンとは異なり、すべ て水溶液に可溶である。ラビットモデルにおいてコントラストが強調されている 画像を得るために、これの（Ｇｄ−メラニン、分子量５０，０００）全血量１ｍ ｇ／ｍｌと同等の量を投与（−だ。製剤に換算すると、ポーラス１ｍｌにつき、 薬剤の含有量は１９．６ｍｇ／ｍｌであった。上記に相当する分子量を持つ天然 メラニン、合成メラニンは粒子であって、これらの濃度では不溶である。本発明 の初期の結果から見ると、メラニン・コントラスト剤１ｍｇ／ｍｌを含有する溶 液が必要であると考えられる。しかしながら、メラニン剤の緩和能は製剤設計に より向上するので（分子量、遊離ラジカルおよび／または金属の含有量）、この 必要量は１ｍｇ　／　ｍ　Ｉより小さくなり得る。天然メラニンは凝集してより 大きな粒子になる傾向があるので、化学的調整なしでは、投与量が大きくなる結 果、浸透圧も大きく変化する問題を避けることができる高い濃度で天然メラニン を使えるとは考えられない。ちなみに、本発明で言う「水溶性」とは１ｍｌにつ き少なくとも０．１ｍｇを意味する。

代表的な天然メラニンが、不対電子（遊離ラジカル）を含有する物質の特徴的な 電子常磁性共鳴（ｅｌｅｃｔｒｏｎｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｎａｎ ｃｅ：　Ｅ　Ｐ　Ｒ）信号を有することが証明されている。天然メラニンの遊離 ラジカル含有量は非常に安定しているが、酸化性還元性化学薬品の影響を受ける と、物質中のスピン（遊離ラジカル）数が変わってしまう。メラニンのスピン密 度は通常使われている基準（α−α−ジフェニル−Ｂ−ピクニルーヒドラジルー Ｄ　Ｐ　Ｐ　Ｈ（ａ　−ａ　−ｄｉｐｈｅｎｙｌ−Ｂ−ｐｉｃｎｙｌ−ｈｙｄｒ ａｚｙｌ−ＤＰＰ）ｌ））を参考にして定量することができる。メラニン類には 、遊離ラジカル自身が中に存在する環境に依存する固有のｇ値（表１）がある。

通常、代表的なメラニンのｇ値は、メラニンのタイプ、メラニン・ポリマーの共 役度および常磁性金属の有無によって変化する（ＲＡ　Ｎ１ｃｏｌａｕｓ、　Ｍ ＥＬＡＮＩＮＳ、　Ｈｅｒｍａｎｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、　Ｐａｒｉｓ、　 １９６８；　Ｌ　Ｃｈａｕｆｆｅｒ、ＪＪ　Ｗｉｎｄｌｅ、　Ｍ　Ｆｒｉｅｄｍ ａｎ、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　５ｐｉｎ　Ｒｅ５ｏｎａｎｃｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　 Ｍｅｌａｎｉｎ　Ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｒｅｄｕｃｉｎｇ　Ａｇｅｎｔｓ 、”　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ。

１５、５６５−５７１．１９７５；　ＲＡ　Ｂａ１ｄｒｙ、　ＧＡ　Ｓｗａｎ、 　”５ｔｕｄｉｅｓＲｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ 　Ｍｅｌａｎｉｎｓ、Ｐａｒｔ　１５゜Ｔｈｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｔｒａｎｓ ｆｅｒ　ａｎｄ　Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃａｌ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｄ ＯＰＡ−Ｍｅｌａｎｉｎ、”　Ｊｏｕｒｎａｌ　Ｃｈｅｏ＋１ｃａｌ　５ｏｃｉ ｅｔｙ　Ｐｏｒｔｉｏｎ　ＩＩ、　１３４６−１３５０．　１９７７）　。

Ｌ−ＤＯＰＡおよび／または他のメラニンの代表的なスピン密度はモノマー１０ ０ないし２５０個につき遊離ラジカル１個（−１％）ないしモノマー１０００個 につき遊離ラジカル１個（−〇　１％）である。これらのメラニン・ポリマーは 、すべて不溶の、高分子量の粒子である。ＥＰＲ信号は幅が広く、しかも超微細 分裂しない。このことは、電子がメラニンの芳香族リング１ないし２個のみに局 在化しているかも知れないことを示している。メラニンに常磁性金属を添加する と、超微細分裂が現れたり、ＥＰＲ信号密度が低下するなど、各種の影響がある 。遊離ラジカルの見かけ上の濃度が低下するのは、金属と遊離ラジカルとの間の 磁気双極子相互作用に原因があることが立証されている（Ｓ　５ａｒｎａ、　Ｊ Ｓ　Ｈｙｄｅ、　ＨＭ　Ｓｗａｒｔｓｚ、　”Ｉｏｎ−Ｅｘｃｈａｎｇｅｉｎ　 Ｍｅｌａｎｉｎ：　Ａｎ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　５ｐｉｎ　Ｒｅ５ｏｎａｎｃｅ　 ５ｔｕｄｙ　ｗｉｔｈ　Ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ　Ｐｒｏｂｅｓ、”　５ｃｉｅｎ ｃｅ、　１９２．１１３２−１１３４．１９７６）。ガドリニウムのような金属 のスピン格子緩和時間が短いので、隣接する遊離ラジカルのスピン格子緩和時間 も短いはずである。したがって、遊離ラジカルによって強力なスピン格子緩和メ カニズムが与えられているのだから、磁気双極子場が急激にゆらぐのである。ガ ドリニウムその他の金属を合成メラニン・ポリマーの内部に組み入れることによ り、金属含有量と遊離ラジカル含有量との相乗作用、しかも強調された相乗作用 を持つコントラスト剤が生産されることとなった。通常のメラニンであれば、ポ リマー内部の表面に金属を結合することができる。しかしながら、金属は希釈そ の他の化学変化によって容易に失われてしまう。

コントラスト剤として用いられるメラニンの遊離ラジカル含有量を変化させると 、金属の有無にかかわらず薬剤の効力を増強させることができる。表ＩＩにおい て、Ｃｈａｕｆｆｅｒらのデータと、分子量（ＭＷ）５０．０００の薬剤による 初期のデータの比較を示す（表４参照）。

Ｌ−ＤＯＰＡ　自己酸化　１０ Ｌ−ＤＯＰＡ　自己酸化／３０ 還元 Ｌ−ＤＯＰＡ　酵素処理　１．２ Ｌ−ＤＯＰＡ　金属なし／１５ ５０、ＯＯＯＭＷ Ｌ−ＤＯＰＡ　ガドリニウム／２５ ５０、ＯＯＯＭＷ Ｌ−ＤＯＰＡ　ガドリニウム／　５ ５０、ＯＯＯＭＷ　酸化 ガドリニウムが遊離ラジカル信号の強度を低下させるため、定量的に比較するこ とが困難である。したがって、固形メラニンと溶液中のメラニンとを比較したが 、化学処理によって遊離ラジカル含有量を変化させることができることは明白で ある。さらに、金属を持たないメラニンは、Ｔ、緩和を増強するような遊離ラジ カル含有量を有する。したがって、解離し、ない形のガドリニウムを添加するこ とによって、この効力を増進することができる。また、遊離ラジカルがなくて、 ガドリニウムのみが存在する場合には、メラニン・ポリマーが高い緩和能を示す ことができない。

本発明により、特に磁気共鳴イメージング、磁気共鳴分光分析法に有用な、新し いコントラスト強調剤の処方と使用方法を開示する。この新しい一部の画像強調 剤は、メラニン単体、および、メラニン配合剤および各種含有量の遊離ラジカル を含有する信号誘導性金属イオンの組み合わせに関する。米国特許第４，８３２ ゜８７７号（引用することにより本明細書の一部とする）に開示されている四原 子核硫化物（ｔｅｔｒａｎｕｃｌｅａｒ　ｓｕｌ、ｆｉｄｏ）により架橋された Ｃ　ｒ　（ＩＩＩ）錯体のような強磁性的に結合された錯体を用いて常磁性メラ ニンを作ることも可能である。この錯体はＣｒ４（ＲｅＯ２）（Ｌ）４２″′で 表され、式中Ｒは炭素原子１〜１２個のアルキル基、Ｌは酸素、窒素、炭素また は硫黄よりなるリガンドである。他のイメージング法や、対応する金属にも適用 することが可能ではあるが、本発明は主として磁気共鳴イメージング、メラニン または遊離ラジカルを含有するメラニン類に常磁性、超常磁性または強磁性金属 を混在させることに関する。メラニン−常磁性金属錯体に隣接する原子核の緩和 率であるＴ、とＴ２は、ガドリニウム−Ｄ　Ｔ　ｉ）　Ａのような従来の常磁性 金属−キレート主剤錯体の場合よりも、大きな範囲で変化する。

金属の有無にかかわらず、遊離ラジカル含有量を増加すると効力はさらに増強さ れる。本明細書で言う、「遊離ラジカル」、　「不対電子」および「不対スピン 」は、通常、同じものを意味すると考えられる。各表現は、それぞれ異なる状況 下、異なる科学分野で好ましく使用されているものである。

本発明は主として、磁気共鳴イメージング、分光分析法において効果的にコント ラストを強調する、および／または効果的にスペクトルシフトを得るための核磁 気共鳴緩和剤としての一部のメラニン材料の合成、製剤化および使用方法に関す る。これらの新しい常磁性材料によると、水中の陽子のＮＭＲ緩和速度は、従来 の使用方法が８易に使用できる最善の緩和調整剤（ガドリニウム−ＤＴＰＡキレ ート）の場合よりも１０００倍上昇する。正常組織、疾患組織おのおのの同じよ うに緊張している部位を区別するためコントラスト剤の必要性が増しつつある現 状では、このことは、磁気共鳴イメージングのコントラスト強調の将来について きわめて重要である。この点で、常磁性メラニン単独（即ち、金属が混在してい ない）でも、現在現場のスタンダードとなっているＧ　ｄ　−Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ錯 体より緩和能効果が大きいことが注目される。

さらに、これらのメラニン・コントラスト剤は、モノクロナール抗体その他の目 標（部位）に特異性を持つ生化学薬品に付加することができる。これにより、部 位指向性磁気共鳴画像化剤となって、部位指向性磁気共鳴イメージングと分光分 析法の実施を可能にする。

これまでにも、部位特異性を持たせようとする試みがなされたが、完全には成功 しなかった。理由は、例えば抗体は、通常ナノモルの濃度で機能するが、緩和特 性に効果がみられるコントラスト剤の最小濃度がこれよりもはるかに高い（ミリ モル）ことにあった。本発明のメラニン系薬剤は、ガドリニウムを含有する場合 でも、超常磁性鉄剤を含有する場合でも、抗体作用の生理学範囲にはるかに近い マイクロモル以下の濃度で機能することができる。

他の金属を組み込むことによって、特性が異なる多数のコントラスｔ・剤を得る ことができる。同様に、合成の際、メラニンの重合度をコントロールすることに よって、一連の分子量範囲の薬剤を作り、全く異なる、新しい用途に充ててもよ い（例えば、血液貯留用剤、経口コントラスト剤、疾患特異性薬剤、腫瘍用剤） 。

あるいは、合成の際に薬剤に組み込まれるガドリニウム（または、他の金属）の 量および／または遊離ラジカル含有量によって薬剤の効力を調整することもでき る。また、メラニン−金属から化学的に誘導体を作り、血液−脳バリアーを浸透 する親油性薬剤を得たり、あるいは別のタイプの部位特異性の材料（リボゾーム 、ペプチド、酵素など）と結び付く部分を持つ他のメラニン剤を得ることができ る。異なるメラニン先駆物質および／または触媒、溶媒、反応時間をはじめとす る各種反応条件の選定を上手に手配して、多種多様の臨床特性や物性を持つ製品 を作り、疾患の検出を増進し、治療の追跡を行うために好適な生体内分布、物性 をもつ画像強調剤を得ることもできる。

最後に、インビボにおいて高分解能ＮＭＲにより化学シフトを変化させるために 、これらの物質を使用することは、はとんど開発されていない研究分野である。

これまで、インビボにおいて高分解能ＮＭＲにより化学シフトを変化させて定量 や同定が行われてきたが、いつもこれに使われるのがランタニド金属錯体であっ た。したがって、これらの新しいメラニン材料によって、インビボの磁気共鳴イ メージングと分光分析法の用途に全く新しい分野が開けたのである。

本発明の主たる目的と用途は、メラニン材料に隣接する陽子その他の原子核の核 磁気共鳴（ＮＭＲ）緩和率Ｔ、とＴ２を変化させることにある。観察している原 子核のＴ　１／　Ｔ　２緩和率が隣接する正常領域と関連しながら変化する場合 、この領域から得た磁気共鳴（ＭＲ）画像あるいはスペクトルのコントラストが 変化しているか、あるいは薬剤の環境中の特定の原子核は化学シフトが変化した ことを示すこととなる。

特定領域のコントラストが変化すると、他の領域との関連で、この特定領域が目 で見えるようになる。多くの組織構造では、磁気共鳴イメージングのコントラス トが同様あるいは同等の強度を有していて、コントラストのノイズに対する比が 充分に大きくならないので、病変、腫瘍または異常がある組織構造を容易に目で 評価したり、検出することができなくなってしまう。

本発明のメラニン剤を添加すると、一様な強度を有している領域が相当に変わり 、ノイズに対するコントラストの比が上昇して、検出と同定が容易になる。メラ ニン剤の常磁性効果は、特定のＮＭＲ共鳴の化学シフトにも働き、さらにメラニ ン剤は観察しようとする原子核を取り囲む微環境を変えるので、これらの領域の 検出、同定、定量をより容易に実施することができる。

本発明の重要な目的と使用方法には、特別なコントラスト剤を構成１７て、イン ビボでの磁気共鳴イメージングに応用することがある。メラニン・マトリックス を用い、これに異なる添加剤（例えば、金属および／または遊離ラジカルの濃度 を変える）を混合して、所望の器官、組織、病変、構造におけるＴ１とＴ２のい ずレカ、またはその両方を変化させることによって、検出能を増大させる。さら に、メラニンマトリックスは、共有結合、イオン結合、疎水性結合あるいは親水 性結合によって、モノクロナールあるいはポリクロナール抗体、受容体、　リポ ゾーム、膜、タンパク質、酵素、ポリペプチドなどに化学的に付着させることが できる。

このように構成したメラニン含有物質を部位（目標）特異性緩和剤として使用し 目標構造の可視化および／または同定を可能とする。このようにして、疾患状態 と健康な組織を、増強された特異性と検出能を持っＭＲＩでプローブすることが できる。

本発明のいくつかの側面のうち、次に掲げるものは新規である。

１、安定な遊離ラジカルと結合したガドリニウムイオンまたは超常磁性鉄粒子を 含有するメラニンは、ＮＭＲ緩和率に関してこれまで報告されたことがなかった 大きな効果を示す。このメラニン剤はマイクロモル（またはそれ以下）の濃度で 、従来の緩和剤がミリモル濃度で達成するのと同様の効果を挙げることが出来る 。従来はランタニド系を用いて化学シフトを変化させていたなどの独特の用途に 対して、別の金属を組み入れた非常に特異的な薬剤を設計することができる。

さらに別の常磁性金属イオンにより、ポリマーの遊離ラジカルあるいは不対電子 の含有量を調整すると、ガドリニウムや超常磁性鉄を含有させて既に改良しであ る薬剤よりも、さらに優れた緩和効果を示すことができるであろう。

２、メラニンは、多くの関連材料（例えば、Ｌ−ＤＯＰ　Ａ、ドーパミン、カテ コール、チロシン、その他のジヒドロキシ芳香族化合物）から合成することがで きる天然ポリマーであって、新規な常磁性特性を持つ、あるいは異なるの金属を 混合する、異なる結合特性を持つ、遊離ラジカルあるいは不対電子の含有量が異 なる、分子量範囲が異なる、などの異なるポリマーを作り出すことができる。緩 和増大のパラメターは、これらの要因によって影響される。し７たがって、メラ ニン先駆物質を選択し、金属イオンを選択ｊ７、付随する官能基を選択（−１ま た製品設旧１、例えば分子量が異なる薬剤に異なる含有量の遊離ラジカルを付け る等の、合成条件を選択して、特定の目的に適合させたメラニン剤を作ることが できる。

３、メラニンは多数の官能基を持つ高分子物質であるから、所望の大きさおよび ／または反応性に、メラニン剤の分子量範囲を適合させることが出来る。例えば 、合成により低分子量のメラニン剤に親油性の付加基を付りて、血液−脳バリア ーの浸透用に用いることもできる。また、メラニンを所望の大きさにして、細胞 付着分子あるいはその重要部分に結合させることもできる。

グルタルアルデヒド、水溶性カルボジイミドなどの三官能基を用い、メラニンを 直接あるいは付加物を介して、所望の結合特異性を持っ担体に付けることができ る。

陽電荷を持つ基、陰電荷を持つ基、ポリエチレングリコールなどの水溶性非イオ ン性部分を結合してメラニンの真の外側形状を変えるだけで、インビボ分布が変 化するので、これによって局在化の位置を選択したり、選択した部位を避けるこ とができる。

分子量が高い常磁性メラニン系薬剤は、経口用コントラスト剤として用いたり、 ゆっくりと移動する薬剤として用いて注射部位で観察を実施することができる。

分子量が１．０００ダルトンを超えると、メラニン・ポリマーの遊離ラジカル（ 不対電子）が組成中の金属（例えば、ガドリニウム）と結び付いて、緩和時間（ Ｔ、と７２）を低下させる相乗効果があると考えられる。金属をメラニン・ポリ マー内部に結合すると緩和が増強されるが、これは恐らくは、メラニン・ポリマ ー内で共役化が長く続いて（ＵＶ／Ｖ　Ｉ　Ｓ吸収と黒色か強いことからも例証 できる）、高度のラジカルの非局在化が起こることが原因となっているのであろ う。

したがって、メラニン表面を水和化すると、ポリマー全体の金属から非局在化に より、高濃度の不対スピン（遊離ラジカル）が現れると考えられる。このように 、非常に大量の水分が影響を受けるので、優れた緩和材料となる。本発明の理解 を押し進めるために、薬剤の効力のメカニズムについて仮説を述べたが、その全 てが正しいとは言えないかも知れない。これらを理由として、本発明の請求範囲 を限定してはならない。

メラニンは、イオン交換材料として働き、外表面に金属を結合することで知られ ているが、これらの金属は交換や希釈（あるいは、透析）によって容易に取り除 かれてしまう。事実、Ｌ−ＤＯＰＡ−メラニンとＬ　−ＤＯＰＡ−メラニン−ガ ドリニウム・ポリマーの双方は、ガドリニウムと結合して、Ｔ１とＴ２を低下さ せる。ところか、希釈するとＬ　−１）　ＯＰ　ＡメラニンのＴ、とＴ２に対す る効果は本来の低さに戻ってしまう（内在する遊離ラジカルが背景となって）が 、合成の際に組み入れられたガドリニウムによって、１゛１とＴ２に対する効果 を再び高水準に戻すことができる。通常、金属をキレート化剤から解離するため に用いられている技術でも、本発明によりメラニン−金属ポリマー含まれている 金属を取り除くことはできない。

４　多数多種の金属をメラニンに組み入れることが出来るから、効果が同等では あるが若干の違いかある有用性か期待できる異なる材料を作ってもよい。例えば 、超常磁性鉄を組み入れるとＴ２緩和に極めて強い効果がある薬剤（例えば、Ｔ 、緩和能＝３２，８１５（ｍｍ。

ｌｅ／ｌ）−’５ｅｃ−’）を作ることができる。一方、ガドリニウムを組み入 れると′ｒ、緩和に非常に強い効果がある（　Ｔ＋緩緩和＝　３０　（ｍｍｏｌ ｅ／１）川５ｅｃ−’　）。ユーロピウム、プラセオジムなどを組み入れると、 非常に有用で、強力なＮ　ＭＲ化学シフｌ〜・エフェクターかできる。これは、 Ｔ、緩和能に対しては、１９８と１８　、６　（ｍｍｏｌ／１）−’５ｅｃ−’ と言う中等度の効果しかないか、インビトロで化学シフトの変化を増強するとと もに、インビボでの磁気共鳴分光分析法で用いられる最初の化学シフト剤を提供 する。

５、金属含有メラニン・ポリマーは、組み入れるべき金属イオンの存在下で合成 しなくてはならない。メラニンのプレポリマーを作って、これを金属イオンの溶 液中にいれたり、あるいはプレポリマーをメラニン・ポリマー中に交換すること ができるが、この交換は効率的ではない。後者の方法で生成したコントラスト剤 は、金属の存在下で重合した薬剤より効果が劣り、しかもアミン類あるいはアジ ドで希釈、反応すると、金属の存在下で合成した金属含有メラニンよりはるかに 急速に効力が衰えてしまう。

金属イオンをメラニンに添加する際（新たな合成、または交換によって）、しば しば水溶液がらメラニン錯体が析出することがある。Ｎ−メチル−グルカミン、 トリエチルアミン、グルタミン酸などの、好適な生体適合性の溶解補助剤で適当 に処理すると、水溶性の塩が出来る。この取り扱いにくいメラニンの溶解度を増 大させる、その他の技術としては、ポリマーを酸性化して酸化重合中に生成する 塩を取り除くことが挙げられる。使用するモノマーにもよるが、メラニン遊離酸 は、水溶液やその他の多くの有機溶液に対する溶解度を高めることができる。

６、各種の常法によりイオン性および／または反応性官能基を反応させることに よって、メラニン−金属錯体から化学的に誘導体を作ることは容易である。これ らの誘導体には、高い親油性を持つもの、非イオン性であるもの、特定の溶解度 を持つもの、リボゾーム、膜、受容体タンパク質、酵素、ポリペプチド、などに 結合しているもの、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体に結合１．いる部 位特異性コントラスト剤が挙げられる。

７、毒性と許容縫は１体的に評価しな１プればならない。しか；−２なから、ｋ 然メラーンは至るところに存在（２、一般にＪ−のような天然あるいは合成メラ ニンのｎ容量は高いはずである。ネズミおよびラビソ］・のモデルによる初期の データでは、急性毒性を認めなかった。

メラニン−金属剤の金属イナン３有逼は変化する。しかしなから、金属はメラニ 試／・ポリマー内部に包接されていて、金属かメラニンと解離できないため、金 属が急性毒性の原因になることはありえない。メラニン剤は、全部ではないとし ７ても、少なくとも部分的には、ネズミとラビットの尿から排泄される。

本発明のメラニン剤は著しい緩和効果があり、モノクロナール抗体に組み入れら れて、抗体の通常機能するナノモル濃度に近い濃度で部位特異性効果を発揮する 最初の薬剤である。この技術による系は、放射性核種による画像化に取って変わ り、Ｐ　Ｅ　Ｔ　（ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｅｉａｉｓｓｉｏｎ　ｔｏｍｏｇｒａｐ ｈｙ）の情報に似ているが、はるかに高い分解能をもつ生化学情報を提供するこ とができる。

９、各種メラニン−ガドリニウム剤を対象として、三つの異なる磁場強度を基準 として緩和パラメーター（ＴＩとＴ２）を測定したところ、従来のガドリニウム イオンの不存在下で合成したメラニンと比較して、すべて、Ｔ、およびＴ２緩和 率を大幅に増大させたことが認められた。本発明の常磁性メラニンは、ガドリニ ウムを組み入れない場合であっても、Ｇｄ−ＤＴＰＡ（ＭΔＧＮＶＩＳＴ＠）と 同等の緩和能を持っており、画像化剤として使用でき得る可能性を示し、でいる 。したがって、メラニン剤は低水準のマイクロモル濃度でもコントラスト剤とし て有効である。超常磁性鉄を含有するメラニン剤を調製したところ、そのＴ＋／ ’ｒ２効果は、従来のガドリニウム剤のうち最−Ｌのものの約１０倍以上であっ た。表２〜５に示すように、多くの金属とメラニン・ポリマーが、Ｔ１緩和能を 増大させるのが認められるが、その効果は金属イオン含有量と遊離ラジカル濃度 の双方に依存している。

動物実験でメラニン−Ｇｄを投与した結果では、優れた許容庫を示していた。予 備実験では、メラニン剤は動物の飲料水に混ぜて与えられる優れた経口コントラ スト剤であることが認められている。この薬剤を静注した場合でも、高い許容度 を示（−た（急性毒性を認めなかった）。予備実験結果は、この薬剤が血液貯留 コントラスト剤（ｂｌｏｏｄ　ｐｏｏｌ　ｃｏｎｔｒａｓｔ　ａｇｅｎｔ）とし ても有効であることを示唆している。循環系、腎臓、肝臓、膀胱において、コン トラストが強調されているのが認められた。ラビットの側頭下顎関節（ｔｅｍｐ ｏｍａｎｄｉｂｕｌａｒ　ｊｏｉｎｔ：　Ｔ　Ｍ　Ｊ　）に注射した後、ＭＲＩ 検査を実施した。コントラストは注射部位でかなり強調されたが、注射部位の周 囲が経時的に堅くな−ってきたので、結果の評価は行わなかった。

常用されている、数種の合成方法により、各種配合量による各種金属イオンを含 有し、各種分子量による最終製品を得て、各種濃度の遊離ラジカルを配合し、最 終製品が各種溶解度を持つ（各種メラニン先駆物質を用いて）メラニン剤を調製 することができる。緩和能（ＴＩ／Ｔ２）の相当な増大を認める分子量約１１． ０００の、ガドリニウム含有Ｌ−Ｄ　ＯＰ　Ａメラニンの典型的な製法を次に掲 げる。

典型的な化学反応順序は次の通りである。。

１、）過硫酸アンモニウム／ＤＭＡ　Ｐまたはアゾビスイソブチロ ニトリル／塩基 Ｌ　−Ｄ　ＯＰ　Ａ± Ｇ　ｄ　Ｃｌ　３または　−−−−−−−−−−−−−−−−−→メラニン上Ｇ ｄ”３他の金属 ２）所望の分子量範囲の遊離と精製 ３）遊離ランカル含有量の調整 ４）必要な場合は、Ｎ−メチル− Ｄ−グルカミンを加える 約１５，０００の分子量のメラニン−Ｇｄポリマーの生成の代表的な反応は次の 通りである。水１５０ｍ１中で、■、−ＤＯＰＡ　］、２５ｇ、ジメチルアミノ ピリジン（ｉ）ＭＡＰ）０．７５ｇ、ＧｄＣｌ、０．２５ｇ、過硫酸アンモニウ ム　０．１５ｇを混合する。３０分間攪絆した後、分子量１４，０００のカット オフの透析膜で透析するか、あるいはＮ−メチル−Ｄ−グルカミンＬｏｇを添加 し、混合物を５０”Ｃで一晩加熱する。

冷却後メラニン−Ｇｄ−メグルミン溶液を分子量１４．。

００のカットオフの透析膜で透析する。あるいは、メラニン溶液について限外濾 過またはカラムクロマトグラフィを実施して分子量を分別する。このようにして 得た水溶液は、そのまま使用するが、あるいは蒸発によって濃縮する。遊離ラジ カル含有量の調整は、メラニンと酸化剤（例えば、Ｈ２Ｏ２）あるいは還元剤（ 例えば、Ｎ　ａ　Ｈ１亜ジチオン酸塩）とを反応させて行う。

図６のグラフはメラニン−Ｇｄ剤の濃度（ｇ／１０００ｇ　Ｈ２Ｏ）と、そのＴ 、緩和効果率との対比を示すものである。これによると、メラニン−Ｇｄ溶液か 陽子のＴ、に対（、て顕著な効果があることがわかる。ガドリニウムを含まない メラニンでも、Ｔ、に対し、でがなりの効果を認めたが、この製剤には濃度依存 効果がないことは注目に値する。

このメラニン−Ｇ　ｄ材料は、さらに、分子量によって分画することができる。

始めの透析溶液を蒸発し７て低分子量メラニン−Ｇｄ（分子量＜１４，０００） を得る。

適当な限外濾過膜を使って、メラニンをどの分子量範囲の大きさにも分別するこ とができる。同様の反応条件によって、超常磁性の鉄その他の金属を含有するメ ラニンを生成することができる。また、触媒、反応時間、反応温度を変えると、 分子量が異なるメラニンができる。さらに、予め生成されたメラニン（合成、天 然の別を間オ）ず）を取り、このポリマーにガドリニウムや鉄を交換させること も可能である。しか（２ながら、このようにした材料のＴ　、／　Ｔ　２に対す る効果は小さい。

（７かもこの効果は信号誘導性金属の存在に依存していて、希釈したり、アミン 類、アジド類と反応させると、急速に夫れでしまう。例えば、図９〜］２におい て、約ｉ、ｏｏｏ〜５０，０００の分子量範囲内のＬ　−Ｄ　０ＰＡ−メラニン −ガドリニウム剤のうち、数種の異なる分子量を持つ分画のＴ、に対する効果を 示している。図１３は、別の先駆物質３−アミノ−Ｌ−チロシンから生成した分 子量約５０．０００のメラニンの効果を示している。これと、図１２の先駆物質 Ｌ−ＤＯＰＡから生成した、同一の分子量をもつメラニン剤と比較する。

これらの薬剤の効果はすべて、Ｔ、を約３５倍減少させる（　１７．５　（ｍｍ ｏｌｅ／１）　’５ｅｅ−’）、毒性が高い塩化ガドリニウムの効果に匹敵する （図９〜１３）。このことは、市販されているＤ　Ｔ　Ｐ　Ａ　−Ｇ　ｄ　（４ ，５（ｍｍｏｌｅ／ｌ）−’５ｅｃ−’）と比較しても良好である。

メラニン−Ｇｄ製品の調製には、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンを用いる場合と、 用いない場合がある。水に対して良好な溶解度を持つメラニン剤は、最上の磁気 共鳴イメージング・コントラスト剤であり、さらにカルボジイミドを用いたり、 他の結合法を用いて、容易に誘導体を生成したり、あるいは抗体その他の担体に 結合することができる。

ＭＲＩは、強調しなくとも、相当広範囲の組織コントラストを得ることができる 。しかしながら、医師がコントラスト剤によって診断能力を向上できる場合が増 えてきている。本発明は、金属キレート剤よりもかなり低い濃度で陽子緩和率に 極めて強力な影響を与える新種の、臨床上有用なコントラスト剤を提供するもの である。したがって、本発明の創意的薬剤は、有効薬剤濃度が低く、また毒性も 低く、さらにこのコントラスト剤をモノクロナール抗体や、特異的な受容体に結 合することにより、より容易に組織および／または器官に特異性のある薬剤を調 製することができる。

安定した遊離ラジカルであって、これに各種常磁性金属を添加し、あるいはこれ ら金属を添加しない一群のメラニン・ポリマーの合成を説明した。合成をコント ロールすることにより、分子量によって陽子緩和特性を変えることができるよう な明確な特性をもつ一連の薬剤を得ることができる。例えば、高分子量（ＭＷ＝ ５０．０ＯＯ）ガドリニウム−メラニン・ポリマーによるＴ、緩和能は、２．４ ５　ｘ　１０３（ｍｍｏｌｅ／１）−’ｓｅｅ　’（ｎ＝３）であるが、これと 比較してＧ　ｄ　−Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ（ＭＡＧＮＡＶ　Ｉ　ＳＴ＠）のそれは、４ ．５　（ｍｍｏｌｅ／ｌ）−’５ｅｅ−”である。これは５００倍以上の効果で あるが、この効果はメラニン・ポリマーの分子ｉｔ　（ＭＷ）とポリマー内の遊 離ラジカル密度に依存している。例えば、中間の分子１（１４，０００ダル］・ ン）のガドリニウム−メラニンによるＴ、緩和能は、９．５　ｘ　１０２（ｍｍ ｏｌｅ／１）−’５ｅｅ−’であるが、低分子量（８，０００ダルトン）の薬剤 のそれは２６．６　（ｍｍｏｌｅ／１）−’５ｅｅ−’である。メラニン先駆物 質であるモノマーと各種金属を選択してメラニン剤を合成すると、陽子緩和に対 する効果が異なる材料が生成する。これまで、超常磁性銖がメラニン・ポリマー に組入れらできたが、Ｔ、およびＴ２緩和率を極めて高める効果を示している（ 図８及び１４参照）。

経口コントラスト剤および血液貯留剤（ｂｌｏｏｄ　ｐｏｏｌａｇｅｎｔ）を量 刑とする、これらの新薬剤をネズミモデルに投与して得た効果を画像データとし て示す（図１５〜１７）。１．０００と５０，０００の分子量のメラニン−ガド リニウム剤をラビットの耳部静脈に静注して得た画像と、ＭＡＧＮＡＶ　Ｉ　Ｓ Ｔのそれと比較したところでは、メラニンはＭＡＧＮＡＶ　Ｉ　ＳＴを超える強 調効果を示している（図１９〜２３）。さらに、Ｇｄ−メラニン・ポリマーを、 ホルモン、即ち膵臓ポリペプチドで処理したモノクロナール抗体と結合すると高 いＴ、緩和能を示すとともに、常磁性活性を保持することが認めらる。また、Ｇ ｄ−メラニンをＩｇＧとウシ血清アルブミンと結合しても、緩和能が保持されて いるのが認められた。１ｌｌｉｎをメラニン・ポリマーに投入してものを、ラビ ットモデルに用いて膵臓の画像を得たが、選択性が低く、高いバックグラウンド が認められる。

メラニンは、高度の共役性を持つポリマーの混合物からなる高分子である。この 共役のため、紫外／可視光線吸収や、安定した遊離ラジカル特性を始め、メラニ ンが持つ特性の多くか形成および／または安定する。

メラニンは安定した遊離ラジカルとして、それ自身で（コントラスト剤として作 用することにより）緩和効果がある。しかしながら、常磁性金属または錯体をメ ラニン・ポリマーに組み入れることにより、ＭＲＩのコントラストに影響を与え る性能が相当増強される。

天然インビボ・メラニンには、若干の内因性金属が含まれてはいるが、本発明の 薬剤のメラニンに組み入れられた常磁性金属イオンのような緩和効果を持つこと はない。生物系で最も存在の可能性が高い金属は鉄とマンガンであるが、これら 二つの金属はメラニン・ポリマーにも含まれていて緩和能を増強する。しかし、 その効力は、数種の他の金属やガドリニウムはど大きくはない（表２〜５参照） 。さらに、通常生成される生物系メラニンは、水溶液に不溶の高分子量粒子（グ ラニュル）からなっている。このように、水分での溶解度がないと、効果的な緩 和能が非常に乏しくなる。

ガドリニウムは毒性が高いので、インビボで生成される天然メラニンに組入れら でいる可能性はほとんどな昔から、メラニン類が金属イオンと結合できることが 知られていた。合成および天然メラニンがガドリニウム（または、他のランタニ ド類）のような金属と結合して、溶液の（Ｔ＋およびＴ２）緩和を著しく減少す る薬剤を構成することが好ましい。しかしながら、希釈（または、透析）または 金属を除く化学処理を実施すると、メラニンから金属イオンが解離して、この効 果が急速に失われてしまう。これは可逆性で、メラニンの始めの緩和能がちとに 戻る可能性がある。

本発明のメラニン−信号誘導性金属物質は、希釈しても、大規模な透析を実施し ても、アジド類、アミン類で処理しても、かなりのガドリニウム（または、他の 金属）を放出することはない。この結果、画像強調剤として低濃度で効力を発揮 し、高い有用性を確立することができる。

合成メラニンの先駆物質は、例えばカテコール、Ｌ−ＤＯＰＡ、　（または、Ｄ Ｌ−ＤＯＰＡ、、Ｄ−ＤＯＰＡ）、　ドーパミン、　ヒドロキシドーノくミン、 　チロシン、アミノチロシン、ジヒドロキシチロシン、またはフェニルアラニン 、１．８−ジヒドロキシナフチレンのような公知の先駆物質である。本発明では 、メラニンの先駆物質として、主としてＬ　−Ｄ　ＯＰ　Ａ、ドーノくミン、ア ミノチロシンを使用したが、メラニン先駆物質の選択はこれらに限定されるもの ではない。本発明の重合は、水性溶媒またはアルコール性コモデファイアーを含 有する水性溶媒により好まし〈実施された。しかじロフランなどを含む他の溶媒 を用いて、所望通りの構造、分子量、遊離ラジカル含有量、金属含有量、最終溶 解度を持つコントラスト剤ポリマーを特製することができる。

上記金属、類縁金属の重合に用いる重合触媒としては、過酸化水素、過硫酸塩、 過酸、過酸化物、酸素、亜硝酸ナトリウムなど、即ち本質的には強力な酸化剤ま たは遊離ラジカル形成剤が挙げられる。これらの触媒に加えて、アゾビスイソブ チロニトリル（遊離ラジカル重合剤）が使われ、溶解度が向上し、遊離ラジカル 濃度または不対電子濃度を調整できる、広い分子量範囲のポリマーを調製できる ことが認められている。

その他の遊離ラジカル剤も、触媒あるいは反応開始剤として使用できるが、詳細 はまだ未定である。

亜ジチオン酸塩のような還元剤を用いて、メラニンの形成を誘導することができ る。至適遊離ラジカル含有量を得るためには、重合条件、例えば使用するメラニ ン先駆物質、所望のメラニンの大きさ、などに合わせて至適の酸化剤、還元剤、 遊離ラジカル形成性メラニン重合剤を使用しなければならない。メラニンと先駆 物質の効果が光吸収によって限定されるが、リボフラビンのような薬剤を用いて 遊離ラジカルの光誘発を行う方法によってもメラニンの形成を開始することがで きる。

メラニンはまた、チロシナーゼ酵素を用いる酵素法によっても調製することがで きる。本発明で用いる代表的な濃度の常磁性金属イオンの存在下で酵素触媒が行 われたことはないが、チロシナーゼ活性が金属に抑制されて、酵素触媒が妨げら れることが予想される。

金属が必ず組み入れられるように、メラニンが形成される間中、金属はその場に 存在していなくてはならない。したがって、さらに研究を続けて、メラニン−信 号誘導性金属剤の酵素合成を可能にする適当な条件を見いだしたりしたり、この 製法が実際的であるか、否かを決定しなければならない。金属を使わずに、酵素 法で調製した代表的なメラニンは、通常者しい緩和能を示さない（例えば、ＭＡ ＧＮＡＶ　Ｉ　ＳＴより低い）。

しかしながら、適当な酸化剤および／またま還元剤を使えば、遊離ラジカル含有 量を上げて、より効果的なコントラスト剤を作ることができる。

合成メラニンの遊離ラジカル含有量は、メラニン（土金属）ポリマーを酸化およ び／または還元する標準方法を用い、電子の添加と除去を行いながらコントロー ルする。これは、電気化学法を行ったり、過酸化物（Ｈ２Ｏ２、など）、アスコ ルビン酸塩その他のオキシダントのようなオキシダントおよび亜ジチオン酸ナト リウム、水素化ナトリウムのような化学還元剤を使用して実施する。スピンの量 （遊離ラジカル）は、電子常磁性共鳴分光分析法により確認する。

必要な場合に備えて、本発明で開示するメラニン剤のある可溶化法の概略を次に 述べる。分子量の分別によりメラニンを各種分子量範囲に分けると、高分子量材 料（分子量＞１００，０００）のあるものは、これまでに試験した全ての溶媒に 不溶（これは、重合条件と先駆物質による）である傾向があることが認められた 。

そこで、安定した常磁性メラニン、または常磁性メラニン−金属アミン塩を生成 する基本的方法を開発した。

例えば、メラニンのＮ−メチルグルカミン塩（ｍｅｇｌｕ■１ｎｅ）を作ると、 高分子量のガドリニウム−メラニンを容易に溶液中に混合できるようになる。

この観察は完全な普遍性を持ち、且つ有意である。

酸性化したメラニンの場合、アミン塩にすると、完全に水に溶ける、あるいはよ り脂質的な環境に溶けるなどの特定の条件に合致する溶解度特性を持った最終製 品を形成することができる。例えば、疎水性アミンを選択すると、非極性材料に 可溶のメラニンができる。

この技術は、薬品の送出を増大させるため広範に用いられてきた。Ｌ−ＤＯＰＡ メラニンは、メラニン合成をコントロールすることによって、完全な水溶性にす ることができる。しかしながら、他の先駆物質では水に対する溶解度が低く、こ のタイプには可溶化が必要である。

メラニンのアミン塩を形成すると、メラニン塩の浸透圧重置モル濃度が高いため 、患者に対する投与特性が乏しい可溶の材料が出来る。、これは、ＣＴコントラ スト剤で観察された問題で、その結果非イオン性ＣＴコントラスト剤が開発され た。メラニンＭＲＩコントラスト剤でも同様の心配があるが、Ｌ　−Ｄ　ＯＰ　 Ａメラニンの誘導体を形成することでこれを解決できる。他の先駆物質から生成 されたメラニンでも、同様に誘導体を作るこさができる。−エステルや、アミド を形成してＬ−ＤＯＰＡのカルボキシル基から誘導体を作るのは容易であり、定 着１．た方法である。メラニンにエステルやアミド基を加えることにすると、水 溶性を増強したり、親油性を増１７たり、さらには抗体や受容体に結合する結合 部位とすることができる。

これまで、多数の金属が本発明のＭＲＩ剤の合成に使用され、緩和に影響して積 極的にコントラストに変化を与えるメラニン金属剤を形成してきた。これら金属 のうちには、他に優るものもあったが、すべてメラニン単独の場合よりも優って いた。使用金属と１７ては、ガドリニウム、マンガン、超常磁性鉄、鉄、プラセ オジム、イッテルビウム、ジスプロシウム、ユーロピウムが挙げられる。使用金 属からマグネシウムと亜鉛が除かれたことは、特定の金属か重要であることを示 すものである。亜鉛またはマグネシウムを用いたメラニン−金属製剤は、メラニ ン単独と較べて、緩和を向上させない。マグネシウムは常磁性ではなく、シたが って緩和率に影響できない。本発明の創意的な方法により、調製されたメラニン −金属結きに於て、透析あるいは透析とその後のアジ化合物による処理によって 金属が除かれたものはなか−）た。金属はメラニン・ポリマーの完全なる内部成 分となる。

他の前駆物質、例えばドーバミ、ン、アミノチロシンを使ってメラニンの合成を 行う場合、合成原料の操作は筒中である。例えば２．−れらの原料はＤＯＰＡ系 原料主原料中に、抗体、受容体その他の物質に結合することができる。だからと 言って、他より優れた原料であるいう意味ではなく、ある背景下ではより多目的 に使用できるにすぎない。

メラニン−金属剤の分子量は、重合触媒の選択、反応条件、重合時間によって、 コント−コールすることができる。低分子量材料と高分子量材料の緩和率に差か あることが解って以来、ガドリニウムその他常磁性金属の総量が重要な要因とな る場合もある。さらに、共役ポリマー・マトリクスに金属を組み入れる程度も重 要である。溶解度が異なる各種分子量の材料を作れるため、用途に特異的な薬剤 を設計することが可能である。

例えば、高分子量で血液が毛細管構造に入らないようにした一般血液貯留用剤（ ｇｅｎｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｐｏｏｌ　ａｇｅｎｔＳ）、血液−脳バリアーに 浸透できる低分子量材料などである。また、粗製合成メラニン（土金属）を各種 分子量に分別するには、数種の標準技術を組み合わせて所望のメラニン・ポリマ ーに合う分別方法を容易に確立することができる。まず、広い分子量範囲毎に透 析膜を選択して、粗製反応液を透析する。同様に選択したカットオフ膜を用いて 限外濾過を実施し、比較的に狭い分子量範囲に分別する。さらに狭い分子量範囲 の分別には、ゲル浸透クロマトグラフィ　（重力またはＨＰ　Ｌ　Ｃ）を用いる 。

メラニン−金属ポリマーを抗体に結合することに成功した。これは、生物の部位 に特異ではないパイロット抗体を選んでいて、画像化研究を前進させることを目 的とはし、ていない。しか］７なから、これらの予備研究によって、メラニン− 金属ポリマーを抗体に結合（７、これに強力な緩和効Ｖと抗体ｌ占性を保持させ る工程が実行可能であることか立証された。現在、特定の疾患過程に結合抗体を 使用して、抗体−メラニン剤の効力を確認する実験が進行中である。

画像化の′Ｙ−備寅験の結果、ガドリニウム−メラニンが動物モデルで紅［’ｌ コントラスト剤および血液貯留用剤として有効であることか証明された。現を、 これまでに形成（またメラニン−金属剤の全てに一ついで、インビボ・コントラ スト剤と１５での作用性能を確認する実験を実施中である。特定の器官、組織に 薬剤を置いて器官画像化効果（例えば、心臓画像化、肝臓画像化、など）を評偏 する予定である。

長年にわたり、数種のランタニドが高分解能ＮＭＲ分光分析法の化学シフト剤と して用いられて来た（ジスプロシウム、ユーロピウムなど）。これらのランタニ ドは画像化に対する効果ばかりでなく、インビボでの化学シフト位置に影響を与 える可能性もある。このことによって、インビボ診断応用の新分野が開かれるか も知れない。メラニン−金属結合は化学シフト剤と１７で特に有用である可能性 がある。

ＭＲＩ用剤の緩和能について、従来品と新製品を比較したものを表２に示す。

ガドリニウム−ＤＴＰＡ　４．５ （Ｍａｇｎａｖｉｓｔ） ガドリニウム−ＤＯＴＡ　３．８ （肝臓中）６．７ マンガン−Ｄ　Ｐ　Ｄ　Ｐ　２．８ （肝臓中）　２１．７ ガドリニウムーメラニン （Ｌ−ＤＯＰＡ） Ｍ　Ｗ二５０．０００　２４５０．０ メラニン（１，−Ｄ　ＯＰ　Ａ　） ＭＷ＝＋５０．０００　４．８ 表２では、薬剤によって誘導された相対的緩和能についで、各種がトリニウムキ レ−１・剤とガドリニウム・−メラニン剤とを比較して、後者の優位性を示して いる。

さらζごまた、金属を含有１．ない常磁性メラニンが、Ｇｄ−ＤＴＰＡ　（ＭＡ ＧＮＡＶ　Ｉ　５Ｔｏ）と同等の緩和能を示すことも示している。この効果は、 メラニン含有の遊離ラジカルによるものである。

磁気共鳴イメージングに用いるコントラスト剤として最も効果的な金属イオン− メラニン・ポリマーを得るため、Ｌ−ＤＯＰＡ、３−アミノ−し−チロシン、ド ーパミン、カテコールを原料とし、各種常磁性金属イオンを投入し、温度、触媒 、反応時間を変えながらメラニンを合成した。その結果、アブビスイソブチロニ トリル（ＡＢＮ）を触媒として合成したＩ、−ＤＯＰＡメラニン−ガドリニウム が、可溶であり、しかも濃度１ｍ　ｇ　／　ｍ　＋以下でＴ、緩和時間に優れた 効果を持つ効果的なコントラスト剤を形成できることが認められた。

過硫酸アンモニウムを触媒として合成したガドリニウム標識のＬ　−Ｄ　ＯＰ　 ＡメラニンはＴ、緩和時間の低下により効果的ではあったが、溶解度を至適化【 ７ようとするとこの効果が大きく低下した。ユーロピウム、プラセオジム、イッ テルビウムなどの金属も緩和時間に対して効果があったか、しかじがトリニウム の効果はど優れたものではなかった。超常磁性酸化鉄は、Ｔ、およびＴ、緩和時 間の双方に対して劇的な効果を認めた。しかしながら、コントラスト剤として使 用するためには、極端に短いＴ２時間をＭＲＩ装置によって利用できる場合を除 いて、Ｔ、とＴ２に対する効果の比をはっきりさせる必要がある（代表的な臨床 用画像化装置では、例えばエコーブレナ画像化（ｅｅｈｏｐｉａｎａｒ　ｉｏｉ ａｇｉｎｇ）のような速い走査や速いイメージング法を日常的に実施することは できない）。

本発明の実施例を以下の例により説明するが、後述の請求範囲で特にその旨を述 べていない限り、この実施例を理由として本発明の請求範囲を限定してはならな い。

仁Ｌ１ 本発明で用いた合成、晶出および 可溶化プロトコル Ｌ　−Ｄ　ＯＰ　Ａ　１．２５ｇ　１９７　．００６３５Ｇ　ｄ　ＣＩ　、　０ ．２５ｇ　３７１　．０００６２５Ｄ　Ｍ　Ａ　Ｐ　０．７５ｇ　１２２　．０ ０６３５過硫酸アンモニウム　０．１５ｇ　２２８　．０００６２５方法： １、蒸留水１００ｍ１中にＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）を溶解する ２、１、−Ｉ）ＯＰＡ（Ｌ−１ニドＯキシ７　、ｘ　ニー　ルア　ラニン）を添 加し、溶解に必要な場合、水をさらに添加する ３、　これをフラスコに移す（２ｘ最低置）４、ＧｄＣｌ３を加え、溶解する ５、過硫酸アンモニウム（触媒）を加える６、所望の分子量と収量を達成するま で異なる時間反応を続ける ７、メラニンを分子量に従って分別する８、遊離ラジカル含有量を測定／調節す るブ一旦−」−−−ヲー沙−Ｕじ一見−ｑ−１−へ−）−２摩−１上清−丈−（ （メープー千−ン二Ω：σ−７戊Ｗ栗−丸ｌ　水子１　１酉１ ■、−Ｄ　ＯＰ　Ａ　６．２５ｇ　１９７　０．０３１７Ｄ　Ｍ　Ａ　Ｐ　３． ７５ｇ　１２２　０．０３０７Ｇ　ｄ　Ｃｌ　、　２．４９ｇ　３７１　０．０ ０６７（存在下、不存在Ｆ） Ｎ　ａ　ＯＨ０，０５Ｋ１１．２０％＝Ｍ　ｅ　ＯＨ６００ｍ１ 方法： １．０．０５Ｍ　ＮａＯＨ６００ｍ１，２０％メタノール（ｐ、Ｈ１−２，６） を反応フラスコにいれ、攪拌しながら７０℃に加熱する２、ＤＯＰＡを加え、完 全に溶解する ３、ＤＭＡＰとＡＢＩＮを加え、完全に溶解する４、ＧｄＣｌ３を反応容器に加 える ５、反応を異なる時間続け、所望の分子量と収率をコントロールする ６、メラニンを分子量に従って分別する７、遊離ラジカル含有量を測定／調節す るＮａＯＨ（０，０５Ｍ）および２０％メタノール（ｐＨ＝１２．６）を反応混 合物に添加しないことを除いては、プロトコルＢと同様にする。

二２−−コ＝乙−−」７．ユ＝シーエク≧−１Ｖλ−−≦］−−５５ニア　ミ　 ノーー！、−二一−ｊ！５−ａ＝Ｌ−ニジつ刀委−，−１、|ブ益ｐ ■１目り慕」１μ」ヨ（支乃ヨー戒 ｕ　ＬＬｊ！　！！ＬｆＵ　千Ｊヒ数 ３−アミノ　１．８１ｇ　２８９　．００６２５Ｌ−チロシン Ｄ　Ｍ　Ａ　Ｐ　０．７５ｇ　１２２　．００６３５Ｇ　ｄ　ＣＩ　３　０．２ ５ｇ　３７１　．０００６２５過硫酸　０．１５ｇ　２２８　．０００６２５ア ンモニウム　（１０％） 方法： プロトコルＡと同様にする。他の前駆物質（例えば、ドーパミン、カテコール、 など）もこの一般的プロトコルに従う。

プロトコルＥ：メラニンの口 仄１　便」Ｌ量 合成メラ：−ン１００−１５０ｍ１ Ｎ−メチル　Ｄ−グルカミン　５ｇ 方法： １、メラニンに、ＮＭＥＧ　（Ｎ−メチル　Ｄ−グルカミン）５ｇを加える ２、これを底の丸いフラスコに移し、５０°Ｃで一晩熱する プロトコルＦ：カテコールの日 トルエンを熱し、これにカテコールを溶解した後、冷却して、カテコールを晶出 させる。トルエン溶液からカテコールを濾出する。

プロトコルＧ：メラニン　ヘ置載 親油特性が異なるメラニン、または抗体や、受容体に容易に結合できるメラニン を形成することを目的とする。メラニンの官能基を利用して、緩和能特性を変化 させることなく常磁性メラニン誘導体を形成する。

上記が代表的プロトコルであるが、フェノール性ヒドロキシル基、カルボン酸、 アミン官能基を介する結合を実現するため、メラニンのタイプによって多数のカ ップリング剤（例えば、カルボジイミド、など）や、リンカ−を使用することが できる。

駁ＩＬｕｊ！！ メラニン−Ｇｄ　（５０にダルトン）　１１．６ｍｇトリエチルアミン　過剰 クロロギ酸イソブチル　４０ｍｍｏｌｅｓ方法 １、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で一晩６５℃で加熱して、トリエチルア ンモニウム塩を生成する ２、蒸発した後、再びＤＭＦ　５ｍ　ｌに溶解する３、水分を防ぎながら、０℃ に冷却する４、クロロギ酸イソブチル（ＩＢＣＦ）を加えた後、溶液を０℃で２ 時間攪拌する ５、ＩＢＣＦで活性化したメラニン（ＩＢＣＦ−ａｃｔｕａｔｅｄｍｅｌａｎｉ ｎ）を−滴づつ（注射針で）加えて１ｍｌとし、エチレンジアミンを２分かけて 冷却（４℃）する ６、メラニンを限外濾過して、低分子量の副産物を取り除いて精製する 二４−ｙ１−ヨトー：ｙ−ル　Ｈ：　、７’　５　−”　＞　−ン辷−乏ｙ−男 １−亨ｎ−１４！−（「−ｒ克−タトーｍＵＡメラニンを分別精製するＡｍ１ｃ ｏｎ限外濾過法メラニン反応物をＨＣｌで析出させて、ろ液をデカントする。メ ラニンをメタノール（または、メタノールニ８２０）で二度洗った後、ろ液をデ カントする。緩衝Ｈ２０（）リス、Ｐ　Ｂ　Ｓ、炭酸塩　、）を入れである、ｐ Ｈ９のＡｍ１ｃｏｎ攪拌セルにメラニンを移し入れる。その後の代表的反応の流 れは次の通りである。

（ＭＷは分子量を、ＭＷＣＯは分子量カットオフをそれぞれ意味する。） メラニン　ｖｓ、１００．ＯＯＯＭＷ（ＹＭｌｏｏ）のフィルターメラニン＜　 １００．ＯＯＯＭＷＣＯｖｓ、５０．ＯＯＯＭＷＣＯ（ＹＭ５０）のフィルター メラニン＜　５０．ＯＯＯＭＷＣＯｖｓ、１０．ＯＯＯＭＷ（ＹＭＩＯ）のフィ ルターメラニン＜　１０．ＯＯＯＭＷＣＯｖｓ、１．ＯＯＯＭＷ（ＹＭＩ）のフ ィルター所望の分子量範囲を得るためには、その他のサイズのフィルターを用い る。

例−２ 合成１．２．３．４ 最高の収量を得る至適条件設定を目的として、カテコールからメラニンを合成し た。まず、カテコールを再結晶させて精製した（プロトコルＣを参照）。予め５ ５℃に熱して攪拌したアセトニトリル１７５ｍ１に、触媒として使う過酸化ベン ゾイル（７ｇ）を加えた。

再結晶したカテコール（５ｇ）を上記の溶液中に加えた。そして、　トリエチル アミン２ｍｌとアセトニトリル２５ｍ１の混液を添加した。溶液を一晩反応させ た。

反応後（暗褐色になっている）、ロータリー・エバポレーターにかけて、アセト ニトリルを除いた。残った生成物をエーテルで析出し、上澄み液をデカントし、 残滓を乾燥させた。沈澱剤をメタノールに溶解し、エーテルで再析出させた。再 び、エーテルをデカントし、沈澱剤は乾燥（真空）して保存した。両沈澱中のエ ーテルに不溶の物質はメタノールに溶解して保存した。

この方法による沈澱物の収量は０．５１ｇであった。この方法と同様して合成２ を実施して沈澱物０．４４１　ｇを得た。トリエチルアミン２ｍｌの代わりに２ ０ｍ１を用いた以外は同様にして合成３を実施した。この変法では、サンプルの 沈澱が困難であった。ロータリー・エバポレーターでは、アセトニトリルと共に トリエチルアミンの全てが取り除かれず、過剰のアミンがサンプル中に残って（ ７まった。沈澱前に、エーテルに不溶の物質（メタノールには溶解した）を０． １２ＭのＨＣ１溶液で洗う必要があった。その後は、メラニンは完全に沈澱し、 　トリメチルアミンは溶液中に残った。

混液を濾過し７、ろ液を水で繰り返し洗った。その後、ろ液を乾燥させた。反応 温度を室温とした以外は合成３と同様にして、合成４を実施ｌ−だ。エーテルに 不溶の沈澱物は、ＨＣＩと水で洗う前には、メタノールよりむしろクロロホルム に溶解した。この時の収量は１０３３ｇであった。

匠１ 合成５ 過硫酸アンモニウムを触媒として、ドーパミンからメラニンを合成した。ドーパ ミン（１ｇ）を水１００ｒｎｌに溶解した。過硫酸アンモニウム（０，１１８４ ｇ）をドーパミン溶液に加えた。溶液を一晩反応させた。

このようにして得たメラニンは、水、メタノール、ジメチルホルムアミドに不溶 であった。不溶のため、この生成物について実験を続けて行わなかった。触媒と してＡＢＩＮを用いる変法を実施したところ、可溶のドーパミン−メラニン−Ｇ ｄポリマーを得た。

旧 合成６ 過硫酸アンモニウムを触媒として、ドーパミンからメラニンを合成した。例３と の主たる相違点として、塩化ベンゾイル０．５ｍｌと塩化メチレン４．５ｍｌと の混液を反応液に加えた以外は同様にして、本例を実施した。得られたサンプル は、依然として水、数種の有機溶媒に不溶であった。

帆ｊ 合成８ コントラスト剤研究用としてガドリニウム（Ｇｄ”↓）を組み入れることを目的 として、Ｌ　−Ｄ　ＯＰ　Ａからメラニンを合成した。まず、ジメチルアミノピ リジン（ＤＭＡＰ）（３ｇ）を水３００ｍ１に溶解した。Ｌ−ＤＯＰＡ　（５ｇ ）を溶液に加えて、完全に溶解するまで攪拌した。Ｉ、　−Ｄ　ＯＰ　Ａを溶解 させることは若干困難であった。ＧｄＧｄＣｌ５（Ｉを溶液に加えた。Ｇｄｃｌ 、は完全に溶解しないで、添加の際溶液は濁った緑色に変わった。過硫酸アンモ ニウム（０，６ｇ）（触媒）を溶液に加えた。触媒添加のほとんど直後から反応 が開始されたので、そのまま２週間反応を続けた。

その後、分子量カットオフが６〜８，０００の５ｐｅＣｔｒａｐｏｆ透析管に水 を入れたものを用い、−）１間透析し２て、過剰の触媒、ＤＭＡＰおよび反応し ない試薬を除いた。

溶液１０ｍ１の乾燥重量は、濃度か７．７ｍｇ／ｍｌであったことを示［７てい た。サンプルの１：１００倍希釈液のＴ１緩和時間は４８８ｍ５ｅｃであった。

液は溶解度１００％ではなく、シたがって結果に固形分によるエラーがあったか も知れない。

例一旦 合成１０ 各種条件によりガドリニウムイオンを組み入れながら、Ｌ　−Ｄ　ＯＰ　Ａから メラニンを合成した。上記の試薬とその使用量を用い、基本的には合成８の方法 と同様にした。反応は一日間続けた。溶液は最初、分子量カットオフが６〜８　 、ＯＯＯの透析管に水を入れたものを用いて透析した。さらにこの分画を、分子 量カットオフが５０．０００の透析管に水を入れたものを用いて透析した。Ｇｄ −メラニン溶液は、この時ばがりでなく、他の時においても、たとえ反応直後に 可溶であったとしても、経時的に不溶となった。合成８の材料は反応直後から既 に一部不溶であったが、本例の材料の場合、最初は可溶であった。恐らく、これ は反応時間が減少し、たためであろう。溶液１０ｍ１の乾燥重量は、濃度が３． ５５ｍｇ／ｍｌであったことを示していた。分子量が５０，０００のサンプルは 、高濃度でＴ、緩和時間に特に有効であった（図７Ａを見よ）。このサンプルの 緩和能は、２．４７０　（ｍｍｏｌｅ／ｌ）−’５ｅｅ−’であった。

合成１１ 合成１０のコントロールとして、Ｌ−ＤＯＰＡからメラニンを合成した。条件は 合成１０の条件と同一であったが、本例の溶液にはガドリニウムを含有していな かった。ガドリニウムを含有していないメラニンは、金属イオンを含有している 場合よりも溶解度が高い傾向があった。また、色もＧｄ−メラニンよりも薄い傾 向かった。溶液１０ｍ１の乾燥重量は、濃度が１．７５ｍｇ　／　ｍ　Ｉであっ たことを示していた。ガドリニウムを含有していないメラニンの緩和を測定した 結果では、Ｔ、緩和に対する効果が非常に低いことが認められた。

ガドリニウムを含有しないメラニンコントロールの緩和能は、４．９５　（ｍｍ ｏｌｅ／ｌ）　’５ｅｃ−’であった。この緩和能は、塩化ガドリニウム（１７ 、５（ｍｍｏｌｅ／Ｉ）−’ｓｅｃ−１）およびＧｄ−ガド’）　＝　ラム−Ｄ 　Ｔ　Ｐ　Ａ　（ＭＡＧＮＡＶＩＳＴ＠）（４，５（ｍｍｏｌｅ／１）　’５ｅ ｃ−’）と比較しても良好である。

匠１ 合成１２ 各種条件によりガドリニウムイオンを組み入れて、Ｌ　−Ｄ　ＯＰ　Ａからメラ ニンを合成した。下記の試薬とその使用量を用い、プロトコルＡと同様の方法を 実施した。　ＤＭＡＰ　（１，５ｇ）、　Ｌ−ＤＯＰＡ　（２，５ｇ）、ＧｄＣ ｌ３　（０，５ｇ）および過硫酸アンモニウム（０゜３ｇ）。溶液を底の丸いフ ラスコ中にいれ、５０℃にセットした油浴上で一晩加熱した。溶液はまず、分子 量カットオフが６〜ｓ、ｏｏｏの透析管に水（４Ｌ）を入れたものを用い、さら に続いて分子量カットオフが５０．０００の透析管をもちいて透析した。溶液１ ０ｍ１の乾燥重量は、濃度が１．２ｍｇ／ｍｌであったことを示していた。この サンプルは、合成１０の効果はどではなかったが、Ｔ、緩和時間にかなりな効果 を認めた（図７参照）。この効果の差は、反応時間か減少したためと思われる。

また、メラニン・ポリマーが非晶質であるため、反応が正確に繰り返し行われな い可能性もある。このサンプルの緩和能は、正確な分子量が分からないため、１ ．９１９　（ｍｍｏｌｅ／ｌ）−’５ｅｃ−’　と見積った。

例り旦 合成１３ 合成１２のコントロールとして、Ｌ−ＤＯＰＡからメラニンを合成した。条件は 合成１２の条件と同一であったが、本例のサンプルにはＧｄＣ１３を含有してい なかった。サンプル１０ｍ１の乾燥重量は、濃度が１２ｍｇ／ｍｌであったこと を示していた。Ｔ、緩和時間に対して高濃度で若モの僅かな効果がみられる。し かしながら、この効果は約２４００〜２５００ｍ５ｅ　ｃで横ばい状態になるよ うに見える。これは水のおおよその緩和時間であるので、極端に希釈されたサン プルでは、緩和時間がほぼ同じ点に集まると考えられる。

はとんどの率グラフにある線の方程式は、実質的に定数である０　４逆数秒のｙ 切片を示している、あるいは予想されているように水の緩和率（緩和率＝０．４ ７濃度（μｇ／ｌ）＋　０．４２　）を示している。このサンプルの分子量は、 コントロール合成１１の分子量の約４倍で、したがって、緩和能は約５　、８　 （ｍｍｏｌｅ／ｌ）−’５ｅｃ−’である。

各種条件によりガドリニウムイオンを組み入れて、Ｌ−ＤＯＰＡからメラニンを 合成した。　下記の試薬とその使用量を用い、プロトコルＡと同様の方法を実施 した。　ＤＭＡＰ　（２，９ｇ）、　Ｌ−ＤＯＰＡ　（４，９５ｇ）、ＧｄＣｌ ３　（Ｉｇ）および過硫酸アンモニウム（０，６ｇ）。反応は４週間継続した。

サンプルはまず、分子量カットオフが６〜ｓ　、ｏ　ｏ　ｏの透析管に水（４Ｌ ）を入れたものを用いて透析した。サンプルは、透析の終了までに完全に沈澱し た。溶液１０ｍ１の乾燥重量は、濃度が９．３ｍｇ／ｍｌであったことを示して いた。

Ｔ、緩和率に対する濃度を表す線の勾配は、合成１０のそれとほとんど同じであ る（図７０参照）。恐らくはサンプル（充分に長く反応して）が飽和点に達し、 この点を超えると収量と溶解度に差が出て来ると考えら合成１５ 合成１４のコントロールとして、Ｌ−ＤＯＰＡからメラニンを合成した。試薬と その使用量を含め方法は合成１２と同一であったが、本例のサンプルにはＧｄＣ ｌ３を含有していなかった。このようにして得た材料もほとんど完全に不溶であ った。サンプル１０　ｍ　ｌの乾燥重量は、濃度が８．１ｍｇ／ｍｌであったこ とを示していた。Ｔ、緩和時間に対する効果はほとんどなかった。金属イオンを 含まない他のサンプル以上に効果がなかったのは、合成の性質によるものと思わ れる。メラニンの合成には、酸化によるものと、遊離ラジカルが誘導する重合に よるものの、二つがある。メラニンの遊離ラジカル要因は、それ自体で緩和時間 に影響するものである。過硫酸アンモニウムは、遊離ラジカル重合剤でもあり、 オキシダントでもある。遊離ラジカル重合は酸化よりも速く始まるので、反応の 初期部分は恐らく主として重合によるものとおもわれる。しかしながら、メラニ ン・ポリマーは順応性が高く、遊離ラジカルを含有する状態から、完全に酸化さ れた状態にかなり容易に変わって行く。反応が続いたまま、ある点を過ぎると、 触媒の酸化しようとする性質によって遊離ラジカルの大部分がより安定した状態 に変わってしまう。このために、ポリマーの遊離ラジカル要因を、したがって緩 和時間に対するポリマーの効力を、減少させたり、除いたりするのである（合成 ２８．２各種条件によりガドリニウムイオンを組み入れて、Ｌ−ＤＯＰＡからメ ラニンを合成した。　下記の試薬とその使用量を用い、プロトコルＡと同様の方 法を実施した。　ＤＭＡＰ　（１，５ｇ）、　Ｌ−ＤＯＰＡ　（２，５ｇ）、Ｇ ｄＣｌ３　（０，５ｇ）および過硫酸アンモニウム（０３ｇ）。溶液を油浴中の 底の丸いフラスコにいれ、還流するまで加熱した（１００℃）。反応は−８間継 続させた。溶液は、分子量カットオフ６〜ｓ、ｏｏｏの透析管に水（４Ｌ）を入 れたものを用いて透析した。サンプル１０ｍ１の乾燥重量は、濃度が２．５ｍｇ ／ｍｌであったことを示していた。このサンプルの１：１０倍希釈液のＴ、緩和 時間は３８９ｍ５ｅｃであった。

先よ４ 合成１７ 合成１６のコントロールとして、Ｌ−ＤＯＰＡからメラニンを合成した。方法は 合成１６と同一であったが、本例のサンプルにはＧｄＣＩ、を含有していなかっ た。サンプル１０ｍ１の乾燥重量は、濃度が１ｍｇ／ｍｌであったことを示して いた。

例１」 合成１８ 次の条件によりガドリニウムイオンを組み入れて、Ｌ　−Ｄ　ＯＰ　Ａからメラ ニンを合成した。下記の試薬を用い、プロトコルＡと同様の方法を実施した。Ｄ ＭＡＰ（Ｌ、５ｇ）、Ｌ、−ＤＯＰＡ　（２，５ｇ）、ＧｄＣ１３（０５ｇ）お よび過硫酸アンモニウム（０，６ｇ）（前例の１０％の代わりに２０％触媒を用 いた）。

混合物は一日間反応させた。溶液は分子量カットオフが６〜ｓ、ｏｏｏの透析管 に水（４Ｌ）を入れたものを用いて透析した。サンプルＬＯｍｌの乾燥重量は、 濃度が０．８ｍｇ／ｍｌであったことを示していた。余分な過硫酸アンモニウム が反応を抑制し、収量と遊離ラジカル含有量を減少させたと思われる。緩和能が 十倍以」二減少した（　３５　、２　（ｍｍｏｌｅ／１）−’５ｅｃ−’）のが 認められた。Ｇｄ標識のメラニン・ポリマーは、二相性のプロットを示し、低濃 度では勾配が少なくなっていた。

例−ユー」− 合成１９ 合成１８のコントロールとして、Ｌ−ＤＯＰＡがらメラニンを合成した。方法は 合成１８と同一であつたが、本例のサンプルにはＧｄＣＩ、を含有していなかっ た。サンプル１０ｍ１の乾燥重量は、濃度が１．４ｍｇ／　ｍ　ｌであったこと を示していた。このサンプルの緩和率は、緩和の測定に影響をほとんど与えなっ かた点で特徴的であった。緩和の測定は散乱パターンで、これは恐らく長い緩和 時間を測定するのが困難であったことにに原因があるのであろう。コントロール の緩和能は１．６　（ｍｍｏｌ／１）−’５ｅｃ−’であった。

次の条件によりガドリニウムイオンを組み入れて、Ｌ−ＤＯＰＡからメラニンを 合成した。下記の試薬を用い、プロトコルＡと同様の方法を実施した。ＤＭＡＰ 　（０，７５ｇ）、Ｌ−ＤＯＰＡ　（１，２５ｇ）、ＧｄＣｌ３　（０，２５ｇ ）および過硫酸アンモニウム（０゜１５ｇ）。反応は室温で３０分続けた。溶液 はまず、分子量が３．５００のＣＯ透析管に水（４Ｌ）を入れたものを用い、さ らに続いて分子量が１２〜１４にのＣＯ透析管に水（ＩＬ）を用いて透析し、両 方の分子量範囲を保存した。サンプル１０ｍ１の乾燥重量は、分子量が１２〜１ ４にの透析材料および分子量が３５００の分画の濃度が共に２．１ｍｇ／ｍｌで あったことを示していた。分子量が１４．０００の材料の緩和能は２Ｌ　Ｌ　（ ｍｍｏｌｅ／Ｌ）−’５ｅｃ−’であった。

例」−１ 合成２１ 合成２０のコントロールとして、Ｌ−ＤＯＰＡからメラニンを合成した。方法は 合成２０と同一であったが、本例のサンプルにはＧｄＣ１３を含有していなかっ た。二つのサンプル１０ｍ１の乾燥重量は、分子量が１２〜１４にの透析材料の 濃度が０．７ｍｇ／ｍｌであったが、３５００と１２〜１４．０００の分子量の 範囲の材料では乾燥重量がほとんど無いに等しかったことを示している。分子量 が１４．０００の材料の緩和能は８．６　（ｍｍｏｌｅ／ｌ）−’５ｅｃ−’で あった。反応時間が短くなればなるほど、金属がある、なしに拘らず、生成され るポリマーの遊離ラジカル含有量が多くなる。

例１」 合成２２ ガドリニウムイオンを組み入れて、３−アミノ　Ｌ−チロシンからメラニンを合 成した。プロトコルＤと同様の方法を実施した。溶液は四日間室温で反応させた 。その後、物質は分子量カットオフが６〜８　、ＯＯＯの透析管に水（４Ｌ　） を入れたものを用いて透析した。

この反応は、速度も遅く、能率も低かった。サンプル１０ｍ１の乾燥重量は、濃 度か０．４ｍｇ／ｍｌであったことを示していた。このサンプルの１；１０倍希 釈液のＴ、緩和時間は１２６６ｍ５ｅｃで、分子量が８゜０００の材料の緩和能 は３０　、７　（ｍｍｏｌｅ／ｌ）−’５ｅｅ−’であった（図１３Ａ参照）。

合成２２のコントロールとして、３−アミノ　Ｌ−チロシンからメラニンを合成 した。方法は合成２２と同一であったが、本例のサンプルにはＧｄＣＩ、を含有 していなかった。このサンプル１０ｍ１の乾燥重量は、濃度が０．２ｍｇ／ｍｌ であったことを示し、緩和能は１０．９　（ｍｍｏｌｅ／１）−’５ｅｃ−’で あった。

合成２２と同様にしてガドリニウムイオンを組み入れ、３−アミノ　し−チロシ ンからメラニンを合成した。収量と緩和データを向上させるため、触媒の使用量 を、過硫酸アンモニウム０．７５ｇ　（５０％触媒）まで増加した。溶液は一日 間室温で反応させた。その後、溶液を分子量カットオフ６〜ｓ　、ｏ　ｏ　ｏの 透析管に水（４Ｌ）を入れたものを用いて透析した。触媒増やした結果では、不 溶の物質が増加したにすぎなかった。

可溶のサンプル１．　Ｏｍ　ｌの乾燥重量は、濃度が２．２ｍｇ　／　ｍ　Ｉで あり、合成２２よりも収量が高ったことを示していた。分子量が８．０００以上 の分画の緩和能は１８７　（ｍｍｏｌｅ／１）−１ｓｅｃ−’であった。

匠主ユ 合成２５ 合成２４のコントロールとして、３−アミノ　Ｌ−チロシンからメラニンを合成 した。方法は合成２４と同一であったが、本例のサンプルにはＧｄＣ１３を含有 していなかった。このサンプル１．０　ｍ　ｌの乾燥重量は、濃度が３．１ｍｇ ／ｍｌであったことを示し、分子量がｓ　、ｏ　ｏ　ｏの分画の緩和能は、３９ 　、８　（ｍｏ＋ｏｌｅ／１）−’ｓｅｃ合成２６ ガドリニウムイオンを組み入れて、Ｌ−ＤＯＰＡからメラニンを合成し、この際 、完全な溶解度を得ることを目的として、Ｎ−メチル　Ｄ−グルカミンを使用し た。方法はプロトコルＡに従−）た。溶液を２１０分反応させた。その後、溶液 を５０℃の油浴中にある底の丸いフラスコにいれた。Ｎ−メチル　Ｄ−グルカミ ン（ＮＭＥＧ）５ｇを加え、溶液を一晩熱した。溶液は、分子量カットオフが６ 〜ｓ　、ｏ　ｏ　ｏの透析管に水（４Ｌ　）を入れたものを用いて透析した。透 析物をロータリーエバポレーターにかけた後、分子量カットオフが３５００の透 析管により再透析した。可溶化を進めていると溶液が反応を続ける可能性がある ので、ＮＭＥＧで可溶化する前に溶液を透析してこれを防ぐことが必要である。

サンプル１０ｍ１の乾燥重量は、分子量が１４．０００のサンプルの濃度が４． ４２ｍｇ／ｍ１であったことを示していた。このサンプルの緩和能は２０．６　 （ｍｍｏｌｅ／ｌ）−’５ｅｅ−’であった。

合成２６のコントロールとして、Ｌ−ＤＯＰＡがらメラニンを合成した。方法は 合成２６と同一であったが、本例のサンプルにはＧｄＣ１３を含有してぃなかっ た。このサンプル１０ｍ１の乾燥重量は、濃度が７２１　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌで あったことを示し、分子量が１４，０００のサンプルの緩和能は０　、４６　（ ａｖ＋ｏｌｅ／ｌ）−’５ｅｅ−’であった。

例じしＡ 次のようにして、過酸化水素により合成２６および２７のサンプルを開裂した。

低分子量材料を得る目的で、１０％過酸化水素を用いて合成２６．２７のサンプ ルを開裂した。合成２６のサンプル１０ｍ１を、コンデンサーと磁気攪拌棒を有 する底の丸いフラスコにとり、これに１０％過酸化水素１０ｍ１を一滴づつ添加 した。溶液を６０間反応させた後、カットオフ分子量が１２〜１．４，０００の 透析管に水（１１、）を入れたもので透析した。合成２７のサンプル１０ｍ１に ついても、同様に処理（、た。透析の前後で行った緩和測定では、緩和能の相当 な低下が認められた。サンプルの色が、反応性を持たないメラニンより黄色で、 漂白されているように見えた。これらの結果は、ポリマーから遊離ラジカルを除 去した場合と一致する。

外ス１ 合成２８ ガドリニウムイオンを組み入れ、かつ触媒として亜硝酸ナトリウムを使用して、 Ｌ　−Ｄ　ＯＰ　Ａからメラニンを合成した。方法はプロトコルＡと、プロトコ ルＥ（可溶化）に従った。これは、過硫酸アンモニウムに代えて、硝酸ナトリウ ム（１０％）４３ｍｇを使用したものである。可溶の混合物を３０分反応させた 後、分子量カットオフが３５００の透析管に水（４Ｉ、）を入れたものを用いて 透析した。続いて、分子量カットオフが１２〜１４．０００の透析管に水（ＩＬ ）をいれたものを用いて再透析したが、透析物の量は無いに等しかったので、保 存しなかった。このサンプル１０ｍ１の乾燥重量は、濃度が３．４ｍｇ／ｍｌで あったことを示していた。このサンプルの分子量は１４　、ＯＯＯで、緩和能は １４９　、８　（ｍｍｏｌｅ／１）　’５ｅｃ−’であった。

Ｋ１ｊ 合成３１ この反応は、偶然に観察されたものである。ＤＭＡＰ（０，７５ｇ）を水１００ ｍ１に溶解した。Ｌ−Ｄ。

ＰＡ　（１，２５ｇ）をＤＭＡＰ溶液に加え、その溶液に蓋をして一晩放置した 。Ｌ−ＤＯＰＡは、水分中に溶解している酸素、大気中の酸素により、他の触媒 作用を必要としないで反応し、メラニンを生成した。その後、溶液を分子量カッ トオフが６〜ｓ　、ｏ　ｏ　ｏの透析管に水（４Ｌ）を入れたものを用いて透析 した。分子量がｓ　、ｏ　ｏ　ｏのサンプルの緩和能は２８．０　（ｍｍｏｌｅ ／１）−’　５ｅｃ−’であった。先駆物質の原液がらの絶え間のない通気によ り供給される酸素のためカテコールとＬ−ＤＯＰＡが反応して、上記のように効 率よくメラニンを生成するのである。

ＮＭＥＧを使用しないで低分子量、可溶の材料を得る目的ともって、ガドリニウ ムイオンを組み入れながら、Ｌ−ＤＯＰＡからメラニンを合成した。方法はこれ までの１０％触媒の代わりに過硫酸アンモニウム（１％）０．０１５ｇを用いた 以外は、プロトコルＡと同様とした。溶液を室温で１０分反応させた後、分子量 カットオフが３５００の透析管に水（４Ｌ）を入れたものを用いて四日間透析し た。続いて、分子量カットオフが１２〜１４，０００の透析管に水（ＩＬ）をい れたものを用いて再透析したが、透析物の量は無いに等しかった。これは恐らく 、分子量が１２，０００以下の物質が不溶であったためであると考えられる。溶 液にトリメチルアミン５ｍｌを加えて、６０℃で一晩可溶化を行った後、６〜８ ＫＭＷＣＯ透析管に水（４Ｌ）をいれたものを用いて、再透析した。分子量が８ ，０００のサンプルの緩和能は５４　、５　（ｍｍｏｌｅ／１）−’５ｅｅ−’ であった。

合成３３ 合成３２のコントロールとして、Ｌ−ＤＯＰＡからメラニンを合成した。方法は 合成３２と同一であったが、本例のサンプルにはＧｄＣ１３を含有していなかっ た。緩和能は２　、９２　（ｍｍｏｌｅ／１）−’５ｅｃ−’であった。

１主Ｊ 合成３４ 低分子量Ｇｄ−メラニンを得る目的ともって、ガドリニウムイオンを組み入れて 、Ｌ−ＤＯＰＡからメラニンを合成した。方法はこれまでの過硫酸アンモニウム （１％触媒）をこれまでの使用量の代わりに００１５ｇを用いた以外は、プロト コルＡと同様とした。反応を１０分続けた後、１％ヨウ化カリウムを溶液に加え て、反応を停止させた。その後、先ず溶液を１０００透析管、続いて分子量カッ トオフが６〜８．０００の透析管に水（４Ｌ）をいれたものを用いて透析し、分 子量が＜　６．０００の分画を評価した。サンプルの緩和能は２２．２　（ｍｍ ｏｌｅ／１）−’ｓｅｅ　’であった。

１１世 合成３５ 合成３４のコントロールとして、Ｌ−ＤＯＰＡからメラニンを合成した。方法は 合成３４と同一であったが、本例のサンプルにはＧｄＣ１３を含有していなかっ た。緩和能は１　、８　（ｉｉｍｏｌｅ／１）−’５ｅｃ−’であった。

例３０ 合成５０ 超常磁性酸化鉄を組み入れて、Ｌ−ＤＯＰＡからメラニンを合成した。方法はＧ ｄＣ１３代わりに超常磁性酸化鉄５０　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉ液２ｍｌを用いた以 外は、プロトコルＡと同様とした。溶液を３日間反応させた後、ＮＭＥＧｌｏｇ で可溶化を行った。溶液を、分子量カットオフが３５００の透析管に水４Ｌを入 れたものを用いて透析した。分子量約５０　、ＯＯＯを持っ超常磁性酸化鉄−メ ラニン剤分画のＴ１緩和時間は１６．６　（閣ｇ／ａｉ１戸’　５ｅｃ−’、Ｔ ２緩和時間は７６　、３　（ａ＋ｇ／ｍ１）−’５ｅｃ−’であった（図８およ び１４参照）。

弗３ ２番号　触媒 １　１０％過硫酸アンモニウム ２　２０％過硫酸アンモニウム ３　１０％亜硝酸ナトリウム ４　１％過硫酸アンモニウム ５　１０％アゾビスイソブチロニトリル（Ａ、　Ｂ　Ｎ　） ６　１００％過酸化ベンゾイル ７　１０％ｔ−ブチル　ヒドロペルオキシド３番号　可溶化方法 １　５ｇＮ−メチルＤ−グルカミン ５０℃で一晩 ２　５ｍ１ｌ−リエチルアミンー晩 なし　メラニンポリマーが可溶であったことを示す４３−アミノＬ−チロシン 例ぢし↓ 過硫酸塩またはアカビスイソブチロニトリルを用いてＬ−ＤＯＰＡからメしヨ之 」Ｊ［１，ｔｆｆ−二Ｉ甫１１原液を次のようにして調製した。Ｌ−ＤＯＰＡ　 １゜２５ｇ　（０，００６モル）とジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）０．７ ５ｇ（０，００６モル）を攪拌しながら水（３００ｍｌ）に溶解した。過硫酸ア ンモニウムまたはアゾビスイソブチロニトリル０．１５ｇ（０，００７モル）を 固形分として添加し、さらに３０分攪拌した。

Ｚｎ２＋／Ｌ−ＤＯＰＡ−メラニンを調製する場合は、Ｚ　ｎ　３０４１．８０ 　ｇを原液に加えた。Ｍｎ”、／Ｌ−ＤＯＰＡ−メラニンを調製する場合は、Ｍ ｎＣｌ２０．１２４ｇを原液に加えた。Ｃｕ”／Ｌ−ＤＯＰＡ−メラニンをＨ製 する場合は、ＣｕＳＯ４０，１５６ｇを原液に加えた。プラセオジム、ユーロピ ウム、イッテルビウム、ジスプロシウムを含む他のランクニドも同様にしてメラ ニン・ポリマーに投：人した。

所−溶一ル広三− メラニン−金属化合物の全てが可溶化を必要としているわけではない。先駆物質 、触媒、分子量が変わると不溶の原因となる。必要に応じて、不溶のＤＯＰＡメ ラニン類を次の方法により可溶化（また。

Ｎ−メチルグルカミンその他のアミン５ｇを、金属／Ｌ−ＤＯＰＡ−メモニン溶 液に加えて、これを酸性として、洗った後、５０°Ｃで一晩（１２〜１８時間） 加熱する。他のメラニンも、可溶化が必要な場合、この塩形成法や、他の公知の 方法によって可溶化することができる。

４＝梶分−子賃−止唾−汰一− Ｉ、−ＤＯＰＡ−メラニンや、金属／　Ｔ−−Ｄ　ＯＰ　Ａ−メラニン溶液は、 可溶化剤を添加しである、していないの別なく、一連の分子量カットオフ膜を用 いて透析を行い、先ず反応１７ない出発原料と低分子量汚染物質を除去し、続い て材料を数個の広い分子量範囲に分画する。分子量カットオフ透析咬（Ｓｐｅ　 ｃ　ｔ　ｒ　ａ／ＰＯＲ３ｇ）には、　１，０００．　３．５００．　８．００ ０．　１４．０００．　および５０，０００があり、）　ラーンを１゜０００− ３，０００，３．５００〜８，０００，８．０００〜１４，０００，１４，００ ０〜５０，０００．　およｏ：＞５０．０００の分子量範囲に分別することがで きる。

さらに、より速くメラニンを分子量範囲別に分別する方法としては、同様の分子 量カットオフ膜を用いる限外濾過がある。

常磁性メラニンサンプルを透析、あるいは限外濾過により範囲別に分別して、分 析する。さらに、標準的なカラム法、あるいは高速液体法を用いるゲル浸透クロ マトグラフィによって、狭い範囲の、均質の分子量に分別する。例えば、２５ｍ Ｍのテトラブチル−リン酸二水素アンモニウム（ＴＢＡＤＨＰ）を含有する８５ ％メタノールで平衡化したＳ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｄ　ｅ　ｘ　Ｌ　Ｈ−２０（１ ，Ｏｘ　１１５ｃｒｎ、９０ｍ１）カラムによって常磁性メラニンを精製するこ 吉ができる。

メラニンサンプルは、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ；８）に入れる。カラムの 溶出は、はじめ１力ラム分の容積（９０ｍｌ）で、その後はＴ　Ｂ　Ａ　Ｄ　Ｈ Ｐを２５ｍｍｏｌ含有する８５％メタノールがら２５ｍＭのＴＢＡＤＨＰを含有 する６０％メタノールへの直線勾配に沿って変化するようにして行う。典型的な 製剤では、分子量１，０００．．１０，０００および５０，０００に対応する三 つの主たる常磁性メラニンのバンドに分割することができる。

図９〜１２は、ガドリニウム−Ｌ−ＤＯＰＡ−メラニンの緩和能に対する各種分 子量の効果を示している。

比較のため、塩化ガドリニウムの緩和能もこれらの図にプロットし７ている。

表４（および、他の箇所）のデータの実験プロトコルは次の通りである。メラニ ン、およびメラニン−ガドリニウムポリマーを分子量により分別し、ガドリニウ ムの量を原子吸光分析法と蛍光Ｘ線分析法により測定した。サンプルの特性を確 認し、計墓した。これを水に溶解し、必要に応（〜てｔ、ｉＪ溶化をおこなった ものを連続希釈して、予め定めた濃度の常磁性メラニン、またはメラニン−金属 ポリマーを含有する水溶液を調製した。

ザンブル量を約１０ｍ１と（２、パルスＦＴ　Ｐｒａｘｉｓ　ＩＩを用い、０． ２５Ｔ　（１０ＭＨｚ）で、スピン格子（Ｔ、）とスピン−スピン（１”、）緩 和の測定を行った。ポリマーを選択（−７で、Ｔ、とＴ、を２Ｔおよび７Ｔで測 定した。

表４は、メラニンの金属含有−計とメラニンの緩和能とは単純な関係でないこと をは−・きりと示している。

例えば、分子量が両方とも５０，０００．　ガドリニウム含有量もほぼ同しであ る（ポリマー１モル当たり１２７〜１０　、２　ｍ　ｍ　ｏ　ｌ　ｅのＧｄ）二 つの！−−−Ｄ　ＯＰ　Ａメラニンを比較して見よう。緩和能が、各々１４８と ２と、非常に大きな差がある。これは、メラニン中の不対スピン（遊離ラジカル ）の濃度のためである。低緩和能メラニン（２）は、ＥＰＲ信号を示さない。常 磁性金属であっても、それだけでは優れた緩和能にはなり得ない。このことは、 ガドリニウムがポリマーの内部に隔離されているため、表面の水分が近すき得な いことと一致している。ガドリニウム含有量を二倍増量して２４．８ｍｍｏｌｅ にすると、緩和能は１０倍以」−増加する。このメラニンは、緩和能１４８を示 したサンプルよりも高い遊離ラジカル濃度を含有しでいる。

最後に、金属を添加していない常磁性メラニンも、ＭＡＧＮＡＶ　Ｉ　ＳＴと同 等の緩和能を示（２ている。

表５は、常磁性メラニンコンストラスト剤、　常磁性メラニン−金属コンストラ スト剤としての効力を持つ各種薬剤の緩和能を比較したものである。

赴 マンガン−ＤＰＤＰ　２．８ ドーパミン−メラニン　３．６ ガドリニウムーＤＯＴＡ　３．８ ガドリニウム−ＤＴＰＡ（Ｍａｇｎａｖｉｓｔ＠）　４．５Ｌ−ＤＯＰＡ−メラ ニン　４．８±２．５（ｎ＝８）Ｌ−ＤＯＰＡ−メラニン類 第２鉄　１４．３ プラセオジウム　１８．６ ユーロビウム　１９．８ 第１鉄　２２．３ イツテルビウム　３３１．０ 超常磁性鉄　８３００ ガドリニウム　２４７０．０ ３−ＮＯ３−チロシン−メラニン−Ｇｄ　３９．８Ｄｏｐａｍｉｎｅ−Ｍｅｌａ ｎｉｎ−Ｇｄ　３２５．０例ぢし２ Ｇｄ−メラニンと抗体の結合 一般的方法 今日まで行われてきたＧｄ−メラニンと抗体を結合させる操作の概略を以下に示 す。次のセクションの大部分を使って、主たる反応（メラニンの合成とメラニン とタンパク質の結合）と、推論的ではあるがその補助操作を説明する。

基本的な結合反応は、次の試薬と方法によって行う。

艮ｌユ メラニンま　たはＧｄ−メラニン　１０ｍ１Ｏ，３３Ｍ　ＥＤＣ（１−（３−シ ′メチルアミノ７’［ｌビル）−３−エチルカル本゛シ′イミド′）　４０　μ 　！０．８９　Ｍ　ＤＭＡＰ　（４−ン′メチルアミｌビリジ゛ン）　３６　μ 　ｌタンハ゛り質（コントロールタン八°り質または抗体）　２５ｍｇ か広ユ 砂浴または水浴を予め３５℃にまで熱しておく。

反応フラスコでメラニン、ＥＤＣとＤＭＡＰを混合する。３５℃で３０分攪拌す る。浴から降ろし、室温（２６℃）まで冷却する。タンパク質（ＩｇＧを含む） を反応フラスコに加える。−晩室温で攪拌する。

この方法を、重量：重量比を使って規模をいろいろに変えた。ＩｇＧ溶液の測定 には、モル比が使えないので、重量二重量比にならざるを得なかった。クローン ＢＳＡ−３３の総タンパク質の含有量は３０．５ｍｇ／ｍｌ、そのうちの３．７ ｍｇ／ｍｌがＩｇＧ２．である。

この材料の他のタンパク質としては、血清アルブミンと、大きさが測定不能の間 質液タンパク質（１ｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ　ｆｌｕｉｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ） である。

メラニン合成の基本的反応（金属なし）先駆物質　０．００６３４モル ＤＭＡＰ　０．００６１４モル　１２２．１７　ＭＷＡＢＮ　（アゾビスイソブ チロニトリル）０．０００６１モル　１６４．２１　ＭＷＨ，０６，９４４４４ モル　１８．０２　ＭＷ反応に備え、油浴を予め７０℃にまで熱しおく。

２５０エーレンマイヤーフラスコに水１２５　ｍｌを加える。

ＤＭＡＰｏ、７５ｇをフラスコに加え、完全に溶解するまで攪拌する。

メラニン先駆物質をフラスコに加え、完全に溶解するまで攪拌する。

ＡＢＮ　（アゾビスイソブチロニトリル）０．１ｇをフラスコに加え、７０℃で 反応完了まで攪拌する（溶液は経時的に速やかに黒くなる。変化しなくなるまで 攪拌を続ける）。

Ｇｄ−メラニン合成の基本的反応 先駆物質　０．００６３４モル ＤＭＡＰ　０．００６１４モル　１２２．１７　ＭＷＡＢＮ　０．０００６１モ ル　１６４．２１　ＭＷＧｄＣＩ３六水和物 ０．０００６７モル　３７０．７０　ＭＷＨ２０６，９４４４４モル　１８．０ ２　ＭＷ反応に備え、油浴を予め７０℃にまで熱しておく。　２５０エーレンマ イヤーフススコに水１２５ｍ１を加える。

ＤＭＡＰｏ、７５ｇをフラスコに加え、完全に溶解するまで攪拌する。

先駆物質をフラスコに加え、完全に溶解するまで攪拌する。

ＧｄＣ１０，２５ｇをフラスコに加え、完全に溶解するまで攪拌する。

ＡＢＮ　０．１ｇをフラスコに加え、７０”Ｃで反応完了まで攪拌する（溶液は 経時的に速やかに黒くなる：変化しなくなるまで攪拌を続ける）。

ウシ血清アルブミンとＧｄ−メラニンを、次の反応により結合させた。

Ｇｄ−メラニン＃３２．Ｓ （合成、例２６を見よ）１０ｍｌ Ｏ，３３ＭＥＤＣ４０μ　１１９２ＭＷＯ，８９Ｍ　ＤＭＡ　Ｐ　３６μ　１１ ２２ＭＷＢＳＡ　２５ｍｇ　６７．０００　ＭＷ註：合成３２のＧｄ−メラニン は、１％過硫酸アンモニウムでＧｄ−メラニン合成の際得られた分子量が６．０ ００より大きい分画である。

この反応溶液（Ｒ８）は、ＴＬＣ分析に使用した。

Ｒｘ５０３　：　Ｌ−ＤＯＰＡを原料とするメラニンの合成。

Ｒｘ５０４　：　Ｌ−ＤＯＰＡを原料とするＧｄ−メラニンの合成。

これらの反応溶液のＴ１、Ｔ２緩和時間を評価した。

ＴＬＣ用Ｇｄ−メラニン（＃３２．３）コントロール液の合成 タンパク質を溶液に加なかったこと以外は、結合の基本的方法と同様にしてこの 溶液を調製した。

この溶液は、Ｔ　Ｌ　Ｃコントロール液として使用した。

より具体的には、Ｇｄ−メラニン（＃３２．Ｓ）とマウスＩｇＧとの結合反応を 、次のようにして行った。

試薬： ＤＭＡＰ　１．４μｌ 容積の調整を行ったこと以外、基本的方法と同様にして反応を実施した。

次の反応により、Ｇｄ−メラニン（＃３２．Ｓ）とモノクロナール　マウス抗Ｂ ＳＡ　ＩｇＧ２ａ　（クローンＢＳＡ−３３；シグマ社製）を結合した。

試薬： Ｇｄ−メラニン　６１ｍ１ ＥＤＣ２４，４μｌ ＤＭＡＰ　２２．０μＩ ＢＳＡ−３３０，５ｍｌ （ＩｇＧ　Ｏ，０１５２５ｇ） 容積二容積比と重量二重量比を用いた以外は、結合反応の基本的方法と同様にし て反応を実施した。生成物を一晩攪拌した後、ｐ　Ｈ７、４のＴＲｌ５希釈緩衝 液５００ｍ１で希釈した。これは、シグマ社が推薦する１　：　１０００倍溶液 と同等である。

１　Ｇの　素　測定法−←旦二ＬＬＤ−結合１ｇＧ用に開発したＥＩＡを説明す る。この方法は、文献で推薦されている濃度を用いる基本的な測定方法である。

マイクロタイタープレートに、適当なコントロール（ＢＳＡ、結合ＩｇＧ、接合 体）で標識を付ける。これらの試薬は、標識をつけたウェルの列上で除去するこ ととした。

方法： ＢＳＡ原液０．２ｍｌをウェルに添加する。このＢＳＡは１０Ｍｇ　／　ｍ　ｌ のウシ血清アルブミン０１２ｍ１をｐＨ７，４（７）０．０２ＭのＴＲＩ　Ｓ希 釈緩衝液に加えたものである。ＢＳＡはシグマ社モノクロチール・マウス抗ＢＳ Ａ　ＩｇＧ２Ａに対する抗原である。

一晩５℃でインキュベートする。

ウェルからＢＳＡを除去する。

ツイーン系界面活性剤を入れたＴＲｌ５洗浄緩衝液０．２ｍｌで六回洗う。ＴＲ １Ｓ洗浄緩衝液は、ＴＲｌ５希釈緩衝液＋ツイ一ン系界面活性剤８゜Ｏ、５ｍ　 ｌ　／　Ｌである。

２．４ｇ　ＴＲｌ５ ８．０ｇ　ＮａＣＩ Ｑ５〜１リットルとし、　ＩＭのＨＣＩでｐＨを７４に調整する。

結合ＩｇＧ溶液０２ｍ１をウェルに添加する。

結合ＴｇＧ溶液０．２ｍｌ。これは、シグマ社モノクロナール・マウス抗ＢＳＡ 　ＴｇＧ２ＡとＧｄ〜メラニンを、例３２で概説した　０２Ｍ希釈緩衝液でｌ　 ：　１０００倍に希釈したものである。この希釈液をＥＩＡ法の試験抗体として 使用する。

室温で一時間（推薦時間間隔の１／２）インキュベートする。

結合ＩｇＧ溶液を取り除く。インキュベート後、Ｇｄ−メラニンに結合している シグマ社モノクロナール・マウス抗ＢＳＡ　ＩｇＧ２Ａを取り除く。

洗浄緩衝液で、ミロあらう。

接合体溶液０．２ｍｌをウェルに添加する。この接合体液はＢｉｏ−Ｒａｄ社の ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリフォスファターゼ接合体を０．０２ＭのＴＲｌ５希 釈緩衝液で１　：　３０００倍に希釈したものである。これにより、マウスＩｇ Ｇに指向性を持ち、アルカリフォスファターゼ酵素に結合したヤギ抗体を得る。

接合対の存在は、ｐＮＰＰをｐ−ニトロフェノールに酵素変換させることにより 確認する。

室温で一時間（推薦時間間隔の１／２）インキュベートする。

接合体溶液を除去する。つまり、結合しないヤギ抗マウスＩｇＧアルカリフォス ファターゼ接合体を試験ウェルから取り除く。

洗浄緩衝液でミロ洗う。

酵素＆質溶液、ｐ−二トロフェニルフオスフエ−ト（１）ＮＰＰ）を次のように 添加する。

希釈剤系　１５ｍ１ （１０ｍＭ　ジェタノールアミン、０．５ｍＭＭｇＣｌ７、ｐＨ９，５） ＮＺ活性の１単位は、ｐＮＰＰを毎分１．０μｍｏ［Ｃの割でｐ−二トロフェノ ールと有機フォスフェートに加水分解するのに匹敵する。吸光度は４０５ｎｍで 測定する（定性的には、黄色に変わる）。

３０分間インキュベートし、色が変わるのをチェックする。停止液である０、１ ＭのＥＧＴＡで反応を停止する。ＥＩＡ＃１を実施する。この結果では、結合活 性を示していた。最初のＥＩＡ条件を重複試験する目的をもって、ＥＩＡ＃２を 実施した。結果は同一であった。

ＥＩＡ試薬溶液至適化法を開発した。これは、ＢＳＡ濃度四種、接合体濃度四種 および結合１ｇＧ濃度４種、さらに各溶液濃度と各溶液濃度を組み合わせて（組 合せ６４個）、これを重複させたもの（ウェル１２８個）を用いて、ＥＩＡ法を 実施し、各溶液の至適濃度を測定した。

ＥＩＡ緩衝液安定剤至適化法を開発した。これは、異なるツイーン系界面活性剤 からなる洗浄緩衝液二種、異なる安定剤三種（非特異的結合を防ぐため不活性タ ンパク質）、さらに各安定剤と各洗浄液とを組合せ、必要なコントロールを用い て、ＥＩＡ法を実施し、ＥＩＡ法に至適である緩衝液と安定剤をを決定し、た。

メラニンとＢ　Ｓ　Ａ、あるいは抗体を結合する生成物のＥＩＡ分析では、すべ て４定的な成績を収め、抗体の反応性が有効に結合および保持されていることを 示麻酔ラットを実験動物とし、７ｃｍイメージングコイル用いる、ＧＥ　Ｃ３Ｉ 　２Ｔ／４５　ＭＲＩにより、Ｔ、に重きを置いた画像（ＴＲ＝４５０ｍｓｅｃ 。

ＴＥ＝３０ｍｓ　ｅ　ｃ）を得た。

１、　ガドリニウム−Ｌ−ＤＯＰＡ−メラニン（分子量約５０，０００）０．０ ４ｍｇ／ｍｌを含有する砂糖水の１０ｍ１ポーラスを、３０分間隔で２度にわた り、強制給餌による経口投与した。薬剤が浄化されるまでの時間をかけて画像を 撮影した。

図１５Ａは、コントラスト剤投与前のラットの冠状系画像（ｃｏｒｏｎａｌ　ｉ ｔｏａｇｅ）である（図１５Ｂの陽画フォトコピーを見よ）。図１５Ｃは、メラ ニン・コントラスト剤の１０ｍ１ポーラスの第二回投与後において、図１５Ａと 同じ面から撮影したコロナ画像（ｃｏｒｏｎａｌｉｍａｇｅ）である（図１５Ｄ の陽画フォトコピーを見よ）。

図１５Ｃの強度が強化されている部位によって、ラットの腸および胃で薬剤が局 在化しているのが分かる。

陽画フォトコピー（図１５Ｄ）は、正確な、しかも観察可能なフォトコピーを作 る方法により、最も暗くまた強度か低い部分と同し強度の部位を示している。こ れらの比較（１５ＡとＣ，１５ＢとＤ）で分かるように、メラニン−Ｇｄにより 胃および胃腸管系のＭＲＩが大きく強調されでいた。

２、−晩５０ｍ１薬剤を与えることによる給餌実験この給餌実験においては、ラ ットがガドリニウム−Ｉ７−ＤＯＰＡ−メラニン−Ｇｄ（分子量約５０．０００ ）０゜０４　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉを含有する砂糖溶液を随意に摂取できるように した。イメージング前１２時間で消費した量は６０ｍ１であ−）だ。薬剤が浄化 されるまでの時間をかけて画像を撮影した。図１６Ａは、イメージング前１２時 間コントラスト溶液を随意に摂取したラットの冠状系画像である。ラットの代表 的なコントロール画像を示す図１５Ａ参照のこと。強度が強化された部位により 、腸および胃で薬剤が局在化されていることを示している。図１６Ｂは、図１６ Ａと対をなす陽画フォトコピーで、その複製法により、同じ部位を黒く写してい る。さらに観察すると、薬剤が胃、腸から一掃されて、コントロール画像に戻る ことが分かる。

これらの比較で分かるように、腸ＭＲＩはＧＤ−メラニンによって大きく強調さ れる。

３、ラット尾部静脈注入とその後、３０〜６０分の循環系 上記メラニン−Ｇｄ溶溶液２ｍ合５分以下の時間をかけてラットの尾部静脈に注 入した。薬剤が浄化されるまでの時間をかけて画像を撮影した。

図１７Ａは、注入後６０分のラットのコロナ画像で、明かに薬剤が循環系で局在 化しているのを示している（例えば、腎臓、肝臓）。図１７Ｂは入日後のラット の状態を示すもので、身体から薬剤が一掃されているのが分かる。図１７Ｃは、 ず１７Ｂの陽画フォトコピ二つの分子量によるラビットイメージング実験麻酔ラ ットを実験動物として、１５ｃｍ容積のイメージングコイル用いる、ＧＥ　Ｃ３ Ｉ’２Ｔ／４５ＭＲＩにより、Ｔ、に重きを置いた画像（ＴＲ＝５００ｍｓｅｃ 、ＴＥ＝３０ｍｓｅｃ）を得た。ラビットの体重は、平均的２．５　Ｋ　ｇであ った。

１、標準ＭＡＧＮＡＶ　Ｉ　ＳＴ　（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）を０．１ｍｍｏｌｅ／Ｋ ｇの割合で、総量０９２ｍ１を麻酔ラビットの耳部静脈に静注した。薬剤が浄化 されるまでの時間をかけて、腎臓を介する面の画像を撮影した。

２、上記と同様にして、分子量１，０００（０，９４ｍ１．０．０３３ｍｍｏ　 ｌ　ｅ／Ｋｇ）、または分子量５０．０００　（０，９４ｍ１．０１５ｍ　ｍ　 ｏ　ｌ　ｅ　／　Ｋ　ｇ　）　のＧｄ−Ｌ−ＤＯＰＡ−メラニンを麻酔ラビット に投与した。薬剤が浄化されるまでの時間をかけて、同一の腎臓を介する面の画 像を撮影した。

図１８〜２２は、この実験結果を示すもので、ＭＡＧＮＡＶＩＳＴ　（ＭＷ＝９ ３８、緩和能６３１）と、各々分子量は１　、ＯＯＯと５０．０００、緩和能は ６８５と１．５５０を有するメラニン−Ｇｄ剤とを比較している。ＭＡＧＮＡＶ 　Ｉ　５Ｔ（７）投与量は、体重Ｉ　Ｋ　ｇ　１．ｍつ、き０．１ｍｍｏｌｅで あったが、これは代表的な、推薦投与量レベルである。表６で、イメージングパ ラメーターの比較を示す。

Ｌ−ＤＯＰＡ　５０，０００　１，５５０．００　＜　０．２ＭＡＧＮＡＶＩＳ Ｔ　９３８　６．３１　１００．０＊ＭＡＧＮＡＶＩＳＴの標準投与量は０　、 １ｍｍｏｌｅ／ｋｇである。

図１８．１９．２０は、ＭＡＧＮＡＶＩＳＴ、ならびに１．ＯＯＯＭＷと５０． ＯＯＯＭＷのメラニン−Ｇｄ剤の０分（コントラスト剤投与前、上部左側）、３ 分（上部右側）、８分（下部左側）および１３分（下部右側）の時間経過を示し ている。すべて、ラビット腎臓において、経時的に強度（コントラスト）が上昇 した。しかしながら、予想されていたように、高分子量剤が最高強度に達する速 度はより遅く、ラビットの身体から浄化される速度もより遅かった。また、分子 量５０．０００の試薬の解像力は、ＭＡＧＮＡＶＩＳＴで観察されるものよりも 高かった。

図２０及び２１は、ＭＡＧＮＡＶ　Ｉ　ＳＴ　（上：０分、３分）と、分子量１ ，０００の薬剤（下：０分、３分）および分子量５０．０００の薬剤（下：０分 、３分）とを、並べて比較したものである。これらの結果は、異なる実験動物に よるものであるが、明かにメラニン剤の効力が優れていることを示している。表 ６で示すように、ＭＡＧＮＡＶ　Ｉ　ＳＴよりも優れたコントラストを得た分子 量１．０００の薬剤の使用量は１／３であった。このことは、毒性があるガドリ ニウムを減量して患者に投与できる可能性があることを意味する。分子量５０． ０００（７）薬剤の投与量１；ｔＭＡＧＮＡＶ　Ｉ　５Ｔ（７）約１／６００で あったが、得られたコントラスト効果は優れていた。質量ベースでは、この投与 量は、ＭＡＧＮＡＶ　Ｉ　ＳＴの投与量の十分の−である。したがって、ラビッ トに投与されたガドリニウムはごく小量に過ぎなかった。

ネズミおよびラビットによる実験のいずれにおいても、メラニンとメラニン−Ｇ ｄの急性毒性は観察されなかった。しかしながら、完全な毒性研究は今後に待た なくてはならない。常磁性メラニン類の効力より見て、部位指向性画像化剤とし て有効であることが示唆されている。さらにまた、分子量および／または化学修 飾によって、各種の疾患特異性剤や、治療目的を持つイメージング用途に特製す ることもできる。

血流中にＧｄ−メラニンが存在すると、血管系および特に肝臓が非常に強調され ることに注目すべきである。

Ｌ記の説明において用いた引用文献は、この説明中で述べた理由により、引用し たことをもって、本明細書の関連部分の一部とする。

［■（、ＩＡ ＦＩＧ、７［ ｍＭ／Ｉ ＦＩＧ、］ ｍＭ／１ ・ＦＩＧ、１０ Ｆ■（，１１ ｍＭ／ｌ Ｏ，００２０４０，６０８１，０１，２ｍＭ／１ ＦＩＧ、１３ ［■Ｇ、１’ｌ−Ｊ＼ ０　０．０２　０．０４　０．０６　０．０８　０ｊミ刃３　’Ｃ０ＮＣＥＮＴ ＲＡＴＩＯＮ　Ｉｇ／ｌ　ｌＦＩＧ、１４−［３ ００，０２０，０４０，０６０，０Ｂ　０．１’１．！’、Ｃ０ＮＣＥＮＴＲＡ ＴＩＯＮ　ｆｇ／Ｉ）ＦＩＧ、１４−［ 店かＣ０ＮＣＥＮＴＲＡＴＩＯＮ　Ｉｇ／１１Ｆｌ（、Ｉ　Ｓ＃　ＦＨＣ，１Ｓ Ｅｌ ［■（、ＩＳ［１■Ｇ、ｌ５Ｉ） ―Ｉ　■【じ＝、ｍ【ｒ　［■（２，１【ＥＦｌ（，１噛【に　Ｆ−（、，１０ １１ＦｌＵ、１７［ ［１（、、ｌＪＥジｔ　［■［，１ＪＢＵＦ■Ｇ、ＩＪＢ［Ｆｌ（う、１Ｅ［ ＦｌＧ、ＩＣ）ノへ　Ｆｌ（，１９珍［Ｆｌ（，１０［ＦｌＧ、１’）Ｉｌ Ｆｌ（７，；ＩＣ）Ａ　ＦＩＧ、Ｚ［）Ｉ３Ｆ■（７，２［）［Ｆｌ〔、ｚｏｎ Ｆｌ（、、ＺｍＡ　Ｆｌ（、，２１Ｅ ＦＩＩ（、ｚｌ［ＦＩＩ（、Ｚｌ［］ ｒｌ（、ｚｚ）へ　ＦＷ［７，２２Ｉ３Ｆ−Ｇ、Ｚ２［Ｆｌ（７，２２１１ 国際調査報告 フロントベージの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、 ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、　ＵＳ

Claims (81)

【特許請求の範囲】
1. １．メラニンおよび信号誘導性金属よりなる画像強調剤。
2. ２．会合定数が少なくとも約１０２０であるメラニンと信号誘導性金属との複合 剤。
3. ３．磁気共鳴イメージングおよびスペクトルシフトを強調増大するのに十分な量 の不対電子を含有する常磁性メラニンよりなる磁気共鳴画像強調またはスペクト ルシフト剤。
4. ４．磁気共鳴イメージングおよびスペクトルシフトを強調増大するのに十分な量 の不対電子を含有する常磁性メラニン。
5. ５．上記薬剤を水に溶解または分散する場合であっても、金属が実質的に解離し ない請求の範囲第１項記載の薬剤。
6. ６．メラニンが常磁性であり、信号誘導性金属が常磁性または超常磁性であり、 かつ強調される画像が磁気共鳴画像である請求の範囲第１項記載の薬剤。
7. ７．信号誘導性金属がガドリニウム、鉄、ニッケル、銅、エルビウム、ユーロピ ウム、イッテルビウム、プラセオジム、ジスプロシウム、ホルミウム、クロム、 およびマンガンである請求の範囲第１項記載の薬剤または請求の範囲第２項記載 の複合剤。
8. ８．信号誘導性金属がガドリニウムである請求の範囲第１項記載の薬剤または請 求の範囲第２項記載の複合剤。
9. ９．信号誘導性金属がイオンの形をとる請求の範囲第１項記載の薬剤または請求 の範囲第２項記載の複合剤。
10. １０．メラニン信号誘導性金属が非イオンの形をとる請求の範囲第１項記載の薬 剤または請求の範囲第２項記載の複合剤。
11. １１．信号誘導性金属が粒子の形をとる請求の範囲第１項記載の薬剤または請求 の範囲第２項記載の複合剤。
12. １２．信号誘導性金属が超常磁性粒子に含まれている請求の範囲第１項記載の薬 剤または請求の範囲第２項記載の複合剤。
13. １３．信号誘導性金属が超常磁性鉄粒子に含まれている請求の範囲第１項記載の 薬剤または請求の範囲第２項記載の複合剤。
14. １４．信号誘導性金属が強磁性結合錯体である請求の範囲第１項記載の薬剤また は請求の範囲第２項記載の複合剤。
15. １５．信号誘導性金属が十分な濃度により溶液及び組織中の高周波音波の速度を 変化させ、かつ高周波音波の放射及び検出によって画像が強調される請求の範囲 第１項記載の薬剤。
16. １６．信号誘導性金属がガンマ線粒子を放射し、かつガンマ線粒子の放射走査に よる画像が強調される請求の範囲第１項記載の薬剤。
17. １７．信号誘導性金属が５１クロム、６８ガリウム、９９ｍテクネチウムまたは １１１インジウムである請求の範囲第１６項記載の薬剤。
18. １８．約１．０００ダルトンから約１００，０００ダルトンまでの間の分子量を 持つとさらに限定される請求の範囲第１項または第３項記載の薬剤、請求の範囲 第２項記載の複合剤または請求の範囲第４項記載のメラニン。
19. １９．メラニンがフェオメラニン、ユーメラニンまたはアロメラニンである請求 の範囲第１項または第３項記載の薬剤、請求の範囲第２項記載の複合剤または請 求の範囲第４項記載のメラニン。
20. ２０．水溶性であるとさらに限定される請求の範囲第１項または第３項記載の薬 剤、請求の範囲第２項記載の複合剤または請求の範囲第４項記載のメラニン。
21. ２１．水可溶化剤に付着させてあるとさらに限定される請求の範囲第１項または 第３項記載の薬剤、請求の範囲第２項記載の複合剤または請求の範囲第４項記載 のメラニン。
22. ２２．水可溶化剤が有機アミンまたは有機酸である請求の範囲第２１項記載の薬 剤。
23. ２３．水可溶化剤がトリエチルアミンである請求の範囲第１項または第３項記載 の薬剤、請求の範囲第２項記載の複合剤または請求の範囲第４項記載のメラニン 。
24. ２４．水可溶化剤がグルタミン酸である請求の範囲第２１項記載の薬剤。
25. ２５．Ｎ−メチルグルカミンに付着させてあるとさらに限定される請求の範囲第 １項または第３項記載の薬剤、請求の範囲第２項記載の複合剤または請求の範囲 第４項記載のメラニン。
26. ２６．生物部位指向性成分に付着させてあるとさらに限定される請求の範囲第１ 項または第３項記載の薬剤、請求の範囲第２項記載の複合剤および請求の範囲第 ４項記載のメラニン。
27. ２７．生物部位指向性成分がタンパク質またはペプチドである請求の範囲第２６ 項記載の薬剤、複合剤またはメラニン。
28. ２８．生物部位指向性成分が目標部位に結合特異性を持つ抗体である請求の範囲 第２６項記載の薬剤。
29. ２９．抗体に付着させてあるとさらに限定される請求の範囲第１項または第３項 記載の薬剤、請求の範囲第２項記載の複合剤または請求の範囲第４項記載のメラ ニン。
30. ３０．ペプチド、タンパク質、ホルモン、リポゾーム、生物膜成分または受容体 成分に付着させてあるとさらに限定される請求の範囲第１項または第３項記載の 薬剤、請求の範囲第２項記載の複合剤または請求の範囲第４項記載のメラニン。
31. ３１．イオン性メラニン成分が化学置換されているため、メラニンが実質的に非 イオン性である請求の範囲第１項または第３項記載の薬剤、請求の範囲第２項記 載の複合剤または請求の範囲第４項記載のメラニン。
32. ３２．近接する陽子その他の原子核の核磁気共鳴緩和率またはスペクトルシフト を変化させる薬剤であって、常磁性金属を含有する、または、これを含有しない 常磁性メラニンからなる薬剤。
33. ３３．常磁性または超常磁性金属よりなるメラニン−金属包含化合物において、 この包含化合物の会合定数が少なくとも約１０２０であり、かつ磁気共鳴画像の 強調に有用であるメラニン−金属包含化合物。
34. ３４．薬剤を水に溶解または分散する場合、金属が実質的に解離しない請求の範 囲第３２項記載の薬剤または請求の範囲第３３項記載の化合物。
35. ３５．金属がガドリニウム、鉄、ニッケル、銅、エルビウム、ユーロピウム、プ ラセオジム、ジスプロシウム、イッテルビウム、ホルミウム、クロム、またはマ ンガンである請求の範囲第３２項記載の薬剤または請求の範囲第３３項記載の化 合物。
36. ３６．金属がガドリニウムである請求の範囲第３２項記載の薬剤または請求の範 囲第３３項記載の化合物。
37. ３７．約１，０００ダルトンから約１００，０００ダルトンまでの間の分子量を 持つとさらに限定される請求の範囲第３２項記載の薬剤または請求の範囲第３３ 項記載の化合物。
38. ３８．メラニンがフェオメラニン、ユーメラニンまたはアロメラニンである請求 の範囲第３２項記載の薬剤または請求の範囲第３３項記載の化合物。
39. ３９．水可溶化剤に付着させてあるとさらに限定される請求の範囲第３２項記載 の薬剤または請求の範囲第３３項記載の化合物。
40. ４０．水可溶化剤が有機アミンである請求の範囲第３９項記載の薬剤。
41. ４１．有機アミンがＮ−メチルグルカミンである請求の範囲第４０項記載の薬剤 。
42. ４２．生物部位指向性成分に付着させてあるとさらに限定される請求の範囲第３ ２項記載の薬剤または請求の範囲第３３項記載の化合物。
43. ４３．抗体に付着させてあるとさらに限定される請求の範囲第３２項記載の薬剤 または請求の範囲第３３項記載の化合物。
44. ４４．モノクロナール抗体に付着させてあるとさらに限定される請求の範囲第３ ２項記載の薬剤または請求の範囲第３３項記載の化合物。
45. ４５．ペプチド、タンパク質、ホルモン、リポゾーム、受容体または生物膜成分 に付着させてあるとさらに限定される請求の範囲第３２項記載の薬剤または請求 の範囲第３３項記載の化合物。
46. ４６．脂質可溶化剤に添加してあるとさらに限定される請求の範囲第１項、請求 の範囲第３２項記載の薬剤または請求の範囲第３３項記載の化合物。
47. ４７．特異な結合親和性をもつ成分が付加することによってメラニンが改質して いる請求の範囲第３２項記載の薬剤または請求の範囲第３３項記載の化合物。
48. ４８．メラニンと信号誘導性金属の化合物を生成するのに十分な量の信号誘導性 金属の存在下でメラニン先駆物質からメラニンを生成することよりなる画像強調 剤の製造方法。
49. ４９．メラニン先駆物質から常磁性メラニンを生成することよりなる画像強調剤 の製造方法。
50. ５０．画像強調剤が、少なくともグラム当り１マイクロモルの金属を含有してい るメラニン−信号誘導性金属複合剤である請求の範囲第４８項記載の方法。
51. ５１．メラニン先駆物質がヒドキシフェニルまたはジヒドロキシフェニル成分か らなる請求の範囲第４８項または第４９項記載の方法。
52. ５２．メラニン先駆物質がジヒドロキシフェニルアラニン、カテコール、ヒドキ シドーパミン、ドーパミン、チロシン、５，６−ジヒドロキシインドール、５， ６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸、５，６−ＤＯＰＡクロム、５， ６−インドールキノン、グルタチオン、システイン、ＤＯＰＡキノン、３−アミ ノＬ−チロシンおよびジヒドロキシフェニルエチルアミンのうちの少なくとも一 つである請求の範囲第４８項または第４９項記載の方法。
53. ５３．メラニン信号誘導性金属複合剤またはメラニンが、さらに水可溶化剤に結 合している請求の範囲第４８項または第４９項記載の方法。
54. ５４．水可溶化剤がＮ−メチルグルカミンである請求の範囲第５３項記載の方法 。
55. ５５．遊離ラジカル生成剤または酸化剤によってメラニン生成が誘発される請求 の範囲第４８項または第４９項記載の方法。
56. ５６．常磁性メラニンが磁気共鳴画像またはスペクトルシフトを強調増大するの に十分な量の不対電子を含有する請求の範囲第４９項記載の方法。
57. ５７．酸化剤または遊離ラジカル生成剤が過硫酸塩または過酸化物である請求の 範囲第５５項記載の方法。
58. ５８．遊離ラジカル生成剤または酸化剤が過硫酸アンモニウム、アゾビスイソブ チロニトリル、過酸化水素、酸素、亜硝酸ナトリウム、過酸化ベンゾイル、また はｔ−ブチルヒドロペルオキシドである請求の範囲第５５項記載の方法。
59. ５９．酵素によってメラニン生成が誘発される請求の範囲第４８項または第４９ 項記載の方法。
60. ６０．酵素がポリフェノールオキシダーゼである請求の範囲第５９項記載の方法 。
61. ６１．信号誘導性金属が常磁性である請求の範囲第４８項記載の方法。
62. ６２．信号誘導性金属がガドリニウム、鉄、ニッケル、銅、エルビウム、ユーロ ピウム、ジスプロシウム、イッテルビウム、プラセオジム、ホルミウム、クロム 、またはマンガンである請求の範囲第４８項記載の方法。
63. ６３．信号誘導性金属がガドリニウムである請求の範囲第４８項記載の方法。
64. ６４．信号誘導性金属が超常磁性である請求の範囲第４８項記載の方法。
65. ６５．信号誘導性金属が十分な濃度により溶液および組織中における高周波音波 の速度を変化させる請求の範囲第４８項記載の方法。
66. ６６．信号誘導性金属が放射性同位元素である請求の範囲第４８項記載の方法。
67. ６７．信号誘導性金属が５１クロム、６８ガリウム、９９ｍテクネチウムまたは １１１インジウムである請求の範囲第４８項記載の方法。
68. ６８．請求の範囲第４８項または第４９項記載の方法により生成される組成物。
69. ６９．患者の磁気共鳴画像を強調する方法において、患者の磁気共鳴イメージン グの施術前に、常磁性金属または超常磁性粒子と結合したメラニンまたは常磁性 メラニンを投与することからなる方法。
70. ７０．常磁性金属がガドリニウム、鉄、ニッケル、銅、エルビウム、ユーロピウ ム、プラセオジム、イッテルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、クロム、ま たはマンガンである請求の範囲第６９項記載の方法。
71. ７１．常磁性金属がガドリニウムである請求の範囲第６９項記載の方法。
72. ７２．メラニン−常磁性金属複合物が少なくともグラム当り１マイクロモルの金 属を含有する請求の範囲第６９項記載の方法。
73. ７３．メラニン−常磁性金属複合剤が水に分散あるいは溶解している間に実質的 に解離しないことを特徴とする請求の範囲第６９項記載の方法。
74. ７４．投与経路が非経口である請求の範囲第６９項記載の方法。
75. ７５．投与経路が血管内である請求の範囲第６９項記載の方法。
76. ７６．投与経路が腸内である請求の範囲第６９項記載の方法。
77. ７７．超常磁性粒子が鉄からなり、長さが約３００オングストローム以下である 請求の範囲第６９項記載の方法。
78. ７８．常磁性金属または超常磁性粒子と結合したメラニンまたは常磁性メラニン が安定した不対電子あるいは遊離ラジカルを含有している請求の範囲第６９項記 載の方法。
79. ７９．動物の磁気共鳴画像を強調する方法において、イメージング施術前に、常 磁性メラニンをこの動物に投与することよりなる方法。
80. ８０．磁気共鳴イメージングまたはスペクトラルシフトを強調増大するのに十分 な量の安定した遊離ラジカルを含有する水溶性常磁性メラニン。
81. ８１．水溶性であるとさらに限定される請求の範囲第４項記載のメラニン。