JPH06504993A - エンドサイトーシスにより高等真核細胞に吸収されうる新規核酸含有複合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エンドサイト−シスにより高等真核細胞に吸収されつる新規核酸含有複合体本発 明は、インターナライジング因子を用いたエンドサイト−シスによる高等真核細 胞への核酸の導入に関する。

近年、例えば、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡが特定の遺伝的配列を選択的に 阻害しうることが分かる等、核酸の治療活性物質としての重要性が益々高まって きている。これらの活性様式は、これらをインビボにおける特定遺伝子（調節さ れないオンコジーンまたはウィルス遺伝子等）の発現の阻害を目的とした治療薬 として使用することをを可能とする。すでに、短いアンチセンス・オリゴヌクレ オチドが細胞内に取り込まれ、部分的には核酸の強い負電荷により細胞膜を通し ての取り込みが制限されることにより細胞内濃度は低いにもかかわらず、そこで 阻害活性を示すことが示された。

選択的に遺伝子を阻害する別の方法にはりボザイムの応用がある。ここでも、細 胞内への輸送が律速因子の１つであることから、細胞内において出来る限り高い 濃度の活性リボザイムを保証する必要がある。

また、遺伝子治療では生細胞に核酸を導入するための効率的なシステムを必要と している。このためには、インビボにおける治療活性遺伝子生産物の合成を行う ために幾つかの遺伝子が細胞内に閉じ込められる。

治療活性ＤＮＡ　（またはｍＲＮＡ）を必要に応じて一度に、または繰り返し薬 のように（“遺伝子治療薬”）投与する治療法に対する必要性が益々高まってい る。遺伝子治療が期待される遺伝病の例には、血友病、β−サラセミアおよび遺 伝的に誘導されるアデノシン・デアミナーゼの欠乏によって引き起こされる症候 群である“重度合併免疫不全”がある。他の応用には体液性または細胞内免疫が 接種による分泌型タンパク質抗原または非分泌型タンパク質抗原をコードする機 能性核酸の投与により達成される免疫調節における応用がある。例えば、個々の 必要性に応じて仕立てられた欠損遺伝子をコードする核酸を投与しつる遺伝子欠 陥の例には、筋萎縮症（ジストロピン遺伝子）、嚢胞性繊維症（“嚢胞性繊維症 トランスメンブレン・コンダクタンス調節遺伝子″）および高コレステロール血 症（ＬＤＬレセプター遺伝子）がある。遺伝子治療による治療法は、ホルモン、 成長因子または細胞毒性又は免疫調節活性を有するタンパク質を体内で合成させ る場合に非常に重要である。

治療における律速因子の１つである核酸の生細胞内への輸送の改善に関する解答 がすでに多（提案されてきている。

これらの解答の１つには、例えば非荷電基で荷電ホスホジエステル基を置換する こと等により核酸を直接修正することが含まれる。別の直接的修正法には、ヌク レオチド・アナログの使用がある。しかし、これらの提案には、例えば、標的分 子への低い結合能、弱い阻害効果および毒性等、種々の欠点がある。

オリゴヌクレオチドの直接的修正の別の方法には、オリゴヌクレオチドを非電荷 にしてしまうこと、および、例えば、細胞への輸送を可能にする分子を用いるこ とによりオリゴヌクレオチドに所望する性質を与える官能基を提供することが含 まれる。

インビトロにおける哺乳細胞の遺伝的トランスホーメーションに関する方法は種 々知られているが、それらのインビボにおける使用は制限される（その方法には 、ウィルス、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション 、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストランまたはリン酸カルシウム沈殿法によるＤＮ Ａの導入が含まれる）。

既に、インビボにおいて目的とする細胞にＤＮＡを運び込むのに使用しつるシス テムを開発する試みが行われてきた（つ（Ｗｕ）およびつ（Ｎｕ）　、１９８７ ）。このシステムは血液細胞を対象として開発されたもので、血液細胞表面上に 提供されるレセプターが応答する糖蛋白質にポリリジンを結合し、次いで、ＤＮ Ａを添加して細胞に吸収される可溶性糖蛋白質・ポリリジン・ＤＮＡ複合体を形 成し、これが吸収されると該ＤＮＡ配列の発現が可能となるという原理に基づく ものである。

このシステムは血液細胞に特異的であり、その機能に関しては、アシアログリコ プロティン・レセプターによる比較的良く特性の分かったメカニズムにより限定 される。

応用範囲が広く効率的な輸送システムは、トランスフェリン・ポリカチオン結合 体による核酸の細胞内への吸収を行うためにトランスフェリン・レセプターを利 用している。このシステムは、ＥＰ−Ａｔ　０３８８７５８の主題であり、その 内容を本明細書に含めるものとする。

このシステムにより細胞内に輸送されたＤＮＡは発現し、かつ、もし阻害効果を 有する核酸が使用されたならば、その阻害効果がこの輸送システムによって妨害 されることはないことが示された。以後、このシステムを１トランスフエリンフ エクシヨン」と呼ぶ。

国際特許出願Ｗ０９１／１７７７３は、ＣＤ４−発現細胞に対して特異的効果を 有する核酸を輸送するシステムに関する。このシステムは、タンパク質部分がＣ Ｄ４に結合する能力を有するタンパク質であるタンパク質・ポリカチオン結合体 と取り込ませる核酸の複合体を形成させ、得られたタンパク質−ポリカチオン・ 核酸複合体を介してＣＤ４−発現細胞を架橋させることにより、ＨＩＶウィルス が使用するレセプターを利用している。このシステム（以後、ＣＤ４　トランス フェクションと呼ぶ）によって細胞内に輸送されたＤＮＡは、その細胞内で発現 することが示された。

これら２つの研究に共通するものは、それらが細胞に核酸を導入するのに特異的 な細胞の機能を利用している点にある。いずれの場合にも、吸収メカニズムは、 本発明の目的に関して「インターナライジング因子」と呼んでいる因子を利用し て進行している。この事は、細胞表面に結合し、広い意味でも、または狭い意味 でも恐らく他の因子（例えば、細胞表面タンパク質）と協同的に、特異的に細胞 内に取り込まれる因子を意味し、また、そのインターナリゼーションは可逆的で も不可逆的でもあり得る。インターナライジング因子は、核酸に対するアフィニ ティーという観点から核酸との結合を確実にするポリカチオン性を有する物質と 結合する。（以後、核酸とインターナライジング因子との間に結合を形成する能 力を有する物質を「結合因子」と呼ぶ。）本発明に先行する２つの研究の過程で 、細胞への核酸の至適導入は、核酸に対する結合体の比率を、実質的にインター ナライジング因子−ポリカチオン・核酸複合体が電気的に中性となるように選択 するときに達成されることが分かった。

本発明の目的は、インターナライジング因子により核酸を吸収させるシステムの 効率を改善することである。

この問題を解決し、このシステムを至適化する知見を得るために、吸収効率に関 し最良の結果を与えるインターナライジング因子・ポリカチオン・核酸複合体の 組成を詳細に検討した。

先ず、種々のトランスフェリン・ポリカチオン結合体を合成した（単離法は別に して、実質的にＥＰ−Ａｌ　０３８８７５８の方法に従った）。最初に、各結合 体について生細胞に遺伝子（この場合にはルシフェラーゼ・レポーター遺伝子） を取り込ませる能力を知るための予備的測定を行った。各結合体・ＤＮＡ複合体 は、結合体／ＤＮＡ比に関して明確な至適値を持つことが分かった。高ポリリジ ン含量のトランスフェリン・ポリリジン結合体（ＴＴｐＬ）は、低ポリリジン含 量の物に比べてＤＮＡのトランスポーチ−ジョンに関して著しく良い結果を与え ることが観測された。ポリリジン４５０　（ｐＬ４５０）はポリリジン２００　 （ｐＬ２ｏＯ）と同様の結果を与えたが、結合体のｐＬ含量が特定の値（ＴＴ／ ｐＬ　ｌ／ｌ　’）を越えると、再び活性は減少した。最良の結果は、結合体に おいてトランスフェリン当たり約１００乃至２００個の正電荷アミノ酸の場合に 得られた。

ＤＮＡに対する結合体の至適比が分かったなら、特定の結合体の亭主適量を使用 し、該結合体を種々の量の遊離した（共有結合していない）ポリカチオンまたは ポリカチオン性の物質（種々のレベルのポリリジン、プロタミン、ヒストンＨ１ 、Ｈ３およびＨ４を使用した）と混合し、次いで、この混合物を一定量のＤＮＡ に添加することを原則とした別の一連の試験を行った。亭主適量の結合体を使用 した場合には有意に至適トランスフェクション・レベルを下回った複合体のトラ ンスフェクション効率が、遊離ポリカチオンの添加で十分に回復し、もしくはそ れを上回った。低イオン強度でのみＤＮＡを収縮することが知られている（チコ ネンコ（Ｔｉｋｃｈｏｎｅｎｋｏ）等、１９８８）スペルミジンまたはスペルミ ンだけは、組織培養システムの生理学的条件下でＤＮＡの発現を増加することは 出来なかった。

本発明の目的のために行った実験を通じて、一連のトランスフェリン・プロタミ ン結合体を調製し、基準または合成プロタミンを用いて生細胞への核酸の輸送能 力を調べた。実際に、試験した結合体は細胞にＤＮＡを輸送する能力を有してい たが、その効率はポリリジン結合体の効率の約１０分のｌであった。遊離ポリリ ジンの添加により、プロタミン結合体の効率を実質的に増加しえた。

ＣＤ４トランスフエクシヨン・システムにおいても同様の結果が得られた。結合 体／ＤＮＡ比、２：ｌの比較的悪い結果を示すｇｐ１２０−ポリリジン結合体か ら始めて、ｇｐＩ２Ｑ−ポリリジン／ＤＮＡ複合体を用いた実験を行った。ＣＤ ４発現Ｈｅｌ、ａ細胞における外来遺伝子の発現は、遊離ポリリジンの添加で４ 倍増加した。

得られた結果から、核酸とトランスフェリンの間の結合を担う機能に加えて、結 合体に含まれるポリカチオン性結合因子は、細胞への核酸の吸収または発現にお いてもう一つの役割を果たしているという仮定が導かれた。

ポリカチオンに対するトランスフェリンの至適比を決定するための滴定実験に続 いて、至適ＤＮＡ／結合体比であることが分かった複合体の分子レベルでの研究 を行った。これらの研究の目的は、結合比の変化が複合体の高次構造に影響する かどうかを調べることである。この目的のために、トランスフェリンフエクショ ンで使用した方法と同様の方法で調製したトランカフニリン・ポリカチオン・プ ラスミド・ＤＮＡ複合体を電子顕微鏡で観測した。意外にも、電子顕微鏡分析は 、結合体存在下のプラスミドＤＮＡが電子顕微鏡の試料調製法とは無関係に直径 約８０乃至１１００ｎのトロイド構造（ドーナツ様）に収縮していることを示し た。

これらの結果の意外な特徴は、トランスフエリンフエクションにおいて最も効率 的であることが分かった結合体について得られたドーナツ構造は、ＤＮＡと遊離 ポリリジンの間の複合体の構造に習っており、即ち、ＤＮＡを収縮させるポリリ ジンの能力は、それがインターナライジング因子と結合する事実には影響されな いことである。高塩濃度におけるポリリジン（レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）　、１ ９７５）または低イオン強度におけるスペルミジン（チャトラ（Ｃｈａｔｔｏｒ ａｊ）等、１９７ｇ）によるλ−ＤＮＡの収縮が文献的にも知られている。

これらの実験を通じて、い（つかの場合における非共有結合の結合因子による発 現の増加を明確に、もしくは排他的にこの収縮効果に帰することは出来ず、別の メカニズムに従わなければならないことが分かった。この事は、電子顕微鏡下で 観測されるヒストンＨ４に寄因するＤＮＡの収縮無しに、トランスフェリンフエ クション効率の著しい増加をもたらすＨ４の場合に見られる。

実施した試験の結果から、先ず、インターナライジング因子−結合因子・核酸複 合体の導入には少なくとも２つの予備条件が必要であることが分かった。

ａ）核酸分子がそのインターナライジングおよび発現に適合するばかりでなく、 明確にこれらの仮定を容易にする形で結合することを保証する混合物中における 十分な量の適当な結合因子の存在。例えば、ＤＮＡの収縮を起こすトランスフェ リンおよびポリカチオンの場合のインターナライジングの改善は、恐らく、その 内径的１１００ｎの（ダーネル（Ｄａｒｎｅｌｌ）等、１９８９）レセプターに 結合したトランスフェリンがインターナライズする「コート化ピット」の大きさ に収縮した「ドーナツＪの直径が一致することに寄因する。（恐ら（、核酸の収 縮は容易なインターナライジングに加えて、酵素的分解からの保護をもたらす。

）ｂ）細胞内への複合体の輸送（例えば、レセプター仲介エンドサイト−シスに よるトランスフェリンの場合）を維持する形および量のインターナライジング因 子の存在、即ち、細胞への複合体の十分な吸収を起こすには必ずしも必要ないが 、ＤＮＡに対する結合体の比が至適である結合体を用いた場合に得られる「ドー ナツ」当たり多数のインターナライジング因子分子の存在。

行った試験の結果は、遊離結合因子によってもたらされる発現の増加がＤＮＡの 収縮に明確に、若しくは少なくとも排他的に帰することは出来ないが、恐らく、 さらにＤＮＡの保護作用、即ち細胞内におけるＤＮＡ分解の阻害、および／また は核酸の発現機械への接触に関するポジティブな影響も手伝っているという仮説 を誘導する。

従って、本発明は、いくつかの結合体を遊離核酸結合物質と置き換えた後、イン ターナライジング因子によって仲介される吸収メカニズムの機能を保証する適当 な形の結合体が十分な量存在するという条件で、インターナライジング因子・ポ リカチオン結合体を使用した場合に、その結合体は、非共有結合ポリカチオン（ または、ポリカチオン性物質）と置換しつるという観察から始まる。

トランスフェリン・ポリカチオン結合体およびプラスミドＤＮＡを使用する本発 明の範囲で実行された実験は、細胞内への遺伝子の輸送を維持するにはＤＮＡ分 子当たりｌＯ乃至２０個のトランスフェリン分子を必要とすることを示している 。

その数がこのレベルを下回ると、遊離ポリカチオンによる結合体の置換の結果、 導入されるＤＮＡ量は純粋なカチオン的導入システムに典型的なレベルにまで激 減する（ファーパー（Ｆａｒｂｅｒ）等、１９７５）。

この理論への適合とは別に、例えば、トランスフェリンの場合はトランスフェリ ン分子か十分または至適数存在するばかりでなく、これらの分子がレセプターに 接近可能なこと、即ち、レセプター仲介エンドサイト−シスが起こることを保証 するようにこれらの分子がレセプターに対して適当に存在することが重要である かもしれない。

意外にもトランスフェリン・ポリカチオン結合体のい（つかを非共有結合ポリカ チオンで置換しても細胞に吸収される核酸量は減少しないことが分かった。ある 場合にはＤＮＡ取り込みが有意に増加した。インターナライジング因子としてＣ Ｏ２結合タンパク質を用いて行った試験も同様の結果を与えた。

以後、核酸への結合能により結合体によるインターナライジングおよび／または 発現効率を増加しつる非共有結合型の複合体に含まれる物質を［核酸結合物質） または「核酸にアフィニティーを有する物質」と呼ぶ。

また、核酸にアフィニティーを有する遊離物質の添加は、他の結合因子を使用し た場合でさえ、この導入システムの効率の増加をもたらすことが分かった。

この効果の試験は、結合因子としてインターカレート剤であるエチジウムダイマ ーを用いたトランスフェリン・エチジウムダイマー結合体を使用して行った。

このシステムでも、ＤＮＡ・結合体複合体が遊離ポリカチオンを含んでいる場合 には、該結合体により細胞に導入されるＤＮＡの発現の増加が起こった。

従って、本発明はインターナライジング因子・結合因子結合体と複合体を形成す る核酸を含む複合体であって、エンドサイト−シスによりインターナライジンク 因子によって高等真核細胞に吸収されうる新しい複合体に関する。この複合体は 、さらに、核酸にアフィニティーを有する物質であって、結合体による核酸のイ ンターナライジングおよび／または発現を増加する非共有結合型の、恐らく結合 因子と一致しつる１つ以上の物質を含むことを特徴とする。

本発明の別の特徴は、細胞を本発明に従う複合体と接触させる、インターナライ ジング因子による高等真核細胞への核酸の導入法に関する。

本発明によれば、細胞へ導入する核酸量に基づくインターナライジング因子・結 合因子結合体の必要量はより少なくなり、トランスフェクション・発現効率は少 なくとも同等に維持できることから、合成コストが軽減される。一方、複合体内 の多数のインターナライジング因子分子により幾つかの隣接する「ドツキング部 位」　（例えば、レセプター）が占有され、結果的にこれらのドツキング部位が 池の複合体によって使用されなくなる効果を避けたい場合にはより少ない量の結 合体が有利となる。処理する標的細胞上に多くのレセプターが無い場合には、複 合体内に含まれるインターナライジング因子の量を最小限に維持すること、即ち 、結合体量を最小にして、これを遊離核酸に対してアフィニティーを有する物質 で希釈することは特に都合がよい。

本発明に従い、それ自体では特に効果的ではない結合体の性能を実質的に増加し 得、また、既に高い効果を有する結合体の性能を更に向上することが出来る。

本発明の複合体の定性的組成に関しては、先ず細胞に導入する核酸およびインタ ーナライジング因子が決定される。最初は、例えば、欠損遺伝子を置換するため に、例えば、阻害又は（遺伝子治療で使用する場合は）発現すべき遺伝子または 遺伝子断片の標的配列によって細胞内で行われる生物学的効果により核酸が決め られる。場合によっては、特定の用途に対する安定性の理由から核酸を修飾する こともある。細胞に輸送する核酸は、そのヌクレオチド配列には制限を持たない ＤＮＡまたはＲＮＡである。例えば、ホスホジエステル基のホスホロチオニー゛ 　ト基による置換やヌクレオチドアナログの使用などの変化もあり得る（シン（ Ｚｏｎ）、１９８８）。特に興味深い治療的に効果のある阻害核酸は、特定の遺 伝子配列を阻害する目的で細胞に導入される核酸である。これらには、場合によ ってはキャリヤー核酸を伴うアンチセンス・オリゴヌクレオチドおよびリポザイ ム（または、アンチセンスＲＮＡまたはりポザイムが転写される遺伝子構築物） が含まれる。

インターナライジング因子は、例えば、ある細胞型に特異的であり、そのタイプ の細胞に選択的に核酸を導入しうる特定の表面抗原又はレセプターによる等、取 り分は標的細胞によって決定される。

核酸およびインターナライジング因子に関する決定から始まり、これらのパラメ ーター、核酸の大きさ、特に、重要とされる負電荷の実質的中和に関して結合因 子が決められる。

複合体中に含まれる核酸にアフィニティーを有する非共有結合物質を選択した場 合、これらの物質の添加が結合体の場合と比べて核酸のインターナリゼーション ・発現の増加をもたらすことが重要である。

複合体の定性的組成と同様に、定量的組成も互いに機能的に関連する基準、例え ば、核酸の濃縮がどの程度必要か、複合体全体の持つ電荷、特定の細胞が有する 結合およびインターナライジング能の程度、および、それをどの程度増加する必 要があるか等により決定される。複合体の組成に関するその他のパラメーターと しては、レセプターに対するインターナライジング因子の接近可能性であって、 該因子が細胞に関する複合体内でどの様に提示されるかが重要な因子となってい る。別の基本的特性としては、その所定の機能を果たすための細胞における核酸 の接近可能性が挙げられる。

本発明の目的に関する［インターナライジング因子」とは、エンドサイト−シス 、望ましくはレセプター仲介エンドサイト−シスにより細胞に結合した後、イン ターナライズされるリガンドまたはそのフラグメント、もしくは、細胞膜要素と の融合により結合・インターナライズされる因子である。

理論的に適したインターナライジング因子には、リガンドであるトランスフェリ ン、コナルブミン；アシアログリコプロティン（アシアロトランスフェリン、ア シアロロソムコイドまたはアシアロフェチュイン）またはガラクトースを含み、 アシアログリコプロティン・レセプターを介してインターナライジングされる物 質；レセプターを介して細胞に吸収されるリボプロティン（アポＢ１００／ＬＤ Ｌ）　；　ＨｔＶタンパク質ｇｐ１２０等のウィルスタンパク質；表面抗原に対 する抗体、例えば、アンチ−ＣＤ４　、アンチ−ＣＤ？　、インターロイキン− １，ＴＮＦ等のサイトカイン；インシュリン、ＥＧＦ等の因子および成長因子； 失活トキシン等が含まれる。リガンドは天然のものでも合成したものでもよく、 かつ、場合によっては修飾されることもある。

本発明の範囲に適したこれらの因子に関しては、ａ）それらは、核酸を導入する 特定の細胞によりインターナライズされなければならず、それらが結合因子と結 合された場合にインターナライズする能力が全く、または実質的に影響を受けて はならない。また、ｂ）この特性の範囲内で、それらは、それらが使用する経路 を介して細胞内に核酸を運ぶことが出来なくてはならない。

本発明に適した結合因子には、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリオル ニチン等のホモ・ポリカチオンまたは２つ以上の異なる正電荷アミノ酸を有する ヘテロ・ポリカチオンであって、おそらく種々の鎖長を有するポリカチオン、並 びに、ポリエチレンイミン等の非ペプチド合成ポリカチオンが含まれる。その他 の適当な結合因子には、ヒストンまたはプロタミン類、またはそのアナログ、ま たはそのフラグメント等のポリカチオン性を有する天然のＤＮＡ結合タンパク質 がある。使用しうるその他の結合因子には、エチジウムダイマー、アクリジンま たはトリプトファンおよび／またはチロシンおよび／またはフェニルアラニンを 含むインターカレーティング・ペプチド等のインターカレーティング物質がある 。

複合体中に非共有結合で含まれている核酸結合物質は、結合因子と同じ物のこと もあるし異なる場合もある。これらを選択する基本的基準は、核酸の大きさ、特 にその収縮に関する大きさである。一般的に、小さい核酸の場合には収縮する必 要はない。核酸にアフィニティーを有する物質の特性および量に関する選択は結 合体、特に結合体中に含まれる結合因子を特に考慮して行われる。例えば、もし 、結合因子がＤＮＡ収縮の能力を全く、または殆ど有していない場合、一般的に 複合体を効率的にインターナライズする目的のためにはＤＮＡに対するアフィニ ティーがより大きい物質を使用することが望ましい。もし、結合因子自体が核酸 を収縮する物質であり、この結合因子により効率的なインターナライジングのた めの核酸の適当な収縮が行われるならば、他のメカニズムにより発現の増加をも たらす核酸にアフィニティーを有する物質を使用することが望ましい。

本発明において使用するのに適している核酸にアフィニティーを有する非共有結 合物質には、核酸を収縮させ、および／または細胞内における不都合な分解から 核酸を保護する能力を有する物質、特に先に示したポリカチオン性の物質が含ま れる。その他の適当な物質には、核酸に結合し、それにより細胞の発現機械に対 する核酸の接近可能性を増加して核酸の転写・発現の増加をもたらす物が含まれ る。このような物質の例には、ＤＮＡが転写に関して活性であるという仮定でＤ ＮＡを収縮し、かつ細胞内で是を発現する能力を有することが見いだされた染色 体非ヒストンタンパク質ＨＭＧＩがある（ベトガー（ＢＱｔｔｇｅｒ）等、１９ ８８）。

核酸に対するアフィニティーを有する結合因子および／または非共有結合物質、 は、場合によっては修飾されうる。この修飾には、例えば、細胞膜に対するイン ターナライジング因子・結合因子・核酸複合体のアフィニティーを増加しつる天 然の脂質（例えば、脂肪酸、コレステロール）に類似する炭化水素基等の親油性 基が含まれる。

修飾を行う別の方法には、標的細胞に対する複合体の特異性を増加しうる親水性 基であって、複合体が親油性基に対するアフィニティーを有する別の細胞に指向 するのを防ぐ親水性基の使用が含まれる。このような親水性基にはラクトース、 マルトース、ガラクトース等の糖およびポリエチレングリコールが含まれる。

結合体内の結合因子に対するインターナライジング因子のモル比を決定するとき は、核酸の複合体化が起こり、かつ生成した複合体が細胞に結合し細胞内に運ば れることを確認すべきである。結合体は、種々の組成の結合体の効率を調べる簡 単な予備実験で決定しつる。

選択された特定の比は基本的にポリカチオン分子の大きさ、正電荷基の数および 分布、輸送される核酸の大きさ、構造および修飾に適合する基準に依存する。

結合体を構築し、トランスフェリンフエクションの効率に関するＤＮＡに対する 結合体の至適比を決定した後、滴定により核酸にアフィニティーを有する遊離物 質と置換しうる結合体画分の量を測定できる。もし、ポリカチオンを結合因子お よび核酸にアフィニティーを有する遊離物質の両方として使用するなら、そのポ リカチオンは同一のものでも異なるものでもよい。

本発明の複合体は、全てが希釈溶液の形で存在してもよい各成分、核酸、インタ ーナライジング因子・結合因子結合体および核酸にアフィニティーを有する遊離 物質を混合する事により調製しうる。もし、結合因子であると同時に核酸に対す るアフィニティーを有する遊離物質としてポリカチオンを使用するならミ一般的 に先ず結合体と遊離ポリカチオンとの混合物を調製し、その後この混合物とＤＮ Ａとを合わせるのが望ましい。特定の結合体・ポリカチオン混合物に対するＤＮ Ａの至適比は、滴定実験、即ち、一定量のＤＮＡおよび種々の量の結合体°ポリ カチオン混合物を用いた一連のトランスフェクション実験で測定する。混合物中 におけるポリカチオンに対する結合体の至適比は、滴定実験で使用した至適混合 物の至適値を使用または比較することで得られる。

ＤＮＡ複合体は、生理学的塩濃度で調製しうる。しかし、より高い塩濃度（おそ らく、２Ｍ　ＮａＣｌ　）を使用し、後に穏やがな希釈または透析で生理学的条 件に調整することも出来る。

本発明に従った、各要素である核酸、結合体および核酸にアフィニティーを有す る非共有結合遊離物質を混合する最も適した配列は、予備実験で個々の場合につ いて決定される。例えば、トランスフェリン・エチジウムダイマー結合体および ポリリジンの場合など特定の合には、先ず、核酸と結合体の複合体を作り、後に 核酸にアフィニティーを有する遊離物質、例えばポリカチオンを添加する。

本発明の１つの態様におけるインターナライジング因子はトランスフェリンであ り、結合因子はポリカチオンである。トランスフェリン・ポリカチオン結合体と 核酸との複合体の形で核酸を釣り上げられ、核酸にアフィニティーを有する遊離 物質は非共有結合型で複合体中に含まれるポリカチオンであり、遊離ポリカチオ ンは結合体中に含まれるポリカチオンと同一または異なるポリカチオンである。

「トランスフェリン」は、天然のトランスフェリン並びにレセプターに結合し、 細胞内に輸送されるトランスフェリン修飾物を示す。

結合体中のトランスフェリン；ポリカチオンのモル比を決定する場合、核酸が複 合体化し、かつ、形成した複合体がトランスフェリンレセプターに結合し細胞内 に輸送されることを確認すべきである。この事は各々の場合で行われる簡単な実 験でチェックしうる。

結合体中のカチオン性物質として以下の化合物を使用しうる。

ａ）プロタミンこれらは、天然もしくは組み換え法で生成した物であり、多数の 複製物を生産しうるし、また分子の大きさおよびアミノ酸配列の修正もしつる。

また、対応する化合物を化学的に合成できる。例えば、合成プロタミンを合成す る場合、その操作には天然のプロタミンにおいては輸送機能（例えば、より大き い凝集物を形成するＤＮＡの収縮）に不都合な機能を示すアミノ酸残基を他の適 当なアミノ酸に置換すること、および／またはその一端にトランスフェリンとの 望ましい結合を可能にするアミノ酸（例えば、システィン）を提供することが含 まれる。

ｂ）ヒストン：天然および合成ヒストンまたはそのフラグメントが使用できる一 方、その生産および修正に関してはプロタミンに関して先に述べた所見が同様に 適用される。

Ｃ）ホモ・ポリペプチド（ポリリジン、ポリアルギニン）またはへテロ・ポリペ プチド（正電荷アミノ酸を２つ以上含む）等の合成ポリペプチド。

ｄ）ポリエチレンイミン等の非ペプチド・ポリカチオン。

基本的に、ポリカチオンの大きさは、輸送される核酸に依存する。

トランスフェリン・ポリカチオン結合体は、化学的に、またはポリ力チオンカ鴫 ポリペプチドの場合は組み換え法により生成しうる。

化学的方法によるカップリングは、取り分はペプチドのカップリングに関する従 来法で行うことができ、もし必要ならば各成分に、かツブリング反応の前をこ１ ノンカー物質が提供されうる（この操作は、例えば、メルカプト基また（まアル コール基等の当初使用しうるカップリングに適した官能基が無い場合に必要とな る）。

このリンカ−物質は、先ず各成分の官能基と反応し、その後修飾した各成分のカ ブプリングを行う二官能性化合物である。

望ましい結合体の性質、特にその安定性に依存して、以下の事項により力・ツブ リングを行いうる。

ａ）還元条件下で再び切断しうるジスルフィド結合（例えば、スクシンイミジル ピリジルージチンプロピオネートを用いて（ジャンク（Ｊｕｎｇ）等、１９８１ ）　）。

ｂ）生物学的条件下で非常に安定な化合物を用いること（例えば、第２成分に結 合するスルフィドリル基とマレイミド・リンカ−を反応させることによるチオエ ステル）。

Ｃ）例えば、エステル結合または弱酸性条件下で不安定なアセタールまｔこ（ま ケタール結合等、生物学的条件下で不安定な結合を用いること。

組み換え法による結合体の生産は、明確に限定された均一な化合物を提供するが 、化学的結合は後に分離しなければならない結合体の混合物を生成する。組み換 え法による調製に関しては、タンパク質およびヒストン結合体カベ特に望ましＧ ）。

結合体の組み換え法による調製は、キメラポリペプチドの生産に関する従来法を 用いて行いうる。ポリカチオン性ペプチドはその大きさおよびアミノ酸配置ＦＪ を変化しうる。また、遺伝子工学による生産は、レセプターへの結合能を増加す ること、例えば、適当な変異導入、またはトランスフェリンをレセプターへの結 合を担う部分に短縮することにより結合体のトランスフェリン部分を修正するの に有利である。

もし、インターナライジング因子が例えば、トランスフェリン等の糖タンパク質 なら、それを糖タンパク質の一つ以上の炭水化物鎖を介して結合因子に結合しう る。

この種の結合体は、使用するリンカ−物質に由来する修正を含まないという利点 を有する。例えば、トランスフェリンなどのカップリングに適した炭水化物基が １つしかないか、または少ない場合には、これらの結合体は糖蛋白質・結合因子 の結合部位が性格に規定されるという利点を有する。

糖蛋白質・ポリカチオン結合体を調製するための適当な方法は、ドイツ特許出願 Ｐ　４１１５０３８．４に公開されている。これはワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）等 （１９９１）によって示されたものである。

本発明は、所定の組成の結合体を得るための、それ自体は明らかにポリリジン結 合体よりも有効ではないが組み換え法によって生成することが比較的容易である トランスフェリン・プロタミン結合体の効率を増加する利点を有している。使用 しうるトランスフェリン・ポリカチオン結合体、またはＤＮＡとの複合体および その調製方法に関しては、特にＢＰ−Ａｌ　０３８８７５８の公開が参考となる 。

先に与えられた情報は、トランスフェリン複合体を用いた本発明の態様を示して いるが、特にトランスフェリン複合体に制限されるものではない。

トランスフェクションの適当な条件を決めるために、トランスフェリン・ポリカ チオン結合体を例に用いた以下の操作が使用しうる。細胞に輸送し、その用途（ 遺伝子または遺伝子断片の転移、アンチセンス・オリゴヌクレオチドによる細胞 機能の阻害、その他）で限定される核酸から出発して、その核酸と複合体を形成 し、トランスフェリン・レセプターを介して細胞に吸収されうるトランスフェリ ン・ポリカチオン結合体を合成した。トランスフェクションを起こす特定の細胞 系では、先ず、特にトランスフェクトされる細胞またはこれらの細胞の状態に関 するトランスフェクションに適した条件、例えば、トランスフェリン・レセプタ ーの数の増加をもたらす、および／または、細胞オルガネラ、特にリゾソーム内 の核酸の分解を阻害する条件が選択される。

トランスフェリン−ポリカチオン・核酸複合体の取り込みの増加が単にレセプタ ー上の直接的または間接的作用（例えば、転写速度の増加、ｍＲＮＡの分解の阻 害、またはｍＲＮＡの翻訳速度の増加、レセプターの分解の減少、またはこのよ うなメカニズムの組み合わせによるレセプター合成の増加）によるトランスフェ リン・レセプター数の増加に帰しうるかどうかは重要ではない。また、この効果 には、例えばトランスフェリンのそのレセプターに対するアフィニティーの増加 、および／またはトランスフェリン・レセプターの再生速度の増加、および／ま たはトランスフェリン・レセプターへの結合に関するトランスフェリン−ポリカ チオン・核酸複合体と本来のトランスフェリンとの競争の阻害等、別のメカニズ ムも関係しうる。重要なことは細胞を処理する条件がトランスフェリン−ポリカ チオン・核酸複合体の取り込みを増加する事である。［トランスフェリン・レセ プター数の増加をもたらす条件」の定義は、上述のメカニズムによるトランスフ ェリンフェクションの効率の増加をもたらす条件も含んでいる。

トランスフェリン・レセプター数を増加する目的で細胞を処理する適当な条件に は、例えば、細胞を細胞内のヘモコンセントレージョンを低下しうる物質と接触 させることが含まれる。

これらは、以下の事項： ａ）プロトポルフィリン■の生合成を阻害する、ｂ）へモホーメーションを妨害 する、 Ｃ）ヘモ・デコンポジションを促進する、により細胞内のヘモコンセントレージ ョンの減少を招く物質であることが望ましい。

グループａ）の物質にはスクシニルアセトンが含まれるが、トランスフェリン・ レセプター数の増加は、恐らくプロトポルフィリン■の生合成の阻害に帰するこ とができる。グループｂ）の物質には、細胞内の鉄欠乏を誘導する物質、例えば 、鉄キレート形成剤であるデスフェリオキサミンが含まれ、恐らく、この物質は プロトポルフィリン■のヘムへの転換を妨害する理由でトランスフェリン・レセ プター数の増加を起こす。基本的に細胞内に吸収され、かつ、ヘム形成に使用し うる鉄の量に関するデスフェリオキサミンの効果を有する全ての物質、特に何時 キレート剤は、トランスフェリン・レセプター数の増加に適している。

これまで述べてきた物質のグループは、これらが明らかにレセプターへの結合に 関する本来のトランスフェリンおよびトランスフェリン−ポリカチオン・核酸複 合体の競争を排除するのに適していることから、本発明の範囲内でトランスフェ リン複合体を使用する場合に重要である。インビトロまたはインビボにおいてこ のような物質で細胞を前処理することにより、トランスフェリンに結合されない 鉄が除かれ、その結果、細胞から排除されるトランスフェリンが使用可能な鉄は 無く、従って、このトランスフェリンはアポトランスフェリンとしてトランスフ ェリン・レセプターへの結合に関してトランスフヱリンーボリカチオン・核酸複 合体と競争しえなくなる。一方、遊離鉄の除去は、遊離鉄の存在に寄因するトラ ンスフェリン・レセプター数の減少を防ぎうる。

グループＣ）には、トランスフェリン・レセプター濃度、またはそのレセプター に対するトランスフェリンのアフィニティー、またはレセプター再生速度を増加 することによりヘム分解を、結果的に、細胞を誘導または刺激する物質が含まれ る（これらの物質により細胞へのＤＮＡの取り込みが増加することが分かり、一 方、グループａ）乃至Ｃ）の物質の組み合わせは、発現されるレポーター遺伝子 の活性により決定されている付加的効果を有していた。）また、本発明の範囲に おいては、細胞内の核酸の分解を阻害する条件を作ることも有用である。このよ うな条件は、いわゆるリソソマトロピ・ツク物質を添加することにより提供され うる。これらの物質は、リゾソーム内のプロテアーゼおよびヌクレアーゼの活性 を阻害することが知られており核酸の分解を妨害するが、一方、リソツマトロピ ック物質の性質の定義には細胞内の細胞オルガネラ膜から核酸を放出させる潜在 的能力が含まれる。

これらの物質には、クロロキン、モネンシン、ニゲリシン、塩化アンモニウムお よびメチルアミンが含まれる。

リソツマトロピック物質群から選択した物質を使用する必要性は、特に処理する 細胞型に依存するであろう。本発明の目的に対するこのグループからの物質の適 合性、および、それを細胞に作用させる濃度または時間は、一方では細胞に対す るそれらの毒性、他方ではこれらの物質が、例えば、ベシクル融合の阻害、それ によるレセプターの解読の阻害等によりトランスフェリン・レセプターの再生に 影響するか否かに依存するであろう。核酸の分解を阻害する物質の使用＝関して 、効率的なトランスフエリンフエクションを行う目的にとって全ての細胞型に必 須なものではないことが分かった。

従って、リソツマトロピック物質を使用した場合、予備実験でそのｌ・要員また は適性を試験する必要がある。必要ならば、細胞を損傷する効果を除外また（よ 最小限にするために、これらの物質を短時間作用させつる。

本発明の別の態様におけるインターナライジング因子は、ＣＤ４に結合しうるタ ンパク質（ｒＣＤ４結合タンパク質Ｊ、ｒｃＩ）４ＢＰＪ　’）である。未公開 のす−スト１ノア特許出願Ａ１１１０／９Ｑの範囲内で、感染の間）１１Ｖウイ Ｊレスにより使用されるレセプター、即ちＣＤ４は、タンパク質部分がＣＤ４結 合タンパク質であるタンパク質・ポリカチオン・結合体と共に細胞内に導入され る核酸と複合体を形成することにより細胞内に核酸を輸送するのに使用しうるこ とが分かった。使用したＣＤ４ＢＰ　１ｔＣＤ４に対するモノクローナル抗体ま たはＣＤ４に結合するそのフラグメント、例えば、Ｆａｂ’フラグメントでよい （ペルチｘ　：／　’　？チュース（Ｐｅｌｃｈｅｎ−Ｍａｔｔｈｅｗｓ）等、 １９８９）。

これらのものには、ｇｐ１２０エピトープへの結合をウィルスと競争するｇり１ ２０エピトープを有する抗ＣＤ４モノクローナル抗体が含まれる。

従来のモノクローナル抗体またはそのフラグメントの代わりに、重鎮および軽鎖 のセグメントの組み合わせ、または重鎮自体を含むＣＤ４抗原結合抗体フラグメ ントを使用しうる。ＣＤ４ＢＰとして、ＨＩＶ−１−ｇｐ１２０または　関連レ トロウィルスまたはそのフラグメントの相同タンパク質も使用しつる。適当なｇ ｐ１２０フラグメントは、例えば、ＣＤ４への結合が示されてきた９５ｋＤａお よび２５ｋＤａフラグメント等にグレン（Ｎｙｇｒｅｎ）等、１９８８）のＣＤ ４　（、ラスキー（Ｌａｓｋｙ）等、１９８７）　ｉこ結合しうる物である。こ れらのフラグメントは、例えば、組み換え法により全ｇｐ１２０タンパク質を生 成し、続いてこれをタンパク質分解的に切断する力）、また＋１、フラグメント 自体の組み換え的調製により得ることができる。

結合体のポリカチオン部分または核酸に対するアフィニティーを有する非共有結 合遊離物質に関しては、原則的にトランスフェリン・ポリカチオン結合体に関し て述べた注意が適用される。

結合体内のポリカチオンに対するＣＤ４８Ｐのモル比および核酸との複合体を形 成し、ＣＤ４と結合し、細胞に輸送されるための必要条件に関しては、トランス フェリン・ポリカチオン結合体に関する注意が適用される。該結合体と接触され 、例えば、放射能ラベルした相補的核酸分子とハイブリダイズするサザンプロッ ト解析、ＰＣＲを用いた増幅、またはレポーター遺伝子の遺伝子生産物の検出に より、細胞中の核酸の存在を調べられるＣＤ４発現細胞系列を用いることにより 、複合体の性能を調べることができる。効率的なトランスフエリンフェクション に関するポリカチオンに対するＣＤ４８Ｐの至適比を測定した後、滴定によりト ランスフェリン結合体の場合使用した操作と同様に、核酸に対するアフィニティ ーを有する遊離物質と置換しうる結合体成分の量を測定できる一方、本発明の本 態様においても、おそらく核酸に対するアフィニティーを有する遊離物質は結合 体のポリカチオン成分とは異なる。

ＣＤ４８Ｐ結合因子結合体を使用した場合でさえ、細胞中の核酸の分解を阻害す る物質を用いてシステムの効率を改善することが望ましいが、このような尺度の 適性または必要性に関して、トランスフェリン・ポリカチオン結合体を使用した 場合と同様の考慮が適用される。

本発明の範囲で行われる試験において、細胞に輸送される核酸の例としてフオチ ナス・ビラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子を 含むプラスミドを使用した。原則的として、このＤＮＡは、例えば、特定の細胞 型に対する個々の場合に要求される特定の条件を決定するために行う予備実験に 特に有用である。

治療的用途における核酸は、取り分は細胞内における生物学的効果によって限定 されるが、遺伝子治療における用途では、例えば、欠陥遺伝子を置換するための 発現される遺伝子または遺伝子断片、または阻害される遺伝子の目的配列により 限定される。細胞内に輸送される核酸はＤＮＡでもＲＮＡでも良い。そのヌクレ オチド配列に関する制限もない。治療的に有効な阻害核酸として、特定遺伝子配 列を阻害する目的で特定の遺伝子構築物が細胞内に輸送される。これらには、ア ンチセンスＲＮＡまたはりポザイムに転写される遺伝子構築物が含まれる。

遺伝子治療に使用され、遺伝子構築物の成分として本発明の方法により細胞内に 閉じ込めうる遺伝子の例には、因子■（血友病で使用される。クラチ（Ｋｕｒａ ｃｈｉ　）およびデビー（Ｄａｖｉｅ）、１９８２）、アデノシン・デミアーゼ （ＳＣＩＤ　；バレリオ（Ｖａｌｅｒｉｏ）等、１９８４）、ａ−１アンチトリ プシン（肺気腫；シリベルト（Ｃｉ　ｌ１ｂｅｒｔｏ）等、１９８５）または「 嚢腫性繊維症トランスメンブレン・コンダクタンス調節遺伝子」　（リョーダン （Ｒｉｏｒｄａｎ）等、１９８９）が含まれる。これらの例は、いかなる制限も 構成しない。

核酸のサイズは広い範囲で使用が可能である。本発明に従い約０．３ｋｂ乃至約 ０．５ｋｂ以上のオーダーの核酸を細胞内に輸送しうる。

別の特徴において、本発明は活性成分として特異的に遺伝子を阻害する核酸との 複合体を含む医薬組成物に関する。例えば、アンチセンス・オリゴヌクレオチド 、アンチセンス・オリゴヌクレオチド・アナログ、またはりボザイムまたはそれ らをコードするＤＮＡの形の阻害核酸を、場合によっては、例えば凍結乾燥物と してｔＲＮＡ等のキャリヤー核酸と共に含む本発明に従う複合体は、Ｈｆｆまた は関連レトロウィルス等のヒトまたは動物の病原ウィルス、オンコジーン、また は例えば＋　ｃ−ｆｏｓ遺伝子またはｃ−ｍｙｃ遺伝子などの細胞の成長および ／または分化をコントロールするその他の重要な遺伝子を阻害するのに使用しう る。

本発明の医薬製剤の使用に関する別の分野には、例えば、アルツ／％イマー症で 発生する主要プラークタンパク質、または自己免疫症を起こすタンパク質等、不 都合な遺伝子タンパク質の生産を阻害することによりそれらの病気と戦うことが 含まれる。

本発明の核酸に対するアフィニティーを有する遊離物質を含むインターナライジ ング因子−結合因子・核酸複合体の投与量は、特に処理する細胞濃度および阻害 すべき特定の核酸に依存する。また、使用する複合体の量は、例えば、その核酸 が活性成分であるかどうか、または例えば、リボザイムの場合、それが遺伝子と して細胞内に輸送され、細胞内で増幅されるかどうかに依存する。

各々の細胞型に対する特定の指標に使用する至適投与量は、個々の場合における 予備実験で決定する。

治療のためには、これらの物質を生体内または生体外に投与する。例えば、腫瘍 の治療のために生体内に投与する場合には、核酸として活性化したオンコジーン を指向するりボザイムを含む適当な複合体の溶液を腫瘍組織に注射することが含 まれる。

生体外治療は、例えば、白血球細胞の処理の場合に考えられる。採用される操作 には、例えば、患者から骨髄または末梢血液を採取することが含まれる。それか ら、白血球を核酸成分としてオンコジーン活性を中和するアンチセンス・オリゴ ヌクレオチドまたはりボザイムを含むトランスフェリン−ポリカチオン・核酸複 合体によるトランスフエリンフェクションの至適条件下で（例えば、デスフェリ オキサミンによる前処理後）選択的に処理する。最後に、その骨髄または血液を 生体に再移植する。

本発明によるインターナライジング因子・結合因子−核酸複合体を含む医薬組成 物の治療への応用により、細胞内への有効な核酸の導入が改善され、その発現が 増加することでその活性の向上が可能となった。

（図面の簡単な説明） 第１Ａ図ニドランスフェリン・ポリリジン結合体／ＤＮＡ　（）ランスフェリン −ポリリジン２００）の至適比の決定。

第１８図ニドランスフェリン・ポリリジン結合体／ＤＮＡ　（）ランスフェリン −ポリリジン４５０）の至適比の決定。

第２図　：遺伝子転移効率に関するポリリジンに対するトランスフェリンの比の 効果（Ａニドランスフェリン・ポリリジン２００．　Ｂ：　ｌ−ランスフェリン ・ポリリジン４５０） 第３図　：ＤＮＡ分子当たりに必要とされるトランスフェリン分子の最小数の決 定。Ａ：量変化させた結合体の非結合ポリリジンによる置換。Ｂニ一定の至適量 結合体に対する非結合ポリリジンの添加。

第４図　ニドランスフェリンおよび合成プロタミンの結合体による遺伝子転移。

第５図　ニドランスフェリンおよび合成プロタミンの結合体によるトランスフリ ンフエクション効率の向上。

第６図　：細胞状態に依存するトランスフリンフエクション効率の増加。

第７図　：遺伝子転移に関する非共有結合ヒストンＨ４に影響。

第８図　：　ｇｐ１２０−ポリリジン結合体によるＣＤ４発ＩＪＪ（ｅＬａ細胞 への遺伝子転移。

第９図　：非共有結合ポリリジンの添加にょるｇｐ１２０−ポリリジン結合体を 用いた遺伝子転移の効率の増加。

第１θ図二親油的に修正したポリリジンの添加によるトランスフェリン・ポリリ ジン結合体を用いた遺伝子転移の効率の増加。

第１１図：非共有結合ポリリジンによるトランスフェリン・エチジウムダイマー 結合体を用いた遺伝子転移の効率の増加。

第１２図ニドランスフェリン・ポリリジン結合体による遺伝子転移に関するラク トース修飾ポリリジンの影響。

本発明を以下に示す実施例で説明する。

実施例１ トランスフェリン・ポリリジン２００およびトランスフェリン・ポリリジン４５ ０結合体（ＴｆｐＬ２００およびＴＴｐＬ４５０　）　（７）調製結合は、文献 （ジャンク（Ｊｕｎｇ）等、１９＋１１）の方法を用い、スクシンイミジルピリ ジルジチオプロピオネートによる修飾後ジスルフィド結合を導入することにより 行った。採用した操作は、ＥＰ−Ａｌ　０３８８７５８に示されているが、単離 方法を若干修正しており、その結果より高収率で結合体が得られた。

ａ）　３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート修飾トランスフェリン：３ｎ ＋ＩのＯ，１Ｍリン酸ナトリウム・バッファ（ｐＨ７，８）中のセファデックス Ｇ−２５でゲル濾過したトランスフェリン（ヒト・トランスフェリン、シグマ、 鉄フリー）１２０■の６ｎ＋１溶液を攪拌しながらスクシンイミジル　３−（２ −ピリジルチオ）プロピオネート（３μＭ、　５ＰＤＰ、ファルマシア）の１５ −エタノール溶液２００μｌと混合し、時々振りながら室温で１時間反応させた 。ゲルカラム（セファデックスＧ−２５，１４Ｘ１８０ｏ＋、０．１Ｍリン酸ナ トリウムバッファｐＨ７，８）で低分子反応生成物および試薬残査を除去し、７ ｍｌの生産物フラクションを得た。トランスフェリンと結合したピリジルジチオ プロピオネート残基は、ジチオスレイトールによる還元後の試料の一部のピリジ ン−２−チオン放出量を分光学的に測定することで定量し、約２，６μＩＤ０１ と決定された。

ｂ）修飾されたポリリジ：／２００（＋）Ｌ２００）およびポリリジン４５０（ ｐＬ４５０）（７）調製３ｍｌの２０ｄ％ｌａ酸ナトリウムバッファ中、０．５ ７μｗ１のｐｔ、２ｏｏ　（蛍光ラベルした平均重合度２００リジン残基のもの ）のゲル濾過溶液を３００μｌのｌ　Ｍ　ＨＨＰｔｌＳバッファの添加でｐＨ７ ，９に調節した。激しく攪拌しながら、ＩＯ−の５ＰＤＰエタノール溶液（２， ０４μｍｏ１）を２０４μｌ添加した。１時間後、５００μｌの１Ｍ酢酸ナトリ ウム（ｐＨ５）を添加した。低分子物質を除去するために、この混合物をセファ デックスＧ−２５で濾過した（溶出液：２０−酸ナトリウムバッファｐＨ５，０ ）。ｌ、８６μａｘ＋１のジチオピリジン基を含む０．５４μｍｌのｐＬ２００ ８　（ポリリジン鎖当たり３．５個のリンカ−）を含む溶液が得られ、この溶液 をバッファを用いてｐＨ７に調節し、３６■のジチオスレイトールを添加後、こ の混合物を暗所、アルゴン雰囲気下、室温で１時間放置した。４００μＩの３岨 詐酸ナトリウムバツフア（ｐＨ５，０）を添加し、さらに、ゲル濾過する事で過 剰な還元剤から分離した（セファデックスＧ−２５，１４Ｘ　１８０−カラム、 １５−酸ナトリウムバッフｙｐＨ５，０）。１．８４μ加１のメルカプト基を含 む蛍光ラベルしたポリリジン０．５０μｌ１１０１を含む生産物溶液４ｍｌが得 られた（エルマン試薬５．５′−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸を用いた分光 学的測定）。

同様に、０．２０μｍｏｌのｐＬ４５０（平均重合度４５０リジン残基）を０． ７０μｌｌｌ０１の５ＰＤＰで修飾し、０，５７μｍｌのジチオピリジン基を含 む０．１８μｍｏｌのｐＬ４５０　（ポリリジン鎖当たり３．２個のリンカ−） を得た。ポリリジン２００について先に述べたようにジチオピリジン基をジチオ スレイトールで還元した。０．５７μｌ１ｌＩＯ１のメルカプト基で修飾された ０、　１７５μＩＤ０１のポリリジンが得られた。

Ｃ）　トランスフェリン・ポリリジン結合体の調製アルゴン雰囲気下、酸素を排 除してａ）で得られた修飾トランスフェリン１．０６μｒ！１ｏｌ　（１００ｔ Ｍ　ＨＥＰＢＳバッファ、ｐＨ７，９）をｂ）で得られた修飾ｐＬ２００　（３ ０−酢酸ナトリウムバッファ）と混合してトランスフェリン・ｐＬ２００を調製 した。同様に、トランスフェリン・ポリリジン４５０結合体を実施例１ａ）に従 い０．６１μｍｏｌの修飾トランスフェリン（１００ｍＭ　ＨＢＰＥＳ　ｐＨ７ ，９）および０．１２μｍｏｌ　ｐＬ４５０　（３０−酢酸ナトリウムバッファ ）から出発して調製した。

室温、１８時間後、反応混合物からカチオン交換クロマトグラフィーにより結合 体を単離した（ファルマシア、モノＳカラムＨＲ１０／ｌＯｉ　勾配溶出、バッ ファＡ：５０ｍ　ＨＥＰＢＳ　ｐＨ７，９、バッファＢ：バッファＡ＋３Ｍ塩化 ナトリウム）。ポリカチオン結合体を得るためには、カラムにチャージする前に 反応混合物に塩化ナトリウムを添加しくＴｆｐＬ２００　（７）場合、最終濃度 ０．６　Ｍ、　ＴｆｐＬ４５０　ｃ７）場合、ｌ　Ｍ）　１．ｍ、（７）塩濃度 から勾配をかけることが重要であると分かった。ＴＴｐＬ２００の場合、生産物 フラクションハ約１．４Ｍで溶出し、ＴＴｐＬ４５０　（７）場合は２Ｍ’ｔ− 溶出した。ＨＢＳ　（ＨＢＰＥＳ緩衝塩溶液：　２０ｄ４　ＨＥＰＥＳ、１５０ 　ｖＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７，４）に対して透析した後、各々の結合フラクション ハ、収率８０％（ＴｆｐＬ２００　）および６４％（ＴｆｐＬ４５０　）　Ｔ： あツタ。

結合フラクションは、第２Ａ図および第２Ｂ図においてポリリジンに対するトラ ンスフェリンの比に関して詳細に検討した。

試料に、トランスフェリン成分■当たり３乃至ｌＯμｌのＩＯ−クエン酸鉄［１ １１］、２００請クエン酸（炭酸水素ナトリウムを用いてｐＨ７，８に調整）を 添加することで結合体に鉄を取り込ませた。

実施例２ ａ）ＤＮＡに対するポリリジン結合体の至適比の測定実施例１で得られた各結合 体に関し、ＤＮＡ導入および発現の目的でＤＮＡに対する結合体の至適比の滴定 を行った。使用したＤＮＡは、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ分解標準法（ドウエツト（Ｄｅ Ｗｅｔ）等、１９８７）　、ＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ平衡密度勾配遠心、ブタノール −１による脱色および１０ｍＭ　ｌ−リス−ＨＣＩ（ｌ］Ｈ７，５）、　１ｍｌ ＋ｌ　ＥＤＴＡに対する透析で調製した（参考ＢＰ−Ａｌ　０３８８７５８）。

滴定に使用したトランスフェリン−ポリカチオン・ＤＮＡ複合体は、特定の結合 体フラクションの量を増やしつつ、一定量のｐＲ３ＶＬ−プラスミドＤ　ＮＡ、 ＴｆｐＬ２００フラクションの場合はＩＯμｇおよびＴｆｐＬ４ｓｏの場合は６ μｇと混合することで調製した。第１Ａ図（ＴｆｐＬ２００）および第２Ｂ図（ ＴｆｐＬ４５ｏ）は、滴定を行うのに選択された量であって、結合体および結合 体フラクション中に含まれるトランスフェリンに対するＤＮＡの重量比を示す量 の比をそれぞれＡ−ＣおよびＡ−Ｄに示している（第２図参照）。複合体は、Ｈ ＢＳ（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、　２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，４）５００　 ｕ　Ｉ中で調製し、室温で３０分間インキュベートしてから細胞培養物２ｍｌに 添加した。トランスフェクション用に、赤白血病細胞系列に５６２をｌＯ％ウシ 胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｌｌ１ｌのストレプト マイシンおよび２−のグルタミンを補ったＰＲＭＩ　１６４０中でｍｌ当たり２ −５　ＸＩＯ’の細胞密度で培養した。この細胞を細胞上のトランスフェリン・ レセプター数を増加するため５０μＭのデスフェリオキサミンでトランスフェク ション前１８−２４時間前処理した。トランスフェクションは、１００μＭクロ ロキンの存在する２ｍｌの培地中、５×１５の細胞で行った。３７℃、４時間の インキュベート後、細胞を新鮮な培地に移して３７℃でインキュベートし、１８ 時間後ルシフェラーゼ測定用に収穫した。第１図は、タンパク質含量で標準化し た細胞抽出物部分標本（全抽出物の約１５−２０％）のルシフェラーゼ活性を示 している。

ｂ）　）ランスフエリンフェクション効率に関する結合体中のトランスフェリン ・ポリリジン比の影響 ＩＯμｇのｐＲ３ＶＬ　ＤＮＡとの複合体形成に、ポリリジン鎖当たりのトラン スフェリン分子平均数が異なる３種類のＴｆｐＬ２００結合体フラクションＡ− Ｃをａ）で決定した至適量で使用した（フラクションＡは４０μｇ、ＢおよびＣ は３０μｇ）。先に述べた標準条件下、生成した複合体で１０’個の細胞をトラ ンスフェクトし、その遺伝子発現をタンパク質含量で標準化した細胞抽出物部分 標本のルシフェラーゼ活性の測定で決定した。

４種のＴｆｐＬ４５０フラクションＡ−Ｄを用いたトランスフエリンフエクショ ン実験は、６μｇのＤＮＡを使用し、至適であることが分かっている結合体量、 即ち１８μｇ（フラクションＡ−Ｃ’）および１２μｇ（フラクションＤ）と混 合すること以外は、全く同様の方法で行った。これらの実験結果を第２図に示す （ルシフェラーゼ活性値は全抽出物に関するものである）。これは、ポリリジン 分子当たり少数のトランスフェリン分子を含むフラクションがより有効であるこ とを明確に示している。第２Ａ図：ポリリジンに対するトランスフェリンのモル 比２：ｌの結合ｇは、モル比６：ｌの結合体Ａよりも１０倍効率か良い。第２Ｂ 図：この実験は、長居トランスフェリン・ｐＬ４５０結合体を使用した場合、モ ル比９：１の結合体は、モル比５：１の結合体よりも活性は低いが、Ｔｆ：ｐＬ 比２．５：ｌの結合体の活性と同様の活性を有することを示している。しかし、 ポリリジン含量が高くなると（比１：Ｉ　）再び活性が下降する。

実施例３ ＤＮＡ分子当たりに必要とされるトランスフェリン分子の最小数の決定本実施例 の実験を行う場合の前提は、レセプター仲介エンドサイト−シスの機能には、「 ドーナ・力　（この数はＤＮＡに対する結合体の質量比から計算した統計的な値 である。）当たり約１２０個のトランスフェリン分子が必要であるとは限らない ということである。この前提の正しさを示すために、トランスフェリン結合体を 非修飾ポリカチオンで置き換え、全ポリリジン量を所定の至適値（ＤＮＡ６μｇ 当たり約４μｇのポリリジン）に維持する試験を行った。トランスフエリンフエ クション（トランスフェクションおよびルシフェラーゼ活性測定は、実施例２と 同様に行った。）は、試料の結合体含量を減らしポリリジンで置き換えた場合、 同じか、もしくは少し増加した（ポリ（Ｄ）リジンおよびポリ（Ｌ）リジンで得 られた結果は一致した。）。しかし、トランスフェリン含量がＤＮＡ分子当たり １０−１５分子以下に落ちた場合、トランスフエリンフエクション効率も急激に 減少した（第３Ａ図、試料５−８）。効率的な遺伝子転移には、ＤＮＡ分子当た り最小１０−１５分子のトランスフェリン分子を必要とすることが分かった。も しも、試料に結合体が添加されなければ、実質的に遺伝子転移は起きない。この 実験の結果を第３Ａ図に示した。カラムｌ−８は、トランスフエリンフエクショ ン後のルシフェラーゼ遺伝子の発現を示しており、一方、ＤＮＡ６μｇによる複 合体形成の際に至適量１８μｇのＴｆｐＬ２００は、ｐ（Ｄ）Ｌ２４０の量を増 加することにより置き換えられた。（ルシフェラーゼ測定に関して第３図に示さ れたレベルは、全抽出物に関するものである。） 実施例４ 次の一連の実験においては、出発物質として実施例２ａ）で至適であることが分 かった量の約１／４に対応する一定量（４，５μｇ）のトランスフェリン・ポリ カチオン結合体を使用した。この結合体を増加量のポリリジン９０（ｐＬ８０） と混合し、一定量のＤＮＡ（６μｇ）に添加した。トランスフェクションおよび ルシフェラーゼ測定は、先の実施例と同様に行った。このテストの結果を第３Ｂ 図に示す。カラム９−１５の実験において、６μｇのｐＲｓＶＬの複合体は、４ ，５μｇのＴｆｐＬ２００Ｃを用いて調製し、これに増加量のｐＬ９ｏを添加し た。（カラム１６は、６μｇのｐＲｓＶＬおよびＴｆｐＬ２００Ｃの至適量（１ ８Ｍｇ）を用いたコントロール実験の結果である）。第３Ｂ図に見られるように 、亭主適出発量のＴｒｐｔを用いた場合の至適結果の約１／１００に落ちたトラ ンスフェクション効率は、遊離のｐＬ９０を添加することで再び復活した。

実施例５ 実施例４と同様に、種々の量の色々のポリカチオンがどの様にＤＮＡの取り込み に影響するかを調べるために、９μｇのＴｆｐＬ２００と複合体を形成した亭主 適量の６μｇのＤＮＡから出発して一連の試験を行った。トランスフェクション およびＤＮＡ輸送効率の測定は、先に示した標準法で行った。使用した遊離ポリ カチオンは、平均鎖長５５．９０．２００または４５０リジンモノマーからなる ポリ（Ｌ）リジン、平均鎖長２４０リジン残基からなるポリ（Ｄ）リジン（全て のポリリジンは、シグマから臭化水素塩として提供された）、プロタミン（サケ 硫酸プロタミスヒストン・フリー、シグマ）、ヒストンＨ１，）１３および８４ 　（ウシ胸腺由来、ベーリンガー・マンハイム）である。表１は使用した遊離カ チオンの量ならびに９μｇのＴｆｐＬ２００および特定量のポリカチオンの混合 物と複合体を形成した６μｇのＤＮＡの相対的トランスフエリンフエクション効 率を示している。表中の数字は、ＴｆｐＬ２００の至適量（１８Ｍｇ）を用いて 調製した複合体に基づく％を示している。

この一連の実験は、使用したポリカチオン、天然プロタミンおよびヒストンの添 加が、至適であることが分かっている結合体を用いたときに得られるＤＮＡ輸送 効率と少なくとも同じ効率を達成しうることを示している。例外は、スペルミン およびスペルミジンであり、これらは組織培養システムの生理学的塩濃度におい てＤＮＡの取り込みを復活させることはできなかった。

実施例６ 合成プロタミンアナログとのトランスフェリン結合体の調製トランスフェリンと 以下に示す配列式：％式％ で表される合成プロタミンの結合体を、ペプチドのＣ末端システィンおよび３− （２−ピリジルジチオ）プロピオネート修飾トランスフェリンの間のジスルフィ ド結合によるカップリングで合成した。

ａ）合成プロタミンの調製 ポリペプチドは、業者の推薦する条件下で自動ペプチド合成機（アプライド・バ イオシステムズ４３１Ａ９）を用いた固相法で合成した（フルオライン・メトキ シカルボニル法（Ｆｍｏｃ）　；使用した側鎖はセリンおよびシスティンに対し てｔ−ブチル基、リジンに対してｔ−ブトキシカルボニル基、アルギニンに対し てはペンタメチルクロマンスルホニル基である）。得られた粗ペプチドをゲル濾 過しくセファデックスＧ−２５Ｐｏ　１０カラム、溶出液；１０％酢酸）、その 溶液をさらに逆相）１１’Ｌｃ　Ｃメルク・ヒタチ、ヌクレオシル＋０Ｏ−５Ｃ １８，８Ｘ２５０ａｎ　、溶液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、溶液Ｂ： ０．１％トリフルオロ酢酸６０％アセトニトリル溶液、４５分間で０−１００％ Ｂの勾配溶出、流速２ｍｌ／ｍ１ｎ）で分画した。溶液８４３％で溶出する生成 物をさらにカチオン交換クロマトグラフィーで精製した（ファルマシアＭｏｎｏ ＳＨＲ１０−１０カラム、バッフｙ　Ａ　：　３３ｍＭ　Ｈｌｌ：ＰＥＳ　ｐＨ ７、バッファＢ：バッファＡ＋１ＭＮａＣ１；勾配溶出、流速０．５ｍｌ／ｎ＋ ｉｎ　）　ｏ　０．８１Ｍの塩濃度で溶出する主ピークをＨＰＬＣ（先に述べた 条件）で脱塩し、凍結乾燥した。トリフルオロ酢酸塩として純粋なペプチド３９ ．６■が得られた。フライト質量スペクトルの時間は（プラズマ脱離質量スペク トロメトリー＝ＰＤ−ＭＳインスツルメン′人アブサラ、スウェーデン）４０１ ８．４と測定された（囲“、【−ブチル保護システィンを有する分子）。

ｂ）ＤＮＡ結合テスト ａ）で調製した合成プロタミンがＤＮＡに結合することがゲル移動度シフト検定 法で確認された。この目的のために、ＨｉｎｄｌＩ［切断λ−ＤＮＡフラグメン トを使用した（フラグメントサイズ２３１２０乃至５６４　ｂｐ、３７℃、４５ 分間、α”ＰｄＡＴＰとタレノーポリメラーゼで突出末端を充填することにより ３′末端を３！Ｐでラベルし、グリコーゲンおよび酢酸ナトリウム添加後エタノ ール沈殿で単離した）。２μＩ　（ｌｏｎｇ）のＤＮＡを含む各試料にｌ　Ｍ　 ＮａＣｌを含む１００　ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッフｙ　（ｐＨ７，３）　２．５μ ｌを添加し、さらに、その試料に増加量（３，１０，３０，１００，３００およ び１０１０００ｎの合成ペプチド（トリフルオロ酢酸塩として）または水ｌ０１ ５μｌ中の１０．３０または１００　ｎｇの天然プロタミンを混合した。各試料 に２μｍのアプリケーション・バッファ（０，２５％ブロモフェノールブルー、 ０．２５％キシレンシアツールおよび３０％グリセリン水溶液）を添加後、試料 をｌ　ＸＴＡＥ　（４０ｒＩＭトリス酢酷ヅ１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐｌ（８）溶出 バッファを用いた５０Ｖ（４２ｍＡ）の１％アガロース電気泳動で分析した。

ゲルを乾燥後、ＸＡＲフィルム（コダック）を用いた一８０℃、２時間のオート ラジオグラフィーを行った。３ｎｇの合成ペプチドを用いたときでさえ有意なバ ンドのシフトが記録され、１０ｎＨの場合に実質的なバンドシフトが記録された （ＤＮＡの大部分が出発スロットに留まった）。

ｃ）トランスフェリンと合成プロタミンとの結合体の調製１ｏＯｍＭ　ＨＥＰＢ Ｓ　（ｐＨ７，３）中のセファデックスＧ−２５カラムによるヒト・トランスフ ェリン１００■（１，２５μｍｏｌ）のゲル濾過で得られる溶液３ｍｌにスクシ ンイミジル３−（２〜ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ；ファルマシ ア）の１５ｍＭエタノール溶液１６７μｍを加え、この溶液を完全に混合した。

室温、１時間後、２０ＭＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７，３）を用いたゲル濾過（セフ ァデックスＧ−２５）を行い、２．２４μｍｏｌのジチオピリジン・リンカ−で 修飾された１、　１４μ園ｌのトランスフェリンの溶液４．６ｍｌを得た。酸素 の除去後、この溶液を０．５％酢酸中遊離メルカプト型の合成プロタミン０．９ μｍｏｌの溶液１．５ｍｌと混合した。この反応混合物をカチオン交換クロマト グラフィーで分画した（ファルマシアＭｏｎｏ　Ｓ−カラムＨＲＩＯ／１０；勾 配溶出０．５ｍｌ／ｍｉｎ、バッフｙ　Ａ　：　５０ｍＭ　ＨＢＰＥＳ　ｐＨ？ 、　３、バッファＢ：バッフｙＡ＋３Ｍ　ＮａＣＬ　２８０ｎｍの四吸収で測定 ）。最初に、未結合の過剰のトランスフェリンが溶出して（る。

生産物フラクションは勾配中に溶出し、２つの結合体フラクション：Ｔｒ−プロ トシンＡ（バッファＢ１７％と２４％の間に溶出）およびＴｆ−プロトシンＢ（ バッファＢの２４％および３０％の間に溶出）として収穫した。２５ｎ＃　ＨＥ ＰＩｉＳ（ｐＨ７，３）に対する透析後、９■の修飾トランスフェリンを含むＴ ｆ−プロトシンＡ（プロタミンに対するトランスフェリンのモル比的１：１．３ 、タンパク質加水分解後のアミノ酸分析に基づく）および修飾トランスフェリン １３．５■を含むＴＴ−プロトシンＢ（プロタミンに対するトランスフェリンの モル比的１：１．８）が得られた。結合体は、全収量として０．２８μｍｏｌの トランスフェリンが得られた。この結合体は、実施例２で示したようにｐＲｓＶ Ｌ　ＤＮＡと複合体を形成した。結合体に対するＤＮＡの比は第４図に示した。

得られた複合体を用いてトランスフェクションを行い、先の実施例と比較した。

第４図に示されているように、プロタミン結合体は細胞中へのＤＮＡの輸送に関 してトランスフェリン・ポリリジン結合体と比較して相対的に少ないが有意な能 力を有している。第４図は、タンパク質含量で標準化した細胞抽出物の部分標本 （全抽出物の約１５−２０％）のルシフェラーゼ活性を示している。実施例７ ポリリジンで部分的に置換することによるトランスフェリンと合成プロタミンの 結合体のトランスフエリンフエクション効率の改善６μｇのｐＲ３ＶＬ　ＤＮＡ 　（結合体／ＤＮＡ比は第４図に示す）で形成した複合体をｐＬ９０と混合し、 Ｄ５６２細胞（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ２４３）にＤＮＡを輸送するために先の実 施例と同様の条件で使用した。行った実験の結果を第５図に示す。ルシフェラー ゼ活性の値は、全抽出物に関するものである。もしも合成プロタミンを含む結合 体の一部が遊離ポリリジンと置き代わったならば、２０倍までにも達するＤＮＡ 発現の増加が観測しうる。（比較のために、予め測定された至適量を用いた実験 も示した。第５図、右側カラム）。

実施例８ 細胞状態の機能とトランスフリンフェクション効率の増加本実施例では、ポリリ ジンで「希釈」する事によるトランスフェリンフェクションの改善の程度が細胞 状態にどの程度依存するかを示す実験を行った。この実験は、基本的に実施例４ の実験と同様である。４．５μｇのＴｆＰ１２００ｃから出発して、細胞に輸送 する複合体をｐＬ９０の添加量を変えながら形成させたが、実施例４とは異なり 、Ｋ５６２細胞をデスフェリオキサミンで前処理しなかった。複合体中のＤＮＡ 量は、全ての試料において６μｇであった。この実験で使用した細胞に関し、ト ランスフェリン・レセプターの数を調べた（スキャッチャード解析）。その値は 、デスフェリオキサミンで処理した細胞の約１１５であった。至適標準条件で確 認サレタヨウニ（６μｇ）ｐＲ５ｖＬＤＮＡニ対しテ１８μｇノＴｆｐＬ２００ ）、レセプター数の減少の結果としてＤＮＡの発現の減少が見られた。しかし、 デスフェリオキサミンで刺激しなかった細胞の場合に、トランスフェリン・ポリ リジン結合体の３７４をポリリジンで置き換えたならば、ＤＮＡ発現は８倍以上 増加する。この値はデスフェリオキサミン刺激の結果としてレセプター数の増加 した細胞の場合よりも僅かに１，８倍低いだけのレベルと対応している。これら の実験の結果を第６図に示す。デスフェリオキサミン刺激した細胞の場合、トラ ンスフェリンによって仲介されるＤＮＡの取り込みは、遊離ポリリジン９０の添 加によって実質的に改善されない。

実施例９ 実施例４で見られた遊離のヒストンＨ４によって引き起こされる遺伝子活性の約 ５倍の増加効果をより詳しく調べるために、以下の実験を行った。ＴｆｐＬ２０ ０ｃ結合体の基本混合物を、ヒストンＨ４の１　（自三角）、２　（黒画角）ま たは４　（黒三角）質量当量で調製し、ＤＮＡ一定量（６μｇ）で形成する複合 体の至適量を各混合物に対する滴定で測定した（第７図）。ヒストンＨ４／Ｔｆ ｐＬの４／ｌ混合物で達成される至適遺伝子活性は結合体自身によって達成され る活性に匹敵した（自回角）。

これらの複合体の電子顕微鏡観察は、ＤＮＡの僅かな収縮を示した。Ｈ４／Ｔｆ ｐＬ　ｌ／１複合体の電子顕微鏡観察はより強い収縮を示したが、純粋な結合体 ・ＤＮＡ複合体の場合よりは実質的により弱い収縮を示した。しかし、意外にも ｌ／Ｉ　Ｈ４／ＴｆｐＬ混合物を使用した場合のトランスフェリンフエクション の増加は、約７倍であった（トランスフェクションは実施例２と同様の標準条件 で行った。ルシフェラーゼ活性の値は全抽出物に関するものである。）。

実施例１０ ＣＤ４＋細胞におけるＤＮＡの輸送 ａ３ｇｐ１２０ポリリジン１ポリリジン結合体スクシンイミジル・ピリジルジチ オプロピオネートによる修飾後のジスルフィド結合の導入またはＮ−ヒドロスク シンイミド−６−マレイミドカプロエート■にＳ、シグマ）による修飾後のチオ エステル結合による、従来法と同様の方法で結合を行った（トランスフェリン結 合体の生成に従い）（フジワラ（Ｆｕｊｉｗａｒａ）等、ｌ９８１）。

ジスルフィド結合ｇｐ１２０−ポリリジン１９０結合体：５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ （ｐＨ７，８）中３■の組み換えｇｐ１２０　（ラスキー（Ｌａｓｋｙ）等、１ ９８６の方法で調製した）の溶液を１Ｏｄｌ　５ＰＤＰエタノール溶液７μｌと 混合した。室温、１時間後、この混合物をセファデックスＧ−２５カラム（溶出 液、１００　ｄ４　ＨＢＰＢＳバッファｐＨ７，９）で濾過し、６７μｍｏｌの ピリジルジチオプロビオネート残基で修飾された２、８■（２３μｍｏ１）のｐ ｇｐ１２０を得た。１２０μｌの３０酬酢酸ナトリウム中、蛍光ラベルし、２３ μｍｏｌのメルカプト基で修飾した（ＳＰＤＰとの反応後、ジチオスレイトール での処理およびゲル濾過）　６．６μｍｏｌのポリリジン１９０の溶液を脱酸素 条件で修飾されたｒｇｐ１２０と混合し、室温で一晩放置した。この反応混合物 に５ＭＮａＣｌを添加し約０．６Ｍとなるように調整した。結合体をイオン交換 クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ　Ｓ、ファルマシア、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐ ｉ（７，３、塩勾配０．６　Ｍ−３Ｍ　ＮａＣ１）で単離した。分画および２５ ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐｌ（７，３に対する透析後、各々１．３μｍｏｌポリリジ ン１９０で修飾された０、　３３ｍｇのｒｇｐ１２０および３．２μｍｏｌのポ リリジン１９０で修飾された０、　３４ｍｇのｒｇｐ１２０を含む２つの結合体 フラクションＡおよびＢが得られた。

チオエーテル結合ｇｐ１２０ポリリジン１９０結合体：０．４５ｍ１の１００蘭 ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，９中、２■の組み換えｇｐ１２０の溶液をジメチルホルム アミド中１０−のＥＭＣ３溶液１７μｍと混合した。室温一時間後、この混合物 をセファデックスＧ−２５ゲルカラム（溶出液１０ｄＪ　ＨＥＰＥＳバッファｐ Ｈ７，９）で濾過した。脱酸素条件下、生産物溶液（１，２ｍ１）を蛍光ラベル し、３０μｍｏｌのメルカプト基で修飾された９、３μｍｏ１のポリリジン１９ ０溶液（９０μｌの３〇−酢酸ナトリウムｐＨ５，０）と反応させ、室温で一晩 放置した。この反応混合物に５　Ｍ　ＮａＣｌを添加して約０．６Ｍに調整した 。この結合体をイオン交換クロマトグラフィー（Ｍｏｎｏ　Ｓ、ファルマシ乙５ ０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，３、塩勾配０．６　Ｍ−３Ｍ　ＮａＣ１）で単離 した。分画および２５ｄｌ（ＥＰＥＳ　ｐｌ（７，３に対する透析後、各々１． ９ｔｏｎｏｌのポリリジン１９０で修飾された０、４０ｍｇのｒｇｐ１２０．２ ．５μｍｏｌのポリリジン１９０で修飾された０、　２５ｍｇのｒｇｐ１２０、 および１．６μｍｏ１のポリリジン１９０で修飾された０、１■のｒｇｐ１２０ を含む３つの結合体フラクションＡ、ＢおよびＣが得られた。

ｂ）ｇｐ＋２０−ポリリジン・ＤＮＡ複合体の調製この複合体は、先ず室温で３ ３０μｌの１（ＢＳ中６μｇのＤＮＡを希釈することにより調製した（１００　 μｇ／ｍｌ以下）。使用したＤＮＡはｐＲ３ＶＳプラスミドＤＮＡ　（実施８ｉ ｌＪ２参照）。ｇｐＪ２０−Ｐｌ　１９０結合体の一部（量は第８図に示した） を１７０μｌのＨＢＳで希釈した。特定した結合体希釈物を迅速にＤＮＡ希釈物 に添加し、３０分間インキュベーションした後、トランスフェクションに使用し た。

ｃ）　ＣＤ４”　’ＩＥ胞のトランスフェクションＣＤ４”　ＨｅＬａ細胞（Ａ ＴＣＣＮｏ、ＣＣｌ２；　７ドン（Ｍａｄｄｏｎ）等、１９８６）をＴ−２５バ イアル当たり６　Ｘ［０’細胞となるように１０％ＦＣＳ　（ウシ胎児血清）を 含むＤＢＭ培地に接種した。１８時間後、細胞を無血清ＯＥＭ培地で２度洗浄し 、この培地（５ｍｌ）で３７℃、５時間培養した。この細胞にｇｐ１２０−ｐＬ ／ｐＲ３ＶＬ複合体溶液を添加した。４時間後、１０％のＦｅ２を含むＤＭＥ培 地（ダルベツコ修正イーグル培地）を等容量各試料に添加した。２４時間後、細 胞を収穫し、抽出物を調製して、同タンパク質含量の部分標本（全物質の約１７ ５）に関し先に実施例で示したルシフェラーゼ活性を検定した。第８図に示した 値は、６　ＸＩＯ’細胞のルシフェラーゼ活性に対応している。

ｇｐ１２（１−ｐＬ結合体の活性は成分比に依存しており、ｇｐ１２０：ポリリ ジン比が低い結合体ではより大きい活性を示しくフラクションＣ、トレース５お よび６）、一方、ｇｐ１２０：ポリリジン比が大きいフラクションでは活性が非 常に低いか、または無いことが分かった（フラクションＡ、Ｉ−レースＩおよび ２）。

実施例１１ 実施例１０のトランスフェクションで悪い結果を示した（フラクションＡおよび Ｂ）　ｇｐ１２ｏ−ｐＬ結合体について、遊離ポリリジンの添加がＤＮＡ取り込 みを改善するかどうかを調べた。６μｇのＤＮＡおよび１２μｇの結合体を使用 し、ＤＮＡとの複合体化の前に結合体に１または３μｇのポリリジン２４０を添 加した。トランスフェリン結合体に関して得られた結果と同様にルシフェラーゼ 活性の著しい増加（２６０倍または５，２倍）が観測された（第９図）。

実施例１２ Ａ）　Ｎ’−アンデシル・ポリリジン（ｐＬ２００−Ｃ１ｌ　）の合成平均鎖長 ２００リジン残基モノマーを有するポリリジンｐＬ２００のトリフルオロ酢酸塩 は、ｐＬ２００４２ｍｇを１ｍｌの０．５％トリフルオロ酢酸に溶解し、０．３ ＭのＮ−エチルジイソプロピルアミン／ＴＦＡバッファ（ｐＨ８）０．２ｍｌを 添加し、０．５％トリフルオロ酢酸を用いてセファデックスＧ−２５カラム（Ｉ ７０×１４Ｉ７Ｉ＋１）を通すことにより調製した。回収した生成物フラクショ ンにンヒドリン検定）を凍結乾燥し、４４■（９１％）のｐＬ２００（ＴＦＡ塩 ）を得た。３．５ｍｌのジオキサン／水（４／ｌ　）中この塩を２２■（０，４ ８μｍ０１）含む溶液を室温で５０μｍのジオキサン（メルク、分析用、使用直 前に蒸留したもの）中４．１■のアンプカナル（２４μｍｏｌ、シグマ）を含む 溶液に添加した。

４時間間隔で１２ｍｇのシアノボロハイドライド・ナトリウム塩に２回にわけて 反応液を添加した。この反応混合物を室温で５日間放置した。酢酸２００μｌを 添加し、溶媒を減圧下で留去した。残査を１．２ｍｌの水／酢酸／エタノール（ ６５／１０／２５）に取り出し、水／酢酸／エタノール（７７／３／２０）を用 いてセファデックス（Ｇ２５−ＰＤＩＯ）でゲル濾過した。生成物フラクション にニンヒドリン検定）を凍結乾燥し、分子当たり約５０−８０アンデシル基で修 飾されたにニンヒドリン分析およびＮＭＲ分析から計算した）ｐＬ２００（酢酸 塩として）１９．７■を得た。ＮＭＲ分析（’Ｈ−題、Ｄ２０＋１５％テトラデ ユーテロメタノール）は以下の値を与えた。σ（１）Ｉ）ＩＩ）　：４．１５− ４．４（リジン　α−Ｈ）　、３．２８（デユーテロメタノール由来）　、２． ９−３．１（リジンε−Ｈおよ■（Ｃ−Ｌ　７ンデシル））、１．９６（アセテ ートＣ１，、）　、１．１−２．０（リジンおよびアンデシルの脂肪族ＣＨｔ由 来）　、０．７−０．９（アンデシル）。

Ｂ）細胞培養およびトランスフェクショントランスフェクションは、１００μＭ クロロキンを含むＤＭＥＭ＋ＩＯ％ウシ胎児血清培地５ｍｌ中５００．０００個 のＨｅｐＧ２細胞で行った（ＡＴＣＣＮｏ、　ＨＢ８０６５　；ノーレス（Ｋｎ ｏｗｌｅｓ）等、１９８０）。（細胞はトリプシン処理し、バイアル中１０ｍ１ のＤＭＥＭ＋ＩＯ％ウシ胎児血清培地に接種後３７℃で２４時間培養した。その 後、培地を１０ｍ１の新鮮な培地と交換し、さらに３７℃で２４時間培養後、再 び５ｍｌの新鮮な培地に交換した。）ａ）ＨＢＳ中ＩＱ７ｚｇのｐＲ５Ｖｓ溶液 ３３０μｌとＨＢＳ中１５または３０μｇ　（至適量）の’ｒｒｐＬｚｏ。

結合体溶液１７０μｌを混合することによりＤＮＡ／結合体複合体を形成した。

この複合体は、先の実施例に述べたように細胞への遺伝子転移に使用した。３７ ℃、４時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、新鮮な培地に移した後３７ ℃でインキュベーションして１８時間後にルシフェラーゼ測定のために収穫した 。タンパク質含量で標準化した細胞抽出物の一部をルシフェラーゼ活性の検定に 使用した。

全抽出物に関して計算した値を第１０Ａ図に示す。

ｂ）ＨＢＳ中ｔｏ　ｕ　ｇノｐＲ３Ｖｓ溶液３３０μｌをＨＢＳ中種々ノ量（７ ）ｐＬ２００−Ｃ１ｌ　ｔ−含量１５μｇのＴｆｐＬ２００結合体の混合物を含 む１７０μｌの溶液と混合することにより非共有結合修飾されたポリカチオンを 含むＤＮＡ結合体複合体を調製した。この複合体は、遺伝子転移に関して先に示 した条件で使用した。また、ルシフェラーゼ活性は、先に示したように計算し第 １０Ｂ図に示した（比較として第１０Ｃ図は、ｐＬ２００−Ｃ１ｌ自体を用いて 得られた値を示している）。

実施例１３ Ａ）トランスフェリン・エチジウムダイマー結合体（Ｔｆ−ＥｔＤ）の調製１ｍ ｌの１００−酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ５）中、３２■（０，４μ５ｏｌ） のトランスフェリン（ヒト、鉄フリー、シグマ）溶液をセファデックスＧ−２５ カラムでゲル濾過した。得られた１、９ｍｌの溶液を０℃に冷却し、その後１． ３■（６μｌｌ０ｌ）の過沃素酸ナトリウムを含む３０酬酢酸ナトリウムバツフ ｙ　（ｐＨ５）　８０μｌを添加した。この混合物を暗所、氷水中に９０分間放 置した。さらに、低分子生産物を除（ためにゲル濾過を行い（セファデックスＧ −２５，３伽鋪詐酸ナトリウムバツフア、ｐＨ５）酸化トランスフェリン約２０ ■（０，２５μｍｏｌ）を含む溶液を得た（２８０　ｒｕｎの聞吸収およびニン ヒドリン検定；非修正トランスフェリンとは異なり、アルデヒドを含む酸化型は アニスアルデヒド試薬と発色反応を起こす：試料を薄層シリカゲルプレートに滴 下し、ｐ−アニスアルデヒド／硫酸／エタノールｌ：ｌ：１８に浸し、乾燥後加 熱する）。このトランスフェリン溶液を１．２ｍｌの水中１１１ｇ（１，１７μ ｌｌｌ０１）のエチジウムホモダイマー（５，５’−ジアザデカメチレン−ビス （３，８−ジアミノ−６＝フェニル−フェナンスリジウム）ジクロライド、２Ｈ ＣＩ、Ｅ−１１６９、モレキュラー・プローブ社）に添加した。この混合物を暗 所に保存し、溶液のｐＨを７．３に調整した（ｌｆＥＰＥｓバッファを添加する ことにより）。４時間間隔で２回１■（１６μ（資）ｌ）のシアノボロハイドラ イド・ナトリウム塩を５０μｌの水に添加した。この反応混合物を室温で暗所に ２昼夜半放置し、ゲル濾過した（セフアゾ・ソクスＧ−２５，５０ＴＩｊＡＨＥ ＰＥＳ　ｐＨ７，３）。４９５　ｎｍの聞吸収により、このステップで約２００ μｇの未結合エチジウムダイマーが他の低分子物質とともに除去されることが分 かった。結合体を含む４．１　ｍｌの溶液のに３分の１を精製実験に使用した。

残りの３分の２は０．６Ｍの塩酸グアニジン（酢酸ナトリウムでｐＨ５に緩衝さ れている）で希釈し、疎水性相互作用に基づいて分離するカラムにかけた（フェ ニルセファロースＣＬ−４Ｂ、ファルマシア、１００　Ｘ８　ｍｍ、約４．５ｍ １）。流出液中に１．５［のトランスフェリンを含む僅かにピンクの溶液が溶出 してくる。紫色の結合体はカラムに留まり、最初は２ｘおよび３％のオクチルグ リコピラノシド（シグマ）を含む０．６賑酸グアニジンで溶出して（る（０．６ ｍ酸グアニジン５０ｍ１で洗浄後）。結合体は、前後に溶出してくる２つのフラ クション（７ｍｌおよび２７．５ｍ１）として回収し、２１の２００−塩酸グア ニジンに対して３日間透析した。その後、各フラクションをスピードバク（サバ ント）を用いて３ｍｌとなるまでエバボレートし、さらに２日間２回の透析を行 った（２１の２５７　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７Ｊ　）。この操作で（長い透析による 損失にもかかわらず）各々２■のトランスフェリン（それぞれニンヒドリン検定 およびバイオ・ラッドタンパク質検定による測定）を含むトランスフェリン・エ チジウムダイマー結合体のフラクション２つが得られた。この２つの紫色のフラ クションは、各々０．４２ＡＵ（５２２ｎｍ）および０．６８ＡＵ（５１６ｎｍ ）であった。（トランスフェリン結合エチジウムダイマーのＵｖ特性は変化する ので、結合体中のエチジウムダイマー含量は測定できなかった。）実施例Ｉと同 様に鉄を取り込ませた。

Ｂ）細胞培養およびトランスフェクションａ）ＴｆｐＬ結合体と同様に、ＨＢＳ 中６ｕｇのｐＲ３ＶＬ溶液３３０μｌとＨＢＳ中種々の量のＴｆ−ＥｔＤ結合体 （結合体フラクションｌ）の溶液１７０μｌを混合しくインターカレーション） 、ついで、種々の量のｐＬ９０の溶液１７０μＩを添加することにより（収縮） ＤＮＡ／結合体複合体を調製した。得られた複合体を標準条件下、５００．００ ０個のに５６２細胞のトランスフェクションに使用した。タンパク質含量で標準 化した細胞抽出物の一部のルシフェラーゼ活性を検定した（第１１Ａ図）。（第 １１Ｄ図はＴｆ−ＥｔＤ結合体自体で行った結果を示している。）ｂ）非共有結 合ポリカチオンは、先ず、４μｇのＴｆ−ＢｔＤの溶液１７０μｌとＨＢＳ中種 々の濃度ノｐＬ９０の溶液１７０μｌを混合し、続いてＨＢＳ中６μｇのｐＲ３ ＶＬの溶液１７０μｍを添加することにより生成した（インターカレーションお よび収縮）。トランスフェクションおよびルシフェラーゼ検定は、先に示した方 法で行った（第１１Ｂ図）。

Ｃ）非共有結合ポリカチオンを含む複合体は、先ず、ＨＢＳ中６μｇのｐＲ３Ｖ Ｌの溶液１７０μｍと種々の濃度のｐＬ９０の溶液１７０μＩを混合しく収縮） 、次いで４μｇのＴ［−ＢｔＤの溶液１７０μｌを添加することで（インターカ レーション）生成した。トランスフェクションおよびルシフェラーゼ検定は先に 示した方法で行った（第１ＩＣ図）。

実施例１４ ａ）　Ｎ’−ラクトース化ポリカチオン（ｐＬ−ラクトース）の調製０．４６ｍ １の１００−酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）中平均鎖長２００リジンモノマーの ポリリジン（ｐＬ２００　）酢酸塩１６．５■（０，４４μｍｏｌ）の溶液に、 ３７℃、３０分間攪拌して溶解したラクトース（シグマ）　９０ｍｇを添加した 。この溶液をこの温度に維持し、３■のシアノボロハイドライドを約１０時間毎 に４回投入した。さらに、この反応混合物を３７℃で２１時間維持した。酢酸１ ５μｌを添加し、この反応混合物を１０〇−酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）を用 いてゲル濾過（セファデックスＧ２５−ＰＤＩＯ）　シた。

生成物フラクションにニンヒドリン・テストおよびアニスアルデヒド染色で検出 した）を２０＃酸ナトリウム、次いでｏ、　ｏｓｓ酢酸に対して一晩透析した。

最後の凍結乾燥で、ニンヒドリン分析およびＮＭＲ分析による見積もりで約７０ ％のＮＥ−リジン−アミノ基がラクトース化されたｐＬ２００酢酸塩２６．５■ が得られた。

０）１−ＮＭＲ（Ｄ２０．２５０ＭＨｚ、溶媒シグナルの抑制）：σ（ｐｐＩｌ ｌ）：４．５１（ｄ、Ｊ□７．２Ｈｚ；ガラクトース−ＩＨ）、４．２２−４． ３４（リジン　α−Ｈ）　、４．１−４．２２（糖Ｈ）、２．９−４．　Ｏ（リ ジン　ε−Ｈおよび糖Ｈ）　、１．９１（酢酸塩−ＣＨｃ　）、１．１−２．０ （脂肪族　リジン−〇Ｈ８）。

ｂ）細胞培養およびトランスフェクショントランスフェクションは、先の実施例 で示した方法と同様に標準条件下、５００゜０００個（７）Ｋ５６２細胞、６　 μｇノｐＲ３ＶＬ　ＤＮＡおよび１８μｇ（７）ＴｆｐＬ、またｌ；ｔ９　μｇ ノＴｆｐＬ、または種々の量のｐｌ−ラクトースを添加した９μｇのＴｆｐＬで 行い、ルシフェラーゼ活性を第１２図に示した（示されている光単位はタンパク 質含量で標準化た細胞抽出物の一部（全抽出物の約１５−２０％）に関するもの である）。非共有結合ラクトース修飾ポリリジンの添加は、少量の結合体を使用 することによって達成されるトランスフェリンフェクション効率の減少を補いう ろことが分かった。

実施例１５ ａ）Ｎ’−マルトース化ポリリジン（ｐＬ−マルトース）の調製ポリリジンを修 飾するのにマルトースを使用すること以外は実施例１４と全（同様の操作を行っ た。以下の顯データが得られた。σ（ｐｌ）＋＋１）：５．１！（ｄ、Ｊ＝３． ４Ｈ２；グルコース−ＩＨ）、２．９５−４．４（リジン−Ｈおよび糖−〇）　 、１．９１（酢酸塩−Ｃｋ）　、１．１−２．０（リジンの脂肪族ＣＩ（Ｂ）。

ｂ）遺伝子転移に関するｐＬ−マルトースの効果実施例１４ｂ）と同様に行った ６　μｇ１７）ｐＲ３ＶＬ−ＤＮＡ　ｌ：よル５００．０００個（７）Ｋ５６２ 細胞のトランスフェリンフエクションは、’ｒｒｐｔ、で完全に飽和したＤＮＡ 複合体の場合（１２ｄｇ　ＴｆｐＬ１９０Ｂ　）　、１．０１ｘｌＯ’光単位の 特異的ルシフェラーセ活性ヲ示シタカ（全試料抽出物の約２０％）、半飽和ＤＮ Ａ複合体（６μｇ（７）ＴｆｐＬＩ９０　）は、５４９、０００光単位を示した 。２．５　ｕｇ（Ｄｐ、−フルドース（６μｇ　ＴｆｐＬ１９０Ｂ＋２．５ｄｇ ｐＬ−マルトース）を添加することにより、トランスフェクション効率は！、　 ２１５．０００光単位にまで増加した。

実施例１６ ａ）　Ｎ’−セロビオース修飾ポリリジン（ｐＬ−セロビオース）の調製ポリリ ジンの修飾にセロビオースを使用すること以外は実施例１４と同様の操作を行っ た。

ｂ）遺伝子転移に関するｐＬ−セロビオースの効果実施例１５ｂ）と同様の条件 下のに５６２細胞のトランスフェクションにおいて、２μｇノｐＬ−セロビオー ス（７）添加テ（６μｇ　ＴｆｐＬＩ９０Ｂ　＋　２ｄｇ　１）Ｌ−１＝ｏヒｔ −ス）、１、１６０．０００光単位が得られた。

参考文献 ボトガー（Ｂ６ｔｔｇｅｒ）、Ｍ等、（１９８８）　Ｂｉｏｃｈｅｕ　Ｂｉｏｐ ｈｙｓ、Ａｃｔａ　９５０，２２１−２２８チヤトラ（Ｃｈａｔｔｏｒａｊ）、 　Ｄ、　Ｋ、等、（１９７８）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１２１．３２７ −３３７シリベルト（Ｃｉｌｉｂｅｒｔｏ）、Ｇ、等、（１９８５）　Ｃｅ１ｌ 　４１，５３１−５４０ダーネル（Ｄａｒｎｅｌｌ）、Ｊ、等、（１９８９）“ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”　ｐｐ、５６７、第２編、編 集Ｗ、　Ｈ，フリーマン（Ｆｒｅｅ＋ｍｎ）・アンド・カンパニー、ニューヨー クドゥウｘット（Ｄｅ　Ｗｅｔ）等、（１９８７）、　Ｍａｔ、　Ｃｅｌ　１． 　Ｂｉｏｌ、　７．７２５−７３７フアーバー（Ｆａｒｂｅｒ）、　Ｆ、　Ｅ、 等、（１９７５）、　Ｂｉｏｃｈｉｕ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　３９０． ２９８−３１１フジワラ（Ｆｕｊｉｗａｒａ）等、（１９８１）、　Ｊ、　Ｉ［ Ｉｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　４５．１９５ハム（Ｈａｍ）、　Ｒ，Ｇ、　、　（ １９６５）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　５３．２８８ジヤ ング（Ｊｕｎｇ）等、（１９８１）、　Ｂｉｏｃｈｅａ　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｎｕ ｎ、　１０１．５９９ノーレス（Ｋｎｏｗｌｅｓ）、　Ｂ、　Ｂ−等、（１９８ ０）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０９．４９７−４９９クラチ（Ｋｕｒａｃｈｉ　） 、　Ｋ、およびデービー（Ｄａｖｉｅ）、　Ｂ、　Ｗ、　（１９８２）、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ａｃａｄA　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７９．６４６１−６４６４ レムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）、　Ｕ、　Ｋ、　、　（１９７５）、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａ比＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７２．４２８８−S２９２ ラスキー（Ｌａｓｋｙ）等、（１９８６）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３．２０９ −２１２ラスキー（Ｌａｓｋｙ）等、（１９８７）、Ｃｅ１ｌ　５０．９７５− ９８５マトン（Ｍａｄｄｏｎ）等、（１９８６）、Ｃｅ１１４７，３３３−３４ ８マニアチア、（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、（１９８２）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒニグレン（Ｎｙｇｒ ｅｎ）、　Ａ、等、（１９８８）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　 Ｓｃｊ、　ＵＳＡ　８５．６５４３−６T４６ ペルチエン・マチユース（Ｐｅｌｃｈｅｎ−Ｍａｔｔｅｗｓ）等、（１９８９） 、　ＥＭＢＯＪ、　８．３６４１−３６４９リヨーダン（Ｒｉｏｒｄａｎ）、　 Ｊ、　Ｒ，等、（１９８９）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４５．１０６６−１０７３ チコネンコ（Ｔｉｋｃｈｏｎｅｎｋｏ）、　Ｔ、　１．等、（１９８８）、Ｇｅ ｎｅ　６３，３２１−３３０バレリオｆｆａｌｅｒｉｏ）、　Ｄ、等、（１９８ ４）、Ｇｅｎｅ　３１．１４７−１５３ワグナ−（Ｗａｇｎｅｒ）、　Ｂ、等、 （１９９１）、　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２．２２６ −２３１つ（Ｗｕ）、Ｇ、Ｙ、およびつ（Ｗｕ）、　Ｃ，Ｈ，、（１９８７）、 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩＬ２６２．４４２９−４４３２ザメクニク（Ｚａ ｍｅｃｎｉｋ）等、（１９８６）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　８３．４１４３シン（Ｚｏｎ）、　Ｇ、　、　（１９８８）、　Ｐｈａ ｒｍａｃｅｕｔ、　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５．５３９−５４９Ｆｉｇ、ＩＡ Ｆｉｇ、ＩＢ Ｆｉｇ、２ Ｆｉｇ−３ Ｆｉｇ、４ ＩＬｇ　ＴｆｐｒｏｔｓｙｎＢ （６μ９　ｐＲＳＶＬ　ＤＮＡ　） Ｆｉｇ、５ Ｆｉｇ、６ Ｆｉｇ、７ μ９　結合体混合物 Ｆｉｇ−８ Ｆｉｇ、９ Ｆｉｇ、１０ （Ａ）　（Ｂ）　（ｃ） Ｆｉｇ−１１ ２４Ｂ　１２　１６　２４　３６　μｇ　Ｔｆ−ＥｔＤ１１７　３３　１３３　 ３００　Ｔｒ／プラスミドＦｉｇ、１２ ＋＋＋＋＋ 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ビルンシュティール　マックス　エルオーストリア　ア−１１ ００ウィーン　グルンデッカーガッセ　４９ （７２）発明者　コツテン　マシュー オーストリア　ア−１１３０ウィーン　マクシングシュトラーセ　２２−２４− ３−８（７２）発明者　ワーグナー　エルンストオーストリア　ア−２１０３ラ ンゲンツエルスドルフ　ヴイーネル　シュトラーセ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．エンドサイトーシスによりインターナライジング因子を用いて高等な真核生 物に吸収しうる新しい複合体であって、インターナライジング因子・結合因子結 合体と複合体を形成した核酸を含み、さらに、非共有結合で結合因子と同一の可 能性のある核酸に対するアフィニティーを有する一つ以上の物質を含む結果とし て、該結合体によって達成される核酸のインターナリゼーションおよび／または 発現が増加することを特徴とする複合体。 ２．前記インターナライジング因子がレセプター仲介エンドサイトーシスにより 細胞中に吸収されるリガンド、または、そのフラグメントである事を特徴とする 請求項１記載の複合体。 ３．前記インターナライジング因子がトランスフェリンである事を特徴とする請 求項１記載の複合体。 ４，前記インターナライジング因子が標的細胞の表面抗原に結合しうるリガンド である事を特徴とする請求項１記載の複合体。 ５．前記リガンドがＣＤ４に結合する事を特徴とする請求項４記載の複合体。 ６．前記インターナライジング因子が抗ＣＤ４抗体である事を特徴とする請求項 ５記載の複合体。 ７．前記インターナライジング因子がウイルスタンパク質である事を特徴とする 請求項５記載の複合体。 ８．前記結合因子がポリカチオン性物質である事を特徴とする請求項１乃至７の いずれか１項記載の複合体。 ９．前記結合因子が均一なポリカチオンである事を特徴とする請求項８記載の複 合体。 １０．前記結合因子がポリリジンである事を特徴とする請求項９記載の複合体。 １１．前記核酸に対するアフィニティーを有する物質が核酸を収縮しうるポリカ チオンである事を特徴とする請求項８乃至１０のいずれか１項記載の複合体。 １２．前記ポリカチオンが均一なポリカチオンである事を特徴とする請求項１１ 記載の複合体。 １３．前記ポリカチオンがポリリジンである事を特徴とする請求項１２記載の複 合体。 １４．前記結合因子がインターカレーティング物質である事を特徴とする請求項 １記載の複合体。 １５．前記核酸に対するアフィニティーを有する物質が親水性または疎水性基に よって修飾されている事を特徴とする請求項１１乃至１４のいずれか１項記載の 複合体。 １６．前記核酸に対するアフィニティーを有する物質が核酸を収縮しうる物質で ある事を特徴とする請求項１４記載の複合体。 １７．前記核酸に対するアフィニティーを有する物質がポリカチオンである事を 特徴とする請求項１６記載の複合体。 １８．前記核酸に対するアフィニティーを有する物質が均一なポリカチオンであ る事を特徴とする請求項１７記載の複合体。 １９．前記核酸に対するアフィニティーを有する物質がポリリジンである事を特 徴とする請求項１８記載の複合体。 ２０．前記結合因子が核酸を収縮しうる物質であり、かつ、前記核酸に対するア フィニティーを有する物質が核酸の収縮とは異なるメカニズムに基づいてインタ ーナライゼーションおよび／または発現の増加をもたらす物質ある事を特徴とす る請求項１記載の複合体。 ２１．前記結合因子がポリリジンであり、かつ、前記核酸に対するアフィニティ ーを有する非共有結合物質がヒストンまたはヒストン類の混合物である事を特徴 とする請求項２０記載の複合体。 ２２．前記核酸に対するアフィニティーを有する物質がヒストンＨ４である事を 特徴とする請求項２１記載の複合体。 ２３．前記核酸に対するアフィニティーを有する物質が非ヒストンタンパク質Ｈ ＭＧＩである事を特徴とする請求項２０記載の複合体。 ２４．前記インターナライジング因子がトランスフェリンである事を特徴とする 請求項２０乃至２３のいずれか１項記載の複合体。 ２５．内容物である核酸、インターナライジング因子・結合因子結合体および核 酸に対するアフィニティーを有する物質の溶液を混合する事を特徴とする請求項 １記載の複合体の製造方法。 ２６．前記インターナライジング因子・結合因子結合体を核酸に対するアフィニ ティーを有する非共有結合物質と混合し、かつ、該混合物を核酸と合わせる事を 特徴とする請求項８乃至１３のいずれか１項記載の複合体の製造方法。 ２７．前記核酸とインターナライジング因子・結合因子結合体の複合体を形成し 、かつ、該複合体に核酸に対するアフィニティーを有する物質を添加する事を特 徴とする請求項１４および１６乃至１９のいずれか１項記載の複合体の製造方法 。 ２８．望ましくは生理学的条件下で可溶性である請求項１乃至２４のいずれか１ 項記載の複合体をインターナライジング因子・結合因子結合体、核酸および核酸 に対するアフィニティーを有する非共有結合物質から生成し、かつ、該複合体と 細胞を接触させる事を特徴とする、エンドサイトーシスによる高等真核細胞への 核酸の導入方法。 ２９．前記細胞を細胞中、特にリソソーム中の核酸の分解を阻害する条件に置く 事を特徴とする請求項２８記載の方法。 ３０．前記細胞をクロロキンで処理する事を特徴とする請求項２９記載の方法。 ３１．前記インターナライジング因子がトランスフェリンである複合体を使用す る事を特徴とする請求項２８乃至３０記載の方法。 ３２．前記細胞をトランスフェリン・レセプターの数が増加する条件下に置く事 を特徴とする請求項３１記載の方法。 ３３．前記細胞を複合体での処理前および／または処理と同時に、細胞中のヘム 濃度を減少させることによりトランスフェリン・レセプターの数を増加させる１ つ以上の物質で処理する事を特徴とする請求項３２記載の方法。 ３４．前記細胞をデスフェリオキサミンで処理する事を特徴とする請求項３３記 載の方法。 ３５．治療的に有効な核酸を含む請求項１乃至２４記載の複合体を１つ以上含む 事を特徴とする医薬製剤。 ３６．前記核酸が遺伝子治療に有効な遺伝子、または遺伝子断片である事を特徴 とする請求項３５記載の医薬製剤。 ３７．前記核酸がアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたは該オリゴヌクレオチ ドを含む事を特徴とする請求項３５記載の医薬製剤。 ３８．前記核酸がリボザイムまたはリボザイムをコードする遺伝子であるか、ま たはリボザイムを含む事を特徴とする請求項３５記載の医薬製剤。 ３９．前記核酸が細胞機能を特異的に阻害するＲＮＡ分子を転写しうる領域を含 む遺伝子構築物である事を特徴とする請求項３５記載の医薬製剤。