JPH06500853A - 固相免疫検定のための使い捨て反応容器および免疫反応により検出可能な成分の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 固相免疫検定のための使い捨て反応容器および免疫反応により検出可能な成分の 測定方法 同相免疫検定のための使い捨て反応容器がその使用方法とともに記載される。

親和クロマトグラフィーは生物分子の予備純化に広く応用される技術である。こ れにおいて決定されるへき分子と補結合強調体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　 ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐａｒｔｎｅｒ　）との間の特別な相互作用が行われる。この ような方法の一般的な実施において、純化されるべき生物分子を含む試料すなわ ちサンプルはクロマトグラフ展開カラムに付与され、このカラムは相互補完の結 合強調体の１つを固体受媒質（ｓｏｌｉｄ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ）に結合させて 含んでいる。

−組の補結合強調体の例は酵素との受媒質、抗体とハブテンおよび抗原のそれぞ れ、および相互補体のＤＮＡまたはＲＮＡ単鎖である。

免疫親和クロマトグラフィーにおいては、定量化のために抗原およびハブテンの それぞれと補体との抗体の間の相互作用が使用される。

これまでの親和クロマトグラフィーを使用した免疫検定に÷５いては再使用可能 なカラムが一般に使用され、このカラムは固体受媒質に結合された抗体または抗 原（以下にリガンドと称する）を詰め込まれている。分析されるへき試料は高圧 のもとてクロマトグラフカラムを通して圧縮され、迅速なりロマトグラフ処理を 保証するようになされる。免疫検定のための高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰ ＬＣ）の応用は、例えば「分析化学」、１９８５、第５７巻、第２７５４〜２７ ５６頁にドウ・エルヴイス、Ｗ、Ｕ、氏により、および「分析化学」、１９８３ 、第５５巻、第７７１〜７７５頁にスポーツマン、Ｊ、Ｒ，民地により記載され ている。しかしながら、免疫検定のためにＨＰＬＣを使用することは幾つかの欠 点を有する。一方でこの技術には安価な器具の使用か必要とされ、他方で分析の ためのクロマトグラフィーカラムは高度の技術的要求に合致しなければならない 。カラムはＨＰＬＣにおいて付与される高圧に耐えねばならないとともに、この 技術の合理的な履行を可能にするために再使用できねばならない。しかしながら 、カラムの再使用は、新しい試料かその同じカラムで分析可能とされる前に、付 加的な測定を必要とする。ＤＥ−Ｏ３３７１１８９４にて公表されたように、再 使用可能なカラムは先行試験において置換され且つまた不完全に溶出した受媒質 の影響を防止するために毎回の分析の前に再生されねはならない。

ＤＥ−Ｏ３２４４８４１１には、固相免疫分析のための反応容器か記載されてい る。しかしなから定量測定の前に、多数回の使用を意図されるこの容器は決定さ れるべき成分の標準による較正を必要とする。しかも長い培養時間この反応容器 には必要とされる。受媒質上の免疫論的補結合強調体に対する決定すべき成分の 十分な結合を保証するために、６時間〜２日が推奨される。

しかしなからこの結合反応は常に、合理的な履行を保証するような１〜２日を要 する結合平衡に到達する前に終結する。標準溶液による較正の必要性はまた結合 反応のこの早期終結の結果でもある。

それ故に本発明の目的は、免疫検定の迅速な履行を可能にし、取扱いか容易で、 事前の較正もしくは再生をしないで容易に使用てきるような固相免疫分析のため の使い捨て反応容器を提供することである。

これは本発明により、上端および下端にて開口し、液体か浸透てきる２つの多孔 質の分離装置を内蔵し、それらの分離装置の間に少なくとも１つの免疫論的な反 応成分か受媒質に結合されている固相免疫分析のための使い捨て反応容器であっ て、受媒質のベッド体積か約６００μｍであることを特徴とし、また、受媒質ベ ッドと組み合わされた上部および（または）下部の分離装置の浸透性によって液 体流れ速度を測定することを特徴とする使い捨て反応容器によって、達成される 。

更に、免疫反応により決定できる成分測定の迅速履行のための方法か記載される 。

この方法は、分析すべき試料を説明した使い捨て反応容器に付与すること、およ び、試料中の決定されるへき成分を記載した反応容器中の補体の反応成分で保持 して、結合平衡を達成させることを特徴とする。決定すべき成分は次に、 ａ）　既知方法で溶出され且つ測定され、ｂ）　既知方法で使い捨て反応容器に て共通の免疫論的なマーカーでマーク付けされ、またはＣ）　決定すべき成分に 対する反応成分のマーク付けした化合物によって測定される。

本発明は第１図および第２図を参照して詳細に説明される。図面において、 第１ａ図は、２つの分離装置２ａおよび２ｂを含み、それらの間に免疫論的な反 応成分３か配置された本発明による使い捨て反応容器の縦断面図、 第１ｂ図は、使い捨て反応容器ｌの頂面図、および第２図は、　抗体生成制御の ためのオンライン装置の概略図である。

ｊｇＩａ図および第１ｂ図に与えられた寸法は単なる例である。

記載された使い捨て反応容器ｌおよびその使い捨て反応容器１か使用される記載 された方法は、既知の反応容器および方法にそれぞれ比較して幾つかのかなりの 利点を表す。

記載された使い捨て反応容器１は、免疫反応によって決定することのできる成分 の定量測定の迅速履行を可能にする。この反応容器ｌの取扱いは非常に簡単で、 ＨＰＬＣのように高価な器具の使用を必要としない。更に、優れた結果か前述し た使い捨て反応容器ｌによって得られるのてあり、免疫論的な反応成分を結合し て有する受媒質３（以下において受媒質ベッドと称する）の消費量は極めて少な い。受媒質ベッド体積３、すなわた上部および下部の分離装置２ａおよび２ｂの 間の５０μｌの体積、を有する使い捨て反応容器１が好ましく使用される。小さ な受媒質ベッド体積は少量の溶出液の使用を可能にし、この結果、溶出による希 釈作用が小さく維持され、従って大量の溶出体積を必要とするその他の方法に比 較して検出限界が低減されない。

更に、前述した反応容器ｌは決定されるべき成分と免疫論的な反応成分との間の 結合平衡における定量測定（終点測定）を可能にする。この結合平衡は前述した 使い捨て反応容器ｌにおける１分間の培養時間内に既に到達されている。この迅 速平衡は、上部および（または）下部の分離装置２ａおよび２ｂ、少量の受媒質 ベッド体積８、および受媒質に対する免疫論的な反応成分の付与によって可能と なる。上部および（または）下部の分離装置は選択された受媒質ベッド体積と関 連して制御された流れを発生し、また、受媒質に反応成分を大量に付与する結果 として、決定されるべき成分は１分間内に、すなわ電流れる液体か受媒質ベッド 体積を離れるよりも前に反応成分と定量的にほぼ結合される。それ故に標準基準 との比較分析か与えられる。

更に、使い捨て反応容器ｌかすぐに使用できるので、試料の迅速分析か可能にな る。何故ならば、免疫論的な反応成分を有する受媒質３か標準化可能で且つまた 調製可能（ｃｏｎｆｅｃｔｉｏｎａｂｌｅ）てあり、使い捨て反応容器１か使用 前に較正されることかないからである。

受媒質３は圧力に対して安定的であってはならない。

何故ならば、使い捨て反応容器１はＨＰＬＣを付与せずに試料の迅速分析を可能 にするからである。受媒質として親和クロマトグラフィーの全ての共通材料か考 慮できる。好ましい受媒質材料はポリメリック砂糖、プラスチック、またはシリ ケートであり、特に好ましい材料はアガローズ（ａｇａｒｏｓｅ）である。

受媒質３に付与された免疫論的反応成分は共有結合的並びに吸着的に受媒質に結 合できる。免疫論的反応成分はハプテン、抗原および抗体を含む群から選択でき る。

ポリクロナール（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ）並びにモノクロナール（ｍｏｎｏｃｌ ｏｎａｌ）抗体か使用できる。

使い捨て反応容器ｌの好ましい設計において、免疫論的反応成分を存する受媒質 ３は２つの分離装置の間に配置され、この上部および（または）下部の分離装置 ２ａ。

２ｂは多孔質フリット（ｆｒｉｔ）である。上部および（または）下部のフリッ ト２ａ、２ｂの多孔性は約０．０５μｍから約１００μｍまでとされ、約０．２ μｍから約１００μｍか好ましく、２μｍの多孔性か特に好ましい。

フリット２ａ、２ｂの材料はプラスチック、金属およびガラスを含む群から選択 され、プラスチックが好ましく、ポリエチレンおよびテフロン（商標）が特に好 ましい。

他の好ましい設計においては、上部および下部の分離装置２ａ、２ｂは２つの等 しい多孔性のフリットである。

他の好ましい設計においては、上部および（または）下部のフリットの層厚さは 約０．０５ｍｍ〜約２闘であり、約０．２ｍｍ〜約２ｍｍが好ましく、約１ｍｍ の層厚さが特に好ましい。

容器材料４は圧力に対して安定してはならない。何故ならば、使い捨て反応容器 ｌは本発明の方法においては高圧を受けないからである。それ故に更に金属のよ うな耐圧材料、その他のガラス、天然材料、プラスチックのような耐圧でない材 料が使い捨て反応容器ｌを製造するのに考慮できる。好ましいプラスチックはポ リエチレン、ボ１１プロピレンおよび（または）ポリスチレンであり、好ましい 金属は多孔質アルミニウムおよびステンレス鋼である。

実際的な目的として、使い捨て反応容器ｌは一端に突出部５を存して、この反応 容器を保持駆動装置内に取付は自動搬送できるようにすることができる。これは 自動化された試料処理装置で使用するのに必要である。

更に、実際的な目的として、使い捨て反応容器Ｉは突出端部と反対側の端部に小 径の連結部を存し、他の使い捨て反応容器とソケット−スイッチ連結するための 連結部を育するのか好ましい。これは例えば幾つかの使い捨て反応容器ｌを直列 状に連結して、第１の容器の出口６か簡単な雌雄連結によって第２の容器の入口 に連結されることを容易にする。

更に、使い捨て反応容器ｌはキャンプ７および９によって閉しる、二とかできる 。

ｉｉＴ述した匣い捨て反応容器ｌを使用する本発明の方法は、一般的な方法に比 へて格段に簡単化され、迅速な定量お、よび定性分析を可能にする。これは、決 定されるへき成分の測定か使い捨て反応容器ｌの使用済み受媒質の事前の較正も しくは再生を必要としないことによって、また、標準溶液の一連の基準測定か全 く必要とされないことによって、一部可能とされる。この簡単容易な取扱いは、 試料およびその他の溶液を通常の研究用器具を使用して、あるいはビペソ１−操 作の自動化によって付与できるようにした結果である。

更に手操作方法、自動操作方法か本発明の反応容器ｌを応用することによって改 善される。このような方法において、試料の付与およびこの方法における他の段 階は自動化した試を斗処理装置によって遂行される。このような処理装置は例え ば］−場における抗体製造のオンライン製造処理制御に使用される。このような 方法においては、試料は約６〜８時間間隔にて自動的に付与され、培養媒体中の 抗体濃度かこの使い捨て反応容器ｌを使用して長時間にわたって迅速且つ簡単に 連続して測定できる。本発明の使い捨て反応容器１を使用する抗体製造の装置か 第２図に概略的に示されている。これにおいて使い捨て反応容器１は自動試料処 理装置の中に含まれている。

本発明の方法は、試料を付与した後に使い捨て反応容器ｌに高圧をかけずに迅速 に遂行できる。しかしながら、例えば遠心力またはポンプ駆動によって低い吸引 力または加圧力か更に素早い遂行を行えるように使用できる。

必要ならば、本発明の方法では幾つかの使い捨て反応容器ｌを直列または並列に 連結できる。これは、例えばそれぞれの単一試料における幾つかのパラメータの 同時測定、幾つかの試料の同時分析を可能にする。

幾つかの使い捨て反応容器の直列的な連結は、例えばアレルギー試験の遂行に有 利である。これにおいては、異なる抗原（アレルゲン）か各側のカラムに付与さ れ、次にこれらのカラムか直列に連結され、アレルゲン反応を成立させるＩｇＥ 級の抗体を含む試料が第１の反応容器に付与される。

試料は異なるアレルゲンを含む異なる反応容器ｌを通して連続して流される。試 料のＩｇＥはアレルギー誘発抗原を含む反応容器内て結合し、例えば蛍光検査に よって検出てきる。このようにして、１つの単体試料か多くの異なる可能性のあ るアレルゲンによって同時に試験できる。

以下の例は本発明を説明するものである。

例　１ 手操作による本発明の方法の実施 第１図に示したようなポリプロピレンて作られた使い捨て反応容器１は以下の成 分を含んていた。すなわち、テフロン（商標）（孔寸法は約２μｍ、層厚さは約 １ｍｍ）で作られた２つのフリット２ａおよび２ｂの間には、０．５ＭのＮａＣ ｌ中の共存結合したポリクロナールのマウスの抗ヒトＩｇＧと橋かけされた市販 のシアノブロマイド活性のアガロースを含む懸濁液約１００μｍか配置される。

この懸濁液の１００μｌは５０μｍの最終受媒質へ７１・体積８を形成する。単 位ｍ１の受媒賀ベット当りの結合能力は約７０μｇのヒトＩｇＧである。

１０ｍＭの燐酸塩緩衝剤ｐＨ７，２，１５０ｍＭのＮａＣｌか平衡緩衝剤（Ｅ　 Ｂ）として使用され、ＩＭのプロピオン酸か溶出緩衝剤（Ｅ　Ｌ）として使用さ れ、１０９６の胎児攬血清（ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ　（Ｆ　ＣＳ　 ）　）を有するＲ　Ｐ　Ｍ　Ｉ媒体か細胞培養媒体（ＣＮ３）として使用された 。

最初に、０５μｇ〜５０μｇのヒトＩｇＧをＣＭに含む５０μｌの試料か反応容 器に付与された。これは１ｍ１のＥＢで洗浄されて溶出液か廃棄され、その後０ ．５ｍｌのＥして溶出された。溶出液は蛍光検査のためにクヴエツトに集められ 、検出装置にて測定された。決定されるへきヒｌ−Ｉ　ｇ　Ｇの試料成分の定量 測定のために、較正曲線か予め設定された。Ｏｆ１ｇ／ｍｌから１ｏｏｏμｇ／ ｍ１まてのＩｇＧ、１１度、好ましく　Ｏｔｔ　ｇ／ｍｌ〜１．００　μｇ／ｍ ｌ、か較正曲線の設定のために使用され、またａ）　紫外線検出装置にて２５０ 〜３００ｎｍの範囲、好ましくは２８０ｎｍでの死滅、 ｂ）　あるいは蛍光検出装置にて２５０〜２９０ｎｍの励起波長および３２０ｎ ｍ以上の放射波長での相対的な蛍光強さ、 か測定された。

マーカー分子か使用されるならば、検出波長はそのマーカーに対して調整される ようになされる。細胞培養媒体単独の測定値か試料の測定値から差し引かれた。

この測定の実際的な遂行において、反応容器ｌを通してのそれぞれの試料の溶出 流れは、最も簡単な場合で重力により発生させることができる。この流れを加速 するために、以下の代替例が考慮できる。すなわち、ａ）　圧力ニこれは最も簡 単な場合で使い捨て注射器を使用して発生でき、注射器はルアーロック（ｌｕｅ ｒ−１ｏｃｋ）連結によって反応容器ｌと連結される。更に、圧力は手操作供給 器のようなその他の器具で発生できる。

ｂ）　真空圧：これは通常の真空ポンプを反応容器の出口に連結して発生できる 。

Ｃ）　遠心力、この変形例においては、試料、洗浄液および溶出液は例えば予め 定めた破断点を有する別の室内に導かれ、適当な遠心力の付加によって予め定め た破断点を経て与えられた遠心力で液体か反応容器へ流される。

例　２ 全自動による本発明の方法の遂行 使用した装置は以下の要素で作られた。すなわちＨＰＬＣ試料形成装置（ＡＢＩ ＭＥＤ　ＡＳＰＥＣ装置）、使い捨て反応容器１、流動セルを備えた蛍光すなわ ち紫外線検出装置、およびデータ処理のためのコンピュータである。

分析は以下のように遂行された。すなわち細胞培養による試料形成が共通の試料 形成装置によって遂行された。フィルタ（ＡＳＰＥＣ装置の）による細胞の分離 および使い捨て反応容器ｌを備えた棚を廃棄位置に位置決めした後、試料が付与 され、反応容器はＥＢで洗浄され、そして反応容器を備えた棚が溶出位置に位置 決めされた。決定されるべき成分の溶出は１段階にて行われた。決定されるべき 成分は溶出溶液中を流れ検出装置に送られ、測定された。使用された体積は例１ の体積と同してあった。

ｐｉｇ、＋ａ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許鵬１８４ＡＯ８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．開口上端および下端を有し、２つの多孔質の分離器装置（２ａ）および（２ ｂ）を収容しており、これらの分離装置は決定されるべき成分を含む液体が浸透 でき、それらの分離装置の間に少なくとも１つの免疫論的な反応成分が受媒質（ ３）に付与されて配置され、受媒質ベッド体積（８）は６００μ１までとされ、 上部および（または）下部の分離装置（２ａ）および（２ｂ）の浸透性が受媒質 ベッドと組み合って液体の流速を制御するようになされた固相の免疫分析のため の使い捨て反応容器（１）。 ２．請求項１による使い捨て反応容器であって、使い捨て反応容器（１）の即時 使用を可能にするために免疫論的な反応成分による受媒質の標準化および調製を 特徴とする使い捨て反応容器。 ３．請求項１または請求項２による使い捨て反応容器であって、受媒質（３）が 圧力に対して安定であってはならない事実を特徴とする使い捨て反応容器。 ４．請求項１から請求項３までの何れか１項による使い捨て反応容器であって、 ポリメリック砂糖、プラスチックまたはシリケートを含む群から受媒質材料（３ ）を選択することを特徴とする使い捨て反応容器。 ５．請求項４による使い捨て反応容器であって、ポリメリック砂糖εしてアガロ ースを特徴とする使い捨て反応容器。 ６．請求項１による使い捨て反応容器であって、受媒質（３）に免疫論的な反応 成分を共有結合または吸着結合することを特徴とする使い捨て反応容器。 ７．請求項６による使い捨て反応容器であって、ハプテン、抗原および抗体を含 む群から免疫論的な反応成分を選択することを特徴とする使い捨て反応容器。 ８．請求項７による使い捨て反応容器であって、ポリクロナール抗体を特徴とす る使い捨て反応容器。 ９．請求項７による使い捨て反応容器であって、モノクロナール抗体を特徴とす る使い捨て反応容器。 １０．請求項１による使い捨て反応容器であって、上部および（または）下部の 分離装置（２ａ，２ｂ）に多孔質フリットまたは膜部材を使用することを特徴と する使い捨て反応容器。 １１．請求項１０による使い捨て反応容器であって、フリット（２ａ，２ｂ）が ０．２μｍ〜１００μｍの多孔性を有することを特徴とする使い捨て反応容器。 １２．請求項１０による使い捨て反応容器であって、フリット（２ａ，２ｂ）が ０．０５ｍｍ〜２ｍｍの層厚さを有することを特徴とする使い捨て反応容器。 １３．請求項１２による使い捨て反応容器であって、層厚さが１ｍｍであること を特徴とする使い捨て反応容器。 １４．請求項１０から請求項１３までの何れか１項による使い捨て反応容器であ って、フリット（２ａ，２ｂ）がプラスチック、金属またはガラスで作られてい ることを特徴とする使い捨て反応容器。 １５．請求項１４による使い捨て反応容器であって、プラスチック材料としてポ リエチレンまたはテフロン（商標）、また、金属として多孔質アルミニウムまた はステンレス鋼を使用することを特徴とする使い捨て反応容器。 １６．請求項１から請求項１５までの何れか１項による使い捨て反応容器であっ て、容器材料（４）が圧力に対して安定であってはならないことを特徴とする使 い捨て反応容器。 １７．請求項１から請求項１５までの何れか１項による使い捨て反応容器であっ て、プラスチック、金属および天然材料を含む群から容器材料（４）が選択され ることを特徴とする使い捨て反応容器。 １８．請求項１５による使い捨て反応容器であって、プラスチック材料としてポ リエチレン、ポリプロピレンおよび（または）ポリスチレンを使用することを特 徴とする使い捨て反応容器。 １９．請求項１から請求項１８までの何れか１項による使い捨て反応容器であっ て、反応容器の一端に形成され、自動搬送のために保持移動装置に反応容器を応 用できるようにする突出部（５）を特徴とする使い捨て反応容器。 ２０．請求項１から請求項１９までの何れか１項による使い捨て反応容器であっ て、突出部（５）と反対端部の容器直径よりも小さな直径の連結部（６）を特徴 とする使い捨て反応容器。 ２１．請求項２０による使い捨て反応容器であって、幾つかの使い捨て反応容器 を直列に連結するために雄雌連結部で反応容器の反対端部を連結できるようにな されたことを特徴とする使い捨て反応容器。 ２２．請求項１から請求項２１までの何れか１項による使い捨て反応容器であっ て、受媒質ベッド体積（８）が５０μｌであることを特徴とする使い捨て反応容 器。 ２３．免疫反応によって決定されるべき成分の測定を行う方法であって、分析さ れるべき試料を請求項１から請求項２２までの何れか１項による使い捨て反応容 器に付与すること、決定されるべき試料の成分を使い捨て反応容器中の免疫論的 な補反応成分と結合させること、および決定されるべき成分の測定を、 ａ）溶出および測定により、または ｂ）免疫論的マーカーにより使い捨て反応容器中の反応を促進させてマーク付け し且つ測定するか、ｃ）決定されるべき成分と匹敵する化合物により、測定する ことを特徴とする方法。 ２４．請求項２３による方法であって、受媒質の事前較正または再生をせずに付 与された反応成分を測定することを特徴とする方法。 ２５．請求項２３または請求項２４による方法であって、通常の研究用器具や自 動ピペット操作によって試料およびその他の溶液を付与することを特徴とする方 法。 ２６．請求項２３または請求項２４による方法であって、試料の付与およびその 他の処理段階を自動化した試料処理装置を使用することを特徴とする方法。 ２７．請求項２６による方法であって、オンライン処理制御装置において自動化 した試料付与を行うことを特徴とする方法。 ２８．請求項２３から請求項２７までの何れか１項による方法であって、更に迅 速に遂行するために、試料付与の後に使い捨て反応容器に小さな吸引力または加 圧力を付与することを特徴とする方法。 ２９．請求項２３から請求項２８までの何れか１項による方法であって、幾つか の使い捨て反応容器を直列または並列に配置することを特徴とする方法。 ３０．請求項２９による方法であって、アレルゲンの測定のために使用すること を特徴とする方法。