JPH06209767A - 動物細胞の凍結保存方法及び凍結保存担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 動物細胞の凍結保存方法及び凍結保存担体を
提供する。 【構成】 保存方法は、動物細胞接着材料を親水性樹脂
又はキトサンとの混合物の形で全表面上に分散して含む
不織布に、動物細胞を付着させて凍結保存することから
なる。凍結保存担体は、前記不織布上に、動物細胞を担
持する。 【効果】 洗浄や回収など処理において取扱が容易な不
織布を用いるので、保存操作が容易になり、細胞に加わ
るストレスが低くなり、保存後の細胞の生存率が高い。
解凍後に不織布をそのまま用いて培養を続行できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、動物細胞の凍結保存方
法及び凍結保存担体に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、遊離した細胞を凍結保存する
方法が知られている。例えば、ディッシュやボトルなど
で培養した細胞を、トリプシン処理によって担体から剥
がし、遠心分離して回収した後、保存液による洗浄と遠
心分離を繰り返す。続いて、保存チューブに細胞を入
れ、保存液でチューブを満たし、フリーザーで冷却した
後で、液体窒素中で保存する方法があった。この方法
は、操作が煩雑な上、トリプシン処理や洗浄の際に、細
胞にストレスがかかるため解凍後の生存率が低いという
欠点があった。マイクロキャリアに細胞を固定した状態
で保存する方法も知られている。すなわち、マイクロキ
ャリアに細胞を培養固定し、これを保存液で置換してか
ら保存チューブに入れ、保存液でチューブを満たし、フ
リーザーで冷却し、液体窒素中で保存する方法である。
この方法によれば、細胞を遊離状態で保存する前記の方
法よりも生存率が向上するが、依然として充分なもので
はなかった。また、マイクロキャリアの粒子が小さいた
め、洗浄や回収工程での取扱が煩雑で難しく、しかもそ
れらの操作中に汚染を受け易いという欠点があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者は、従来技術
の欠点を解消する保存手段を鋭意研究したところ、意外
にも、本発明者等が特開平４−２３７４９４号公報及び
特願平４−１４８５０７号明細書に開示した不織布担体
を用いると、保存のための操作が容易で、細胞に加わる
ストレスが低く、しかも保存後の細胞の生存率が高いこ
とを見出した。本発明は、こうした知見に基づくもので
ある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】従って、本発明は、動物
細胞接着材料を親水性樹脂又はキトサンとの混合物の形
で全表面上に分散して含む不織布に、動物細胞を付着さ
せて凍結保存することを特徴とする、動物細胞の保存方
法に関する。また、本発明は、動物細胞接着材料を親水
性樹脂又はキトサンとの混合物の形で全表面上に分散し
て含む不織布上に、動物細胞を担持した、凍結保存担体
にも関する。

【０００５】本発明では、動物細胞接着材料を親水性樹
脂又はキトサンとの混合物の形で全表面上に分散して含
む不織布を担体として使用する。これらの不織布は、特
開平４−２３７４９４号公報及び特願平４−１４８５０
７号明細書に記載されている。

【０００６】本発明で用いる不織布の構成繊維は特に限
定されないが、親水性繊維を主体とするのが望ましい。
すなわち、不織布の構成繊維中に親水性繊維が５０％以
上含まれていることが望ましい。親水性繊維としては、
例えば、再生セルロース繊維、ポリアミド繊維、タンパ
ク質含有繊維又は天然繊維（例えば、木綿、麻、絹又は
羊毛）を挙げることができる。更に、疎水性繊維（例え
ば、ポリエチレン繊維、ポリプロピレン繊維、アクリル
繊維又はウレタン繊維）から、任意の親水性付与処理に
よって親水性に変性させたものも含まれる。この親水性
付与処理は任意の段階、即ち、不織布形成前の繊維や樹
脂の段階で実施しても、又は不織布形成後に実施しても
よい。

【０００７】親水性繊維の太さは特に制限されるもので
はないが、３〜１００デニールの太いもの、特に１０〜
１００デニールのものを用いるのが好ましい。また、不
織布としてニードルパンチ処理をしたものを用いるのが
好ましい。不織布の繊維密度は０．０２〜０．１ｇ／ｃ
ｍ³ 、好ましくは０．０３〜０．０７ｇ／ｃｍ³ の範囲
にあることが望ましい。

【０００８】本発明で用いる不織布担体に含まれている
動物細胞接着材料は、絹フィブロイン、骨粉、ゼラチ
ン、コラーゲン及び二価陽イオン生成性塩（特には、二
価陽イオン生成性無機塩）からなる群から選ばれる。二
価陽イオン生成性塩（特には、二価陽イオン生成性無機
塩）とは、水中で陰イオンを放出してそれ自体が二価陽
イオンとなるものであり、例えば、アルカリ土類金属
（例えば、カルシウム又はマグネシウム）の炭酸塩、塩
酸塩、硫酸塩又はリン酸塩を挙げることができる。本発
明においては、これらの動物細胞接着材料を１種類単独
で、あるいは２種類以上を組み合わせて用いることがで
きる。

【０００９】前記の動物細胞接着材料との混合物の形で
用いる親水性樹脂は、一般に不織布のバインダーとして
通常用いられている任意の親水性樹脂であり、更に、水
不溶性であることが好ましい。水溶性樹脂を不織布の構
成繊維に含ませた後に、加熱処理や架橋化によって水不
溶性にしてもよい。従って、前記の親水性樹脂として
は、例えば、ポリビニルアルコール、セルロース、でん
ぷん及びこれらの誘導体を挙げることができる。ポリビ
ニルアルコールを用いる場合には、ポリビニルアルコー
ル水溶液を不織布の構成繊維に含浸させた後に、熱処理
又は架橋により不溶化する。

【００１０】前記の動物細胞接着材料との混合物の形で
用いるキトサンは、キチン（β−ポリ−Ｎ−アセチル−
Ｄ−グルコサミン）を濃アルカリ溶液と加熱するか又は
カリウム融解してから、脱アセチル化して得ることので
きる生成物（β−ポリ−Ｄ−グルコサミン）であり、特
に限定されるものではないが、脱アセチル化度が７５％
以上で、０．６重量％Ｌ−乳酸水溶液に０．５重量％の
量で溶解した場合に、溶液粘度が３００〜５０００セン
チポイズになるものが、膜強度の大きな膜を形成するこ
とができるので好ましい。

【００１１】動物細胞接着材料と親水性樹脂との混合物
を用いた不織布は、例えば、親水性繊維を主体とする繊
維ウェブに、前記混合物を含む液体（特には、水）を含
浸させ、そしてその含浸ウェブを乾燥することによって
調製することができる。含浸工程及び乾燥工程は、通常
の不織布製造工程と同様に実施することができる。こう
して、３次元的な網状構造を有する不織布内に動物細胞
接着材料が分散して強固に付着した構造が提供される。
動物細胞接着材料の担持量は特に限定されるものではな
いが、絹フィブロイン、コラーゲン又はゼラチンの場合
には１〜１０ｇ／ｍ² の範囲であるのが好ましく、骨粉
又は二価陽イオン生成性塩の担持量は、１０〜２００ｇ
／ｍ² の範囲であるのが好ましい。

【００１２】動物細胞接着材料とキトサンとの混合物を
用いた不織布は、例えば、キトサンの０．１〜１０％酸
性水溶液（好ましくは、有機酸水溶液）に前記の動物細
胞接着材料を加えて被覆液を生産し、この被覆液で繊維
ウエブを含浸した後、乾燥してキトサンを析出させ、ア
ルカリ（例えば、アルカリ金属水酸化物希水溶液）を加
えてキトサンを不溶化させることによって調製すること
ができる。こうして、キトサン水溶液中に存在した動物
細胞接着材料が、３次元的な不織布の全表面上に不溶性
キトサンによって強固に付着される。

【００１３】基材上のキトサンの担持量は特に限定され
るものではないが、好ましくは０．５〜５０ｇ／ｍ² 、
より好ましくは５〜３０ｇ／ｍ² である。また、前記の
動物細胞接着材料とキトサンとの混合物の担持量は特に
限定されるものではないが、絹フィブロイン、コラーゲ
ン又はゼラチンの場合には１〜１００ｇ／ｍ² の範囲で
あるのが好ましく、骨粉又は二価陽イオン生成性塩とキ
トサンとの混合物の担持量は１０〜２００ｇ／ｍ² の範
囲であるのが好ましい。

【００１４】本発明において、前記の不織布に固定して
保存することのできる動物細胞は、特に限定されるもの
ではないが、例えば、ＢＨＫ、Ｌ９２９、ＣＨＯなどの
遺伝子組換の宿主として用いられる細胞や、ＩＭＲ−９
０細胞のような正常細胞を挙げることができる。前記の
不織布担体へ動物細胞を固定するには、従来の担体と同
様に、例えば、前記の不織布を充填したカラムに動物細
胞懸濁液を流すか、あるいは前記の不織布を動物細胞懸
濁液に浸漬すればよい。

【００１５】細胞担持不織布の凍結保存方法は、不織布
担体を用いることを除けば、従来法と全く同様に実施す
ることができる。例えば、最初に、不織布が浸漬されて
いる培養液を保存液に置き換える。次に、細胞担持不織
布を保存容器に移し、保存容器に保存液を注入し、例え
ば、液体窒素中で凍結保存する。

【００１６】本発明で用いる不織布は、使用する保存容
器の形状に合わせて、大きさを適切に調整することがで
きる。特に、保存容器内部を１つの不織布担体で充填す
るように成形するのが好ましい。例えば、通常の保存チ
ューブを使用する場合には、不織布を円柱状に成形す
る。

【００１７】解凍も、不織布担体を用いることを除け
ば、従来法と全く同様に実施することができる。また、
本発明で用いる不織布は、細胞培養用にも優れているの
で、解凍後の細胞を他の担体へ移し変えることなく、そ
のまま不織布上で培養することができ、便利である。

【００１８】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。実施例１ 後記参考例１（特願平４−１４８５０７号明細書の実施
例１）に記載の不織布を直径２２ｍｍの円形に裁断した
ものを複数枚準備し、これらにリン酸緩衝溶液（ＰＢ
Ｓ）を加え、オートクレーブで滅菌した（１２１℃；１
５分間）。各不織布を１２ウエルディッシュの各ウエル
に移した。この時の不織布重量（乾燥重量）は各ウエル
毎に０．１ｇであった。次に、ＤＭＥ（Dulbecco's Mod
ified Eagle ）培地に１０％ウシ胎児血清を加えた培養
用培地で３回リンスした後、５％ＣＯ₂ インキュベータ
中で３７℃にて２４時間放置した。続いて、Ｌ９２９細
胞をＤＭＥ培地に分散し、５×１０⁵ ／ｍｌの濃度に調
整したものを、各ウエルに１ｍｌづつ接種した。インキ
ュベータ中で４時間静置した後、新しいウエルに移し、
前記の培養用培地２ｍｌを加えて培養を行った。５日後
に、細胞が定常期となった段階で、前記の培養用培地に
１０％ジメチルスルホキシドを加えて調製した保存液で
３回リンスし、不織布を保存チューブに移し、前記保存
液を満たした。−３０℃のフリーザーで１時間、更に−
８５℃のディープフリーザーで２４時間冷却した後、液
体窒素中で保存した。７日後に、不織布を取り出し、３
７℃の恒温水浴中で解凍し、１２ウエルディッシュに移
し、前記の培養用培地で３回リンスした。細胞生存率
は、解凍した不織布をトリプシン処理して細胞を剥が
し、得られた細胞数を血球計算盤で計数して求めた。ま
た、増殖性は、別の解凍した不織布に前記の培養用培地
を付与し、生存していた細胞を５日間培養した後の細胞
数を血球計算盤で計数して求めた。結果を表１に示す。

【００１９】実施例２ 不織布として、特開平４−２３７４９４号公報の実施例
７に記載の不織布を用いること以外は、前記実施例１に
記載の操作を繰り返して、細胞生存率及び増殖性を調べ
た。結果を表１に示す。

【００２０】比較例１ 細胞固定及び保存用担体として、実施例１で使用したウ
レタン含浸ニードルパンチフェルト（前記実施例１の不
織布において、キトサン、フィブロイン及びゼラチンを
含む被覆液で処理する前のもの）を用いること以外は、
前記実施例１に記載の操作を繰り返して細胞生存率及び
増殖性を調べた。結果を表１に示す。

【００２１】比較例２ 細胞固定及び保存用担体として、牛皮由来のＩ型コラー
ゲンで処理したマイクロキャリアー〔セルロース発泡
体；商品名「セルスノ−ＣＸ」；キリン麦酒〕を用いる
こと以外は、前記実施例１に記載の操作を繰り返して、
細胞生存率及び増殖性を調べた。結果を表１に示す。

【００２２】比較例３ 細胞固定及び保存用担体として、ポリエチレンイミンで
処理したマイクロキャリアー〔セルロース発泡体；商品
名「セルスノ−ＥＸ」；キリン麦酒〕を用いること以外
は、前記実施例１に記載の操作を繰り返して、細胞生存
率及び増殖性を調べた。結果を表１に示す。

【００２３】

【表１】

【００２４】表１において、＊印は計測不能を意味す
る。但し、血球計算盤で計測可能な細胞数は１×１０⁴
／ｍｌ以上であるので、＊印は、細胞数が１×１０⁴ ／
ｍｌ以下であることを意味する。なお、比較例１及び比
較例３でも、解凍後に５日間培養を行っており、それで
も計測不能の結果が出ているので、凍結時に死滅したも
のと推測される。

【００２５】実施例３ 後記参考例１に記載の不織布を直径６ｍｍの円形に裁断
したものを複数枚準備し、これらにＰＢＳを加え、オー
トクレーブで滅菌した（１２１℃；１５分間）。１２ウ
エルディッシュの各ウエルに３枚ずつの不織布を入れ
た。次に、ＤＭＥ培地に１０％ウシ血清を加えた増殖用
培地で３回リンスした後、５％ＣＯ₂ インキュベータ中
で３７℃にて２４時間放置した。続いてＢＨＫ−２１細
胞をＤＭＥ培地に分散し、２．４×１０⁶ ／ｍｌの濃度
に調整したものを各ウエルに２ｍｌ加えて培養を開始し
た。細胞が対数的に増殖している３日後、定常期に相当
する５日後、及び７日後に細胞数測定を行うと共に、実
施例１と同様の方法で凍結保存した。いずれも１０日後
に解凍し、各々の細胞数を計数し、細胞生存率を求め
た。また、解凍後、保存液を除去し、新たな増殖用培地
を用いて３日間培養し、その細胞数を求めた。結果を表
２に示す。

【００２６】

【表２】

【００２７】参考例１ レーヨン繊維ウェブ１７０ｇ／ｍ² （平均繊維径＝１５
デニール：平均繊維長＝７６mm）にニードルパンチ処理
（針密度２００本／cm² ）を施してニードルパンチフェ
ルトを得た。ポリウレタンエマルジョン（固形分３５
％）（メルシー５８９：東洋ポリマー）２０重量部とエ
ポキシ系架橋剤（ＡＤ−Ｃ−６５：東洋ポリマー）０．
５重量部とを含み、蒸留水で全体を１００重量部とした
バインダー液を用い、ステンレススチールマングルによ
り、スリット幅０．７mmで絞り、前記のニードルパンチ
フェルトに均一に含浸させた後、１５０℃で架橋乾燥さ
せた（バインダー量＝２５ｇ／ｍ² ）。次に、キトサン
１％溶液〔キトサン（脱アセチル化率＝８５〜９５％；
和光純薬工業（株））１ｇを、蒸留水９８．４ｇ及びＬ
−乳酸（和光純薬工業（株））０．６ｇで、５８℃にて
溶液化して調製〕７０重量部、３％フィブロイン水溶液
２０重量部及び８％ゼラチン水溶液１０重量部からなる
被覆液を用い、ステンレススチールマングルにより、ス
リット幅０．８mmで絞り、前記のウレタン含浸ニードル
パンチフェルトに均一に含浸させた。１５０℃で乾燥さ
せた後、４％ＮａＯＨ水溶液で処理してキトサンを不溶
化し、水洗してからもう一度１５０℃で乾燥させて担体
を得た（目付＝２７０ｇ／ｍ² ；厚み＝３．０mm）。

【００２８】

【発明の効果】本発明によれば、洗浄や回収など処理に
おいて取扱が容易な不織布を用いるので、保存操作が容
易になり、細胞に加わるストレスが低くなる。従って、
保存後の細胞の生存率が高い。また、解凍後に不織布を
そのまま用いて培養を続行することができる。

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【手続補正書】

【提出日】平成５年１月１８日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】実施例３ 後記参考例１に記載の不織布を直径６ｍｍの円形に裁断
したものを複数枚準備し、これらにＰＢＳを加え、オー
トクレーブで滅菌した（１２１℃；１５分間）。１２ウ
エルディッシュの各ウエルに３枚ずつの不織布を入れ
た。次に、ＤＭＥ培地に１０％ウシ血清を加えた増殖用
培地で３回リンスした後、５％ＣＯ_２インキュベータ中
で３７℃にて２４時間放置した。続いてＢＨＫ−２１細
胞をＤＭＥ培地に分散し、２．４×１０^５／ｍｌの濃度
に調整したものを各ウエルに２ｍｌ加えて培養を開始し
た。細胞が対数的に増殖している３日後、定常期に相当
する５日後、及び７日後に細胞数測定を行うと共に、実
施例１と同様の方法で凍結保存した。いずれも１０日後
に解凍し、各々の細胞数を計数し、細胞生存率を求め
た。また、解凍後、保存液を除去し、新たな増殖用培地
を用いて３日間培養し、その細胞数を求めた。結果を表
２に示す。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２６】

【表２】 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年１月２５日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】実施例３ 後記参考例１に記載の不織布を直径６ｍｍの円形に裁断
したものを複数枚準備し、これらにＰＢＳを加え、オー
トクレーブで滅菌した（１２１℃；１５分間）。１２ウ
エルディッシュの各ウエルに３枚ずつの不織布を入れ
た。次に、ＤＭＥ培地に１０％ウシ血清を加えた増殖用
培地で３回リンスした後、５％ＣＯ_２インキュベータ中
で３７℃にて２４時間放置した。続いてＢＨＫ−２１細
胞をＤＭＥ培地に分散し、２．４×１０^５／ｍｌの濃度
に調整したものを各ウエルに２ｍｌ加えて培養を開始し
た。細胞が対数的に増殖している３日後、定常期に相当
する５日後、及び７日後に細胞数測定を行うと共に、実
施例１と同様の方法で凍結保存した。いずれも１０日後
に解凍し、各々の細胞数を計数し、細胞生存率を求め
た。また、解凍後、保存液を除去し、新たな増殖用培地
を用いて３日間培養し、その細胞数を求めた。結果を表
２に示す。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２６】

【表２】

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 動物細胞接着材料を親水性樹脂又はキト
   サンとの混合物の形で全表面上に分散して含む不織布
   に、動物細胞を付着させて凍結保存することを特徴とす
   る、動物細胞の保存方法。
2. 【請求項２】 動物細胞接着材料を親水性樹脂又はキト
   サンとの混合物の形で全表面上に分散して含む不織布上
   に、動物細胞を担持した、凍結保存担体。