JPH06125785A - セファロスポラン酸誘導体の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 デアセチルセファロスポラン酸誘導体を、酵
素の作用によりセファロスポラン酸誘導体に変換する方
法を提供する。 【構成】 デアセチルセファロスポラン酸誘導体に、酢
酸エステルの存在下で、酵素（例えば、ロドトルラ属に
属する微生物またはその調製物）を作用させて、セファ
ロスポラン酸誘導体を製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、セフアロスポリン系抗
生物質製造における有用中間体であるセファロスポラン
酸誘導体の新規製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】これまで、前記化２式で示されるセファ
ロスポラン酸誘導体の製造としては、７−アミノセファ
ロスポリンＣ（７−ＡＣＡ）を原料とし、化学合成法ま
たは酵素法による７−位の化学修飾が行なわれてきた。
しかしながら、この化学修飾の際にはかなりの量の副生
物が生じており、目的物質の収率低下をきたしている。
この副生物の代表化合物は、３−位が脱アセチル化され
たデアセチルセファロスポラン酸誘導体（前記化１）で
あり、再利用されず廃棄されていた。すなわち、副生物
であるデアセチルセファロスポラン酸（前記化１）をセ
ファロスポラン酸誘導体（前記化２）に変換して、有効
利用する方法は見出されていない。

【０００３】さらに、７−ＡＣＡ（前記化２におけるＲ
が水素原子）の化学合成法、酵素法、または発酵法によ
る生産における副生物であるデアセチル−７−ＡＣＡ
（前記化１におけるＲが水素原子）の、７−ＡＣＡへの
変換による有効利用の方法も見出されていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、セファロス
ポリン系抗生物質、またはその合成原料中間体の製造上
において、副生物を有効再利用するという課題を解決す
るものである。すなわち、デアセチルセファロスポラン
酸誘導体の３−位にアセチル基を酵素反応にて導入し、
セファロスポラン酸に変換する方法を提供することを目
的とするものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するため、デアセチルセファロスポラン酸誘導
体をセファロスポラン酸誘導体に変換する手法について
検討してきた。その結果、前記化１式で示されるデアセ
チルセファロスポラン酸誘導体を、酢酸エステルの存在
下で酵素を作用させることにより、化２式で示されるセ
ファロスポラン酸誘導体に変換することを見出し、本発
明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、化１式で示されるデ
アセチルセファロスポラン酸誘導体に、酢酸エステルの
存在下で酵素（例えば、ロドトルラ属に属する微生物ま
たはその調製物）を作用させ、化２式で示されるセファ
ロスポラン酸誘導体を製造する方法である。

【０００７】この化１式および化２式におけるＲは水素
原子、Ｒ¹ −ＣＯ基またはＲ² −ＳＯ₂ 基を表し、Ｒ¹
は水素原子、アミノ基、カルボニル基、カルボキシル基
により１個または複数個置換された炭素数１〜６の直鎖
状あるいは分枝状のアルキル基、ハロゲン原子、シアノ
原子、炭素数１〜３のアルコキシ基、置換または無置換
のアリールオキシ基、イミノ基、炭素数１〜４のアルキ
リデン基あるいは複素環基により置換された炭素数１〜
３のアルキル基、炭素数１〜４の直鎖状あるいは分枝状
のアルコキシ基、置換あるいは無置換のアラルオキシ基
を表し、Ｒ² は炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜
３のハロゲン置換アルキル基、置換あるいは無置換のア
リール基を表す。

【０００８】さらに詳しく説明すると、Ｒ¹ のアルキル
基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル
基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチ
ル基、ヘキシル基等がある。置換アルキル基としては、
例えば、クロロメチル基、２，２，２−トリクロロエチ
ル基、シアノメチル基、シアノエチル基、メトキシエチ
ル基、エトキシエチル基、メトキシプロピル基、フェノ
キシメチル基、トリルオキシメチル基、ｐ−クロロフェ
ノキシ基、ｐ−ニトロフェノキシ基、（２−チエニル）
メチル基、（１−（１Ｈ）−テトラゾール）メチル基、
（２−アミノ−４−チアゾリル）メチル基、（２−フリ
ル）メチル基、（２−アミノ−４−チアゾリル）メトキ
シイミノメチル基、（２−アミノ−４−チアゾリル）プ
ロピリデンメチル基等がある。アルコキシ基としては、
メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキ
シ基、ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基等がある。アラルオ
キシ基としては、例えば、ベンジルオキシ基、ｐ−ニト
ロベンジルオキシ基等がある。Ｒ² のアルキル基として
は、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等があ
る。ハロゲン置換アルキル基としては、例えば、トリフ
ルオロメチル基等がある。

【０００９】本発明に用いられる酵素としては、セファ
ロスポラン酸の３位のアセチル基に作用するエステラー
ゼ（別名アセチルハイドロラーゼ）またはリパーゼ等で
あればよく、微生物もしくは動物由来のいずれのもので
あってもよい。さらに、酵素はそのままでもよく、さら
には、天然高分子物質または合成高分子に固定化された
ものを用いることができる。酵素の具体例としては、市
販のエステラーゼまたはリパーゼであり、さらに、本発
明に用いる酵素として最も適しているのは、ロドトルラ
属に属する微生物またはその調製物である。具体的に
は、ロドトルラグルチニス（ Rhodotorula glutinis )
３８Ｂ１（微工研菌寄第１３０３９号）を使うことがで
きる。本菌は京都府の土壌中より分離したもので、上記
の番号で微生物工業技術研究所に寄託されている。本菌
の菌学的性質は、以下に示すとおりである。

【００１０】３８Ｂ１菌株： ＹＭ培地における形態； 液体培地；４８時間培養にて、（３−５）×（４−６）
μｍの球形ないし卵形で、単一細胞で存在。２１日培養
にて、毛状ではない沈殿を生じ、クリーム色。 寒天培地；４８時間培養にて、（３−５）×（４−８）
μｍの球形ないし長い卵形で、単一細胞および複数の対
の細胞で存在。２１日培養にて、オレンジ色となり、表
面はなめらかで、わずかに光沢あり。 仮性菌糸と真性菌糸について；コーンミール寒天培地お
よびポテトデキストロース寒天培地において、好気およ
び嫌気条件下にて、仮性および真性菌糸はなし。 胞子について；射出胞子、分節胞子、エンドスポアー、
厚膜胞子はともに観察されない。 有性胞子について；Gorodkowa 培地およびコーンミール
寒天培地にて有性胞子は観察されない。 発酵能；Ｄ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、シューク
ロース、マルトース、セロビオース、α，α−トレハロ
ース、ラクトース、メリビオース、ラフィノース、メレ
ズィトース、イヌリン、可溶性デンプン、メチルα−Ｄ
−グルコピラノシドに対する発酵能はすべてない。

【００１１】同化能； Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ Ｌ−ソルボース − シュークロース ＋ マルトース ＋ セロビオース − α，α−トレハロース ＋ ラクトース − メリビオース − ラフィノース ± メレズィトース ＋ イヌリン ＋ 可溶性デンプン − キシロース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−アラビノース ＋ Ｄ−リボース ＋ Ｌ−ラムノース − エタノール ＋ グリセロール ＋ エリスリトール − リビトール ＋ ガラクチトール − Ｄ−マンニトール ＋ Ｄ−グルシトール − メチルα−Ｄ−グルコピラノシド ＋ サリシン ＋ 乳 酸 ＋ コハク酸 ＋ クエン酸 − myo −イノシトール − Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトン ＋ Ｄ−グルコサミン − メタノール − キシリトール ＋ 硫酸アンモニウム ＋ 硝酸カリウム ＋ エチルアミン − カダベリン ＋ Ｌ−リジン ＋

【００１２】その他の特性； ０．０１％シクロヘキシマイド生育 ＋ ０．１％シクロヘキシマイド生育 ＋ ５０％グルコース生育 − １％酢酸生育 − 油脂分解性 − 生酸性 − ３７℃での生育 ＋ アルブチン加水分解 − ウレアーゼ活性 − デンプン生産性 − ＮａＣｌ耐性 −

【００１３】以上の菌学的性質を飯塚、後藤による「酵
母の分類同定法，第２版（１９７３）」および J.Lodde
r による「 The Yeasts, A Taxonomic Study, 2nd ed.,
（１９７０）」にしたがって分類すると、３８Ｂ１菌株
はロドトルラ グルチニス（Rhodotorula glutinis )と
同定された。

【００１４】本発明における反応方法は、化１式に示さ
れるデアセチルセファロスポラン酸誘導体と、酵素、も
しくは微生物またはその調製物とを、酢酸エステルの存
在下にて接触させることにより、化２式で示されるセフ
ァロスポラン酸誘導体を得るものである。微生物または
その調製物とは、具体的には、前記のロドトルラ属に属
する微生物を培養した培養物、そこから集めた菌体処理
物（例えば、菌体の破砕物または菌体より分離抽出した
酵素）、さらに、菌体または菌体処理物を適当な方法に
より、例えば、天然高分子物質または合成高分子に固定
化したものを示す。

【００１５】本発明で使用される微生物の培養は、公知
の方法に準じて行なうことができる。使用する培地は、
一般酵母の栄養源として公知のものが利用でき、グルコ
ース、フラクトース、エタノール、シュークロース、マ
ルトース、酢酸、オレイン酸エチル等の炭素源、硝酸、
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、アンモニア等の
窒素源、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキ
ス、ポテト等の有機栄養源、Ｌ−バリン、Ｌ−グルタミ
ン酸等のアミノ酸、リン酸、マグネシウム、カリウム、
鉄、コバルト、マンガン等の無機栄養源を適宜組合せて
使用できる。培地のｐＨは３〜１０の範囲で選べばよ
く、培養温度は１５℃から４０℃、好ましくは２５℃か
ら３２℃である。培養日数は１日から１０日の範囲で活
性が最大となるまで培養すればよい。

【００１６】本発明における反応条件を次に説明する。
反応は、水性溶媒、非水溶性有機溶媒のどちらにおいて
も進行させることができる。水性溶媒とは、水、各種塩
類からなる緩衝液、およびこれらとプロパノール等のア
ルコール溶媒、アセトン等のケトン溶媒、アセトニトリ
ル等のニトリル溶媒、１，４−ジオキサン等のエーテル
溶媒、ジメチルスルホキシド等の極性非プロトン性溶媒
等の水溶性有機溶媒との混合溶媒、さらには、水性溶媒
と非水溶性有機溶媒との混合溶媒（二相系となってもよ
い）を意味する。また、原料の種類によっては溶解性を
増すことにより反応速度を上昇させるために、界面活性
剤を添加してもよい。

【００１７】反応条件において最も重要なことは、反応
におけるアセチル基の供与体として、酢酸エステルを添
加することである。酢酸エステルとしては、酢酸メチ
ル、酢酸エチル等が安価で使いやすい。この酢酸エステ
ルの反応系への添加濃度は、０．０００１から１００％
の間で選べばよく、上記に記載の反応溶媒そのものとし
て選ぶこともできる。酢酸エステルがアセチル基の供与
体として有効であるのは、化１式にて示されるデアセチ
ルセファロスポラン酸誘導体のアセチル化が、酵素によ
るエステル交換反応によるからであると考えられる

【００１８】反応温度は、原料の種類、反応溶媒の種
類、その他の条件により必ずしも一定ではないが、通常
は約０〜８０℃の間であり、好ましくは３〜３５℃の間
を選択する。反応における化１式で示される原料の添加
濃度は、約０．００１〜７０重量％の間であり、好まし
くは０．１〜４０重量％の間を選択する。反応ｐＨは３
〜１１であり、好ましくは４〜８の間を選択する。反応
時間は、０．５〜３００時間の間を選択する。反応によ
り消費される化１式で示されるデアセチルセファロスポ
ラン酸誘導体は、連続的あるいは間歇的に補充し、反応
液中の濃度が上記の範囲に維持されるように添加しても
よい。

【００１９】このようにして得られる反応混合物から、
目的化合物を回収するには、先ずｐＨを７〜８に調整
後、遠心分離あるいは濾過等により微生物等の不溶物を
除去し、希硫酸もしくは希塩酸にて酸性となし、０〜１
０℃条件下にて６〜４８時間静置し、生成した結晶を濾
種する。目的化合物は、必要により再結晶、メタノール
等のアルコール類による洗浄、または吸着樹脂やイオン
交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーにより精製
し、高純度のものとすることができる。

【００２０】

【実施例】次に、実施例によって本発明をさらに詳細に
説明する。ただし、これらの実施例は、本発明の範囲を
限定するものではない。 実施例１ 酢酸ナトリウム２％、塩化アンモニウム０．３％、リン
酸２カリウム０．３％、リン酸１カリウム０．２％、硫
酸マグネシウム（７水塩）０．０２％、ビタミン混合液
０．１％、金属混合液０．２％（ビタミン混合液とは、
チアミン塩酸塩１mg、リボフラビン２mg、パントテン酸
カルシウム２mg、ピリドキシン塩酸塩２mg、ビオチン
０．１mg、ｐ−アミノベンゾイック酸１mg、ニコチン酸
２mgを１００mlの蒸留水に溶かしたものである。金属混
合液とは、硫酸マグネシウム７水塩５ｇ、塩化マンガン
４水塩４１０mg、塩化第１鉄３５０mg、塩化亜鉛２００
mg、塩化カルシウム１００mg、塩化コバルト６水塩２０
mg、塩化銅２水塩２０mg、モリブデン酸ナトリウム２水
塩１０mg、ホウ酸ナトリウム１０水塩１０mgを１００ml
の蒸留水に溶かしたものである。）を含み、ｐＨを７．
０にした殺菌培地５００mlに、予め同培地で培養したロ
ドトルラ グルチニス ３８Ｂ１株を２％移植し、２８
℃で３６時間培養した。培養後、遠心分離にて菌体を集
め、生理食塩水で洗浄した。この菌体を、０．１Ｍクエ
ン酸カリウム−ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）
にて、さらに洗浄した。このようにして得た菌体約２．
５ｇ-dcwと酢酸メチル９５ml、および２２６mgのデアセ
チル−７−アミノセファロスポラン酸（化１式における
Ｒが水素原子）を含む水溶液５mlを混合し、１０℃で３
０時間反応させた。反応終了後、ｐＨを７．０とし、遠
心分離により菌体を除去した上清液を減圧濃縮し、酢酸
メチルを完全にとばした。この濃縮液を蒸留水に溶解さ
せた後、合成吸着剤であるＨＰ−２０のカラムに吸着さ
せた。蒸留水−１０％メタノール水のグラジエントによ
り、目的物質を溶出させた。目的物質を含む画分を集
め、減圧濃縮（３５℃以下）し、５℃にて結晶化させ
た。２４時間静置後、生成した結晶を濾取し、メタノー
ルで洗浄後、乾燥し、７−アミノセファロスポラン酸１
０９mgを得た。化合物の同定は、標品のクロマトデータ
およびＮＭＲ、ＩＲ、ＵＶ等のスペクトルデータと比較
して行った。

【００２１】実施例２ 実施例１と同様にして培養し、洗浄したロドトルラ グ
ルチニス ３８Ｂ１の菌体（２０mg-dcw）に、３．３ｍ
Ｍデアセチル−７−アミノセファロスポラン酸（化１式
におけるＲが水素原子）溶液（ McIlvaine buffer,ｐＨ
５．５）０．３ml、酢酸メチル０．２ml、さらに各種有
機溶媒０．５mlを添加し、３０℃で３時間反応させた。
反応終了後、遠心分離により菌体を除去した上清液をＨ
ＰＬＣにより、生成された７−アミノセファロスポラン
酸（７−ＡＣＡ）を定量した。結果は表１のようにな
り、アセトンおよびアセトニトリルにおいて、溶媒の添
加効果がみられた。

【００２２】

【表１】

【００２３】実施例３ 実施例１と同様にして培養し、洗浄したロドトルラ グ
ルチニス ３８Ｂ１の菌体（４０mg-dcw）に、６．６ｍ
Ｍデアセチル−７−アミノセファロスポラン酸溶液（ M
cIlvaine buffer,ｐＨ５．５）０．６ml、酢酸メチル
０．４ml、アセトニトリル１mlを添加し、各種反応温度
で５時間反応させた。反応終了後、遠心分離により菌体
を除去した上清液をＨＰＬＣにより、生成された７−Ａ
ＣＡを定量した。結果は図１のようになり、１８℃付近
が最適であった。

【００２４】実施例４ 実施例１と同様にして培養し、洗浄したロドトルラ グ
ルチニス ３８Ｂ１の菌体（４０mg-dcw）に、４０ｍＭ
デアセチル−７−アミノセファロスポラン酸溶液（ McI
lvaine buffer,ｐＨ５．５）０．１mlと酢酸メチルまた
は酢酸エチルを各種濃度に添加し（最終液量は蒸留水に
て２．０mlに合わせた）、２５℃で３時間反応させた。
反応終了後、遠心分離により菌体を除去した上清液をＨ
ＰＬＣにより、生成された７−ＡＣＡを定量した。結果
は表２のようになり、酢酸メチル９５％添加で反応が最
大となった。

【００２５】

【表２】

【００２６】実施例５ 実施例１における培地において、酢酸ナトリウム２％の
代わりに、各種炭素源を１％とした殺菌培地５０ml（５
００ml坂口フラスコ使用）を用いて、ロドトルラ グル
チニス ３８Ｂ１菌株を２８℃、２日培養した。培養
後、遠心分離にて菌体を集め、実施例１と同様に洗浄し
た。この菌体４０mg-dcwに、４０ｍＭデアセチル−７−
アミノセファロスポラン酸溶液（ McIlvaine buffer,ｐ
Ｈ５．５）０．１mlと酢酸メチル１．９mlを添加し、２
５℃で３時間反応させた。反応終了後、遠心分離により
菌体を除去した上清液をＨＰＬＣにより、生成された７
−ＡＣＡを定量した。結果は表３のようになり、酢酸ナ
トリウムを炭素源とした際、最大活性を示した。

【００２７】

【表３】

【００２８】実施例６ 実施例１における培地において、酢酸ナトリウム２％お
よび塩化アンモニウム０．３％の代わりに、炭素源とし
て酢酸ナトリウムまたはフラクトース各１％、および窒
素源として塩化ナトリウム、ヒドロキシ−Ｌ−プロリ
ン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−システ
イン各０．３％を入れた殺菌培地５０ml（５００ml坂口
フラスコ使用）を用いて、ロドトルラ グルチニス ３
８Ｂ１菌株を２８℃、２日培養した。培養後、遠心分離
にて菌体を集め、実施例１と同様に洗浄した。この菌体
４０mg-dcwに、４０ｍＭデアセチル−７−アミノセファ
ロスポラン酸溶液（ McIlvaine buffer,ｐＨ５．５）
０．１mlと酢酸メチル１．９mlを添加し、２５℃で３時
間反応させた。反応終了後、遠心分離により菌体を除去
した上清液をＨＰＬＣにより、生成された７−ＡＣＡを
定量した。結果は表４のようになり、酢酸ナトリウムと
塩化ナトリウムを組合せた場合において、最大活性を示
した。

【００２９】

【表４】

【００３０】実施例７ 実施例１と同様にして培養し、洗浄したロドトルラ グ
ルチニス ３８Ｂ１菌体約２．８ｇ-dcwと酢酸メチル９
５ml、および３６９mgの７−（５−アミノ−５−カルボ
キシ−１−オキソペンチル）デアセチルセファロスポラ
ン酸（化１式におけるＲ¹ が４−アミノ−４−カルボキ
シブチル基：デアセチルセファロスポランＣ）を含む水
溶液５mlを混合し、１０℃で２２時間反応させた。反応
終了後、実施例１と同様に、除菌、ＨＰ−２０カラムク
ロマトグラフィー、結晶化（ｐＨ３）を行い、７−（５
−アミノ−５−カルボキシ−１−オキソペンチル）セフ
ァロスポラン酸（セファロスポリンＣ）１９１mgを得
た。化合物の同定は、標品のクロマトデータおよびＮＭ
Ｒ、ＩＲ、ＵＶ等のスペクトルデータと比較して行っ
た。

【００３１】実施例８ 実施例１と同様に培養し、洗浄したロドトルラ グルチ
ニス ３８Ｂ１菌体約２．１ｇ-dcwと酢酸メチル９９m
l、および３００mgの７β−〔（Ｚ）−２−（２−アミ
ノチアゾール−４−イル）−２−メトキシイミノアセチ
ル〕デアセチルセファロスポラン酸〔化１式におけるＲ
が（２−アミノ−４−チアゾリル）メトキシイミノアセ
チル基〕を混合し、十分攪拌しながら、１０℃で２０時
間反応させた。反応終了後、実施例１と同様に、除菌、
ＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー、結晶化（ｐＨ
３）を行い、７β−〔（Ｚ）−２−（２−アミノチアゾ
ール−４−イル）−２−メトキシイミノアセチル〕セフ
ァロスポラン酸１２７mgを得た。化合物の同定は、標品
のクロマトデータおよびＮＭＲ、ＩＲ、ＵＶ等のスペク
トルデータと比較して行った。

【００３２】

【発明の効果】本発明を利用することにより、セファロ
スポリン系抗生物質の製造中間体であるセファロスポラ
ン酸誘導体を、対応するデアセチルセファロスポラン酸
誘導体より、酢酸エステルの存在下で、酵素反応を用い
て、常温常圧下で製造できるため経済上非常に有利であ
る。本発明は、詳細に、かつ、特にその具体化において
は、実施例をもって述べてきたが、本発明の精神と範囲
から外れることがないならば、本発明の中で各種の変化
や変更ができることは、当該技術分野のものには明らか
であろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例３における反応温度による影響
の結果を示すグラフである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記化１式で示されるデアセチルセファ
   ロスポラン酸誘導体に、酢酸エステルの存在下で酵素を
   作用させることを特徴とする下記化２式で示されるセフ
   ァロスポラン酸誘導体の製造法。 【化１】 （式中、Ｒは水素原子、Ｒ¹ −ＣＯ基またはＲ² −ＳＯ
   ₂ 基を表し、Ｒ¹ は水素原子、アミノ基、カルボニル
   基、カルボキシル基により１個または複数個置換された
   炭素数１〜６の直鎖状あるいは分枝状のアルキル基、ハ
   ロゲン原子、シアノ原子、炭素数１〜３のアルコキシ
   基、置換または無置換のアリールオキシ基、イミノ基、
   炭素数１〜４のアルキリデン基あるいは複素環基により
   置換された炭素数１〜３のアルキル基、炭素数１〜４の
   直鎖状あるいは分枝状のアルコキシ基、置換あるいは無
   置換のアラルオキシ基、Ｒ² は炭素数１〜３のアルキル
   基、炭素数１〜３のハロゲン置換アルキル基、置換ある
   いは無置換のアリール基を表す。） 【化２】 （式中、Ｒは上記化１と同一である。）
2. 【請求項２】 酵素がロドトルラ属に属する微生物また
   はその調製物である請求項１に記載の製造法。