JPH0580051A - 凝集イムノアツセイ - Google Patents
凝集イムノアツセイInfo
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- JPH0580051A JPH0580051A JP5549892A JP5549892A JPH0580051A JP H0580051 A JPH0580051 A JP H0580051A JP 5549892 A JP5549892 A JP 5549892A JP 5549892 A JP5549892 A JP 5549892A JP H0580051 A JPH0580051 A JP H0580051A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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-
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 臨床的診断等に有用なミクロ粒子を用いる凝
集イムノアッセイの改良を目的とする。 【構成】 ミクロ粒子の反応系に、イムノアッセイの感
度および信号を有意に増強する有効量のポリビニルピロ
リドンを添加することを含む。
集イムノアッセイの改良を目的とする。 【構成】 ミクロ粒子の反応系に、イムノアッセイの感
度および信号を有意に増強する有効量のポリビニルピロ
リドンを添加することを含む。
Description
【０００１】本発明は、ミクロ粒子に基づく凝集イムノ
アッセイの改良のためのＰＶＰの使用に関し、結果とし
てこれらのイムノアッセイの感度および信号を有意に増
強するものである。
アッセイの改良のためのＰＶＰの使用に関し、結果とし
てこれらのイムノアッセイの感度および信号を有意に増
強するものである。
【０００２】更に特定的には、本発明は、凝集検出測定
による体液試料中の標的分子検出のためのミクロ粒子に
基づくイムノアッセイにおいて、改良を与えるもので、
この改良は、前記試料にイムノアッセイの感度および信
号を増大するに有効な量のポリビニルピロリドン（ＰＶ
Ｐ）を添加することを含む。
による体液試料中の標的分子検出のためのミクロ粒子に
基づくイムノアッセイにおいて、改良を与えるもので、
この改良は、前記試料にイムノアッセイの感度および信
号を増大するに有効な量のポリビニルピロリドン（ＰＶ
Ｐ）を添加することを含む。
【０００３】診断的アッセイにおけるミクロ粒子の使用
は、今では一般に周知である。該アッセイ方法は、均質
および不均質型の両者において、大分子（例えば蛋白質
類、ホルモン類、酵素類、抗体類、免疫複合体類）およ
び小分子（例えば、治療用薬剤、誤用薬剤およびそれら
の代謝物）の両者に対し、競合および直接接合アッセイ
において使用され得る。種々のポリマー性ミクロ粒子系
が開発され、それらは、生物学的に興味ある化合物の共
有的または非共有的結合を許容する（例えば、これらは
米国特許第４，４８０，０４２の２欄にて論じられてい
る）。広く使用されているものは、種々の大きさの、ス
チレンと共重合されるモノマーからなる粒子である。
は、今では一般に周知である。該アッセイ方法は、均質
および不均質型の両者において、大分子（例えば蛋白質
類、ホルモン類、酵素類、抗体類、免疫複合体類）およ
び小分子（例えば、治療用薬剤、誤用薬剤およびそれら
の代謝物）の両者に対し、競合および直接接合アッセイ
において使用され得る。種々のポリマー性ミクロ粒子系
が開発され、それらは、生物学的に興味ある化合物の共
有的または非共有的結合を許容する（例えば、これらは
米国特許第４，４８０，０４２の２欄にて論じられてい
る）。広く使用されているものは、種々の大きさの、ス
チレンと共重合されるモノマーからなる粒子である。
【０００４】イムノアッセイにおいてミクロ粒子技術の
種々の実施態様は、一般には免疫的結合対の一成分のた
めの担体である固体支持体を有している。免疫化学反応
は、粒子の分散状態の変化に影響を与え、あるいは粒子
が単に固体支持体上の決定因子の単離にのみ働く場合に
おいては、第２の標識が使用され得る。結合対の相互作
用の結果として、粒子が特異的に交差結合（またはそれ
を阻害）される場合、例えば、混濁度、白濁測定、角度
異方性、準弾性的光散乱等、信号検出のために使用され
得る種々の分析方法がある。このような利用可能な種々
の凝集検出技術のみならず、該方法は、数種の装置に対
して種々の自動化の程度をもって適用される。
種々の実施態様は、一般には免疫的結合対の一成分のた
めの担体である固体支持体を有している。免疫化学反応
は、粒子の分散状態の変化に影響を与え、あるいは粒子
が単に固体支持体上の決定因子の単離にのみ働く場合に
おいては、第２の標識が使用され得る。結合対の相互作
用の結果として、粒子が特異的に交差結合（またはそれ
を阻害）される場合、例えば、混濁度、白濁測定、角度
異方性、準弾性的光散乱等、信号検出のために使用され
得る種々の分析方法がある。このような利用可能な種々
の凝集検出技術のみならず、該方法は、数種の装置に対
して種々の自動化の程度をもって適用される。
【０００５】診断におけるミクロ粒子の初期の応用は、
体液中の免疫学的決定因子の検出であった（Ｈｏｗａｎ
ｉｔｚ Ｊ．Ｈ．の、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ−Ｉｎｎ
ｏｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｌａｂｅｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂ Ｍｅｄ，
Ｖｏｌ １１２，７７５−７７９頁（１９８８）；Ｈｅ
ｃｈｅｍｙ Ｋ．Ｅ．およびＭｉｃｈａｅｌｓｏｎ
Ｅ．Ｅ．の、ＬａｔｅｘＰａｒｔｉｃｌｅ Ａｓｓａｙ
ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第
Ｉ部，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ
（１９８４年６月））。興味ある抗原に対して選択的な
凝集剤は、粒子表面に（共有的または吸着的に）結合さ
れ得た。該抗原が、凝集剤の結合に利用可能な数個の決
定因子を有している場合に、交差結合および検出が最適
となる。試料中に抗原が存在しない場合、粒子分散物の
状態に変化を検出しないであろう。この方法は、低分子
量ハプテンの検出に対しては最適化されていない。しか
しながら、２価の凝集剤が可溶性結合成分である場合に
は、分析対象物は、凝集剤結合部位について、担体上で
ハプテンと競合する。従って、試料中にハプテンが存在
すると粒子の交差結合を阻害する。こうして得られる感
度の改善は、誤用および治療用薬剤等のハプテンならび
にヒト絨毛膜ゴナドトロピン等の抗原の両者に対する診
断的試験において、ミクロ粒子の有用性を増大させた
（米国特許第３，８５７，９３１号）。これらのアッセ
イは、凝集の検出に依存するものであるが、可溶性凝集
剤により得られた感度は、凝集剤が、臨床的に有意な範
囲より過剰でない場合には、信号を犠牲にする。
体液中の免疫学的決定因子の検出であった（Ｈｏｗａｎ
ｉｔｚ Ｊ．Ｈ．の、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ−Ｉｎｎ
ｏｖａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｌａｂｅｌ Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ Ｌａｂ Ｍｅｄ，
Ｖｏｌ １１２，７７５−７７９頁（１９８８）；Ｈｅ
ｃｈｅｍｙ Ｋ．Ｅ．およびＭｉｃｈａｅｌｓｏｎ
Ｅ．Ｅ．の、ＬａｔｅｘＰａｒｔｉｃｌｅ Ａｓｓａｙ
ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，第
Ｉ部，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ
（１９８４年６月））。興味ある抗原に対して選択的な
凝集剤は、粒子表面に（共有的または吸着的に）結合さ
れ得た。該抗原が、凝集剤の結合に利用可能な数個の決
定因子を有している場合に、交差結合および検出が最適
となる。試料中に抗原が存在しない場合、粒子分散物の
状態に変化を検出しないであろう。この方法は、低分子
量ハプテンの検出に対しては最適化されていない。しか
しながら、２価の凝集剤が可溶性結合成分である場合に
は、分析対象物は、凝集剤結合部位について、担体上で
ハプテンと競合する。従って、試料中にハプテンが存在
すると粒子の交差結合を阻害する。こうして得られる感
度の改善は、誤用および治療用薬剤等のハプテンならび
にヒト絨毛膜ゴナドトロピン等の抗原の両者に対する診
断的試験において、ミクロ粒子の有用性を増大させた
（米国特許第３，８５７，９３１号）。これらのアッセ
イは、凝集の検出に依存するものであるが、可溶性凝集
剤により得られた感度は、凝集剤が、臨床的に有意な範
囲より過剰でない場合には、信号を犠牲にする。
【０００６】凝集増強剤として、ポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）および種々の洗浄剤の使用が示唆されてい
る。米国特許第４，４８０，０４２号第１０欄およびＧ
ａｌｌｏｗａｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｅｓｔｓ ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，２９頁（Ｓｅｒａｄｙ
ｎ，Ｉｎｃ．インディアナポリス，１９８８）参照。ミ
クロ粒子の分散物の安定化、ならびに“非−特異的凝
集”の阻害は、界面活性剤およびポリビニルピロリドン
（ＰＶＰ）を含む水可溶性ポリマーに帰因するとされて
いる。Ｂａｎｇｓ，Ｌ．Ｂ．，Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｌａｔ
ｅｘ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，２５−２６頁および５５−
５６頁（Ｓｅｒａｄｙｎ Ｉｎｃ．，１９８４）。低濃
度、すなわち最終濃度０．４％未満のＰＶＰ−３６０
は、薬剤誤用試験用のＯＮＴＲＡＫ（商標）（Ｒｏｃｈ
ｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ．）として商業的に販売されているキャピラリに媒介
されるアグルチノグラフスライド（ａｇｇｌｕｔｉｎｏ
ｇｒａｐｈｉｃ ｓｌｉｄｅ）に使用されるラテックス
ミクロ粒子試薬中に組入れられている。（この明細書お
よび特許請求の範囲において称される最終濃度は、すべ
ての試薬に試料を加えて含む完全に作り上げられた反応
混合物について言及している。また全て百分率は、重量
／体積を特に述べない限り示している。
ル（ＰＥＧ）および種々の洗浄剤の使用が示唆されてい
る。米国特許第４，４８０，０４２号第１０欄およびＧ
ａｌｌｏｗａｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ｏｆ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｅｓｔｓ ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，２９頁（Ｓｅｒａｄｙ
ｎ，Ｉｎｃ．インディアナポリス，１９８８）参照。ミ
クロ粒子の分散物の安定化、ならびに“非−特異的凝
集”の阻害は、界面活性剤およびポリビニルピロリドン
（ＰＶＰ）を含む水可溶性ポリマーに帰因するとされて
いる。Ｂａｎｇｓ，Ｌ．Ｂ．，Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｌａｔ
ｅｘ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，２５−２６頁および５５−
５６頁（Ｓｅｒａｄｙｎ Ｉｎｃ．，１９８４）。低濃
度、すなわち最終濃度０．４％未満のＰＶＰ−３６０
は、薬剤誤用試験用のＯＮＴＲＡＫ（商標）（Ｒｏｃｈ
ｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ．）として商業的に販売されているキャピラリに媒介
されるアグルチノグラフスライド（ａｇｇｌｕｔｉｎｏ
ｇｒａｐｈｉｃ ｓｌｉｄｅ）に使用されるラテックス
ミクロ粒子試薬中に組入れられている。（この明細書お
よび特許請求の範囲において称される最終濃度は、すべ
ての試薬に試料を加えて含む完全に作り上げられた反応
混合物について言及している。また全て百分率は、重量
／体積を特に述べない限り示している。
【０００７】図面の簡単な説明 図１は、例１において作られるＴＨＣ検量線のデータを
図示的に例示する。図２は、例２に従った種々の濃度に
おけるＰＶＰ３６０の使用によるＴＨＣアッセイの最適
化を示す。図３は、例３に従ったＰＶＰ−４０無添加に
対するＰＶＰ−３６０およびＰＶＰ−４０の使用による
ベンゾジアゼピンアッセイに対する検量線の最適化を示
す。図４は、例４による、種々の濃度のＰＶＰ−４０の
使用によるベンゾジアゼピンに対する競合的ミクロ粒子
凝集反応の増強を示す。
図示的に例示する。図２は、例２に従った種々の濃度に
おけるＰＶＰ３６０の使用によるＴＨＣアッセイの最適
化を示す。図３は、例３に従ったＰＶＰ−４０無添加に
対するＰＶＰ−３６０およびＰＶＰ−４０の使用による
ベンゾジアゼピンアッセイに対する検量線の最適化を示
す。図４は、例４による、種々の濃度のＰＶＰ−４０の
使用によるベンゾジアゼピンに対する競合的ミクロ粒子
凝集反応の増強を示す。
【０００８】本発明により、ミクロ粒子に基づくイムノ
アッセイへの有効量のＰＶＰの添加が、反応動力学の増
強を生じ、これにより精度の増大した信号が得られ、ま
た改善された感度および全体の信号対ノイズ比が得られ
ることが、予期せずに見出された。充分な濃度で使用さ
れた場合、ＰＶＰは、単に分散物の安定剤としてよりも
反応増強剤として作用する。いずれの分子量のＰＶＰも
本発明において使用され得る。
アッセイへの有効量のＰＶＰの添加が、反応動力学の増
強を生じ、これにより精度の増大した信号が得られ、ま
た改善された感度および全体の信号対ノイズ比が得られ
ることが、予期せずに見出された。充分な濃度で使用さ
れた場合、ＰＶＰは、単に分散物の安定剤としてよりも
反応増強剤として作用する。いずれの分子量のＰＶＰも
本発明において使用され得る。
【０００９】本発明において使用されるミクロ粒子試薬
は、免疫学的結合対の一成分より被覆されたミクロ粒子
が組込まれ、ここで結合対は、興味ある物質に対して診
断的に選択性である。該ミクロ粒子は、単一分散型に保
たれる。相補的結合相手の存在下での動力学的相互作用
において、ミクロ粒子凝集物は、光学密度の変化を生じ
る。反応動力学の増強は、精度の増大した信号および感
度の改善されたアッセイを生じる。検量線について有意
な傾斜が得られ、定量化を可能とする。
は、免疫学的結合対の一成分より被覆されたミクロ粒子
が組込まれ、ここで結合対は、興味ある物質に対して診
断的に選択性である。該ミクロ粒子は、単一分散型に保
たれる。相補的結合相手の存在下での動力学的相互作用
において、ミクロ粒子凝集物は、光学密度の変化を生じ
る。反応動力学の増強は、精度の増大した信号および感
度の改善されたアッセイを生じる。検量線について有意
な傾斜が得られ、定量化を可能とする。
【００１０】本発明は、粒子担体により媒介される特異
的な分析対象物−凝集剤結合の増強を与え、これによっ
て、ハプテンおよび抗原の検出に応用するための、充分
に臨床的な感度をもった診断的アッセイの設計を可能と
する。ヒト体液中の特異的な代表的分析対象物は、例え
ば、Δ9 −カルボキシテトラヒドロカンナビノール（Ｃ
ＯＯＨ−ＴＨＣ）、ジアゼパム、ヒト絨毛膜ゴナドトロ
ピン、およびヒトガンマグロブリンを含む。
的な分析対象物−凝集剤結合の増強を与え、これによっ
て、ハプテンおよび抗原の検出に応用するための、充分
に臨床的な感度をもった診断的アッセイの設計を可能と
する。ヒト体液中の特異的な代表的分析対象物は、例え
ば、Δ9 −カルボキシテトラヒドロカンナビノール（Ｃ
ＯＯＨ−ＴＨＣ）、ジアゼパム、ヒト絨毛膜ゴナドトロ
ピン、およびヒトガンマグロブリンを含む。
【００１１】一般的に、ＰＶＰの濃度の増大は、感度お
よび信号の増大をもたらす。更に、先に注記したように
ＰＶＰの分子量の増大によっても同様な効果が達成され
る。ＰＶＰは、平均分子量、例えばＰＶＰ−４０（平均
Ｍ．Ｗ．＝４０ｋＤ）、ＰＶＰ−３６０（平均Ｍ．Ｗ．
＝３６０ｋＤ）等により異なった大きさの級において典
型的に商業的に利用可能である。これらの標準的商業品
の級は、ポリマーの分子量のかなり広い分布からなるで
あろう。本発明によれば、低分子量の級のＰＶＰ（例え
ばＰＶＰ−４０）は、最終濃度約３％から有効であり、
一方高分子量（例えば、ＰＶＰ−３６０）は０．６％の
量から有効である。分子量の混合は、異なる分子量の有
益な効果を平均されたものに対応して生ずる傾向があ
り、ある場合には相乗効果様の増強を生じ、他のＰＶＰ
との組合せにおいて所定ＰＶＰのより少量の使用で優位
性を与え得る。
よび信号の増大をもたらす。更に、先に注記したように
ＰＶＰの分子量の増大によっても同様な効果が達成され
る。ＰＶＰは、平均分子量、例えばＰＶＰ−４０（平均
Ｍ．Ｗ．＝４０ｋＤ）、ＰＶＰ−３６０（平均Ｍ．Ｗ．
＝３６０ｋＤ）等により異なった大きさの級において典
型的に商業的に利用可能である。これらの標準的商業品
の級は、ポリマーの分子量のかなり広い分布からなるで
あろう。本発明によれば、低分子量の級のＰＶＰ（例え
ばＰＶＰ−４０）は、最終濃度約３％から有効であり、
一方高分子量（例えば、ＰＶＰ−３６０）は０．６％の
量から有効である。分子量の混合は、異なる分子量の有
益な効果を平均されたものに対応して生ずる傾向があ
り、ある場合には相乗効果様の増強を生じ、他のＰＶＰ
との組合せにおいて所定ＰＶＰのより少量の使用で優位
性を与え得る。
【００１２】かくして、ＰＶＰ−３６０は、同じ濃度に
おいてＰＶＰ−４０より大きい反応の加速を与える。例
えば、ＴＨＣのアッセイにおいて、ＰＶＰ−３６０は最
終濃度０．６９％で充分に作用する（図２参照）。１．
５０％以後の濃度においては、加速度合の増大はなくな
る。ＰＶＰ−４０の場合には、最終反応混合物中の３．
２７％の濃度は、１．３１％のＰＶＰに対するものの３
倍以上の吸収信号を与える（図４参照）。同じ３．２７
％のＰＶＰ−４０濃度は、しかしながら、０．７７％の
ＰＶＰ−３６０の添加が与える増強に一致する（図３と
比較）。
おいてＰＶＰ−４０より大きい反応の加速を与える。例
えば、ＴＨＣのアッセイにおいて、ＰＶＰ−３６０は最
終濃度０．６９％で充分に作用する（図２参照）。１．
５０％以後の濃度においては、加速度合の増大はなくな
る。ＰＶＰ−４０の場合には、最終反応混合物中の３．
２７％の濃度は、１．３１％のＰＶＰに対するものの３
倍以上の吸収信号を与える（図４参照）。同じ３．２７
％のＰＶＰ−４０濃度は、しかしながら、０．７７％の
ＰＶＰ−３６０の添加が与える増強に一致する（図３と
比較）。
【００１３】本発明の好適な実施態様において、使用さ
れるＰＶＰは平均分子量約３６０ｋＤを有し、また最終
濃度で少なくとも約０．６％添加される。
れるＰＶＰは平均分子量約３６０ｋＤを有し、また最終
濃度で少なくとも約０．６％添加される。
【００１４】場合により、高および低分子量のものを同
時に使用して利点が得られるであろう。例えば、Ｏｌｙ
ｍｐｕｓ分析装置での使用のため調製されたベンソジア
ゼピンアッセイ試薬においては（例３）、抗体および希
釈剤収容器（Ｒ１）中のＰＶＰ−３６０の濃度が約１．
１８％を越えると、該装置はＰＶＰ含有試薬の正確なピ
ペットができなかった。Ｒ１に対して２．０％の濃度ま
でのＰＶＰ−４０の添加（１．３１％の最終濃度）およ
びＲ１への１．１７５％の濃度までのＰＶＰ−３６０の
添加（０．７７％の最終濃度）は、許容できる動力学お
よび良好なピペット精度を与えた（図３）。
時に使用して利点が得られるであろう。例えば、Ｏｌｙ
ｍｐｕｓ分析装置での使用のため調製されたベンソジア
ゼピンアッセイ試薬においては（例３）、抗体および希
釈剤収容器（Ｒ１）中のＰＶＰ−３６０の濃度が約１．
１８％を越えると、該装置はＰＶＰ含有試薬の正確なピ
ペットができなかった。Ｒ１に対して２．０％の濃度ま
でのＰＶＰ−４０の添加（１．３１％の最終濃度）およ
びＲ１への１．１７５％の濃度までのＰＶＰ−３６０の
添加（０．７７％の最終濃度）は、許容できる動力学お
よび良好なピペット精度を与えた（図３）。
【００１５】信号および感度の増強度の大きさは、当然
ながら各アッセイに固有な特徴、および例えば抗体の親
和性等の内部因子ならびに装置の限界等の外部因子に反
映する。しかしながら、図２および４に取上げたような
最適化グラフから認識されるように、当業者は、容易に
ＰＶＰ分子量の級、濃度、またはそれらの組合せがいず
れの特定のアッセイ系または装置に対して最適であるよ
うな選択を行なうことができる。
ながら各アッセイに固有な特徴、および例えば抗体の親
和性等の内部因子ならびに装置の限界等の外部因子に反
映する。しかしながら、図２および４に取上げたような
最適化グラフから認識されるように、当業者は、容易に
ＰＶＰ分子量の級、濃度、またはそれらの組合せがいず
れの特定のアッセイ系または装置に対して最適であるよ
うな選択を行なうことができる。
【００１６】濃度の上限は、凝集反応を損い始める点、
またはアッセイ操作において他の実際上の困難性を与え
るところにあり、通常、過度の粘性効果、また場合によ
り使用する装置に依存する。
またはアッセイ操作において他の実際上の困難性を与え
るところにあり、通常、過度の粘性効果、また場合によ
り使用する装置に依存する。
【００１７】本発明は改良されたイムノアッセイ試薬お
よび方法は、凝集反応によりもたらされる変化の測定の
ための手段となる方法の影響を受け易いイムノアッセイ
の型式において便利に使用され得る。人手および自動化
装置試験の両者ともに、このような凝集検出分析のため
に好適に採用される。典型的には、自動化装置は、試薬
に添加する各試薬の適量をピペットで取るための複数の
試薬容器または保管容器を用いて操作される。主題であ
る凝集アッセイ等のイムノアッセイについて、このこと
は少なくとも２つの容器を通常含み；典型的には１つは
抗体試薬用、他は対応する抗原性決定因子が結合するミ
クロ粒子用である。希釈剤、緩衝溶液および／または試
料の適切な処理のための他の添加剤を入れた追加の容器
／保管容器が装置内にあってもよい。
よび方法は、凝集反応によりもたらされる変化の測定の
ための手段となる方法の影響を受け易いイムノアッセイ
の型式において便利に使用され得る。人手および自動化
装置試験の両者ともに、このような凝集検出分析のため
に好適に採用される。典型的には、自動化装置は、試薬
に添加する各試薬の適量をピペットで取るための複数の
試薬容器または保管容器を用いて操作される。主題であ
る凝集アッセイ等のイムノアッセイについて、このこと
は少なくとも２つの容器を通常含み；典型的には１つは
抗体試薬用、他は対応する抗原性決定因子が結合するミ
クロ粒子用である。希釈剤、緩衝溶液および／または試
料の適切な処理のための他の添加剤を入れた追加の容器
／保管容器が装置内にあってもよい。
【００１８】当然のことながら、本発明はこれらの容器
の１つまたはそれ以上に適切な量のＰＶＰを組み入れ、
試料中に有効な最終濃度が達成されるようにして便宜よ
く実施できる。従って、本発明の目的は、凝集検出測定
による体液試料中の標的分子を検出するためのミクロ粒
子に基づくイムノアッセイ用診断キットを提供すること
を一つとして含み、前記標的分子に対して選択的な抗体
を含んでなる試薬を収容する第１の容器、前記標的分子
に対して選択的な免疫的に活性なハプテンまたは抗原が
結合されたミクロ粒子を含んでなる試薬を収容する第２
の容器を含み、改良点においていずれかの容器または２
つの組合せ中に、前記イムノアッセイの感度および信号
を増大させるに有効量のＰＶＰを含ませる。但し、過剰
量のＰＶＰがミクロ粒子含有試薬には有害であろうこと
を考えると、ＰＶＰをミクロ粒子の含まれない相補的免
疫試薬に入れることが好ましいであろう。この状況のも
とに、本発明は、標的分子に対して選択的な抗体および
前記イムノアッセイの感度および信号を増大させるに有
効な量のＰＶＰを含む、ミクロ粒子に基づくイムノアッ
セイ用試薬を提供する。
の１つまたはそれ以上に適切な量のＰＶＰを組み入れ、
試料中に有効な最終濃度が達成されるようにして便宜よ
く実施できる。従って、本発明の目的は、凝集検出測定
による体液試料中の標的分子を検出するためのミクロ粒
子に基づくイムノアッセイ用診断キットを提供すること
を一つとして含み、前記標的分子に対して選択的な抗体
を含んでなる試薬を収容する第１の容器、前記標的分子
に対して選択的な免疫的に活性なハプテンまたは抗原が
結合されたミクロ粒子を含んでなる試薬を収容する第２
の容器を含み、改良点においていずれかの容器または２
つの組合せ中に、前記イムノアッセイの感度および信号
を増大させるに有効量のＰＶＰを含ませる。但し、過剰
量のＰＶＰがミクロ粒子含有試薬には有害であろうこと
を考えると、ＰＶＰをミクロ粒子の含まれない相補的免
疫試薬に入れることが好ましいであろう。この状況のも
とに、本発明は、標的分子に対して選択的な抗体および
前記イムノアッセイの感度および信号を増大させるに有
効な量のＰＶＰを含む、ミクロ粒子に基づくイムノアッ
セイ用試薬を提供する。
【００１９】好ましくは、ＰＶＰは、付加的に使用され
るのであれば希釈剤／緩衝剤試薬中に入れられる。この
場合、凝集検出測定による体液試料中の標的分子を検出
するためのミクロ粒子に基づくイムノアッセイ用診断キ
ットであって、前記標的分子に対して選択的な抗体を含
んでなる試薬を収容する第１の容器、前記標的分子に対
して選択的な免疫的に活性化されたハプテンを結合する
ミクロ粒子を含んでなる試薬を収容する第２の容器、お
よび希釈剤水溶液を含んでなる試薬を収容する第３の容
器を含み、前記容器の一つまたはそれらの組合せ中に、
前記イムノアッセイの感度および信号を増大させるに有
効量のＰＶＰを含んでなるキットが適用されるであろ
う。試薬または診断キットにおいて使用されるＰＶＰ
は、好ましくは約３６０ｋＤの平均分子量を有し、前記
イムノアッセイにおいて少なくとも約０．６％の最終濃
度を与えるに充分な量をもって使用される。
るのであれば希釈剤／緩衝剤試薬中に入れられる。この
場合、凝集検出測定による体液試料中の標的分子を検出
するためのミクロ粒子に基づくイムノアッセイ用診断キ
ットであって、前記標的分子に対して選択的な抗体を含
んでなる試薬を収容する第１の容器、前記標的分子に対
して選択的な免疫的に活性化されたハプテンを結合する
ミクロ粒子を含んでなる試薬を収容する第２の容器、お
よび希釈剤水溶液を含んでなる試薬を収容する第３の容
器を含み、前記容器の一つまたはそれらの組合せ中に、
前記イムノアッセイの感度および信号を増大させるに有
効量のＰＶＰを含んでなるキットが適用されるであろ
う。試薬または診断キットにおいて使用されるＰＶＰ
は、好ましくは約３６０ｋＤの平均分子量を有し、前記
イムノアッセイにおいて少なくとも約０．６％の最終濃
度を与えるに充分な量をもって使用される。
【００２０】
【実施例】以下の例は、発明の例示的実施態様を示すも
のである。
のである。
【００２１】例１ テトラヒドロカンナビノイド・アッセイ トランス−ｒａｃ−１−〔〔（６ａ，７，１０，１０ａ
−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−
３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−
イル（カルボニル）オキシ〕−２，５−ピロリジンジオ
ンの調製 ５０ｍＬのエチルアセテート／メチレンクロライド中の
１．２６ｇ（３．６７ｍ ｍｏｌｅ）の１１−ｎｏｒ−
Δ8 −ＴＨＣ−９−カルボン酸溶液に、１．６８ｇ（１
４．７ｍ ｍｏｌｅ）のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミ
ドおよび２．１０ｇ（１１．０ｍ ｍｏｌｅ）の１−
（３−ジメチル−アミノプロピル）３−エチルカルボジ
イミド塩酸を加えた。該反応物を室温にて１６時間攪拌
した。該反応混合物を、１Ｎ塩酸（３×１００ｍＬ）、
水（３×１００ｍＬ）および飽和食塩水（１００ｍＬ）
にて洗浄した。有機相をＮａ2 ＳＯ4 上にて乾燥させ、
減圧下で濃縮した。シリカゲル上でのクロマトグラフィ
（フラッシュ、２インチ×６インチ）。ヘキサン中の４
０％（ｖ／ｖ）エチルアセテートにより溶出して１．４
１ｇ（８７％）の所望のＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルを得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳは、構造に無
盾なく得られた。トランス−ｒａｃ−１−〔〔（６ａ，
７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシー
６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−イル）カルボニル〕オキシ〕−
２，５−ピロリジンジオン（カンナビノイド）のウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）への接合は：参考文献：Ｉ．
Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５１，５４６３−５４６５（１
９８６）。
−テトラヒドロ−１−ヒドロキシ−６，６−ジメチル−
３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−
イル（カルボニル）オキシ〕−２，５−ピロリジンジオ
ンの調製 ５０ｍＬのエチルアセテート／メチレンクロライド中の
１．２６ｇ（３．６７ｍ ｍｏｌｅ）の１１−ｎｏｒ−
Δ8 −ＴＨＣ−９−カルボン酸溶液に、１．６８ｇ（１
４．７ｍ ｍｏｌｅ）のＮ−ヒドロキシ−スクシンイミ
ドおよび２．１０ｇ（１１．０ｍ ｍｏｌｅ）の１−
（３−ジメチル−アミノプロピル）３−エチルカルボジ
イミド塩酸を加えた。該反応物を室温にて１６時間攪拌
した。該反応混合物を、１Ｎ塩酸（３×１００ｍＬ）、
水（３×１００ｍＬ）および飽和食塩水（１００ｍＬ）
にて洗浄した。有機相をＮａ2 ＳＯ4 上にて乾燥させ、
減圧下で濃縮した。シリカゲル上でのクロマトグラフィ
（フラッシュ、２インチ×６インチ）。ヘキサン中の４
０％（ｖ／ｖ）エチルアセテートにより溶出して１．４
１ｇ（８７％）の所望のＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステルを得た。ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳは、構造に無
盾なく得られた。トランス−ｒａｃ−１−〔〔（６ａ，
７，１０，１０ａ−テトラヒドロ−１−ヒドロキシー
６，６−ジメチル−３−ペンチル−６Ｈ−ジベンゾ
〔ｂ，ｄ〕ピラン−９−イル）カルボニル〕オキシ〕−
２，５−ピロリジンジオン（カンナビノイド）のウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）への接合は：参考文献：Ｉ．
Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５１，５４６３−５４６５（１
９８６）。
【００２２】材料 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、フラクションＶ、試薬
級、カンナビノイド誘導体、分子量４４１．５２ｍｇ／
ｍＭ、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝溶液ｐＨ＝７．５（ＫＰｉ緩衝溶
液）、カンナビノイドの保存溶液（５ｍｇ／ｍＬ）：２
ｍＬのＤＭＳＯ中の１０ｍｇのカンナビノイド誘導体、
透析膜２５，０００ＭＷＣＯ。
級、カンナビノイド誘導体、分子量４４１．５２ｍｇ／
ｍＭ、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、５０ｍＭ
リン酸カリウム緩衝溶液ｐＨ＝７．５（ＫＰｉ緩衝溶
液）、カンナビノイドの保存溶液（５ｍｇ／ｍＬ）：２
ｍＬのＤＭＳＯ中の１０ｍｇのカンナビノイド誘導体、
透析膜２５，０００ＭＷＣＯ。
【００２３】方法 接合されるＢＳＡを１．２５ｍＬのＫＰｉ緩衝溶液中に
１２５ｍｇ溶解させて調製された（１００ｍｇ ＢＳＡ
／ｍＬ緩衝液）。一旦蛋白質を溶解させ、該溶液を氷浴
中で冷却した。電磁攪拌プレート上で混合しつつ、該蛋
白質溶液にＤＭＳＯ（１．８７５ｍＬ）を滴々加え、次
いでこれを室温にした。この時点でカンナビノイドの貯
留溶液が新たに調製される（上記参照）。カンナビノー
ルの貯留溶液（０．１６７ｍＬ）をＤＭＳＯ／緩衝溶液
中の蛋白質に滴々加えた。該反応物を室温にて一夜攪拌
した。過剰のＤＭＳＯおよび非結合ハプテンを、拡大し
た透析系（合計で１０００万倍以上）にて除去した。接
合体を、まず３５ｍＬのＫＰｉ緩衝溶液で希釈された１
５ｍＬのＤＭＳＯに対し、次いで４５ｍＬのＫＰｉ緩衝
溶液で希釈された５ｍＬのＤＭＳＯに対して室温にて透
析した。次いで、透析を４℃にてＫＰｉ緩衝溶液に対し
て継続した。回収された接合体は、蛋白質濃度を２８０
ｎｍにて評価された。
１２５ｍｇ溶解させて調製された（１００ｍｇ ＢＳＡ
／ｍＬ緩衝液）。一旦蛋白質を溶解させ、該溶液を氷浴
中で冷却した。電磁攪拌プレート上で混合しつつ、該蛋
白質溶液にＤＭＳＯ（１．８７５ｍＬ）を滴々加え、次
いでこれを室温にした。この時点でカンナビノイドの貯
留溶液が新たに調製される（上記参照）。カンナビノー
ルの貯留溶液（０．１６７ｍＬ）をＤＭＳＯ／緩衝溶液
中の蛋白質に滴々加えた。該反応物を室温にて一夜攪拌
した。過剰のＤＭＳＯおよび非結合ハプテンを、拡大し
た透析系（合計で１０００万倍以上）にて除去した。接
合体を、まず３５ｍＬのＫＰｉ緩衝溶液で希釈された１
５ｍＬのＤＭＳＯに対し、次いで４５ｍＬのＫＰｉ緩衝
溶液で希釈された５ｍＬのＤＭＳＯに対して室温にて透
析した。次いで、透析を４℃にてＫＰｉ緩衝溶液に対し
て継続した。回収された接合体は、蛋白質濃度を２８０
ｎｍにて評価された。
【００２４】カンナビノイド−ＢＳＡ接合体を含む感作
ミクロ粒子の調製：材料 カルボキシル化ポリスチレンミクロ粒子（直径０．１−
０．１３ｕｍ、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ社製）、Ｎ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール（ＮＨＢ；Ｈ2 Ｏ）、１−シクロヘキ
シル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド
メト−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）、トライト
ンＸ−１００、カンナビノイド−ＢＳＡ接合体、５０ｍ
Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．６、ＢＳＡフラクショ
ンＶ試薬級、１０ｍＭＫＰｉ緩衝溶液、ｐＨ７．５、
０．１％ナトリウムアジド、および０．１％トライトン
Ｘ−１００（ミクロ粒子保存緩衝溶液）。
ミクロ粒子の調製：材料 カルボキシル化ポリスチレンミクロ粒子（直径０．１−
０．１３ｕｍ、Ｓｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ社製）、Ｎ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール（ＮＨＢ；Ｈ2 Ｏ）、１−シクロヘキ
シル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミド
メト−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）、トライト
ンＸ−１００、カンナビノイド−ＢＳＡ接合体、５０ｍ
Ｍ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ８．６、ＢＳＡフラクショ
ンＶ試薬級、１０ｍＭＫＰｉ緩衝溶液、ｐＨ７．５、
０．１％ナトリウムアジド、および０．１％トライトン
Ｘ−１００（ミクロ粒子保存緩衝溶液）。
【００２５】方法 製造者より供給を受けた状態のカルボキシル化ミクロ粒
子（固形分１０％の２．０ｍＬ）を、洗浄剤を交換する
ために洗浄した。脱イオン水中の０．１％トライトンＸ
−１００を、体積にて１：１，０００，０００以上の希
釈となるように使用した。０．１％トライトンＸ−１０
０中の洗浄ラテックスを、５００ｎｍにおけるラテック
ス濃度の標準曲線により、０．１％トライトンＸ−１０
０中に固形分３％となるよう調整した。
子（固形分１０％の２．０ｍＬ）を、洗浄剤を交換する
ために洗浄した。脱イオン水中の０．１％トライトンＸ
−１００を、体積にて１：１，０００，０００以上の希
釈となるように使用した。０．１％トライトンＸ−１０
０中の洗浄ラテックスを、５００ｎｍにおけるラテック
ス濃度の標準曲線により、０．１％トライトンＸ−１０
０中に固形分３％となるよう調整した。
【００２６】ＮＨＢの貯留溶液は、１１０ｍｇのＮＨＢ
を２．２ｍＬのＤＭＦに溶解させ、これに脱イオン水
（２．２ｍＬ）を加えて調製した（２５ｍｇＮＨＢ／ｍ
Ｌ）。急速に攪拌しつつ、調製されたミクロ粒子溶液
（６．７ｍＬ）に、室温にてＮＨＢ溶液（０．４２ｍ
Ｌ）を急速に滴下した。該溶液を１０分間攪拌し、その
間にＣＭＣの貯留溶液を調製した。
を２．２ｍＬのＤＭＦに溶解させ、これに脱イオン水
（２．２ｍＬ）を加えて調製した（２５ｍｇＮＨＢ／ｍ
Ｌ）。急速に攪拌しつつ、調製されたミクロ粒子溶液
（６．７ｍＬ）に、室温にてＮＨＢ溶液（０．４２ｍ
Ｌ）を急速に滴下した。該溶液を１０分間攪拌し、その
間にＣＭＣの貯留溶液を調製した。
【００２７】ＣＭＣの保存溶液は、３００ｍｇのＣＭＣ
を６．０ｍＬの脱イオン水に溶解して調製した（５０ｍ
ｇ ＣＭＣ／ｍＬ）。急速に攪拌しつつ、０．５８／ｍ
Ｌを上述のように調製されたミクロ粒子溶液に急速に滴
下して加えた。この添加に続けて、該反応物を室温にて
３時間攪拌した。過剰の活性化試剤を、該ミクロ粒子調
製物を０．１％トライトンＸ−１００を用いて全希釈
１：１，０００，０００について再度洗浄することによ
り除去した。該ミクロ粒子を、５００ｎｍにおけるミク
ロ粒子濃度の標準曲線との比較により固形分２％に調節
した。
を６．０ｍＬの脱イオン水に溶解して調製した（５０ｍ
ｇ ＣＭＣ／ｍＬ）。急速に攪拌しつつ、０．５８／ｍ
Ｌを上述のように調製されたミクロ粒子溶液に急速に滴
下して加えた。この添加に続けて、該反応物を室温にて
３時間攪拌した。過剰の活性化試剤を、該ミクロ粒子調
製物を０．１％トライトンＸ−１００を用いて全希釈
１：１，０００，０００について再度洗浄することによ
り除去した。該ミクロ粒子を、５００ｎｍにおけるミク
ロ粒子濃度の標準曲線との比較により固形分２％に調節
した。
【００２８】先に調製したＢＳＡ接合体を次の方法によ
りミクロ粒子の感作に使用した。該接合体（１２．５ｍ
ｇ）を、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムｐＨ８．５を用い
て５ｍｇ接合体ＢＳＡ／ｍＬに希釈した。ウシ血清アル
ブミンフラクションＶ、試薬級（３７．５ｍｇ）を、
７．５ｍＬの炭酸水素ナトリウムｐＨ８．５に溶解させ
た（５ｍｇＢＳＡ／ｍＬ）。次いで、該ＢＳＡ（７．５
ｍＬ）およびＢＳＡ接合体（２．５ｍＬ）を合して１０
ｍＬの全体積、５ｍｇＢＳＡ／ｍＬの濃度とした。該蛋
白質溶液を激しく混合しつつ、活性化ミクロ粒子（１０
ｍＬ）を素速く添加した。該反応物を一夜混合した。非
結合ＢＳＡ接合体を、次いで充分良く洗浄して除去し
た。最終ラテックス懸濁物を、１０ｍＭＫＰｉ、０．１
％トライトンＸ−１００、０．１％ナトリウムアジド、
ｐＨ７．５により希釈し、また最終ミクロ粒子試薬につ
いては、１０ｍＭＫＰｉ、０．１％ナトリウムアジド、
ｐＨ７．５によって、１０ｍＭＫＰｉ、０．０７％トラ
イトンＸ−１００、０．１％ナトリウムアジド、ｐＨ
７．５中の固形分０．７％とした。ミクロ粒子の固形分
百分率は、５００ｎｍにおけるミクロ粒子濃度の標準曲
線との比較により測定した。
りミクロ粒子の感作に使用した。該接合体（１２．５ｍ
ｇ）を、５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムｐＨ８．５を用い
て５ｍｇ接合体ＢＳＡ／ｍＬに希釈した。ウシ血清アル
ブミンフラクションＶ、試薬級（３７．５ｍｇ）を、
７．５ｍＬの炭酸水素ナトリウムｐＨ８．５に溶解させ
た（５ｍｇＢＳＡ／ｍＬ）。次いで、該ＢＳＡ（７．５
ｍＬ）およびＢＳＡ接合体（２．５ｍＬ）を合して１０
ｍＬの全体積、５ｍｇＢＳＡ／ｍＬの濃度とした。該蛋
白質溶液を激しく混合しつつ、活性化ミクロ粒子（１０
ｍＬ）を素速く添加した。該反応物を一夜混合した。非
結合ＢＳＡ接合体を、次いで充分良く洗浄して除去し
た。最終ラテックス懸濁物を、１０ｍＭＫＰｉ、０．１
％トライトンＸ−１００、０．１％ナトリウムアジド、
ｐＨ７．５により希釈し、また最終ミクロ粒子試薬につ
いては、１０ｍＭＫＰｉ、０．１％ナトリウムアジド、
ｐＨ７．５によって、１０ｍＭＫＰｉ、０．０７％トラ
イトンＸ−１００、０．１％ナトリウムアジド、ｐＨ
７．５中の固形分０．７％とした。ミクロ粒子の固形分
百分率は、５００ｎｍにおけるミクロ粒子濃度の標準曲
線との比較により測定した。
【００２９】試験用抗血清試薬の調製 カンナビノイドに対して選択的なマウスモノクローナル
抗体をｐＨ６．５にて水溶液中に適当に希釈した： １．０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ〔４−（２−ヒドロキシメ
チル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸およびナト
リウム塩〕 ２．０．０１％ウシ血清アルブミン ３．０．５％塩化ナトリウム ４．０．１％ナトリウムアジド
抗体をｐＨ６．５にて水溶液中に適当に希釈した： １．０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ〔４−（２−ヒドロキシメ
チル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸およびナト
リウム塩〕 ２．０．０１％ウシ血清アルブミン ３．０．５％塩化ナトリウム ４．０．１％ナトリウムアジド
【００３０】試験用試料希釈剤の調製：該反応緩衝溶液
は、ｐＨ７．０の水溶液である。 １．０．０５Ｍ ＰＩＰＥＳ〔１，４−ピペラジンビス
（エタンスルホン酸）および二ナトリウム塩〕 ２．２．５％ＰＶＰ〔ポリビニルピロリドン〕３６０ ３．２．０％塩化ナトリウム ４．０．１％ナトリウムアジド ５．０．０２５％フォーマスタ（Ｆｏａｍａｓｔｅｒ）
ＦＬＤ
は、ｐＨ７．０の水溶液である。 １．０．０５Ｍ ＰＩＰＥＳ〔１，４−ピペラジンビス
（エタンスルホン酸）および二ナトリウム塩〕 ２．２．５％ＰＶＰ〔ポリビニルピロリドン〕３６０ ３．２．０％塩化ナトリウム ４．０．１％ナトリウムアジド ５．０．０２５％フォーマスタ（Ｆｏａｍａｓｔｅｒ）
ＦＬＤ
【００３１】カンナビノイド誤用のアッセイ 診断的選択アッセイをＲＯＣＨＥ ＣＯＢＡＳ ＭＩＲ
Ａにて実施した。標準を、薬剤非含有正常ヒト尿（０．
１％ナトリウムアジドを含む）に対してΔ9 −ＣＯＯＨ
ＴＨＣを添加することにより調製した。該診断用分析
装置は、競合的凝集反応が起こり、混濁測定が行なわれ
るキュベット中に、載置される試薬および試料をピペッ
ト分取する。試薬の移送は、２段階で行なわれる。段階
１：１０マイクロリットルの尿試料が、８５ｕＬの試料
希釈剤と共にピペットでキュベット中に分取され、直ち
に１００ｕＬの抗体試薬が入れられ、混合される。初期
の分光測定の読取が行なわれる。２５秒後、段階２：３
０ｕＬのミクロ粒子試薬と２０ｕＬの水とがキュベット
中に移され、該反応物が混合される。段階２の約１００
秒後に、混濁の最終測定が行なわれる。該反応物中の混
濁度の全変化が検量線と比較され、結果がｎｇ／ｍＬに
て報告される。
Ａにて実施した。標準を、薬剤非含有正常ヒト尿（０．
１％ナトリウムアジドを含む）に対してΔ9 −ＣＯＯＨ
ＴＨＣを添加することにより調製した。該診断用分析
装置は、競合的凝集反応が起こり、混濁測定が行なわれ
るキュベット中に、載置される試薬および試料をピペッ
ト分取する。試薬の移送は、２段階で行なわれる。段階
１：１０マイクロリットルの尿試料が、８５ｕＬの試料
希釈剤と共にピペットでキュベット中に分取され、直ち
に１００ｕＬの抗体試薬が入れられ、混合される。初期
の分光測定の読取が行なわれる。２５秒後、段階２：３
０ｕＬのミクロ粒子試薬と２０ｕＬの水とがキュベット
中に移され、該反応物が混合される。段階２の約１００
秒後に、混濁の最終測定が行なわれる。該反応物中の混
濁度の全変化が検量線と比較され、結果がｎｇ／ｍＬに
て報告される。
【００３２】アッセイ成分、特には抗体力価およびＰＶ
Ｐ３６０の濃度が、至適化されており、ＮＩＤＡカット
オフ、Ｘ、１００ｎｇＴＨＣ／ｍＬの周辺で特徴的な所
望の性能をもった標準曲線を与える。第１参照。該アッ
セイは、低い臨床的背景を有しており、カンナビノイド
類に対して選択的であり、臨床的に有意な感度を有し、
また、０．８Ｘおよび１．２ＸをＸから区別する９５％
を越える信頼性の限界を与える精度を有している。
Ｐ３６０の濃度が、至適化されており、ＮＩＤＡカット
オフ、Ｘ、１００ｎｇＴＨＣ／ｍＬの周辺で特徴的な所
望の性能をもった標準曲線を与える。第１参照。該アッ
セイは、低い臨床的背景を有しており、カンナビノイド
類に対して選択的であり、臨床的に有意な感度を有し、
また、０．８Ｘおよび１．２ＸをＸから区別する９５％
を越える信頼性の限界を与える精度を有している。
【００３３】例２ ＰＶＰ３６０濃度のＴＨＣアッセイ効果 次の濃度のＰＶＰ３６０（１．５％、２．０％、２．３
％、２．４％、２．５％、２．６％および２．７％）を
含む７種の試料希釈剤を調製した点を除き、例１と同様
の材料および方法を使用した。ＰＶＰ３６０の異なる最
終濃度の効果を示す結果を、図２に表した。
％、２．４％、２．５％、２．６％および２．７％）を
含む７種の試料希釈剤を調製した点を除き、例１と同様
の材料および方法を使用した。ＰＶＰ３６０の異なる最
終濃度の効果を示す結果を、図２に表した。
【００３４】例３ ベンゾジアゼピンアッセイ ５−（（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキ
ソ）−５−オキソ−ペンタノイルクロライド（２） 無水グルタール酸を、１当量のＮ−ヒドロキシスクシン
イミドと還流させたテトラヒドロフラン中にて反応さ
せ、グルタール酸モノスクシンイミジルエステルを得
た。次いでこれを、過剰量の塩化チオニルにて４５℃で
処理し、２を得た。
ソ）−５−オキソ−ペンタノイルクロライド（２） 無水グルタール酸を、１当量のＮ−ヒドロキシスクシン
イミドと還流させたテトラヒドロフラン中にて反応さ
せ、グルタール酸モノスクシンイミジルエステルを得
た。次いでこれを、過剰量の塩化チオニルにて４５℃で
処理し、２を得た。
【００３５】３−アミノ−７−クロロ−１，３−ジヒド
ロ−１−メチル−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾ
ジアゼピン−２−オン（１） ３，７−ジクロロ−１−メチル−５−フェニル−１，４
−ベンゾジアゼピン−２−オン1 を、Ｔ．Ｙｕｓｕｍｉ
ｔｓｕらの方法に従って、７−クロロ−３−アジド−１
−メチル−５−フェニル−１，４−ベンゾジアゼピン−
２−オンに交換した。更にこれを、Ｈ．Ｓｔａｕｄｉｎ
ｇｅｒおよびＥ．Ｈａｕｓｅｒの方法に従って化合物１
に変換した。
ロ−１−メチル−５−フェニル−２Ｈ−１，４−ベンゾ
ジアゼピン−２−オン（１） ３，７−ジクロロ−１−メチル−５−フェニル−１，４
−ベンゾジアゼピン−２−オン1 を、Ｔ．Ｙｕｓｕｍｉ
ｔｓｕらの方法に従って、７−クロロ−３−アジド−１
−メチル−５−フェニル−１，４−ベンゾジアゼピン−
２−オンに交換した。更にこれを、Ｈ．Ｓｔａｕｄｉｎ
ｇｅｒおよびＥ．Ｈａｕｓｅｒの方法に従って化合物１
に変換した。
【００３６】Ｎ−（７−クロロ−２，３−ジヒドロ−１
−メチル−２−オキソ−５−フェニル−１，４−ベンゾ
ジアゼピン−３−イル）−５−オキソ−５−（（２，５
−ジオキソ−１−ピロリリジニル）オキシ）ペンタンア
ミド（３） 無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の３−アミノジアゼパム１
（０．５、１．４８ｍｍｏｌｅ）および乾燥Ｅｔ3 Ｎ
（０．５ｍＬ）の溶液混合物に、０℃にて０．４６ｇ
（１．８５ｍｍｏｌｅ）の２を添加した。０℃にて１５
分間攪拌後、該反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を、
ＣＨ2 Ｃｌ2に溶解させ、そしてＨ2 Ｏ、飽和ＮａＨＣ
Ｏ3 およびＨ2 Ｏにより洗浄した。有機相をＮａ2 ＳＯ
4 にて乾燥させ、減圧下で濃縮して白色固体を得、Ｅｔ
2 Ｏ中で結晶化させて化合物３を得た（５９５ｍｇ、７
８％、ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳは、構造に一致した）。参考文献 １．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２２（９）、１０９３−１
０９６、（１９７９） ２．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２６（９）、２
８７４−２８７９（１９７８） ３．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．４，８６１（１９
２１）
−メチル−２−オキソ−５−フェニル−１，４−ベンゾ
ジアゼピン−３−イル）−５−オキソ−５−（（２，５
−ジオキソ−１−ピロリリジニル）オキシ）ペンタンア
ミド（３） 無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）中の３−アミノジアゼパム１
（０．５、１．４８ｍｍｏｌｅ）および乾燥Ｅｔ3 Ｎ
（０．５ｍＬ）の溶液混合物に、０℃にて０．４６ｇ
（１．８５ｍｍｏｌｅ）の２を添加した。０℃にて１５
分間攪拌後、該反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を、
ＣＨ2 Ｃｌ2に溶解させ、そしてＨ2 Ｏ、飽和ＮａＨＣ
Ｏ3 およびＨ2 Ｏにより洗浄した。有機相をＮａ2 ＳＯ
4 にて乾燥させ、減圧下で濃縮して白色固体を得、Ｅｔ
2 Ｏ中で結晶化させて化合物３を得た（５９５ｍｇ、７
８％、ＮＭＲ、ＩＲおよびＭＳは、構造に一致した）。参考文献 １．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２２（９）、１０９３−１
０９６、（１９７９） ２．Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２６（９）、２
８７４−２８７９（１９７８） ３．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ．４，８６１（１９
２１）
【００３７】ベンゾジアゼピン−ＢＳＡ接合体の調製 材料 ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）フラクションＶ、試薬
級、ベンゾジアゼピン−ＮＨＳ誘導体、ＤＭＳＯ（ジメ
チルスルホキシド）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液
ｐＨ７．６、ベンゾジアゼピン保存溶液（５ｍｇ／ｍＬ
ＤＭＳＯ）、透析膜２５，０００ＭＷＣＯ。
級、ベンゾジアゼピン−ＮＨＳ誘導体、ＤＭＳＯ（ジメ
チルスルホキシド）、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝溶液
ｐＨ７．６、ベンゾジアゼピン保存溶液（５ｍｇ／ｍＬ
ＤＭＳＯ）、透析膜２５，０００ＭＷＣＯ。
【００３８】方法 ８９ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを、ｐＨ７．６のリン酸緩衝液
に溶解させた。この溶液中に最終濃度が５５％ＤＭＳＯ
となるように、ＢＳＡ／緩衝溶液中に氷浴中にて攪拌し
つつＤＭＳＯを滴々加えた。次いで１０ｍＬの溶液を室
温とし、１．５ｍｇのＢＤＺ−ＮＨＳ保存物を加えた。
これを室温にて一夜攪拌した。該溶液を、過剰のＤＭＳ
Ｏおよびハプテンを除去するために透析した。これは、
ＤＭＳＯの濃度が減少する段階的勾配にて行なった（Ｄ
ＭＳＯ：緩衝溶液比３：７で室温にて３時間、１：９で
室温にて３時間、次いで緩衝溶液のみ、４℃にて一
夜）。ＢＳＡ−ハプテン接合体の濃度を、２８０ｎｍに
おいて分光学的に測定した。この接合物は、冷凍保存さ
れ得る。
に溶解させた。この溶液中に最終濃度が５５％ＤＭＳＯ
となるように、ＢＳＡ／緩衝溶液中に氷浴中にて攪拌し
つつＤＭＳＯを滴々加えた。次いで１０ｍＬの溶液を室
温とし、１．５ｍｇのＢＤＺ−ＮＨＳ保存物を加えた。
これを室温にて一夜攪拌した。該溶液を、過剰のＤＭＳ
Ｏおよびハプテンを除去するために透析した。これは、
ＤＭＳＯの濃度が減少する段階的勾配にて行なった（Ｄ
ＭＳＯ：緩衝溶液比３：７で室温にて３時間、１：９で
室温にて３時間、次いで緩衝溶液のみ、４℃にて一
夜）。ＢＳＡ−ハプテン接合体の濃度を、２８０ｎｍに
おいて分光学的に測定した。この接合物は、冷凍保存さ
れ得る。
【００３９】ミクロ粒子試薬の調製 材料 カルボキシル化ポリスチレンミクロ粒子（０．１−０．
１３ミクロン、Ｓｅｒａｄｙｎ Ｉｎｃ．より）、Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（ＮＨＢ．Ｈ2 Ｏ）（ＮＨＢ貯留溶
液は、０．１２５ｇのＮＨＢ．Ｈ2 Ｏを２．５ｍＬのＤ
ＭＦに溶解させ、次いで２．５ｍＬの脱イオン水を添
加、混合することにより新たに調製される。２５ｍｇ／
ｍＬの濃度で、全量は５．０ｍＬである）、１−シクロ
ヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミ
ドメト−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）（ＣＭＣ
保存溶液は、０．２５ｇを使用直前に５ｍＬのＨ2 Ｏに
溶解することによって新たに調製される。濃度＝５０ｍ
ｇ／ｍＬ）、トライトンＸ−１００、ＢＤＺ−ＢＳＡ接
合体、０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウムｐＨ８．６、ＢＳ
ＡフラクションＶ、試薬級、ミクロ粒子貯留緩衝溶液：
０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝溶液ｐＨ＝６．０、０．
１％ＮａＮ3 および０．１％トライトンＸ−１００を含
む。
１３ミクロン、Ｓｅｒａｄｙｎ Ｉｎｃ．より）、Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（ＮＨＢ．Ｈ2 Ｏ）（ＮＨＢ貯留溶
液は、０．１２５ｇのＮＨＢ．Ｈ2 Ｏを２．５ｍＬのＤ
ＭＦに溶解させ、次いで２．５ｍＬの脱イオン水を添
加、混合することにより新たに調製される。２５ｍｇ／
ｍＬの濃度で、全量は５．０ｍＬである）、１−シクロ
ヘキシル−３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミ
ドメト−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）（ＣＭＣ
保存溶液は、０．２５ｇを使用直前に５ｍＬのＨ2 Ｏに
溶解することによって新たに調製される。濃度＝５０ｍ
ｇ／ｍＬ）、トライトンＸ−１００、ＢＤＺ−ＢＳＡ接
合体、０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウムｐＨ８．６、ＢＳ
ＡフラクションＶ、試薬級、ミクロ粒子貯留緩衝溶液：
０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝溶液ｐＨ＝６．０、０．
１％ＮａＮ3 および０．１％トライトンＸ−１００を含
む。
【００４０】方法 １０ｍＬのカルボキシ修飾ミクロ粒子（固形分１０％）
を洗浄剤の交換のために０．１％トライトンＸ−１００
を１：１，０００，０００の体積比で用いて洗浄した。
該ミクロ粒子の濃度を、５００ｎｍにおける標準曲線を
標準として３％に調節した。
を洗浄剤の交換のために０．１％トライトンＸ−１００
を１：１，０００，０００の体積比で用いて洗浄した。
該ミクロ粒子の濃度を、５００ｎｍにおける標準曲線を
標準として３％に調節した。
【００４１】活性化 ２ｍＬのＮＨＢ貯留溶液を、急速に攪拌されるミクロ粒
子（固形分３％）３３ｍＬに、徐々に滴々加えた。この
ミクロ粒子懸濁物を、室温にて１０分間攪拌した。新た
に調製されたＣＭＣ貯留溶液２．９ｍＬを滴々加えた
（ＮＨＢ：ＣＭＣ：ミクロ粒子試薬の比は３：３：
１）。ＣＭＣの添加後、ミクロ粒子懸濁物を室温で３時
間攪拌した。活性化ミクロ粒子を、上記のように０．１
％トライトンＸ−１００にて洗浄し、有機溶媒および過
剰の活性化試薬を除去し、濃度を２％の固形分に調節し
た（５００ｎｍにて測定）。
子（固形分３％）３３ｍＬに、徐々に滴々加えた。この
ミクロ粒子懸濁物を、室温にて１０分間攪拌した。新た
に調製されたＣＭＣ貯留溶液２．９ｍＬを滴々加えた
（ＮＨＢ：ＣＭＣ：ミクロ粒子試薬の比は３：３：
１）。ＣＭＣの添加後、ミクロ粒子懸濁物を室温で３時
間攪拌した。活性化ミクロ粒子を、上記のように０．１
％トライトンＸ−１００にて洗浄し、有機溶媒および過
剰の活性化試薬を除去し、濃度を２％の固形分に調節し
た（５００ｎｍにて測定）。
【００４２】接合体溶液の調製（ＢＳＡ：ＢＳＡ−ＢＤ
Ｚ比は、１：０．２５）：ＢＳＡ（１８７．５ｍｇ）お
よびＢＤＺ−ＢＳＡ（６２．５ｍｇ）を、５０ｍＬの
０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウムｐＨ８．６に溶解させ
た。
Ｚ比は、１：０．２５）：ＢＳＡ（１８７．５ｍｇ）お
よびＢＤＺ−ＢＳＡ（６２．５ｍｇ）を、５０ｍＬの
０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウムｐＨ８．６に溶解させ
た。
【００４３】感作：５０ｍＬの活性化ミクロ粒子を、急
速に攪拌される接合体溶液に２５°＋／−１℃にて手速
く加えた。該混合物を同温度にて１８時間インキュベー
トした。該ミクロ粒子を保存緩衝溶液の１，０００，０
００倍量にて洗浄し、過剰のＢＳＡを除去した。ミクロ
粒子試薬は、０．７％の固形分に調製された。
速に攪拌される接合体溶液に２５°＋／−１℃にて手速
く加えた。該混合物を同温度にて１８時間インキュベー
トした。該ミクロ粒子を保存緩衝溶液の１，０００，０
００倍量にて洗浄し、過剰のＢＳＡを除去した。ミクロ
粒子試薬は、０．７％の固形分に調製された。
【００４４】Ｏｌｙｍｐｕｓ分析装置用のミクロ粒子試
薬の調製 ミクロ粒子試薬（０．７％）を、０．１％ＮａＮ3 およ
び０．０５％トライトンＸ−１００を含む０．０１Ｍの
リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０により、０．３％に希
釈した。
薬の調製 ミクロ粒子試薬（０．７％）を、０．１％ＮａＮ3 およ
び０．０５％トライトンＸ−１００を含む０．０１Ｍの
リン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０により、０．３％に希
釈した。
【００４５】試験用抗体試薬の調製 ベレゾジアゼピンに対して選択的なヒツジポリクローナ
ル抗体を、下記の緩衝溶液ｐＨ７．０にて適切に希釈し
た。 ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ０．５％ ＮａＣｌ ０．１％ ＢＳＡ ０．１％ ＮａＮ3 ４％ＰＶＰ４０（ポリビニルピロリドン、平均分子量＝
４０，０００）。
ル抗体を、下記の緩衝溶液ｐＨ７．０にて適切に希釈し
た。 ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ０．５％ ＮａＣｌ ０．１％ ＢＳＡ ０．１％ ＮａＮ3 ４％ＰＶＰ４０（ポリビニルピロリドン、平均分子量＝
４０，０００）。
【００４６】試験用希釈剤の調製 希釈用緩衝溶液はｐＨ７．０である。 ５０ｍＭ ＰＩＰＥＳ ２％ ＮａＣｌ ２．３５％ＰＶＰ３６０（平均分子量＝３６０，００
０） ０．１％ ＮａＮ3 ０．０５％ ＮＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅ＋Ｐ−４０）
０） ０．１％ ＮａＮ3 ０．０５％ ＮＰ４０（Ｎｏｎｉｄｅ＋Ｐ−４０）
【００４７】ベンゾジアゼピンアッセイ 診断的試験を、分光光度計として機能するＯｌｙｍｐｕ
ｓ ＡＵ５０００分析装置にて行なった。ミクロ粒子の
凝集を生じる懸濁物中のミクロ粒子の動力学的相互作用
を、混濁度変化について測定した。ミクロ粒子試薬を試
薬２（Ｒ２）として使用し、一方、等量の希釈剤と混合
した抗体試薬を試薬１（Ｒ１）として使用した。該分析
装置は、分析対象物を含む尿試料を１５μｌキュベット
中に分取し、続いて、１８０μｌのＲ１を分配する。８
０μｌのＲ２を分配した後、競合反応が始まる。吸光度
の変化を１４４秒間測定した。吸光度値を検量線と比較
し、結果がｎｇ／ｍｌとして報告された。図３参照。Ｐ
ＶＰ４０、ＰＶＰ３６０および抗体濃度は、カットオ
フ、Ｘ、１００ｎｇノルジアゼパム／ｍＬの周辺で特徴
的な所望の性能をもった最良の動的標準曲線を与えるよ
うに調節される。
ｓ ＡＵ５０００分析装置にて行なった。ミクロ粒子の
凝集を生じる懸濁物中のミクロ粒子の動力学的相互作用
を、混濁度変化について測定した。ミクロ粒子試薬を試
薬２（Ｒ２）として使用し、一方、等量の希釈剤と混合
した抗体試薬を試薬１（Ｒ１）として使用した。該分析
装置は、分析対象物を含む尿試料を１５μｌキュベット
中に分取し、続いて、１８０μｌのＲ１を分配する。８
０μｌのＲ２を分配した後、競合反応が始まる。吸光度
の変化を１４４秒間測定した。吸光度値を検量線と比較
し、結果がｎｇ／ｍｌとして報告された。図３参照。Ｐ
ＶＰ４０、ＰＶＰ３６０および抗体濃度は、カットオ
フ、Ｘ、１００ｎｇノルジアゼパム／ｍＬの周辺で特徴
的な所望の性能をもった最良の動的標準曲線を与えるよ
うに調節される。
【００４８】例４ ベンゾジアゼピンアッセイ−ＰＶＰ４０の濃度効果 抗体および希釈剤を下記のとおり調製したことを除き、
例３と同じ材料および方法を用いた。
例３と同じ材料および方法を用いた。
【００４９】試験用抗体試薬の調製 ベンゾジアゼピンに対して選択的なヒツジポリクローナ
ル抗体を、下記の緩衝溶液中にｐＨ７．０にて適切に希
釈した。 ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ０．５％ ＮａＣｌ ０．１％ ＢＳＡ ０．１％ ＮａＮ3 種々の濃度のＰＶＰ４０ ａ） ０％ ｂ） ４％ ｃ） ６％ ｄ） １０％
ル抗体を、下記の緩衝溶液中にｐＨ７．０にて適切に希
釈した。 ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ０．５％ ＮａＣｌ ０．１％ ＢＳＡ ０．１％ ＮａＮ3 種々の濃度のＰＶＰ４０ ａ） ０％ ｂ） ４％ ｃ） ６％ ｄ） １０％
【００５０】試験用希釈剤の調製 希釈剤緩衝溶液は、ｐＨ７．０である： ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ２％ ＮａＣｌ ４％ ＰＶＰ４０ ０．１％ ＮａＮ3 ０．０５％ ＮＰ４０ 結果を図４に示す。
【図１】図１は、例１で得られるＴＨＣの検量線を例示
するグラフである。
するグラフである。
【図２】図２は、例２において種々の濃度のＰＶＰ３６
０を用いて得られるＴＨＣアッセイの至適化を示すグラ
フである。
０を用いて得られるＴＨＣアッセイの至適化を示すグラ
フである。
【図３】図３は、例３においてＰＶＰ−３６０およびＰ
ＶＰ−４０を用いたベンゾジアゼピンアッセイに対して
の検量線の至適化を示すグラフである。
ＶＰ−４０を用いたベンゾジアゼピンアッセイに対して
の検量線の至適化を示すグラフである。
【図４】図４は、例４において種々の濃度のＰＶＰ−４
０を用いたベンゾジアゼピンに対する競合的ミクロ粒子
凝集反応の増強を示すグラフである。
０を用いたベンゾジアゼピンに対する競合的ミクロ粒子
凝集反応の増強を示すグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 ジヨデイ ブレイク コートニイ アメリカ合衆国ニユージヤージー州アツパ ー モントクレアー，バレイ ロード 407 (72)発明者 ジヨセフ ジヨン パツサレリ アメリカ合衆国ニユージヤージー州リンゴ ーズ，エベリツツ ロード 34 (72)発明者 サルバトーレ ジヨセフ サラモン アメリカ合衆国ニユージヤージー州ルサー フオード，イー．ピエールポント アベニ ユー 37
Claims (8)
- 【請求項１】 凝集検出測定による体液試料中の標的分
子検出のための方法であって、前記試料に、イムノアッ
セイの感度および信号を増大するに有効な量のポリビニ
ルピロリドン（ＰＶＰ）を添加することを含んでなるミ
クロ粒子に基づくイムノアッセイ方法。 - 【請求項２】 該凝集検出測定を、分光学的測定による
混濁度（光吸収）にて行なう請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 該ＰＶＰが、約３６０ｋＤの平均分子量
を有し、少なくとも約０．６％の最終濃度まで添加され
る請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 凝集検出測定による体液試料中の標的分
子検出のための、ミクロ粒子に基づくイムノアッセイ用
診断キットであって、前記標的分子に対して選択的な抗
体を含む試薬を収容する第１の容器および前記標的分子
に対して選択的である免疫学的に活性なハプテン類また
は抗体類が結合するミクロ粒子を含む試薬を収容する第
２の容器を有してなり、いずれか一方の容器または２つ
の組合せ中に、前記イムノアッセイの感度および信号を
増大するに有効な量のＰＶＰを含むことを特徴とする診
断キット。 - 【請求項５】 凝集検出測定による体液試料中の標的分
子検出のための、ミクロ粒子に基づくイムノアッセイ用
診断キットであって、前記標的分子に対して選択的に抗
体を含む試薬を収容する第１の容器、前記標的分子に対
して選択的である免疫学的に活性なハプテンが結合する
ミクロ粒子を含む試薬を収容する第２の容器、および希
釈剤水溶液を含む試薬を収容する第３の容器を有してな
り、前記容器の一つまたはそれらの組合せ中に、前記イ
ムノアッセイの感度および信号を増大するに有効な量の
ＰＶＰを含むことを特徴とする診断キット。 - 【請求項６】 凝集検出測定による体液試料中の標的分
子検出のためのミクロ粒子に基づくイムノアッセイ用試
薬であって、前記標的分子に対して選択的な抗体を有し
てなり、前記イムノアッセイの感度および信号を増大す
るに有効な量のＰＶＰを含むことを特徴とする試薬。 - 【請求項７】 該ＰＶＰが、約３６０ｋＤの平均分子量
を有し、前記イムノアッセイにおいて少なくとも約０．
６％の最終濃度を与えるために充分な量で存在する請求
項６に記載の試薬。 - 【請求項８】 イムノアッセイの感度および信号を増大
するための、ミクロ粒子に基づくイムノアッセイにおけ
るＰＶＰの使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66978391A | 1991-03-15 | 1991-03-15 | |
| US669783 | 1991-03-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0580051A true JPH0580051A (ja) | 1993-03-30 |
Family
ID=24687720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5549892A Pending JPH0580051A (ja) | 1991-03-15 | 1992-03-13 | 凝集イムノアツセイ |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0503454A1 (ja) |
| JP (1) | JPH0580051A (ja) |
| AU (1) | AU1104092A (ja) |
| CA (1) | CA2061371A1 (ja) |
| NZ (1) | NZ241889A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002010760A1 (fr) * | 2000-07-27 | 2002-02-07 | Kyowa Medex Co., Ltd | Technique relative a une epreuve d'immunite menee avec des particules d'un vehicule insoluble et reactif a cet effet |
| EP2042870A1 (en) | 2007-09-28 | 2009-04-01 | Fujifilm Corporation | Method of high sensitive immunoassay |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5237057A (en) * | 1992-04-06 | 1993-08-17 | Biosite Diagnostics, Inc. | Tetrahydrocannabinol derivatives and protein and polypeptide tetrahydrocannabinol derivative conjugates and labels |
| DE102006000707A1 (de) * | 2006-01-03 | 2007-07-05 | Qiagen Gmbh | Verwendung von Polymeren zur Erhöhung der Signalintensität bei der Durchführung von Nachweisreaktionen |
| WO2013059294A1 (en) * | 2011-10-17 | 2013-04-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and devices for detecting and separating target analyte species using anisotropic micro-particles |
| ES2527887B1 (es) * | 2013-08-02 | 2015-11-19 | Linear Chemicals, S. L. | Procedimiento para cuantificar la presencia de un antígeno de Helicobacter pylori en una muestra biológica de origen fecal y kit para cuantificar la presencia de dicho antígeno mediante dicho método |
| CN106405076A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-02-15 | 上海科华生物工程股份有限公司 | D‑二聚体检测试剂盒及其制备方法 |
| WO2018138264A2 (en) | 2017-01-27 | 2018-08-02 | Roche Diagnostics Gmbh | Methods for modulating signal intensity in interaction assays |
| CN112946254B (zh) * | 2021-01-18 | 2024-03-15 | 上海云泽生物科技有限公司 | 一种胶乳增强竞争免疫比浊检测方法及试剂盒 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1384399A (en) * | 1971-02-01 | 1975-02-19 | Hoffmann La Roche | Automated method of obtaining serological data |
| FI792576A (fi) * | 1979-08-20 | 1981-02-21 | Orion Yhtymae Oy | Foerbaettrad metod att utfoera enzymimmunologiska bestaemningar |
| US4480042A (en) * | 1981-10-28 | 1984-10-30 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Covalently bonded high refractive index particle reagents and their use in light scattering immunoassays |
| DE3322643C2 (de) * | 1983-06-23 | 1986-07-10 | Brigitte Dr. Ebener | Verfahren zur Herstellung eines Latextestreagenz zum Nachweis und zur Differenzierung von Humanhämoglobin, Humanhämoglobinbestandteilen oder Humanhämoglobinvarianten |
| US4931385A (en) * | 1985-06-24 | 1990-06-05 | Hygeia Sciences, Incorporated | Enzyme immunoassays and immunologic reagents |
| DE69010089T2 (de) * | 1989-01-20 | 1994-12-22 | Stago Diagnostica | Submikronische teilchen, herstellung und verwendung in der immundiagnose. |
-
1992
- 1992-02-17 CA CA 2061371 patent/CA2061371A1/en not_active Abandoned
- 1992-02-18 AU AU11040/92A patent/AU1104092A/en not_active Abandoned
- 1992-03-04 EP EP92103667A patent/EP0503454A1/en not_active Withdrawn
- 1992-03-09 NZ NZ24188992A patent/NZ241889A/en unknown
- 1992-03-13 JP JP5549892A patent/JPH0580051A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002010760A1 (fr) * | 2000-07-27 | 2002-02-07 | Kyowa Medex Co., Ltd | Technique relative a une epreuve d'immunite menee avec des particules d'un vehicule insoluble et reactif a cet effet |
| JP4950406B2 (ja) * | 2000-07-27 | 2012-06-13 | 協和メデックス株式会社 | 不溶性担体粒子を用いる免疫測定方法およびその試薬 |
| US8431415B2 (en) | 2000-07-27 | 2013-04-30 | Tfb, Inc. | Immunoassay using insoluble carrier particles and reagent therefor |
| EP2042870A1 (en) | 2007-09-28 | 2009-04-01 | Fujifilm Corporation | Method of high sensitive immunoassay |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2061371A1 (en) | 1992-09-16 |
| AU1104092A (en) | 1992-09-17 |
| EP0503454A1 (en) | 1992-09-16 |
| NZ241889A (en) | 1994-04-27 |
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