JPH0580051A - 凝集イムノアツセイ - Google Patents

凝集イムノアツセイ

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JPH0580051A
JPH0580051A JP5549892A JP5549892A JPH0580051A JP H0580051 A JPH0580051 A JP H0580051A JP 5549892 A JP5549892 A JP 5549892A JP 5549892 A JP5549892 A JP 5549892A JP H0580051 A JPH0580051 A JP H0580051A
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immunoassay
reagent
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microparticle
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JP5549892A
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アントニアン エドナ
Jodi Blake Courtney
ブレイク コートニイ ジヨデイ
Joseph John Passarelli
ジヨン パツサレリ ジヨセフ
Salvatore Joseph Salamone
ジヨセフ サラモン サルバトーレ
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F Hoffmann La Roche AG
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    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 臨床的診断等に有用なミクロ粒子を用いる凝
集イムノアッセイの改良を目的とする。 【構成】 ミクロ粒子の反応系に、イムノアッセイの感
度および信号を有意に増強する有効量のポリビニルピロ
リドンを添加することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】本発明は、ミクロ粒子に基づく凝集イムノ
アッセイの改良のためのPVPの使用に関し、結果とし
てこれらのイムノアッセイの感度および信号を有意に増
強するものである。
【0002】更に特定的には、本発明は、凝集検出測定
による体液試料中の標的分子検出のためのミクロ粒子に
基づくイムノアッセイにおいて、改良を与えるもので、
この改良は、前記試料にイムノアッセイの感度および信
号を増大するに有効な量のポリビニルピロリドン(PV
P)を添加することを含む。
【0003】診断的アッセイにおけるミクロ粒子の使用
は、今では一般に周知である。該アッセイ方法は、均質
および不均質型の両者において、大分子(例えば蛋白質
類、ホルモン類、酵素類、抗体類、免疫複合体類)およ
び小分子(例えば、治療用薬剤、誤用薬剤およびそれら
の代謝物)の両者に対し、競合および直接接合アッセイ
において使用され得る。種々のポリマー性ミクロ粒子系
が開発され、それらは、生物学的に興味ある化合物の共
有的または非共有的結合を許容する(例えば、これらは
米国特許第4,480,042の2欄にて論じられてい
る)。広く使用されているものは、種々の大きさの、ス
チレンと共重合されるモノマーからなる粒子である。
【0004】イムノアッセイにおいてミクロ粒子技術の
種々の実施態様は、一般には免疫的結合対の一成分のた
めの担体である固体支持体を有している。免疫化学反応
は、粒子の分散状態の変化に影響を与え、あるいは粒子
が単に固体支持体上の決定因子の単離にのみ働く場合に
おいては、第2の標識が使用され得る。結合対の相互作
用の結果として、粒子が特異的に交差結合(またはそれ
を阻害)される場合、例えば、混濁度、白濁測定、角度
異方性、準弾性的光散乱等、信号検出のために使用され
得る種々の分析方法がある。このような利用可能な種々
の凝集検出技術のみならず、該方法は、数種の装置に対
して種々の自動化の程度をもって適用される。
【0005】診断におけるミクロ粒子の初期の応用は、
体液中の免疫学的決定因子の検出であった(Howan
itz J.H.の、Immunoassay−Inn
ovations in Label Technol
ogy,Arch.Pathol Lab Med,
Vol 112,775−779頁(1988);He
chemy K.E.およびMichaelson
E.E.の、LatexParticle Assay
in Laboratory Medicine,第
I部,Laboratory Management
(1984年6月))。興味ある抗原に対して選択的な
凝集剤は、粒子表面に(共有的または吸着的に)結合さ
れ得た。該抗原が、凝集剤の結合に利用可能な数個の決
定因子を有している場合に、交差結合および検出が最適
となる。試料中に抗原が存在しない場合、粒子分散物の
状態に変化を検出しないであろう。この方法は、低分子
量ハプテンの検出に対しては最適化されていない。しか
しながら、2価の凝集剤が可溶性結合成分である場合に
は、分析対象物は、凝集剤結合部位について、担体上で
ハプテンと競合する。従って、試料中にハプテンが存在
すると粒子の交差結合を阻害する。こうして得られる感
度の改善は、誤用および治療用薬剤等のハプテンならび
にヒト絨毛膜ゴナドトロピン等の抗原の両者に対する診
断的試験において、ミクロ粒子の有用性を増大させた
(米国特許第3,857,931号)。これらのアッセ
イは、凝集の検出に依存するものであるが、可溶性凝集
剤により得られた感度は、凝集剤が、臨床的に有意な範
囲より過剰でない場合には、信号を犠牲にする。
【0006】凝集増強剤として、ポリエチレングリコー
ル(PEG)および種々の洗浄剤の使用が示唆されてい
る。米国特許第4,480,042号第10欄およびG
alloway,R.J.,Development
of Microparticle Tests an
d Immunoassays,29頁(Serady
n,Inc.インディアナポリス,1988)参照。ミ
クロ粒子の分散物の安定化、ならびに“非−特異的凝
集”の阻害は、界面活性剤およびポリビニルピロリドン
(PVP)を含む水可溶性ポリマーに帰因するとされて
いる。Bangs,L.B.,Uniform Lat
ex Particles,25−26頁および55−
56頁(Seradyn Inc.,1984)。低濃
度、すなわち最終濃度0.4%未満のPVP−360
は、薬剤誤用試験用のONTRAK(商標)(Roch
e Diagnostic Systems,In
c.)として商業的に販売されているキャピラリに媒介
されるアグルチノグラフスライド(agglutino
graphic slide)に使用されるラテックス
ミクロ粒子試薬中に組入れられている。(この明細書お
よび特許請求の範囲において称される最終濃度は、すべ
ての試薬に試料を加えて含む完全に作り上げられた反応
混合物について言及している。また全て百分率は、重量
/体積を特に述べない限り示している。
【0007】図面の簡単な説明 図1は、例1において作られるTHC検量線のデータを
図示的に例示する。図2は、例2に従った種々の濃度に
おけるPVP360の使用によるTHCアッセイの最適
化を示す。図3は、例3に従ったPVP−40無添加に
対するPVP−360およびPVP−40の使用による
ベンゾジアゼピンアッセイに対する検量線の最適化を示
す。図4は、例4による、種々の濃度のPVP−40の
使用によるベンゾジアゼピンに対する競合的ミクロ粒子
凝集反応の増強を示す。
【0008】本発明により、ミクロ粒子に基づくイムノ
アッセイへの有効量のPVPの添加が、反応動力学の増
強を生じ、これにより精度の増大した信号が得られ、ま
た改善された感度および全体の信号対ノイズ比が得られ
ることが、予期せずに見出された。充分な濃度で使用さ
れた場合、PVPは、単に分散物の安定剤としてよりも
反応増強剤として作用する。いずれの分子量のPVPも
本発明において使用され得る。
【0009】本発明において使用されるミクロ粒子試薬
は、免疫学的結合対の一成分より被覆されたミクロ粒子
が組込まれ、ここで結合対は、興味ある物質に対して診
断的に選択性である。該ミクロ粒子は、単一分散型に保
たれる。相補的結合相手の存在下での動力学的相互作用
において、ミクロ粒子凝集物は、光学密度の変化を生じ
る。反応動力学の増強は、精度の増大した信号および感
度の改善されたアッセイを生じる。検量線について有意
な傾斜が得られ、定量化を可能とする。
【0010】本発明は、粒子担体により媒介される特異
的な分析対象物−凝集剤結合の増強を与え、これによっ
て、ハプテンおよび抗原の検出に応用するための、充分
に臨床的な感度をもった診断的アッセイの設計を可能と
する。ヒト体液中の特異的な代表的分析対象物は、例え
ば、Δ9 −カルボキシテトラヒドロカンナビノール(C
OOH−THC)、ジアゼパム、ヒト絨毛膜ゴナドトロ
ピン、およびヒトガンマグロブリンを含む。
【0011】一般的に、PVPの濃度の増大は、感度お
よび信号の増大をもたらす。更に、先に注記したように
PVPの分子量の増大によっても同様な効果が達成され
る。PVPは、平均分子量、例えばPVP−40(平均
M.W.=40kD)、PVP−360(平均M.W.
=360kD)等により異なった大きさの級において典
型的に商業的に利用可能である。これらの標準的商業品
の級は、ポリマーの分子量のかなり広い分布からなるで
あろう。本発明によれば、低分子量の級のPVP(例え
ばPVP−40)は、最終濃度約3%から有効であり、
一方高分子量(例えば、PVP−360)は0.6%の
量から有効である。分子量の混合は、異なる分子量の有
益な効果を平均されたものに対応して生ずる傾向があ
り、ある場合には相乗効果様の増強を生じ、他のPVP
との組合せにおいて所定PVPのより少量の使用で優位
性を与え得る。
【0012】かくして、PVP−360は、同じ濃度に
おいてPVP−40より大きい反応の加速を与える。例
えば、THCのアッセイにおいて、PVP−360は最
終濃度0.69%で充分に作用する(図2参照)。1.
50%以後の濃度においては、加速度合の増大はなくな
る。PVP−40の場合には、最終反応混合物中の3.
27%の濃度は、1.31%のPVPに対するものの3
倍以上の吸収信号を与える(図4参照)。同じ3.27
%のPVP−40濃度は、しかしながら、0.77%の
PVP−360の添加が与える増強に一致する(図3と
比較)。
【0013】本発明の好適な実施態様において、使用さ
れるPVPは平均分子量約360kDを有し、また最終
濃度で少なくとも約0.6%添加される。
【0014】場合により、高および低分子量のものを同
時に使用して利点が得られるであろう。例えば、Oly
mpus分析装置での使用のため調製されたベンソジア
ゼピンアッセイ試薬においては(例3)、抗体および希
釈剤収容器(R1)中のPVP−360の濃度が約1.
18%を越えると、該装置はPVP含有試薬の正確なピ
ペットができなかった。R1に対して2.0%の濃度ま
でのPVP−40の添加(1.31%の最終濃度)およ
びR1への1.175%の濃度までのPVP−360の
添加(0.77%の最終濃度)は、許容できる動力学お
よび良好なピペット精度を与えた(図3)。
【0015】信号および感度の増強度の大きさは、当然
ながら各アッセイに固有な特徴、および例えば抗体の親
和性等の内部因子ならびに装置の限界等の外部因子に反
映する。しかしながら、図2および4に取上げたような
最適化グラフから認識されるように、当業者は、容易に
PVP分子量の級、濃度、またはそれらの組合せがいず
れの特定のアッセイ系または装置に対して最適であるよ
うな選択を行なうことができる。
【0016】濃度の上限は、凝集反応を損い始める点、
またはアッセイ操作において他の実際上の困難性を与え
るところにあり、通常、過度の粘性効果、また場合によ
り使用する装置に依存する。
【0017】本発明は改良されたイムノアッセイ試薬お
よび方法は、凝集反応によりもたらされる変化の測定の
ための手段となる方法の影響を受け易いイムノアッセイ
の型式において便利に使用され得る。人手および自動化
装置試験の両者ともに、このような凝集検出分析のため
に好適に採用される。典型的には、自動化装置は、試薬
に添加する各試薬の適量をピペットで取るための複数の
試薬容器または保管容器を用いて操作される。主題であ
る凝集アッセイ等のイムノアッセイについて、このこと
は少なくとも2つの容器を通常含み;典型的には1つは
抗体試薬用、他は対応する抗原性決定因子が結合するミ
クロ粒子用である。希釈剤、緩衝溶液および/または試
料の適切な処理のための他の添加剤を入れた追加の容器
/保管容器が装置内にあってもよい。
【0018】当然のことながら、本発明はこれらの容器
の1つまたはそれ以上に適切な量のPVPを組み入れ、
試料中に有効な最終濃度が達成されるようにして便宜よ
く実施できる。従って、本発明の目的は、凝集検出測定
による体液試料中の標的分子を検出するためのミクロ粒
子に基づくイムノアッセイ用診断キットを提供すること
を一つとして含み、前記標的分子に対して選択的な抗体
を含んでなる試薬を収容する第1の容器、前記標的分子
に対して選択的な免疫的に活性なハプテンまたは抗原が
結合されたミクロ粒子を含んでなる試薬を収容する第2
の容器を含み、改良点においていずれかの容器または2
つの組合せ中に、前記イムノアッセイの感度および信号
を増大させるに有効量のPVPを含ませる。但し、過剰
量のPVPがミクロ粒子含有試薬には有害であろうこと
を考えると、PVPをミクロ粒子の含まれない相補的免
疫試薬に入れることが好ましいであろう。この状況のも
とに、本発明は、標的分子に対して選択的な抗体および
前記イムノアッセイの感度および信号を増大させるに有
効な量のPVPを含む、ミクロ粒子に基づくイムノアッ
セイ用試薬を提供する。
【0019】好ましくは、PVPは、付加的に使用され
るのであれば希釈剤/緩衝剤試薬中に入れられる。この
場合、凝集検出測定による体液試料中の標的分子を検出
するためのミクロ粒子に基づくイムノアッセイ用診断キ
ットであって、前記標的分子に対して選択的な抗体を含
んでなる試薬を収容する第1の容器、前記標的分子に対
して選択的な免疫的に活性化されたハプテンを結合する
ミクロ粒子を含んでなる試薬を収容する第2の容器、お
よび希釈剤水溶液を含んでなる試薬を収容する第3の容
器を含み、前記容器の一つまたはそれらの組合せ中に、
前記イムノアッセイの感度および信号を増大させるに有
効量のPVPを含んでなるキットが適用されるであろ
う。試薬または診断キットにおいて使用されるPVP
は、好ましくは約360kDの平均分子量を有し、前記
イムノアッセイにおいて少なくとも約0.6%の最終濃
度を与えるに充分な量をもって使用される。
【0020】
【実施例】以下の例は、発明の例示的実施態様を示すも
のである。
【0021】例1 テトラヒドロカンナビノイド・アッセイ トランス−rac−1−〔〔(6a,7,10,10a
−テトラヒドロ−1−ヒドロキシ−6,6−ジメチル−
3−ペンチル−6H−ジベンゾ〔b,d〕ピラン−9−
イル(カルボニル)オキシ〕−2,5−ピロリジンジオ
ンの調製 50mLのエチルアセテート/メチレンクロライド中の
1.26g(3.67m mole)の11−nor−
Δ8 −THC−9−カルボン酸溶液に、1.68g(1
4.7m mole)のN−ヒドロキシ−スクシンイミ
ドおよび2.10g(11.0m mole)の1−
(3−ジメチル−アミノプロピル)3−エチルカルボジ
イミド塩酸を加えた。該反応物を室温にて16時間攪拌
した。該反応混合物を、1N塩酸(3×100mL)、
水(3×100mL)および飽和食塩水(100mL)
にて洗浄した。有機相をNa2 SO4 上にて乾燥させ、
減圧下で濃縮した。シリカゲル上でのクロマトグラフィ
(フラッシュ、2インチ×6インチ)。ヘキサン中の4
0%(v/v)エチルアセテートにより溶出して1.4
1g(87%)の所望のN−ヒドロキシスクシンイミド
エステルを得た。NMR、IRおよびMSは、構造に無
盾なく得られた。トランス−rac−1−〔〔(6a,
7,10,10a−テトラヒドロ−1−ヒドロキシー
6,6−ジメチル−3−ペンチル−6H−ジベンゾ
〔b,d〕ピラン−9−イル)カルボニル〕オキシ〕−
2,5−ピロリジンジオン(カンナビノイド)のウシ血
清アルブミン(BSA)への接合は:参考文献:I.
J.Org.Chem.51,5463−5465(1
986)。
【0022】材料 ウシ血清アルブミン(BSA)、フラクションV、試薬
級、カンナビノイド誘導体、分子量441.52mg/
mM、ジメチルスルフォキシド(DMSO)、50mM
リン酸カリウム緩衝溶液pH=7.5(KPi緩衝溶
液)、カンナビノイドの保存溶液(5mg/mL):2
mLのDMSO中の10mgのカンナビノイド誘導体、
透析膜25,000MWCO。
【0023】方法 接合されるBSAを1.25mLのKPi緩衝溶液中に
125mg溶解させて調製された(100mg BSA
/mL緩衝液)。一旦蛋白質を溶解させ、該溶液を氷浴
中で冷却した。電磁攪拌プレート上で混合しつつ、該蛋
白質溶液にDMSO(1.875mL)を滴々加え、次
いでこれを室温にした。この時点でカンナビノイドの貯
留溶液が新たに調製される(上記参照)。カンナビノー
ルの貯留溶液(0.167mL)をDMSO/緩衝溶液
中の蛋白質に滴々加えた。該反応物を室温にて一夜攪拌
した。過剰のDMSOおよび非結合ハプテンを、拡大し
た透析系(合計で1000万倍以上)にて除去した。接
合体を、まず35mLのKPi緩衝溶液で希釈された1
5mLのDMSOに対し、次いで45mLのKPi緩衝
溶液で希釈された5mLのDMSOに対して室温にて透
析した。次いで、透析を4℃にてKPi緩衝溶液に対し
て継続した。回収された接合体は、蛋白質濃度を280
nmにて評価された。
【0024】カンナビノイド−BSA接合体を含む感作
ミクロ粒子の調製:材料 カルボキシル化ポリスチレンミクロ粒子(直径0.1−
0.13um、Seradyn,Inc社製)、N,N
−ジメチルホルムアミド(DMF)、1−ヒドロキシベ
ンゾトリアゾール(NHB;H2 O)、1−シクロヘキ
シル−3−(2−モルホリノエチル)カルボジイミド
メト−p−トルエンスルホネート(CMC)、トライト
ンX−100、カンナビノイド−BSA接合体、50m
M炭酸水素ナトリウム、pH8.6、BSAフラクショ
ンV試薬級、10mMKPi緩衝溶液、pH7.5、
0.1%ナトリウムアジド、および0.1%トライトン
X−100(ミクロ粒子保存緩衝溶液)。
【0025】方法 製造者より供給を受けた状態のカルボキシル化ミクロ粒
子(固形分10%の2.0mL)を、洗浄剤を交換する
ために洗浄した。脱イオン水中の0.1%トライトンX
−100を、体積にて1:1,000,000以上の希
釈となるように使用した。0.1%トライトンX−10
0中の洗浄ラテックスを、500nmにおけるラテック
ス濃度の標準曲線により、0.1%トライトンX−10
0中に固形分3%となるよう調整した。
【0026】NHBの貯留溶液は、110mgのNHB
を2.2mLのDMFに溶解させ、これに脱イオン水
(2.2mL)を加えて調製した(25mgNHB/m
L)。急速に攪拌しつつ、調製されたミクロ粒子溶液
(6.7mL)に、室温にてNHB溶液(0.42m
L)を急速に滴下した。該溶液を10分間攪拌し、その
間にCMCの貯留溶液を調製した。
【0027】CMCの保存溶液は、300mgのCMC
を6.0mLの脱イオン水に溶解して調製した(50m
g CMC/mL)。急速に攪拌しつつ、0.58/m
Lを上述のように調製されたミクロ粒子溶液に急速に滴
下して加えた。この添加に続けて、該反応物を室温にて
3時間攪拌した。過剰の活性化試剤を、該ミクロ粒子調
製物を0.1%トライトンX−100を用いて全希釈
1:1,000,000について再度洗浄することによ
り除去した。該ミクロ粒子を、500nmにおけるミク
ロ粒子濃度の標準曲線との比較により固形分2%に調節
した。
【0028】先に調製したBSA接合体を次の方法によ
りミクロ粒子の感作に使用した。該接合体(12.5m
g)を、50mM炭酸水素ナトリウムpH8.5を用い
て5mg接合体BSA/mLに希釈した。ウシ血清アル
ブミンフラクションV、試薬級(37.5mg)を、
7.5mLの炭酸水素ナトリウムpH8.5に溶解させ
た(5mgBSA/mL)。次いで、該BSA(7.5
mL)およびBSA接合体(2.5mL)を合して10
mLの全体積、5mgBSA/mLの濃度とした。該蛋
白質溶液を激しく混合しつつ、活性化ミクロ粒子(10
mL)を素速く添加した。該反応物を一夜混合した。非
結合BSA接合体を、次いで充分良く洗浄して除去し
た。最終ラテックス懸濁物を、10mMKPi、0.1
%トライトンX−100、0.1%ナトリウムアジド、
pH7.5により希釈し、また最終ミクロ粒子試薬につ
いては、10mMKPi、0.1%ナトリウムアジド、
pH7.5によって、10mMKPi、0.07%トラ
イトンX−100、0.1%ナトリウムアジド、pH
7.5中の固形分0.7%とした。ミクロ粒子の固形分
百分率は、500nmにおけるミクロ粒子濃度の標準曲
線との比較により測定した。
【0029】試験用抗血清試薬の調製 カンナビノイドに対して選択的なマウスモノクローナル
抗体をpH6.5にて水溶液中に適当に希釈した: 1.0.05M HEPES〔4−(2−ヒドロキシメ
チル)−1−ピペラジン−エタンスルホン酸およびナト
リウム塩〕 2.0.01%ウシ血清アルブミン 3.0.5%塩化ナトリウム 4.0.1%ナトリウムアジド
【0030】試験用試料希釈剤の調製:該反応緩衝溶液
は、pH7.0の水溶液である。 1.0.05M PIPES〔1,4−ピペラジンビス
(エタンスルホン酸)および二ナトリウム塩〕 2.2.5%PVP〔ポリビニルピロリドン〕360 3.2.0%塩化ナトリウム 4.0.1%ナトリウムアジド 5.0.025%フォーマスタ(Foamaster)
FLD
【0031】カンナビノイド誤用のアッセイ 診断的選択アッセイをROCHE COBAS MIR
Aにて実施した。標準を、薬剤非含有正常ヒト尿(0.
1%ナトリウムアジドを含む)に対してΔ9 −COOH
THCを添加することにより調製した。該診断用分析
装置は、競合的凝集反応が起こり、混濁測定が行なわれ
るキュベット中に、載置される試薬および試料をピペッ
ト分取する。試薬の移送は、2段階で行なわれる。段階
1:10マイクロリットルの尿試料が、85uLの試料
希釈剤と共にピペットでキュベット中に分取され、直ち
に100uLの抗体試薬が入れられ、混合される。初期
の分光測定の読取が行なわれる。25秒後、段階2:3
0uLのミクロ粒子試薬と20uLの水とがキュベット
中に移され、該反応物が混合される。段階2の約100
秒後に、混濁の最終測定が行なわれる。該反応物中の混
濁度の全変化が検量線と比較され、結果がng/mLに
て報告される。
【0032】アッセイ成分、特には抗体力価およびPV
P360の濃度が、至適化されており、NIDAカット
オフ、X、100ngTHC/mLの周辺で特徴的な所
望の性能をもった標準曲線を与える。第1参照。該アッ
セイは、低い臨床的背景を有しており、カンナビノイド
類に対して選択的であり、臨床的に有意な感度を有し、
また、0.8Xおよび1.2XをXから区別する95%
を越える信頼性の限界を与える精度を有している。
【0033】例2 PVP360濃度のTHCアッセイ効果 次の濃度のPVP360(1.5%、2.0%、2.3
%、2.4%、2.5%、2.6%および2.7%)を
含む7種の試料希釈剤を調製した点を除き、例1と同様
の材料および方法を使用した。PVP360の異なる最
終濃度の効果を示す結果を、図2に表した。
【0034】例3 ベンゾジアゼピンアッセイ 5−((2,5−ジオキソ−1−ピロリジニル)オキ
ソ)−5−オキソ−ペンタノイルクロライド(2) 無水グルタール酸を、1当量のN−ヒドロキシスクシン
イミドと還流させたテトラヒドロフラン中にて反応さ
せ、グルタール酸モノスクシンイミジルエステルを得
た。次いでこれを、過剰量の塩化チオニルにて45℃で
処理し、を得た。
【0035】3−アミノ−7−クロロ−1,3−ジヒド
ロ−1−メチル−5−フェニル−2H−1,4−ベンゾ
ジアゼピン−2−オン(1) 3,7−ジクロロ−1−メチル−5−フェニル−1,4
−ベンゾジアゼピン−2−オン1 を、T.Yusumi
tsuらの方法に従って、7−クロロ−3−アジド−1
−メチル−5−フェニル−1,4−ベンゾジアゼピン−
2−オンに交換した。更にこれを、H.Staudin
gerおよびE.Hauserの方法に従って化合物
に変換した。
【0036】N−(7−クロロ−2,3−ジヒドロ−1
−メチル−2−オキソ−5−フェニル−1,4−ベンゾ
ジアゼピン−3−イル)−5−オキソ−5−((2,5
−ジオキソ−1−ピロリリジニル)オキシ)ペンタンア
ミド(3) 無水THF(30mL)中の3−アミノジアゼパム
(0.5、1.48mmole)および乾燥Et3
(0.5mL)の溶液混合物に、0℃にて0.46g
(1.85mmole)のを添加した。0℃にて15
分間攪拌後、該反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を、
CH2 Cl2に溶解させ、そしてH2 O、飽和NaHC
3 およびH2 Oにより洗浄した。有機相をNa2 SO
4 にて乾燥させ、減圧下で濃縮して白色固体を得、Et
2 O中で結晶化させて化合物3を得た(595mg、7
8%、NMR、IRおよびMSは、構造に一致した)。参考文献 1.J.Med.Chem.22(9)、1093−1
096、(1979) 2.Chem.Pharm.Bull.26(9)、2
874−2879(1978) 3.Helv.Chim Acta.,861(19
21)
【0037】ベンゾジアゼピン−BSA接合体の調製 材料 ウシ血清アルブミン(BSA)フラクションV、試薬
級、ベンゾジアゼピン−NHS誘導体、DMSO(ジメ
チルスルホキシド)、50mMリン酸カリウム緩衝溶液
pH7.6、ベンゾジアゼピン保存溶液(5mg/mL
DMSO)、透析膜25,000MWCO。
【0038】方法 89mg/mLのBSAを、pH7.6のリン酸緩衝液
に溶解させた。この溶液中に最終濃度が55%DMSO
となるように、BSA/緩衝溶液中に氷浴中にて攪拌し
つつDMSOを滴々加えた。次いで10mLの溶液を室
温とし、1.5mgのBDZ−NHS保存物を加えた。
これを室温にて一夜攪拌した。該溶液を、過剰のDMS
Oおよびハプテンを除去するために透析した。これは、
DMSOの濃度が減少する段階的勾配にて行なった(D
MSO:緩衝溶液比3:7で室温にて3時間、1:9で
室温にて3時間、次いで緩衝溶液のみ、4℃にて一
夜)。BSA−ハプテン接合体の濃度を、280nmに
おいて分光学的に測定した。この接合物は、冷凍保存さ
れ得る。
【0039】ミクロ粒子試薬の調製 材料 カルボキシル化ポリスチレンミクロ粒子(0.1−0.
13ミクロン、Seradyn Inc.より)、N,
N−ジメチルホルムアミド(DMF)、1−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール(NHB.H2 O)(NHB貯留溶
液は、0.125gのNHB.H2 Oを2.5mLのD
MFに溶解させ、次いで2.5mLの脱イオン水を添
加、混合することにより新たに調製される。25mg/
mLの濃度で、全量は5.0mLである)、1−シクロ
ヘキシル−3−(2−モルホリノエチル)カルボジイミ
ドメト−p−トルエンスルホネート(CMC)(CMC
保存溶液は、0.25gを使用直前に5mLのH2 Oに
溶解することによって新たに調製される。濃度=50m
g/mL)、トライトンX−100、BDZ−BSA接
合体、0.05M炭酸水素ナトリウムpH8.6、BS
AフラクションV、試薬級、ミクロ粒子貯留緩衝溶液:
0.01Mリン酸カリウム緩衝溶液pH=6.0、0.
1%NaN3 および0.1%トライトンX−100を含
む。
【0040】方法 10mLのカルボキシ修飾ミクロ粒子(固形分10%)
を洗浄剤の交換のために0.1%トライトンX−100
を1:1,000,000の体積比で用いて洗浄した。
該ミクロ粒子の濃度を、500nmにおける標準曲線を
標準として3%に調節した。
【0041】活性化 2mLのNHB貯留溶液を、急速に攪拌されるミクロ粒
子(固形分3%)33mLに、徐々に滴々加えた。この
ミクロ粒子懸濁物を、室温にて10分間攪拌した。新た
に調製されたCMC貯留溶液2.9mLを滴々加えた
(NHB:CMC:ミクロ粒子試薬の比は3:3:
1)。CMCの添加後、ミクロ粒子懸濁物を室温で3時
間攪拌した。活性化ミクロ粒子を、上記のように0.1
%トライトンX−100にて洗浄し、有機溶媒および過
剰の活性化試薬を除去し、濃度を2%の固形分に調節し
た(500nmにて測定)。
【0042】接合体溶液の調製(BSA:BSA−BD
Z比は、1:0.25):BSA(187.5mg)お
よびBDZ−BSA(62.5mg)を、50mLの
0.05M炭酸水素ナトリウムpH8.6に溶解させ
た。
【0043】感作:50mLの活性化ミクロ粒子を、急
速に攪拌される接合体溶液に25°+/−1℃にて手速
く加えた。該混合物を同温度にて18時間インキュベー
トした。該ミクロ粒子を保存緩衝溶液の1,000,0
00倍量にて洗浄し、過剰のBSAを除去した。ミクロ
粒子試薬は、0.7%の固形分に調製された。
【0044】Olympus分析装置用のミクロ粒子試
薬の調製 ミクロ粒子試薬(0.7%)を、0.1%NaN3 およ
び0.05%トライトンX−100を含む0.01Mの
リン酸カリウム緩衝液pH6.0により、0.3%に希
釈した。
【0045】試験用抗体試薬の調製 ベレゾジアゼピンに対して選択的なヒツジポリクローナ
ル抗体を、下記の緩衝溶液pH7.0にて適切に希釈し
た。 50mM HEPES 0.5% NaCl 0.1% BSA 0.1% NaN3 4%PVP40(ポリビニルピロリドン、平均分子量=
40,000)。
【0046】試験用希釈剤の調製 希釈用緩衝溶液はpH7.0である。 50mM PIPES 2% NaCl 2.35%PVP360(平均分子量=360,00
0) 0.1% NaN3 0.05% NP40(Nonide+P−40)
【0047】ベンゾジアゼピンアッセイ 診断的試験を、分光光度計として機能するOlympu
s AU5000分析装置にて行なった。ミクロ粒子の
凝集を生じる懸濁物中のミクロ粒子の動力学的相互作用
を、混濁度変化について測定した。ミクロ粒子試薬を試
薬2(R2)として使用し、一方、等量の希釈剤と混合
した抗体試薬を試薬1(R1)として使用した。該分析
装置は、分析対象物を含む尿試料を15μlキュベット
中に分取し、続いて、180μlのR1を分配する。8
0μlのR2を分配した後、競合反応が始まる。吸光度
の変化を144秒間測定した。吸光度値を検量線と比較
し、結果がng/mlとして報告された。図3参照。P
VP40、PVP360および抗体濃度は、カットオ
フ、X、100ngノルジアゼパム/mLの周辺で特徴
的な所望の性能をもった最良の動的標準曲線を与えるよ
うに調節される。
【0048】例4 ベンゾジアゼピンアッセイ−PVP40の濃度効果 抗体および希釈剤を下記のとおり調製したことを除き、
例3と同じ材料および方法を用いた。
【0049】試験用抗体試薬の調製 ベンゾジアゼピンに対して選択的なヒツジポリクローナ
ル抗体を、下記の緩衝溶液中にpH7.0にて適切に希
釈した。 50mM HEPES 0.5% NaCl 0.1% BSA 0.1% NaN3 種々の濃度のPVP40 a) 0% b) 4% c) 6% d) 10%
【0050】試験用希釈剤の調製 希釈剤緩衝溶液は、pH7.0である: 50mM HEPES 2% NaCl 4% PVP40 0.1% NaN3 0.05% NP40 結果を図4に示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、例1で得られるTHCの検量線を例示
するグラフである。
【図2】図2は、例2において種々の濃度のPVP36
0を用いて得られるTHCアッセイの至適化を示すグラ
フである。
【図3】図3は、例3においてPVP−360およびP
VP−40を用いたベンゾジアゼピンアッセイに対して
の検量線の至適化を示すグラフである。
【図4】図4は、例4において種々の濃度のPVP−4
0を用いたベンゾジアゼピンに対する競合的ミクロ粒子
凝集反応の増強を示すグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 ジヨデイ ブレイク コートニイ アメリカ合衆国ニユージヤージー州アツパ ー モントクレアー,バレイ ロード 407 (72)発明者 ジヨセフ ジヨン パツサレリ アメリカ合衆国ニユージヤージー州リンゴ ーズ,エベリツツ ロード 34 (72)発明者 サルバトーレ ジヨセフ サラモン アメリカ合衆国ニユージヤージー州ルサー フオード,イー.ピエールポント アベニ ユー 37

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 凝集検出測定による体液試料中の標的分
    子検出のための方法であって、前記試料に、イムノアッ
    セイの感度および信号を増大するに有効な量のポリビニ
    ルピロリドン(PVP)を添加することを含んでなるミ
    クロ粒子に基づくイムノアッセイ方法。
  2. 【請求項2】 該凝集検出測定を、分光学的測定による
    混濁度(光吸収)にて行なう請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項3】 該PVPが、約360kDの平均分子量
    を有し、少なくとも約0.6%の最終濃度まで添加され
    る請求項1に記載の方法。
  4. 【請求項4】 凝集検出測定による体液試料中の標的分
    子検出のための、ミクロ粒子に基づくイムノアッセイ用
    診断キットであって、前記標的分子に対して選択的な抗
    体を含む試薬を収容する第1の容器および前記標的分子
    に対して選択的である免疫学的に活性なハプテン類また
    は抗体類が結合するミクロ粒子を含む試薬を収容する第
    2の容器を有してなり、いずれか一方の容器または2つ
    の組合せ中に、前記イムノアッセイの感度および信号を
    増大するに有効な量のPVPを含むことを特徴とする診
    断キット。
  5. 【請求項5】 凝集検出測定による体液試料中の標的分
    子検出のための、ミクロ粒子に基づくイムノアッセイ用
    診断キットであって、前記標的分子に対して選択的に抗
    体を含む試薬を収容する第1の容器、前記標的分子に対
    して選択的である免疫学的に活性なハプテンが結合する
    ミクロ粒子を含む試薬を収容する第2の容器、および希
    釈剤水溶液を含む試薬を収容する第3の容器を有してな
    り、前記容器の一つまたはそれらの組合せ中に、前記イ
    ムノアッセイの感度および信号を増大するに有効な量の
    PVPを含むことを特徴とする診断キット。
  6. 【請求項6】 凝集検出測定による体液試料中の標的分
    子検出のためのミクロ粒子に基づくイムノアッセイ用試
    薬であって、前記標的分子に対して選択的な抗体を有し
    てなり、前記イムノアッセイの感度および信号を増大す
    るに有効な量のPVPを含むことを特徴とする試薬。
  7. 【請求項7】 該PVPが、約360kDの平均分子量
    を有し、前記イムノアッセイにおいて少なくとも約0.
    6%の最終濃度を与えるために充分な量で存在する請求
    項6に記載の試薬。
  8. 【請求項8】 イムノアッセイの感度および信号を増大
    するための、ミクロ粒子に基づくイムノアッセイにおけ
    るPVPの使用。
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