JPH10282102A - 測定方法及び測定キット - Google Patents
測定方法及び測定キットInfo
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- JPH10282102A JPH10282102A JP9363797A JP9363797A JPH10282102A JP H10282102 A JPH10282102 A JP H10282102A JP 9363797 A JP9363797 A JP 9363797A JP 9363797 A JP9363797 A JP 9363797A JP H10282102 A JPH10282102 A JP H10282102A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 非特異的反応による凝集がなく、また、測定
対象物質が低濃度しか含有されていない生体試料におい
ても正確な測定が可能であり、高感度で迅速である測定
方法、及び、この測定方法を実施するための測定キット
を提供する。 【解決手段】 試料中の測定対象物質を測定するにあた
り、測定対象物質に対する抗原又は抗体を感作した不溶
性担体と上記試料とを混合して抗原抗体反応による凝集
反応を生じさせ、凝集反応液の吸光度変化量を測定して
検量線と照合することよりなる測定対象物質の測定方法
であって、上記凝集反応液は、分子量が５００〜２００
０で、主骨格としてステロイド環を有する界面活性剤を
凝集反応促進剤として含むものである測定方法。
対象物質が低濃度しか含有されていない生体試料におい
ても正確な測定が可能であり、高感度で迅速である測定
方法、及び、この測定方法を実施するための測定キット
を提供する。 【解決手段】 試料中の測定対象物質を測定するにあた
り、測定対象物質に対する抗原又は抗体を感作した不溶
性担体と上記試料とを混合して抗原抗体反応による凝集
反応を生じさせ、凝集反応液の吸光度変化量を測定して
検量線と照合することよりなる測定対象物質の測定方法
であって、上記凝集反応液は、分子量が５００〜２００
０で、主骨格としてステロイド環を有する界面活性剤を
凝集反応促進剤として含むものである測定方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、抗原抗体反応によ
る不溶性担体の凝集を促進する凝集促進剤及びそれを用
いた試料中のタンパク質等の物質の高感度で迅速な測定
方法、特にラテックス凝集比濁法を利用する測定方法及
びこの測定方法を実施するための測定キットに関する。
る不溶性担体の凝集を促進する凝集促進剤及びそれを用
いた試料中のタンパク質等の物質の高感度で迅速な測定
方法、特にラテックス凝集比濁法を利用する測定方法及
びこの測定方法を実施するための測定キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】生体試料中の生理活性物質量を測定する
ための方法としては、ＨＰＬＣ法、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法
等の免疫学的測定法等がある。近年、免疫学的測定方法
は、反応系の微量化、感度の向上、反応時間の短縮等を
目的として、ラテックス凝集によるものが開発されてい
る。このようなラテックス凝集による免疫的測定方法に
おいて用いられるラテックス凝集免疫試薬としては、様
々なものが上市されている。しかしながら、従来のラテ
ックス凝集免疫試薬は、非特異的反応による凝集がよく
見られ、ＲＩＡ法やＥＩＡ法等に比べると、検出方法が
凝集による濁度の変化を測定しており、特に低濃度域で
は正確に測定できない等の問題があった。
ための方法としては、ＨＰＬＣ法、ＲＩＡ法、ＥＩＡ法
等の免疫学的測定法等がある。近年、免疫学的測定方法
は、反応系の微量化、感度の向上、反応時間の短縮等を
目的として、ラテックス凝集によるものが開発されてい
る。このようなラテックス凝集による免疫的測定方法に
おいて用いられるラテックス凝集免疫試薬としては、様
々なものが上市されている。しかしながら、従来のラテ
ックス凝集免疫試薬は、非特異的反応による凝集がよく
見られ、ＲＩＡ法やＥＩＡ法等に比べると、検出方法が
凝集による濁度の変化を測定しており、特に低濃度域で
は正確に測定できない等の問題があった。
【０００３】特許第２５６１７５３号には、ＨＬＢ１６
以上の界面活性剤を含み、ラテックスを担体として用い
た測定キットが開示されている。しかしながら、特に、
ラテックスのようなポリマーを担体として用いた測定キ
ットでの界面活性剤の用途は洗浄剤であり、測定機器等
に付着する担体等の汚れを洗浄するものであった。ま
た、界面活性剤は分散性を向上させるため、凝集反応を
利用する免疫的測定法では測定系に混入させることはな
く、混入させても極微量であった。
以上の界面活性剤を含み、ラテックスを担体として用い
た測定キットが開示されている。しかしながら、特に、
ラテックスのようなポリマーを担体として用いた測定キ
ットでの界面活性剤の用途は洗浄剤であり、測定機器等
に付着する担体等の汚れを洗浄するものであった。ま
た、界面活性剤は分散性を向上させるため、凝集反応を
利用する免疫的測定法では測定系に混入させることはな
く、混入させても極微量であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記に鑑
み、非特異的反応による凝集がなく、また、測定対象物
質が低濃度しか含有されていない生体試料においても正
確な測定が可能であり、高感度で迅速である測定方法、
及び、この測定方法を実施するための測定キットを提供
することを目的とする。
み、非特異的反応による凝集がなく、また、測定対象物
質が低濃度しか含有されていない生体試料においても正
確な測定が可能であり、高感度で迅速である測定方法、
及び、この測定方法を実施するための測定キットを提供
することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料中の測定
対象物質を測定するにあたり、測定対象物質に対する抗
原又は抗体を感作した不溶性担体と上記試料とを混合し
て抗原抗体反応による凝集反応を生じさせ、凝集反応液
の吸光度変化量を測定して検量線と照合することよりな
る測定対象物質の測定方法であって、上記凝集反応液
は、分子量が５００〜２０００で、主骨格としてステロ
イド環を有する界面活性剤を凝集反応促進剤として含む
ものである測定方法である。以下に本発明を詳述する。
対象物質を測定するにあたり、測定対象物質に対する抗
原又は抗体を感作した不溶性担体と上記試料とを混合し
て抗原抗体反応による凝集反応を生じさせ、凝集反応液
の吸光度変化量を測定して検量線と照合することよりな
る測定対象物質の測定方法であって、上記凝集反応液
は、分子量が５００〜２０００で、主骨格としてステロ
イド環を有する界面活性剤を凝集反応促進剤として含む
ものである測定方法である。以下に本発明を詳述する。
【０００６】本発明においては、試料中の測定対象物質
を測定するにあたり、まず、測定対象物質に対する抗原
又は抗体を感作した不溶性担体と試料とを混合して抗原
抗体反応による凝集反応を生じさせる。
を測定するにあたり、まず、測定対象物質に対する抗原
又は抗体を感作した不溶性担体と試料とを混合して抗原
抗体反応による凝集反応を生じさせる。
【０００７】上記試料としては特に限定されず、例え
ば、血清、血漿等が挙げられる。また、本発明の測定方
法は、これら以外の各種の生体試料、非生体試料に適用
することも可能である。
ば、血清、血漿等が挙げられる。また、本発明の測定方
法は、これら以外の各種の生体試料、非生体試料に適用
することも可能である。
【０００８】上記測定対象物質としては、生理活性物質
であればその作用や種類は特に限定されないが、抗原抗
体反応を利用するため、分子量が１０００〜１０万のも
のが好ましい。分子量が小さすぎると、抗原又は抗体が
測定対象物質と反応するのが困難となり、分子量が大き
すぎると、精度が低下する。
であればその作用や種類は特に限定されないが、抗原抗
体反応を利用するため、分子量が１０００〜１０万のも
のが好ましい。分子量が小さすぎると、抗原又は抗体が
測定対象物質と反応するのが困難となり、分子量が大き
すぎると、精度が低下する。
【０００９】上記不溶性担体としては、粒径が比較的一
定であり、一定の品質、性能のものを工業的に大量生産
することができるラテックス粒子が用いられる。上記ラ
テックス粒子の素材としては特に限定されず、例えば、
スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニ
ル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビ
ニル系モノマーの単独重合体又は共重合体；スチレン−
ブタジエン共重合体、メチル（メタ）アクリレート−ブ
タジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等が挙げら
れる。なかでも、抗原又は抗体の吸着性に優れており、
生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、
ポリスチレン系のラテックス粒子が特に好ましい。
定であり、一定の品質、性能のものを工業的に大量生産
することができるラテックス粒子が用いられる。上記ラ
テックス粒子の素材としては特に限定されず、例えば、
スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニ
ル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビ
ニル系モノマーの単独重合体又は共重合体；スチレン−
ブタジエン共重合体、メチル（メタ）アクリレート−ブ
タジエン共重合体等のブタジエン系共重合体等が挙げら
れる。なかでも、抗原又は抗体の吸着性に優れており、
生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、
ポリスチレン系のラテックス粒子が特に好ましい。
【００１０】上記ラテックス粒子の粒径は、０．０２〜
０．５μｍであることが好ましい。上記ラテックス粒子
の粒径が小さすぎると、凍結乾燥を行ったときに分散が
困難になり、上記ラテックス粒子の粒径が大きすぎる
と、自己凝集が進み、分散性が低下する。より好ましく
は、０．０５〜０．２μｍである。
０．５μｍであることが好ましい。上記ラテックス粒子
の粒径が小さすぎると、凍結乾燥を行ったときに分散が
困難になり、上記ラテックス粒子の粒径が大きすぎる
と、自己凝集が進み、分散性が低下する。より好ましく
は、０．０５〜０．２μｍである。
【００１１】本発明においては、上記不溶性担体に、測
定対象物質に対する抗原又は抗体を感作する。本明細書
において「感作」とは、測定対象物質に対する抗原又は
抗体を不溶性担体表面に吸着させることをいい、上記感
作は、例えば、物理的又は化学的に吸着させる方法等に
より行うことができる。
定対象物質に対する抗原又は抗体を感作する。本明細書
において「感作」とは、測定対象物質に対する抗原又は
抗体を不溶性担体表面に吸着させることをいい、上記感
作は、例えば、物理的又は化学的に吸着させる方法等に
より行うことができる。
【００１２】上記抗体としては特に限定されず、例え
ば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が挙げ
られる。上記ポリクローナル抗体は、由来の動物種（ヒ
ト、ウサギ、ヤギ等）、純度（グロブリン画分又はアフ
ィニティ精製画分等）、処理方法（Ｆａｂ′又はＦ（ａ
ｂ）2 ）によって制限されるものではない。
ば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等が挙げ
られる。上記ポリクローナル抗体は、由来の動物種（ヒ
ト、ウサギ、ヤギ等）、純度（グロブリン画分又はアフ
ィニティ精製画分等）、処理方法（Ｆａｂ′又はＦ（ａ
ｂ）2 ）によって制限されるものではない。
【００１３】本発明においては、上記反応溶液中の上記
不溶性担体の濃度は、０．０３〜３重量％であることが
好ましい。上記不溶性担体の濃度が小さすぎると、凝集
塊の形成が不充分で必要な感度が得られず、上記不溶性
担体の濃度が大きすぎると、バックグラウンドとしての
吸光度が高すぎて正確な測定ができない。
不溶性担体の濃度は、０．０３〜３重量％であることが
好ましい。上記不溶性担体の濃度が小さすぎると、凝集
塊の形成が不充分で必要な感度が得られず、上記不溶性
担体の濃度が大きすぎると、バックグラウンドとしての
吸光度が高すぎて正確な測定ができない。
【００１４】本発明においては、上記凝集反応液は、凝
集反応促進剤を含むものである。上記凝集反応促進剤
は、界面活性剤である。
集反応促進剤を含むものである。上記凝集反応促進剤
は、界面活性剤である。
【００１５】本明細書において「界面活性剤」とは、分
子内に親水性部分と親油性部分を含有しており、これら
のそれぞれが親水性物質及び親油性物質と親和すること
により乳化や懸濁を安定化させる働きを有する物質をい
う。これらの物質中の親水性部分及び親油性部分は、そ
れぞれ少なくとも１つあればよいが、両方とも有してい
なくてはならない。このような界面活性剤でないと、不
溶性担体や測定対象物質との親和性がないため、所期の
反応促進効果等が得られない。
子内に親水性部分と親油性部分を含有しており、これら
のそれぞれが親水性物質及び親油性物質と親和すること
により乳化や懸濁を安定化させる働きを有する物質をい
う。これらの物質中の親水性部分及び親油性部分は、そ
れぞれ少なくとも１つあればよいが、両方とも有してい
なくてはならない。このような界面活性剤でないと、不
溶性担体や測定対象物質との親和性がないため、所期の
反応促進効果等が得られない。
【００１６】上記凝集反応促進剤の分子量は、５００〜
２０００である。上記凝集反応促進剤の分子量が、５０
０未満であると、反応時に不溶性担体等を乳化するた
め、良好な凝集反応が得られず、上記凝集反応促進剤の
分子量が、２０００を超えると、界面活性剤としての効
果が低下するため所期の効果が得られないため、上記範
囲に限定される。好ましくは、６００〜１０００であ
る。
２０００である。上記凝集反応促進剤の分子量が、５０
０未満であると、反応時に不溶性担体等を乳化するた
め、良好な凝集反応が得られず、上記凝集反応促進剤の
分子量が、２０００を超えると、界面活性剤としての効
果が低下するため所期の効果が得られないため、上記範
囲に限定される。好ましくは、６００〜１０００であ
る。
【００１７】上記凝集反応促進剤は、主骨格としてステ
ロイド環を有する。上記主骨格としてステロイド環を有
するものとしては、凝集反応促進剤中に主骨格としてス
テロイド環を有していれば特に限定されず、その側鎖に
は界面活性作用を与えるための種々の官能基が結合して
いてもよい。
ロイド環を有する。上記主骨格としてステロイド環を有
するものとしては、凝集反応促進剤中に主骨格としてス
テロイド環を有していれば特に限定されず、その側鎖に
は界面活性作用を与えるための種々の官能基が結合して
いてもよい。
【００１８】本発明で用いられる凝集反応促進剤として
は、上述の条件を満たすものであれば特に限定されず、
例えば、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピ
ル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）
（分子量：６１４．８９、ＨＬＢ：４４．８）、ＢＩＧ
ＣＨＡＰ（Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロ
ピル）コールアミド）（分子量：８７８．０７、ＨＬ
Ｂ：３１．７）、サイコサポニン（分子量７８１）等の
種々のサポニン等が挙げられる。
は、上述の条件を満たすものであれば特に限定されず、
例えば、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピ
ル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）
（分子量：６１４．８９、ＨＬＢ：４４．８）、ＢＩＧ
ＣＨＡＰ（Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロ
ピル）コールアミド）（分子量：８７８．０７、ＨＬ
Ｂ：３１．７）、サイコサポニン（分子量７８１）等の
種々のサポニン等が挙げられる。
【００１９】上記凝集反応促進剤は、適当な媒体に分散
及び溶解させて使用することが好ましい。この場合にお
いては、上記不溶性担体と上記凝集反応促進剤とを同一
の媒体に分散又は溶解させることにより１液型のラテッ
クス試薬として使用してもよいし、また、それぞれ、別
個に媒体に分散又は溶解させることにより、ラテックス
試薬と溶液状の試薬である検体希釈用液との２液型試薬
として使用してもよい。
及び溶解させて使用することが好ましい。この場合にお
いては、上記不溶性担体と上記凝集反応促進剤とを同一
の媒体に分散又は溶解させることにより１液型のラテッ
クス試薬として使用してもよいし、また、それぞれ、別
個に媒体に分散又は溶解させることにより、ラテックス
試薬と溶液状の試薬である検体希釈用液との２液型試薬
として使用してもよい。
【００２０】上記媒体としては特に限定されず、例え
ば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝
液、グッドの緩衝液等が挙げられる。上記媒体のｐＨ
は、５．５〜８．５が好ましい。
ば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝
液、グッドの緩衝液等が挙げられる。上記媒体のｐＨ
は、５．５〜８．５が好ましい。
【００２１】上記凝集反応促進剤の濃度は、凝集反応を
行う溶液（１液型の場合は試料及びラテックス試薬の混
合液、２液型の場合は試料、ラテックス試薬及び検体希
釈用液の混合液）中において、０．０１〜０．１重量％
になるように添加して使用することが好ましい。
行う溶液（１液型の場合は試料及びラテックス試薬の混
合液、２液型の場合は試料、ラテックス試薬及び検体希
釈用液の混合液）中において、０．０１〜０．１重量％
になるように添加して使用することが好ましい。
【００２２】上記１液型のラテックス試薬中には、更
に、ウシ血清アルブミン、塩化コリン、ショ糖、塩濃度
調整のための塩化ナトリウム等を適宜溶解させてもよ
い。また、上記２液型試薬中にも、それぞれにウシ血清
アルブミン、塩化コリン、ショ糖、塩濃度調整のための
塩化ナトリウム等を適宜溶解させてもよい。
に、ウシ血清アルブミン、塩化コリン、ショ糖、塩濃度
調整のための塩化ナトリウム等を適宜溶解させてもよ
い。また、上記２液型試薬中にも、それぞれにウシ血清
アルブミン、塩化コリン、ショ糖、塩濃度調整のための
塩化ナトリウム等を適宜溶解させてもよい。
【００２３】本発明においては、凝集反応時間は、５秒
〜１５分間が好ましい。反応時間が短すぎると、正確な
測定ができず、反応時間が長すぎると、非特異反応によ
る凝集が生じて正確な測定ができない。上記凝集反応温
度は、恒温において行われることが好ましい。より好ま
しくは、２５〜３７℃である。
〜１５分間が好ましい。反応時間が短すぎると、正確な
測定ができず、反応時間が長すぎると、非特異反応によ
る凝集が生じて正確な測定ができない。上記凝集反応温
度は、恒温において行われることが好ましい。より好ま
しくは、２５〜３７℃である。
【００２４】本発明においては、次に、上記凝集反応に
基づく吸光度変化量を測定して検量線と照合することに
より、測定対象物質を測定する。上記吸光度変化量は、
凝集反応に伴う吸光度の増加量である。
基づく吸光度変化量を測定して検量線と照合することに
より、測定対象物質を測定する。上記吸光度変化量は、
凝集反応に伴う吸光度の増加量である。
【００２５】上記吸光度変化量の測定の際の測定波長
は、通常、５００〜１０００ｎｍの範囲から適切な波長
が選択される。上記吸光度変化量の測定に用いられる測
定装置としては、経時的に上記溶液の吸光度を測定する
ことができるものであれば特に限定されず、例えば、汎
用の生化学自動分析装置等が挙げられる。上記吸光度変
化量の測定における測定波長、検体量、試薬量等は、装
置に合わせて適宜選択することができる。
は、通常、５００〜１０００ｎｍの範囲から適切な波長
が選択される。上記吸光度変化量の測定に用いられる測
定装置としては、経時的に上記溶液の吸光度を測定する
ことができるものであれば特に限定されず、例えば、汎
用の生化学自動分析装置等が挙げられる。上記吸光度変
化量の測定における測定波長、検体量、試薬量等は、装
置に合わせて適宜選択することができる。
【００２６】上記検量線と照合する具体的な方法として
は、例えば、既知量の試料（例えば、測定対象物質の標
準血清とその希釈系列等）について、吸光度変化量の測
定を行い、その測定値とその物質量とから検量線を作成
しておき、濃度未知の試料について同一条件で測定した
吸光度変化量の測定値から上記検量線において対応する
物質量を求めることにより実施することができる。
は、例えば、既知量の試料（例えば、測定対象物質の標
準血清とその希釈系列等）について、吸光度変化量の測
定を行い、その測定値とその物質量とから検量線を作成
しておき、濃度未知の試料について同一条件で測定した
吸光度変化量の測定値から上記検量線において対応する
物質量を求めることにより実施することができる。
【００２７】本発明２は、本発明１の測定方法を実施す
るための測定キットであって、測定対象物質の抗原又は
抗体を感作したラテックス粒子と、凝集反応促進剤とし
て分子量が５００〜２０００で、主骨格としてステロイ
ド環を有する界面活性剤とを含む測定キットである。上
記凝集反応促進剤は、上記不溶性担体と同一の媒体に分
散又は溶解させることにより１液型のラテックス試薬と
して使用してもよいし、また、それぞれ、別個に媒体に
分散又は溶解させることにより、ラテックス試薬と溶液
状の試薬である検体希釈用液との２液型試薬として使用
してもよい。
るための測定キットであって、測定対象物質の抗原又は
抗体を感作したラテックス粒子と、凝集反応促進剤とし
て分子量が５００〜２０００で、主骨格としてステロイ
ド環を有する界面活性剤とを含む測定キットである。上
記凝集反応促進剤は、上記不溶性担体と同一の媒体に分
散又は溶解させることにより１液型のラテックス試薬と
して使用してもよいし、また、それぞれ、別個に媒体に
分散又は溶解させることにより、ラテックス試薬と溶液
状の試薬である検体希釈用液との２液型試薬として使用
してもよい。
【００２８】本発明２で用いられるラテックス粒子は、
本発明１において説明したものと同様のものである。
本発明１において説明したものと同様のものである。
【００２９】本発明２の測定キットを用いて測定する具
体的な方法としては、例えば、汎用の生化学自動分析装
置を用いる場合には、本発明２の測定キットを所定の位
置にセットし、測定すべき試料及び既知量の試料をセッ
トし、適宜、吸光度測定のための条件をセットすること
により実施することができる。また、吸光度変化量の測
定に吸光度計を用いる場合には、本発明２の測定キッ
ト、測定すべき試料及び既知量の試料を混合、攪拌し、
一定の時間経過後、その吸光度を測定することにより実
施することができる。好ましくは、汎用の生化学自動分
析装置を用いる方法である。このような生化学自動分析
装置としては特に限定されず、例えば、日立製作所社製
の７１５０型自動分析装置、ＣＯＢＡＳ社製のＭＩＲＡ
等が挙げられる。
体的な方法としては、例えば、汎用の生化学自動分析装
置を用いる場合には、本発明２の測定キットを所定の位
置にセットし、測定すべき試料及び既知量の試料をセッ
トし、適宜、吸光度測定のための条件をセットすること
により実施することができる。また、吸光度変化量の測
定に吸光度計を用いる場合には、本発明２の測定キッ
ト、測定すべき試料及び既知量の試料を混合、攪拌し、
一定の時間経過後、その吸光度を測定することにより実
施することができる。好ましくは、汎用の生化学自動分
析装置を用いる方法である。このような生化学自動分析
装置としては特に限定されず、例えば、日立製作所社製
の７１５０型自動分析装置、ＣＯＢＡＳ社製のＭＩＲＡ
等が挙げられる。
【００３０】本発明の測定方法によれば、測定対象物質
に対する抗原又は抗体を感作した不溶性担体と試料とを
混合し、抗原抗体反応を契機としたラテックス凝集反応
を生ぜしめ、この溶液の吸光度変化量を測定し、予め作
成しておいた検量線を用いて、濃度未知の試料中の測定
対象物質量を正確に測定することができる。また、本発
明の測定方法を実施するための測定キットを用いること
により、試料中の測定対象物質量を正確に測定すること
ができる。
に対する抗原又は抗体を感作した不溶性担体と試料とを
混合し、抗原抗体反応を契機としたラテックス凝集反応
を生ぜしめ、この溶液の吸光度変化量を測定し、予め作
成しておいた検量線を用いて、濃度未知の試料中の測定
対象物質量を正確に測定することができる。また、本発
明の測定方法を実施するための測定キットを用いること
により、試料中の測定対象物質量を正確に測定すること
ができる。
【００３１】
【実施例】以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。
明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるもの
ではない。
【００３２】実施例１〜３、比較例１、２ １）試薬及び材料ラテックス 平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）を用いた。ラテックス希釈用緩衝液 ５０ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 と５０ｍＭのＮａＨ2 ＰＯ4
とをｐＨ７．５０になるように混合して用いた。抗プラスミノーゲン（ＰＬＧ）抗体 ヤギの抗血清からイムノグロブリン分画にまで精製した
ヤギ抗ＰＬＧ抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を用いた。
形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）を用いた。ラテックス希釈用緩衝液 ５０ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 と５０ｍＭのＮａＨ2 ＰＯ4
とをｐＨ７．５０になるように混合して用いた。抗プラスミノーゲン（ＰＬＧ）抗体 ヤギの抗血清からイムノグロブリン分画にまで精製した
ヤギ抗ＰＬＧ抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を用いた。
【００３３】抗体希釈用緩衝液 ラテックス希釈用緩衝液を、抗体希釈用緩衝液として用
いた。ブロッキング用緩衝液 １００ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 と１００ｍＭのＮａＨ2 Ｐ
Ｏ4 とをｐＨ７．４０になるように混合し、ウシ血清ア
ルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉ
ｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｇｒａｄ
ｅ、Ｍｉｌｅｓ Ｃｏｒｐ．社製）を１％（Ｗ／Ｖ）に
なるように、また、ＮａＮ3 （試薬特級、ナカライテス
ク社製）を０．１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したも
のを用いた。 プラスミノーゲン標準ヒト血清 ヒトプール血清からアフィニティクロマトグラフィによ
りＰＬＧを除去し、それに対して精密に秤量した精製抗
原を加え、２０ｍｇ／ｄｌのＰＬＧを含有する血清を調
製した。更に、生理食塩水にて１５．５、１０．２、
５．５、２．７ｍｇ／ｄｌにそれぞれ希釈して使用し
た。また、ＰＬＧを含まない、生理食塩水のみのものを
０ｍｇ／ｄｌとした。検体希釈用希釈液（Ｒ1 液 ） ブロッキング用緩衝液に、表１に示した添加物を３％
（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを用いた。なお、
表１中のＭＥＧＡ−８は、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチ
ルグルカミド、ドデシルマルトシドは、ｎ−ドデシル−
β−Ｄ−マルトピラノシドを表す。
いた。ブロッキング用緩衝液 １００ｍＭのＮａ2 ＨＰＯ4 と１００ｍＭのＮａＨ2 Ｐ
Ｏ4 とをｐＨ７．４０になるように混合し、ウシ血清ア
ルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉ
ｎ、ＦｒａｃｔｉｏｎＶ、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｇｒａｄ
ｅ、Ｍｉｌｅｓ Ｃｏｒｐ．社製）を１％（Ｗ／Ｖ）に
なるように、また、ＮａＮ3 （試薬特級、ナカライテス
ク社製）を０．１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したも
のを用いた。 プラスミノーゲン標準ヒト血清 ヒトプール血清からアフィニティクロマトグラフィによ
りＰＬＧを除去し、それに対して精密に秤量した精製抗
原を加え、２０ｍｇ／ｄｌのＰＬＧを含有する血清を調
製した。更に、生理食塩水にて１５．５、１０．２、
５．５、２．７ｍｇ／ｄｌにそれぞれ希釈して使用し
た。また、ＰＬＧを含まない、生理食塩水のみのものを
０ｍｇ／ｄｌとした。検体希釈用希釈液（Ｒ1 液 ） ブロッキング用緩衝液に、表１に示した添加物を３％
（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを用いた。なお、
表１中のＭＥＧＡ−８は、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチ
ルグルカミド、ドデシルマルトシドは、ｎ−ドデシル−
β−Ｄ−マルトピラノシドを表す。
【００３４】
【表１】
【００３５】２）方法 （１）ラテックス試薬の調製 平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固
形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）１容に、ラ
テックス希釈用緩衝液３容を添加希釈し、２．５％（Ｗ
／Ｖ）ラテックス液とした。抗ＰＬＧ抗体は、タンパク
濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希
釈し、感作抗体液とした。２．５％（Ｗ／Ｖ）ラテック
ス液２００μｌを２５℃のインキュベーター中でマグネ
チックスターラーで攪拌しながら、抗体感作液８００μ
ｌを素早く添加し、２５℃にて１時間攪拌した。その
後、ブロッキング用緩衝液を２．０ｍｌ添加し、２５℃
にて続けて２時間攪拌した。その後、１５℃、１５００
０ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。得られた沈殿にブ
ロッキング用緩衝液４．０ｍｌを添加し、同様に遠心分
離することにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は３回行
った。この沈殿にブロッキング用緩衝液を２．０ｍｌ添
加し、よく攪拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行
い、固形分０．２５％（Ｗ／Ｖ）のラテックス試薬とし
た。このようにして調製したラテックス試薬は４℃にて
保存した。
形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学工業社製）１容に、ラ
テックス希釈用緩衝液３容を添加希釈し、２．５％（Ｗ
／Ｖ）ラテックス液とした。抗ＰＬＧ抗体は、タンパク
濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希
釈し、感作抗体液とした。２．５％（Ｗ／Ｖ）ラテック
ス液２００μｌを２５℃のインキュベーター中でマグネ
チックスターラーで攪拌しながら、抗体感作液８００μ
ｌを素早く添加し、２５℃にて１時間攪拌した。その
後、ブロッキング用緩衝液を２．０ｍｌ添加し、２５℃
にて続けて２時間攪拌した。その後、１５℃、１５００
０ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。得られた沈殿にブ
ロッキング用緩衝液４．０ｍｌを添加し、同様に遠心分
離することにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は３回行
った。この沈殿にブロッキング用緩衝液を２．０ｍｌ添
加し、よく攪拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行
い、固形分０．２５％（Ｗ／Ｖ）のラテックス試薬とし
た。このようにして調製したラテックス試薬は４℃にて
保存した。
【００３６】（２）ラテックス試薬によるＰＬＧ量の測
定 ラテックス試薬によるＰＬＧ量の測定は、生化学用自動
分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行っ
た。上記（１）で得られた固形分０．２５％（Ｗ／Ｖ）
のラテックス試薬をそのままＲ2 液（固形分０．２５％
（Ｗ／Ｖ））とした。測定条件は以下の通りであった。 検体容量 ３μｌ 検体希釈液（Ｒ1 液） ３００μｌ 試薬（Ｒ2 液） １００μｌ 測定波長 ５７０ｎｍ 測定温度 ３７℃
定 ラテックス試薬によるＰＬＧ量の測定は、生化学用自動
分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行っ
た。上記（１）で得られた固形分０．２５％（Ｗ／Ｖ）
のラテックス試薬をそのままＲ2 液（固形分０．２５％
（Ｗ／Ｖ））とした。測定条件は以下の通りであった。 検体容量 ３μｌ 検体希釈液（Ｒ1 液） ３００μｌ 試薬（Ｒ2 液） １００μｌ 測定波長 ５７０ｎｍ 測定温度 ３７℃
【００３７】試薬（Ｒ2 液）を添加してから約８０秒後
の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７０）
を測定し、この吸光度の差を１００００倍したものを吸
光度変化量とした。検体の代わりに既知濃度の血液項目
標準血清で同様の測定を行って、予め、検量線を作成し
ておき、上記検体の吸光度変化量を上記検量線に外挿し
て、検体中のＰＬＧ量を算出した。
の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７０）
を測定し、この吸光度の差を１００００倍したものを吸
光度変化量とした。検体の代わりに既知濃度の血液項目
標準血清で同様の測定を行って、予め、検量線を作成し
ておき、上記検体の吸光度変化量を上記検量線に外挿し
て、検体中のＰＬＧ量を算出した。
【００３８】３）試験と結果 （１）実施例１〜３、比較例１、２ プラスミノーゲン標準ヒト血清を用いて上記２）の
（２）ラテックス試薬によるＰＬＧ量の測定に従って、
吸光度変化量を得た。その時、添加物として表１に示し
たものを用いた。結果は、表２及び図１に示した。表２
及び図１から明らかなように、特定の凝集反応促進剤を
用いることにより、吸光度変化量が大きく、高い反応性
が得られることが明らかとなった。
（２）ラテックス試薬によるＰＬＧ量の測定に従って、
吸光度変化量を得た。その時、添加物として表１に示し
たものを用いた。結果は、表２及び図１に示した。表２
及び図１から明らかなように、特定の凝集反応促進剤を
用いることにより、吸光度変化量が大きく、高い反応性
が得られることが明らかとなった。
【００３９】
【表２】
【００４０】
【発明の効果】本発明の測定方法は、上述の構成からな
るので、従来のラテックス凝集免疫試薬に見られたよう
な検体中の共存物質による非特異的反応を抑制し、測定
対象物質が低濃度しか含有されていなくても、高い検出
感度を示す。また、この測定方法を実施するための測定
キットを用いることにより、迅速、簡便に測定対象物質
を正確に測定することが可能となり、疾患の発見、病態
の把握、治療方法の決定等に有効に利用することができ
る。
るので、従来のラテックス凝集免疫試薬に見られたよう
な検体中の共存物質による非特異的反応を抑制し、測定
対象物質が低濃度しか含有されていなくても、高い検出
感度を示す。また、この測定方法を実施するための測定
キットを用いることにより、迅速、簡便に測定対象物質
を正確に測定することが可能となり、疾患の発見、病態
の把握、治療方法の決定等に有効に利用することができ
る。
【図１】実施例１〜３及び比較例１、２の相関を示す図
である。縦軸は、吸光度変化量であり、横軸は、ＰＬＧ
の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。
である。縦軸は、吸光度変化量であり、横軸は、ＰＬＧ
の濃度（ｍｇ／ｄｌ）である。
Claims (2)
- 【請求項１】 試料中の測定対象物質を測定するにあた
り、測定対象物質に対する抗原又は抗体を感作した不溶
性担体と前記試料とを混合して抗原抗体反応による凝集
反応を生じさせ、凝集反応液の吸光度変化量を測定して
検量線と照合することよりなる測定対象物質の測定方法
であって、前記凝集反応液は、分子量が５００〜２００
０で、主骨格としてステロイド環を有する界面活性剤を
凝集反応促進剤として含むものであることを特徴とする
測定方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の測定方法を実施するため
の測定キットであって、測定対象物質の抗原又は抗体を
感作したラテックス粒子と、凝集反応促進剤として分子
量が５００〜２０００で、主骨格としてステロイド環を
有する界面活性剤とを含むことを特徴とする測定キッ
ト。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9363797A JPH10282102A (ja) | 1997-04-11 | 1997-04-11 | 測定方法及び測定キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9363797A JPH10282102A (ja) | 1997-04-11 | 1997-04-11 | 測定方法及び測定キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10282102A true JPH10282102A (ja) | 1998-10-23 |
Family
ID=14087870
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9363797A Withdrawn JPH10282102A (ja) | 1997-04-11 | 1997-04-11 | 測定方法及び測定キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10282102A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016125948A (ja) * | 2015-01-07 | 2016-07-11 | Jsr株式会社 | 粒子分散液、標的物質の検出に用いるためのキット、及び標的物質の検出方法 |
-
1997
- 1997-04-11 JP JP9363797A patent/JPH10282102A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016125948A (ja) * | 2015-01-07 | 2016-07-11 | Jsr株式会社 | 粒子分散液、標的物質の検出に用いるためのキット、及び標的物質の検出方法 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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| A977 | Report on retrieval |
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|
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