JPH0577389B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0577389B2 JPH0577389B2 JP62171772A JP17177287A JPH0577389B2 JP H0577389 B2 JPH0577389 B2 JP H0577389B2 JP 62171772 A JP62171772 A JP 62171772A JP 17177287 A JP17177287 A JP 17177287A JP H0577389 B2 JPH0577389 B2 JP H0577389B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- culture substrate
- culture
- frozen
- anchorage
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 29
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 22
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003211 trypan blue cell staining Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、培養基質上に培養された形態的特徴
を維持したまま凍結され、長期保存可能になつて
いる状態の動物細胞およびその製造法に関する。 〔従来の技術〕 培養動物細胞を凍結保存することは、長期間に
渡つて継代培養された細胞の性質が一般に変化し
やすいことから、安定した性質を維持している細
胞を繰り返し、再現性よく使用するために、学術
研究、商業目的を問わず、繁用されている技術で
ある。このための一般的技術は、培養細胞を凍結
障害保護剤を含む凍結用培地に懸濁しアンプルに
詰めて凍結保存するというものである。 〔発明が解決しようとする問題点〕 この方法では、当初から懸濁状態で培養されて
いる浮遊性細胞はそのままの状態で凍結できる
が、培養基質上に付着して生存増殖する足場依存
性細胞は、これをそのまま凍結すると培養基質か
ら剥離して死滅してしまうため、トリプシン等を
用いて培養基質から剥離し、懸濁状態にしてから
凍結しなければならない。しかし足場依存性細胞
は培養基質から剥離すると、本来の形態的特徴を
失うと同時に急速に増殖能等の生理的機能をも失
う。凍結融解後も基質上に播種してから、基質に
十分に接着伸展している通常の培養状態に回復す
るまでに長時間を要するという問題がある。 したがつて本発明の目的は、凍結融解後、細胞
機能を速やかに回復する凍結動物細胞及びその製
造法を提供することである。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、培養基質上に培養された状態で、凍
結用培地と共に培養基質ごと凍結されている足場
依存性動物細胞及び、足場依存性動物細胞を培養
基質上で培養したのち、培養用培地を凍結用培地
に交換し、培養基質上に付着している足場依存性
動物細胞を凍結用培地と共に直ちに培養基質ごと
凍結することを特徴とする、培養基質上に培養さ
れた状態で凍結されている足場依存性動物細胞の
製造法を提供するものである。 本発明の足場依存性細胞の代表例を以下に示
す。
を維持したまま凍結され、長期保存可能になつて
いる状態の動物細胞およびその製造法に関する。 〔従来の技術〕 培養動物細胞を凍結保存することは、長期間に
渡つて継代培養された細胞の性質が一般に変化し
やすいことから、安定した性質を維持している細
胞を繰り返し、再現性よく使用するために、学術
研究、商業目的を問わず、繁用されている技術で
ある。このための一般的技術は、培養細胞を凍結
障害保護剤を含む凍結用培地に懸濁しアンプルに
詰めて凍結保存するというものである。 〔発明が解決しようとする問題点〕 この方法では、当初から懸濁状態で培養されて
いる浮遊性細胞はそのままの状態で凍結できる
が、培養基質上に付着して生存増殖する足場依存
性細胞は、これをそのまま凍結すると培養基質か
ら剥離して死滅してしまうため、トリプシン等を
用いて培養基質から剥離し、懸濁状態にしてから
凍結しなければならない。しかし足場依存性細胞
は培養基質から剥離すると、本来の形態的特徴を
失うと同時に急速に増殖能等の生理的機能をも失
う。凍結融解後も基質上に播種してから、基質に
十分に接着伸展している通常の培養状態に回復す
るまでに長時間を要するという問題がある。 したがつて本発明の目的は、凍結融解後、細胞
機能を速やかに回復する凍結動物細胞及びその製
造法を提供することである。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明は、培養基質上に培養された状態で、凍
結用培地と共に培養基質ごと凍結されている足場
依存性動物細胞及び、足場依存性動物細胞を培養
基質上で培養したのち、培養用培地を凍結用培地
に交換し、培養基質上に付着している足場依存性
動物細胞を凍結用培地と共に直ちに培養基質ごと
凍結することを特徴とする、培養基質上に培養さ
れた状態で凍結されている足場依存性動物細胞の
製造法を提供するものである。 本発明の足場依存性細胞の代表例を以下に示
す。
以下実施例により本発明を更に具体的に説明す
る。 実施例 １ Ｌ細胞の凍結 (1) 直径35mmのプラスチツク製培養皿に２mlの１
％ゼラチン水溶液を入れ、室温で30分放置し、
培養基質表面をコーテイングした。 (2) ゼラチン水溶液を捨て、２mlの培養用培地に
懸濁した105個ないし４×105個のＬ細胞を播種
した。培養用培地としては、10％（ｖ／ｖ）の
仔ウシ血清を含むDM−160培地を用いた。 (3) ２日または３日、37℃で培養した。 (4) 培地を、１mlの凍結用培地に交換した。凍結
用培地としては、前記(2)と培養用培地に、10％
のジメチルスホキシドを含むものを用いた。 (5) プログラムフリーザーを用いて、１分間に−
１℃の速度で−80℃まで徐冷し、凍結した。凍
結した細胞は培養皿ごと−80℃のフリーザーに
いれ、保存する。 本方法によつて凍結された細胞は、凍結直前の
形態を維持し、培養基質表面に張り付いたまま凍
結されている。この細胞を37℃のインキユベータ
ーに入れて急速に融解し、培地を培養用培地２ml
に交換すと、直ちに培養が再開できる。本方法
は、従来方法に従つて細胞を一旦剥離しアンプル
にて凍した場合よりも、融解後の再培養の効率が
高く一夜培養後の付着している生存細胞数が多か
つ。なお、その後の細胞の増殖は、本方法によつ
も、従来の方法によつても、基本的に変らない、
本方法によつたほうが生存細胞数の多い分だ細胞
密度が高く、そのため増殖速度はやや遅くつてい
た（図１）。 実施例 ２ NI−3T3細胞の凍結 (1) 直径３mmのプラスチツク製培養皿に２mlの１
％ゼラン水溶液を入れ、室温で30分放置し、培
養質表面をコーテイングした。 (2) ゼラチ水溶液を捨て、２mlの培養用培地に懸
濁した05個ないし２×105個のNIH−3T3胞を
播種した。培養用培地としては、10％（／ｖ）
のウシ胎児血清を含むイーグル最小須培地
（MEM）を用いた。 (3) ２日まは３日、37℃で培養した。 (4) 培地を、１mlまたは２mmの凍結用培地に交換
した。凍結用培地としては、前記(2)の培養用培
地に、10％のジメチルスホキシドを含むものを
用いた。 (5) プログラムフリーザーを用いて、１分間に−
１℃の速度で−80℃まで徐冷し、凍結した。凍
結した細胞は培養皿ごと−80℃のフリーザーに
いれ、保存する。 本方法によつて凍結された細胞の融解直後の生
存率をトリパンブルー色素排除法によつて調べる
と、85％以上の生存率を示した（表１）。但し、
この際、(1)のコーテイングを省略し、凍結用培地
を２ml加えて凍結した場合は、生存率がやや低下
していた（表１）。また、(1)のコーテイングを行
つた上で凍結し40日間に渡つて保存した場合で
は、この生存率は殆ど変化しなかつた（図２）。 この細胞は、融解直後、培地交換する際、培養
基質から剥離し易い状態になつている（図３左）
が、凍結時の細胞密度がコンフルエントに達して
いた方が、融解直後の細胞の生存性も良く、再培
養後も通常の培養と同様に増殖した（図３右）。
る。 実施例 １ Ｌ細胞の凍結 (1) 直径35mmのプラスチツク製培養皿に２mlの１
％ゼラチン水溶液を入れ、室温で30分放置し、
培養基質表面をコーテイングした。 (2) ゼラチン水溶液を捨て、２mlの培養用培地に
懸濁した105個ないし４×105個のＬ細胞を播種
した。培養用培地としては、10％（ｖ／ｖ）の
仔ウシ血清を含むDM−160培地を用いた。 (3) ２日または３日、37℃で培養した。 (4) 培地を、１mlの凍結用培地に交換した。凍結
用培地としては、前記(2)と培養用培地に、10％
のジメチルスホキシドを含むものを用いた。 (5) プログラムフリーザーを用いて、１分間に−
１℃の速度で−80℃まで徐冷し、凍結した。凍
結した細胞は培養皿ごと−80℃のフリーザーに
いれ、保存する。 本方法によつて凍結された細胞は、凍結直前の
形態を維持し、培養基質表面に張り付いたまま凍
結されている。この細胞を37℃のインキユベータ
ーに入れて急速に融解し、培地を培養用培地２ml
に交換すと、直ちに培養が再開できる。本方法
は、従来方法に従つて細胞を一旦剥離しアンプル
にて凍した場合よりも、融解後の再培養の効率が
高く一夜培養後の付着している生存細胞数が多か
つ。なお、その後の細胞の増殖は、本方法によつ
も、従来の方法によつても、基本的に変らない、
本方法によつたほうが生存細胞数の多い分だ細胞
密度が高く、そのため増殖速度はやや遅くつてい
た（図１）。 実施例 ２ NI−3T3細胞の凍結 (1) 直径３mmのプラスチツク製培養皿に２mlの１
％ゼラン水溶液を入れ、室温で30分放置し、培
養質表面をコーテイングした。 (2) ゼラチ水溶液を捨て、２mlの培養用培地に懸
濁した05個ないし２×105個のNIH−3T3胞を
播種した。培養用培地としては、10％（／ｖ）
のウシ胎児血清を含むイーグル最小須培地
（MEM）を用いた。 (3) ２日まは３日、37℃で培養した。 (4) 培地を、１mlまたは２mmの凍結用培地に交換
した。凍結用培地としては、前記(2)の培養用培
地に、10％のジメチルスホキシドを含むものを
用いた。 (5) プログラムフリーザーを用いて、１分間に−
１℃の速度で−80℃まで徐冷し、凍結した。凍
結した細胞は培養皿ごと−80℃のフリーザーに
いれ、保存する。 本方法によつて凍結された細胞の融解直後の生
存率をトリパンブルー色素排除法によつて調べる
と、85％以上の生存率を示した（表１）。但し、
この際、(1)のコーテイングを省略し、凍結用培地
を２ml加えて凍結した場合は、生存率がやや低下
していた（表１）。また、(1)のコーテイングを行
つた上で凍結し40日間に渡つて保存した場合で
は、この生存率は殆ど変化しなかつた（図２）。 この細胞は、融解直後、培地交換する際、培養
基質から剥離し易い状態になつている（図３左）
が、凍結時の細胞密度がコンフルエントに達して
いた方が、融解直後の細胞の生存性も良く、再培
養後も通常の培養と同様に増殖した（図３右）。
【表】
ーテイング
２ml 247 171 69.2％
なし
培養皿のコ 99.2％ １ml 320 274 85.8％
ーテイング
２ml 325 281 86.4％
あり
２ml 247 171 69.2％
なし
培養皿のコ 99.2％ １ml 320 274 85.8％
ーテイング
２ml 325 281 86.4％
あり
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 培養基質上に培養された状態で、凍結用培地
と共に培養基質ごと凍結されている足場依存性動
物細胞。 ２ 足場依存性動物細胞を培養基質上で培養した
のち、培養用培地を凍結用培地に交換し、培養基
質上に付着している足場依存性動物細胞を凍結用
培地と共に直ちに培養基質ごと凍結することを特
徴とする、培養気質上に培養された状態で凍結さ
れている足場依存性動物細胞の製造法。 ３ 培養を、細胞密度がコンフルエントの状態に
なるまで行うことを特徴とする特許請求の範囲第
２項記載の方法。 ４ 細胞の播種前、培養基質表面を接着促進物質
によりコーテイングしておくことを特徴とする特
許請求の範囲第２項又は体３項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62171772A JPS6416581A (en) | 1987-07-09 | 1987-07-09 | Frozen animal cell and production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62171772A JPS6416581A (en) | 1987-07-09 | 1987-07-09 | Frozen animal cell and production thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6416581A JPS6416581A (en) | 1989-01-20 |
| JPH0577389B2 true JPH0577389B2 (ja) | 1993-10-26 |
Family
ID=15929394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62171772A Granted JPS6416581A (en) | 1987-07-09 | 1987-07-09 | Frozen animal cell and production thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6416581A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019026910A1 (ja) * | 2017-07-31 | 2019-02-07 | 株式会社ツーセル | 凍結保存用組成物、凍結保存物の製造方法、細胞製剤、細胞製剤の製造方法、凍結保存用キット |
| WO2020067434A1 (ja) * | 2018-09-27 | 2020-04-02 | テルモ株式会社 | 細胞の凍結保存方法 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2506534Y2 (ja) * | 1990-07-17 | 1996-08-14 | 日立設備エンジニアリング株式会社 | コイルばね製造機の巻線軸作動装置 |
| ES2324525T3 (es) | 2001-06-20 | 2009-08-10 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Metodo para promover transferencia de acidos nucleicos. |
| JP5105905B2 (ja) * | 2007-03-05 | 2012-12-26 | 丹羽 正美 | 複数種類の細胞の立体的な配置の凍結保存方法及び凍結保存細胞の解凍方法 |
| JPWO2009050965A1 (ja) * | 2007-10-19 | 2011-02-24 | 国立成育医療センター総長 | 細胞凍結物固定化基材及び初代肝細胞培養ツール、並びに初代肝細胞培養ツールの製造方法 |
| ES2690212T3 (es) * | 2011-11-30 | 2018-11-19 | Astellas Institute For Regenerative Medicine | Células estromales mesenquimales y usos relacionados con las mismas |
-
1987
- 1987-07-09 JP JP62171772A patent/JPS6416581A/ja active Granted
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019026910A1 (ja) * | 2017-07-31 | 2019-02-07 | 株式会社ツーセル | 凍結保存用組成物、凍結保存物の製造方法、細胞製剤、細胞製剤の製造方法、凍結保存用キット |
| JPWO2019026910A1 (ja) * | 2017-07-31 | 2020-07-27 | 株式会社ツーセル | 凍結保存用組成物、凍結保存物の製造方法、細胞製剤、細胞製剤の製造方法、凍結保存用キット |
| WO2020067434A1 (ja) * | 2018-09-27 | 2020-04-02 | テルモ株式会社 | 細胞の凍結保存方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6416581A (en) | 1989-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107148967B (zh) | 一种抗原特异性t淋巴细胞冻存液及其制备方法和应用 | |
| US20180153155A1 (en) | Method for cryopreservation of cardiocytes derived from pluripotent stem cells or mesenchymal stem cells derived from adipose tissue or bone marrow | |
| TW201816107A (zh) | 用於細胞冷凍保存的組合物和方法 | |
| CN109526941A (zh) | 一种脂肪间充质干细胞的保存液 | |
| JP2008546406A5 (ja) | ||
| JP2007306856A (ja) | 細胞凍結保存方法 | |
| JPH0577389B2 (ja) | ||
| US20130295669A1 (en) | Method for controlling binding of cells to a substrate | |
| EP0834252B1 (en) | Method of thawing cryopreserved cells | |
| Kent et al. | Optimal seeding conditions for human endothelial cells | |
| JP5140155B2 (ja) | 動物細胞の凍結保存用担体、それを用いた凍結保存用バイオデバイス及び凍結保存方法 | |
| CN113088482B (zh) | 一种犊牛瘤胃上皮细胞分离培养的方法 | |
| JPS62249926A (ja) | 試験管内骨髄複製方法 | |
| JPH089966A (ja) | 動物細胞の輸送方法 | |
| JP2022131878A (ja) | 凍結された腎臓細胞の製造方法及び凍結された腎臓細胞 | |
| CN112544613A (zh) | 一种多能干细胞冻存液、其应用及冻存方法 | |
| JPWO2011016485A1 (ja) | ｉＰＳ細胞から肝実質細胞への分化誘導方法 | |
| Douthwaite et al. | Differentiation of human induced Pluripotent stem cell into Macrophages | |
| WO2017187941A1 (ja) | 凍結細胞集塊及び凍結細胞集塊の製造方法 | |
| JP6189599B2 (ja) | シート状細胞培養物の製造方法 | |
| CN110079500B (zh) | 角膜缘干细胞及其制备方法 | |
| CN114190367A (zh) | 冻存液及其制备方法与在免疫细胞的应用 | |
| Mariana et al. | Hepatocytes isolation from adult rats for liver recellularization | |
| JPH058675B2 (ja) | ||
| US6562621B1 (en) | Method of using fish ovarian fluid for culture and preservation of mammalian cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |