JPH0574344B2 - - Google Patents

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JPH0574344B2
JPH0574344B2 JP61502939A JP50293986A JPH0574344B2 JP H0574344 B2 JPH0574344 B2 JP H0574344B2 JP 61502939 A JP61502939 A JP 61502939A JP 50293986 A JP50293986 A JP 50293986A JP H0574344 B2 JPH0574344 B2 JP H0574344B2
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ligand
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substance
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Christian Guillot
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Battelle Memorial Institute Inc
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Description

請求の範囲 １ 所定のリガンドに特異的且つ可逆的に固定さ
れることのできる生物学的活性物質を、リガンド
がシロキサン試薬を介して固定されるSiO2、
Al2O3、TiO2及びZrO2の中から選ばれる粒状物
質よりなる「ミネラル−リガンド」系である鉱物
質担体を吸着剤として用いて、水相中で吸着させ
て分離する方法があつて、 (a) 担体を生物学的活性物質がリガンドに結合さ
れるように水相と混合し、 (b) 得られた負荷担体を遠心分離或いは濾過によ
り水相から分離し、 (c) 分離後担体を第二の水相に分散し及び該生物
学的活性物質を担体から脱着させ、及び (d) この様に脱着後、担体を該生物学的活性物質
を溶液中に含有する第二の水相から遠心分離或
いは濾過により分離し、その後該生物学的活性
物質を溶液から単離する工程よりなり、且つ、
吸着剤として用いられる鉱物質粒子がミクロン
以下であり且つ非−多孔性であることを特徴と
する生物学的活性物質を生物学的特異的吸着に
より精製する方法。
２ 1μｍ未満の粒径及び50〜600m2／ｇの比表面
積を有する微細粉末化材料が用いられる請求の範
囲第１項記載の方法。
３ 該材料が沈殿或いは焦性シリカである請求の
範囲第２項記載の方法。
４ 50〜600m2／ｇの比表面積を有するSio2、
Al2O3、TiO2及びZrO2の中から選ばれる非−多
孔性ミクロン以下の粒状材料を含んでなり、且つ
得られる粒状凝集物が100〜1000nｍの平均径を
有するまで水に分散され、凝集物の表面が生物学
的特異的吸着により精製される物質に特異的なリ
ガンドを有し、リガンドが連結シランを介して前
記粒状材料に固定されていることを特徴とする生
物学的物質を生物学的特異的に吸着する担体。
５ 前記粒状材料が焦性或いは沈殿シリカである
請求の範囲第４項記載の担体。
明細書 本発明は一般的に生物学的特異的吸着による生
物学的活性物質の精製に関する。より具体的に
は、本発明は水相における鉱物質基材における吸
着による生物学的活性物質の製造方法であつて、
その物質が所定のリガンドに特定の安定な可逆性
複合体を形成することにより固定可能であり、及
び使用される吸着剤担体媒体がリガンドを有する
シロキサン置換基により修正された微粉砕鉱物質
材料である方法に関する。
公知の如く、生物学的物質（蛋白質、酵素、ヘ
パリン、ホルモン、レクチン、抗原、抗体及びそ
の他のポリプチド類）をアフイニテイクロマトグ
ラフイにより精製するために、クロマトグラフイ
担体材料が選択され及び被精製物質に対して強い
特異的親和性を有する化学分子（リガンド）がそ
の上にグラフト化されている。分離されるべきそ
の他の物質と混合されている物質が粒状材料の存
在下におかれると、それは特異的反応（通常、そ
れ以後に可逆的である）、例えば抗原−抗体反応
における複合体の形成により問題のリガンドに結
合されるに対し、その他の物質は溶液中に残存す
る。引続き被精製物質は担体材料を複合体が解離
し、目的物質が回収され、又クロマトグラフイ担
体が回収されて新しい抽出過程に循環されること
ができるような条件下及び媒体中に置くことによ
り塩析される（例、文献US−Ａ 4066505参照）。
この塩析操作は通常溶出溶媒或いは溶媒混合物を
用いてクロマトグラフイカラム内で行われる。
次のものは上記目的のために一般的に用いられ
る担体材料の具体例である：Sephadex、
Sepharose、Sephacryl、Spherosil、Ultogel、
Affi−Gelなどの市販品として知られているよう
な有機及び鉱物質ゲル。
通常、これらの材料は数ミクロン乃至数百ミク
ロンのオーダーの大きさ及び10〜300nｍの寸法
の孔を有する球状或いは異つた形状の多孔性粒子
から構成されている。所定のリガンドをクロマト
グラフイ担体の表面に結合されるための結合剤は
リガンドと共有結合その他の態様で反応すること
のできる基を含み且つリガンドを担体表面に固定
する（化学的或いは吸着により）基を含んでなる
分子である。シリカの粒子（Spherosil）或いは
多孔的ガラス（CPGガラス）などの鉱物質担体
に関しては一般的にアルキル基が固定されるべき
リガンドと反応する−OH、−CHO、−NH2、−
NCO或いはオキシランなどの基を含んでなるト
リアルコキシ−アルキルシランなどの反応性シラ
ンから作られている。
例えばK.ロイ等（K.Roy et al.）「アフイニテ
イクロマトグラフイ及び生物学的認識（Affinity
Chromatography and Biological
Recognition）」〔I.M.Chaiken等編、Academic
Press、1983年257頁〕はγ−グリシジル−オキシ
プロピル−トリメトキシ−シランでシラン化され
たシリカゲル担体の使用を記載している。P.O.ラ
ルーソン等（P.O.Larsson et al.）は「アフイニ
テイクロマトグラフイに関連した幾つかの新しい
技術（Some New Techniques Related to
Affinity Chromatography）」les colloques de
l′INSERM：Chromatographe d′affinite et
interactions moleculaires、J.M.Egli編（1979
年）91頁においてグリセロプロピルトリアルコキ
シシラン（アルキル置換基か−HOCH2−
CH2OH−CH2O−C3H6−基である）によりシリ
カゲル（10μｍ粒子、6nｍ孔）のシラン化を記載
しており、グリコール基が引続いて公知の方法に
よりアルデヒド基に転換され、引続きそのアミノ
基のシツフ反応及びＮ＝Ｃ結合の還元により生物
学的活性リガンド（例、抗体）を固定するのに用
いられている。
文献US−A3652761はアルキル基がアミノ、ニ
トロソ、カルボニル、カルボキシ、イソシアネー
ト、ジアゾ、イソチオシアネート、スルフヒドリ
ル及びハロゲノカルボニル基などの基を含んでな
るアルキル化アルコキシシランによる生物学的活
性分子（例えば抗原或いは抗体）のガラス、シリ
カゲル、コロイド状シリカ、ベントナイト、ウオ
ラストナイトなどへのカツプリングを記載してい
る。
文献WO−Ａ−82／02818は粒子、特に前記通
常の方法によりシラン化された多孔性ガラスより
なり、且つ被精製イムノグロブリンの一方或いは
他方に特異的なモノクローナル抗体を有する粒子
を充填したカラム上にミルクを運ぶことによりミ
ルクからイムノグロブリンを分離する方法及び装
置を記載している。
その他の文献例えばEP−Ａ 56977号及びEP
−Ａ 88818号も同様な主題を論じている。
これ迄に知られた上記技術を用いる方法は使用
される担体の多孔性、孔の寸法及び担体内の粒子
がカラム内に置かれた際にチヤンネリングを避け
るために実質的に球状であり且つ均一な寸法を有
さなければならないという事実により幾つかの欠
点を有する。これらの材料の活性表面の殆んどは
孔の内側にあり、又孔は固定されるべき分子の大
きさと同一のオーダーの寸法をしばしば有するた
めに、分子は塩析の際に孔の内側をゆつくり撹拌
するので外部の方向に拡散するのが困難である。
又被精製物質（しばしば巨大分子）は低い固有の
拡散速度を有するに過ぎない。巨大分子が問題の
リガンドに到達するまでの平均距離は比較的大き
い（吸着粒子の場合において数十ミクロン）の
で、被精製分子の吸着或いは脱着の如何を問わ
ず、これらの通過は遅く非効率的である。小さな
孔は大きな分子に接近可能でなく、又これらの孔
内に存するリガンドは従つて被精製物質を固定す
ることができない。
上記理由により、多孔性生物学的吸着剤は数多
くの欠点、主にそれらの低い固定能力及び吸着及
び脱着工程の遅さを有する。固定能力に関して、
例えばUS−Ａ 3652761において、グラフト率が
多孔性ガラスのグラム当り14〜18mgの抗原（リガ
ンド）であるならば、僅かに約５mgの抗体（ヒト
ガンマ−グロブリン）が担体のグラム当り固定さ
れるに過ぎないと述べられている。更に、均一寸
法の多孔性ビーズのコストは極めて高く大規模の
工業的用途に適合しない。
本発明の特許請求の範囲第１項に規定されてい
る方法は上記欠点を除去し、実質的に特異的抽出
収率を増大させることができる。更に、被抽出生
成物が基材上に固定される速度が高く、従つてこ
の方法は使用するのにより経済的である。最後に
この方法は従来の技術とは対照的に比較的に多量
の（毎年数十トン乃至数百トン）の被抽出物を処
理するために困難なしに使用することができる。
更に、非−多孔性のミクロン以下にされたシリカ
のコストは通常吸着による精製のために使用され
ている標準化された孔を有する担体のコストより
も約千倍低いものである。予想に反して、本発明
により使用される非−多孔性ミクロン以下の粒子
はリガンドによりグラフト化された後、、濾過に
より容易に分離される。
以下のものは本発明により好ましく使用される
鉱物質担体の具体例である：範疇に応じて異る
0.01〜0.1μｍの範囲の一次（非−凝集）粒子を有
し、大きな比表面積を有する沈殿或いは焦性シリ
カ。Al2O3、TiO2、及びZrO2が通常0.02〜1μｍの
粒径を有する粒子を有する粉末形状で用いられ
る。以下において、特にシリカについてより多く
述べられるが、茲に与えられる情報は同等にアル
ミナ、Tio2及びZrO2に適用されるべきものと了
解されるべきである。又、文献US−Ａ 3652761
に記載されるシリケート担体も用いることができ
る。上記担体に関して以下の文献が注意されるべ
きである。
文献US−Ａ 4190425号は気相クロマトグラフ
イ用のカラムを充填するためのミクロン以下のシ
リカに基づいた重合体材料を記載する。例えば、
具体例4ffは高度に多孔性の媒体を得るように有
機基のシリカ粒子へのグラフト化及び引続くその
単量体による共重合の方法を開示する（アブスト
クラト、16行参照）。この材料は従つて本発明に
よる様な要請に対しては不適当なものである。
又、この文献はクロマトグラフイ担体を不活性化
する目的のためのシリル化（ヘキサメチルジシラ
ザンを使用）を教示するが、しかし本発明におけ
るようなグラフト化の目的のためにシリカ粒子の
シラン化を教示するものではない。
文献FR−Ａ 2020527号は生物学的活性分子
（例、酵素類）の鉱物質担体上のカツプリング剤
としてシラン類を用いる固定化を記載している。
多孔性グラス、シリカゲル、ベントナイト、アル
ミナ、ヒドロキシ−アパタイト及びコロイド状シ
リカが鉱物担体の具体例として与えられている。
しかしながら、文献FR−Ａ 2020527号の目的即
ち循環可能な生物活性鉱物質担体の調整は本発明
のそれとは異る。固定化酵素は触媒であり、全く
異つた要領で作用する生物学的特異的吸着剤では
ない。又、この文献に記載されるシラン類は本発
明におけるような水性媒体の代りに無水媒体（キ
シレン、ベンゼン）中においてグラフト化されて
いる。
文献FR−Ａ 2083067号は同様に不溶性にされ
た酵素、特に重合体及びオルガノシランを介して
固定された再使用可能な酵素を有するシリカ−含
有物質に関する（４頁９〜17行参照）。中間体の
重合体のために、この文献の教示は本発明による
それとは更に離れたものである。
文献FR−Ａ 2078427号は同様な主題を取扱う
ものである。この文献の実施例１はシリカタイプ
のCab−Ｏ−Sil（これはミクロン以下のシリカに
対して用いれている名前である）へのシラン及び
カルボジイミドによるトリプシンの固定化を記載
している。この教示は従つて文献FR−Ａ
2020527号のそれに極めて類似している。この種
の再使用可能な触媒を得るためにトリプシンは本
発明と全く異る鉱物質担体に強く結合されなけれ
ばならない。本発明の目的はフエニルブチルアミ
ン（非−多孔性鉱物質粒子に固定されている）な
どのリガンドによりトリプシンの選択された吸着
から生ずるような一次的な可逆性結合を得ること
であり、吸着はトリプシンが引続いて塩析される
ように可逆的なものである。
本発明の方法の工程(a)をシリカの場合に行うた
めには「シリカ−リガンド」担体の水性懸濁液が
被単離生物学的活性物質を含有する水性媒体に添
加され、反応物質はPH、イオン強度及び温度を調
整するのが容易である最適条件下に接触され、か
くして、抽出時の収率を大きく改良する。これら
の条件は各々の場合においてオペレーターにより
技術上の原則に従つて選ばれなければならない。
目的物質に対する吸着及び固定収率は優れたもの
である。又反応は通常の担体の場合のように担体
が分子（通常は嵩ばつた分子）が精製される前に
侵入しなければならない孔を有しないので極めて
迅速である。全ての反応性の基は粒子の表面上に
おいて利用可能である。その結果実際的に固定を
完了するための時間は通常周囲温度において約５
〜10分である。又、周囲温度において作業するこ
とが可能であり、それは状況に応じて比較的高い
圧力を必要とする多孔性支持体の場合よりもより
経済的である。
一般的に、本発明に従つてミクロン以下のシリ
カの懸濁液を使用する場合に、水和吸着剤懸濁液
を使用する場合に、水和吸着剤懸濁液の密度は約
0.2（SiO2のｇ当り５mlの吸着剤懸濁液）であり、
又懸濁液はシリカのグラム当り約100〜300mgの生
物学的活性物質の生物学的特異的吸着能力を有す
る。これらの値は通常の多孔性担体よりも少なく
とも大きさが１オーダーより大きなシリカのグラ
ム当りの吸着能力に対応する。
本発明の方法の工程(b)は通常の手段による濾過
或いは遠心分離により行うことができる。4000〜
6000ｇのオーダーの遠心分離の重力場が適当であ
り高能力遠心分離即ち操作当り１以上の懸濁液
を処理することのできる遠心分離において困難な
しに得ることができる。
分離は又所定の多孔度の限外濾過或いはマイク
ロ濾過隔膜を用いた接線濾過として知られている
方法によつても行うことができる。この方法にお
いては、濾過されるべき懸濁液が隔膜表面と接触
され、高速度でそれに接線方法に運ばれる。隔膜
の透過率は相当な液相の流れが実際の粒子が隔膜
内を通過できないにも拘らず通過し、従つて非−
吸着物質を含有する液相から次第に分離されるよ
うに選ばれる。幾つかの市販の接線濾過装置は懸
濁液が流れる中空フイルターを用いる（例、
ENKA GmbH Wuppertal、FRGによるModule
Microdyn；SFEC、Bollene、Franceによる
Module CARBOSEP）。その他の装置は平坦な
膜を用いる（MILLIPOREによるPellikon
Cassettes）。或いは又荷電粒子は除去されるべき
溶解物質から透過液中の除去された量に等しい量
の水相が濾過される懸濁液に連続的に添加される
透過濾過方法により分離されることが出来、この
方法は水相が抽出物質を担持する粒子状基材のみ
を含有し、精製されるべき溶液中に元々存在した
その他の溶解生成物がなくなるまで継続される。
これらの操作においては、媒体が通常引続く操
作、即ち工程(c)に対して適したものであるので、
洗浄後荷電シリカを乾燥させたり或いはそれを洗
浄媒体から単離する必要がない。
担体から精製されるべき物質の工程(c)における
脱着即ち精製されるべき物質と複合したリガンド
の解離は通常の方法即ち適当に水相の特性を調整
することにより（適当な有機溶媒などによるPH、
温度、イオン強度、稀釈）により行われる。脱着
のための操作条件は例えば次の文献に記載されて
いる：E.A.ヒル及びM.D.ヒルテンスタイン（E.
A.Hill and M.D.Hirtenstein）、Adv.in
Biotechn.Process １、31（1983）。最も通常用い
られている方法の幾つかはイオン強度或いはPHの
修正、及びカオトロピツク剤（例、KSCN）、水
溶性有機溶媒（アルコール類、エチレングリコー
ル、イソプロパノール等）、「変形」剤（尿素及び
グアニジン）及び遊離状態のリガンドの使用に関
する。解離が約20％のイソプロパノール或いはそ
の他の同様な水溶性溶媒を含有する0.5M NaCl
の水相を用いることにより有利にもたらされる場
合がある。
工程(d)は工程(b)について説明したのと同様の方
法により行うことが可能である。精製されるべき
物質が脱着されたシリカ−リガンド基材を接線濾
過を含む前記遠心分離及び濾過の方法を用いて分
離することができる。その場合には勿論濾液はそ
れが溶液中に精製されるべき物質を含有するので
主に必要とされる相である。この物質は常法によ
り抽出され、即ち水が例えば常圧或いは減圧下に
ロトヴエイパー内における蒸留、或いは凍結乾燥
或いはスプレーにより分離或いは沈澱が生ずるま
で蒸発される。或いは又、沈澱は非−溶媒の添加
或いは加塩（例えば（NH4）2SO4の添加）により
もたらすこともできる。この物質を次いで集め常
法により貯蔵する。得られたシリカ−リガンド系
は通常そのまゝ新たな抽出操作に再使用可能であ
る。
本発明による方法において使用されるシリカ担
体（シリカ−リガンド系）は適当なリガンドが予
め堆積されたアルコキシシランを用いてミクロン
以下のシリカのシラン化により或いは引続き供給
されるリガンドを固定することのできる基を有す
るアルコキシシランによるシリカのシラン化によ
つて調製することが出来る。
第一の場合において、ミクロン以下のシリカ例
えば50〜600m2／ｇのオーダーの比表面積を有す
る焦性或いは沈澱シリカ（米国CABOT Corp.に
よるCAB−Ｏ−SIL種と同様にDEGUSSAによ
るAEROSILタイプ−130、−200、−300及び−380
が適当である）が液体例えば有機溶媒或いは水中
において好ましくはガラス球の存在下にミルク状
の均質な液体が得られるまで激しく撹拌されて分
散される。撹拌された混合物におけるこれらの球
はこれらの条件下で形成される傾向を有する（そ
れらの高度の吸湿性により接着し合うことによ
り）SiO2粒子の凝集体の大きさを減少させる。
或いは又分散液はホモジナイザー例えば
KINEMATICA GmbH、FRGによる
POLYTRON装置を用いることによりもたらす
ことができる。アルミナの場合においては、
DEGUSSAによる「酸化アルミニウム−Ｃ」と
或いはCABOTによるALCANと称される製品が
使用される。ZrO2及びTiO2は少なくとも50m2／
ｇの比表面積を有する極めて微細な粉末の形態で
使用される（例、DEGUSSAによる二酸化チタ
ンP25）。適当な装置における周囲温度でのある
分散時間（半時間乃至１時間）の後、凝集体の大
きさは約100〜1000nｍ、好ましくは200〜300nｍ
に標準化される（シリカの一次的個々の粒子は最
初に僅かに数ナノメータであることに注意）。分
散後の凝集体の大きさは常法により例えば
COULTERナノサイザーを用いてチエツクする
ことができる。
適当なシランは選択され引続く被精製物質との
特別の錯体を形成するために必要とされるリガン
ドと反応させられる。その様なリガンドの具体例
としては被精製物質の抗体、酵素阻害剤、補因
子、レクチン、Cobachron blue Ｆ 3G−Ａ或
いはPROCION（ICI）などの染料、アルキル或い
はフエニル基などの疎水性基、炭水化物、ヘパリ
ンなどである。
本発明の方法に用いられるシラン類はケイ素原
子に結合したアルキル置換基の一部を形成し、選
ばれたリガンドを固定するのに適した反応性基を
有するものの中から選ばれる。我々は既に個々の
場合に応じて適当であり、それらに添加されるべ
きリガンドの構造及びその反応性基の性質に応じ
て選ばれる各種トリアルコキシシランを見て来
た。ポリペプチドリガンドは通常それらの反応性
基−OH、−NH2、SH或いは−COOH（必要に応
じて中間試薬を介して変成される）を介して固定
され、適当なシランは−NCO、アゾ、グリシド
キシ、−CHO、オキシラン、アミノ−などの固定
基を含有する。場合によつては反応性シラン基と
固定されるべきリガンドの間に架橋剤が使用され
なければならないことがあり、例えばNH2基と
カルボン酸の間の結合の場合（カルボジイミドの
使用）或いは二つのアミノ基のカツプリングの場
合などがあり、この場合には架橋剤はジアルデヒ
ド例えばグルタルアルデヒドである。本発明に従
えばトリメトキシアミノプロピル−シラン及びト
リメトキシグリシドキシプロピル−シランを用い
るのが好ましい。勿論、その他の同様なアルコキ
シシラン例えば対応するエトキシ、プロポキシ或
いはブトキシシラン類も又適当である。シランと
リガンドの間の反応は通常の手段により且つ目的
とする反応のための通常の条件下においてもたら
される。これらの条件は当業者には公知であり、
茲で詳述する必要はない。しかしながら、その中
でシロキサン基が安定である例えばTHF、アセ
トン、ジオキサン或いはその他の無水（しかし水
溶性の）有機溶媒などの非−水性媒体中において
通常反応が行われる。場合によつては溶媒なしに
操作することも可能である。
リガンドがシラン誘導体に固定されると、反応
混合物を周囲温度において撹拌しながら前記水性
或いは有機シリカ分散液に添加する。より高温例
えば20〜80℃に加熱することにより数時間（通常
１〜８時間）操作を行うことも可能である。冷却
後、「シリカ−リガンド」基材の所望の懸濁液を
得、そのまゝ本発明の方法に用いることができる
（請求の範囲第１項参照）。
シリカ−リガンド系を調製する第二の場合にお
いて、トリアルコキシシランを先ずシリカ懸濁液
好ましくは水溶液と先ず接触させ、リガンドは後
になるまで添加されない。この方法はリガンドが
バシトラシン或いは抗体或いはレクチンなどの場
合のように有機溶媒に不溶であるか或いはその存
在に対して感受性（変性）である場合に特に好ま
しい。その場合には、シラン化試薬は水性シリカ
懸濁液に直接に添加されるか或いはシラン試薬を
先ずそのアルコキシ基の予備加水分解をもたらす
ために先ずPH４〜10において水中に分散し、その
後予備加水分解されたアルコキシシランの分散を
シリカ分散液に添加することができる。鉱物質担
体に添加される前に水性媒体中にトリアルコキシ
シランが保たれる時間は引続く選ばれたリガンド
の固定に関してシラン化されたシリカの特性に影
響を及ぼすことに注意。従つて、実験条件（グラ
フト化される担体を添加する前の待時間、グラフ
ト時のPH及び温度）を調整することによりシラン
化される担体の性質を使用されるリガンドの性質
に適用させることが可能であり、これはシラン化
が行われる水性媒体のPH及び温度も又極めて重要
であるので本発明の方法のもう一つの利点であ
る。PH（考慮されている範囲内の）が高ければ高
い程、水溶液がますます濃化し、且つ担体の容積
（遠心分離により液体から分離された際に）が増
加する傾向を示す。アミノシラン類に対しては
100℃のオーダーの温度が適当であるのに対して、
グリドキシ−化合物の場合には50℃を越えないの
が好ましい。
リガンドはシラン化された担体に通常の条件下
において、通常単にリガンド（水溶液中）を前記
の如く得られたシラン化されたシリカ懸濁液に添
加し、及びこれらの試薬を共にリガンドが担体に
結合するのに十分な時間放置することにより水溶
液中のシラン化された担体に固定される。場合に
より（前記参照）この段階において架橋剤が使用
される（実施例５参照）。得られた「シリカ−リ
ガンド」系を次いで前記の抽出過程において用い
られる。しかしながら、場合によつては、リガン
ドは非−水性有機媒体中においてシラン化された
担体に固定することができる。その場合には、水
溶性有機溶媒が分散されたシラン化担体に添加さ
れ、混合物を遠心分離し、残渣を溶媒に溶解し、
及び残存水が除去されるまでこの操作を繰返して
有機溶媒中のシラン化された粒子の最終懸濁液を
得る。THF、ジオキサン及びエタノールが溶媒
の具体例である。リガンドは前記場合と同様に直
接にシランに結合される。
以下、実施例により本発明を例示する。
実施例 １ PH４における77mlの10ｍＭ酢酸ナトリウム溶液
中の23ml（0.1mol）のギリシドキシプロピルト
リメトキシ−シランを周囲温度において撹拌しな
がら滴加した。添加後、混合物を30分間撹拌しな
がら室温において放置した。
６ｇの焦性シリカ（Aerosil 130 DEGUSSA）
をガラス球（直径３mm）の存在下において撹拌し
ながら水中にミルク状の懸濁液が得られるまで分
散した。平均粒径は200〜300nｍであつた。
このシラン溶媒６mlを次いで撹拌しながらシリ
カ懸濁液（１ｍmolシラン／ｇシリカ）及びPHを
0.5MのK2HPO4溶液（約１ml）及び数滴の1N
NaOH溶液で8.5に増大させた。一晩放置後この
懸濁液を遠心分離（6000ｇにおいて10分）し、残
渣を再溶解し、100mlの純粋中で二回濯いだ。
シラン化されたシリカを50mlの水に再懸濁し、
PH8.0の0.2M重炭酸緩衝液約100ml中の25ｇのバ
シトラシンの溶液を撹拌しながら５ｇの初期シリ
カに対応する量の懸濁液に添加した。この混合物
を次いで周囲温度においてPH８で24時間放置し
た。
それを次いで遠心分離して鉱物質担体を過剰の
バシトラシン溶液から分離し、残渣を尚存在する
エポキシ基を不活性化するためにPH８の過剰の
1Mエタノールアミン溶液（50ml）に再懸濁させ
た。この懸濁液を遠心分離（10分間、6000ｇ）
し、残渣を次いで４回（各回毎に遠心分離による
中間分離を行う）、即ち２回続けて水で、１回は
1M NaCl中で及び最後にトリス−緩衝液（10ｍ
Ｍ）及び0.2ｍＭのCaCl2、PH８中において洗浄し
た。
この「シリカ−バシトラシン」担体を次いでバ
シトラシンと特異的複合体を形成する酵素サブチ
リシンBPN′の生物学的特異的吸着による抽出及
び精製のために使用した。
この目的のために、前記担体をmlの溶液当り
100mgの固体基材の割合で47mg／mlの蛋白質及び
2000U／mlの酵素活性を有する予め清澄化された
PH８の発酵媒体中に導入した。前記において、サ
ブチリシンBPN′の単位は周囲温度においてPH８
で毎分1μmolのＮ−アセチル−Ｌ−チロシンのエ
チルエステルを加水分解することのできる酵素の
量と定義される。30分間インキユベーシヨン後、
混合物を遠心分離（6000ｇ、10分）し、上澄液体
を分析したところ、その酵素活性は初期活性の
3.7％に対応し、及びそれが溶液中に初めに存在
した蛋白質の74％を含有することを示した。
残渣を担体ｇ当り30mlの溶液を用いて25容量％
のイソプロパノールを含有するNaClの1M溶液中
に懸濁した。１時間後更に遠心分離により液体画
分E1が得られた。残渣を同一の方法で溶解し、
再抽出して第二の画分E2を得た。画分E1及びE2
を合一し、分析したところ、出発溶液中に存在し
た量の蛋白質の23重量％と共に元の酵素活性の
96.4％の存在を示した。従つてサブチリシン精製
因子は4.2であつた。
実施例 ２ シラン化されたシリカを実施例１と同様に使用
し、0.2M、PH９炭酸緩衝液内で操作して、コン
カナバリンＡレクチン（Con Ａ）とカツプリン
グさせた。同一緩衝液に溶解したCon Ａの溶液
（21mg／ml）をシラン化されたシリカのｇ当り247
mgのCon Ａの割合で添加し（乾燥製品として計
算）、室温において撹拌しながら一晩放置した。
遊離エポキシ基を次いで1M溶液、PH９内のエタ
ノールアミンにより保護し、一晩放置した。
固形分を次いで遠心分離により分離し、残渣を
次の溶液を用いて洗浄した（水性媒体中に再懸濁
後遠心分離）： 水で２回；Tris10ｍＭ緩衝液中1M NaCl、PH
９；10ｍＭ酢酸緩衝液中1M NaCl、PH５；最後
にPH８におけるTris0.05M中0.05M NaCl。この
溶液は尚当り２ｍmolの次の各イオンを含有し
た：Ca++、Mg++、Mn++。
このシリカ−Con Ａ基材を次いで用いてワサ
ビダイコンペルオキシダーゼと混合化したイムノ
グロブリンIgGを抽出した。この目的のために、
シリカ−Con Ａ系のIgG単独に対する親和性の不
存在について予めチエツクを行つた。この目的の
ために、PH８におけるTris50ｍＭ、NaCl50ｍＭ
緩衝液中に溶解された10mgのヒトIgG（Miles）を
100mgのシリカ−Con Ａで処理した。30分間接触
後、混合物を前記の如く遠心分離し（6000ｇ、10
分）、残渣を同一媒体中に再分散し、再遠心分離
した。これらの二つの操作からの上澄液体を合一
し、分析したところ98％の初期蛋白質含量の存在
を示した。溶液中のヒトIgGを次いでS.アブラメ
アス（S.AVRAMEAS）、イムノケミストリー
（Immunochemistry）（1963）、６、43に従つてペ
ルオキシダーゼで標識を付した。標識付された
IgG画分を次いでシリカ−Con Ａ担体を用いて抽
出した。
同時に遊離IgG及びペルオキシダーゼで標識付
られたIgGを含有する溶液を次いで溶液中６mgの
蛋白質当り100mgのシリカ−Con Ａ担体で処理し
た。この媒体は次の緩衝液よりなるものであつ
た：50ｍＭ NaCl、50ｍＭ Tris、PH８、Ca++、
Mg++、Mn++2ｍＭ。周囲温度で30分後固体粒子
を遠心分離により分離した。分析は上澄液が初期
ペルオキシダーゼ活性の僅か8.2％を含有するに
過ぎないが、しかし、IgGの非−複合化部分の約
92％を含有することを示した。
シリカ−Con Ａ担体に固定したペルオキシダ
ーゼIgG複合体は次の様に解離された。負荷担体
を次の緩衝液中のα−メチルグルコシドの0.1M
溶液に懸濁させた：50ｍＭ NaCl、50ｍＭ
Tris；++8；Ca、Mg++、Mn++2ｍＭ。30分間イ
ンキユベーシヨン後遠心分離した（6000ｇ、10
分）。上澄液は元のペルオキシダーゼ活性の86.2
％を含有した。
実施例 ３ ６ｍmolの４−フエニルグチルアミン（リガン
ド）を４℃において５ｍmolのグリシドキシプロ
ピルトリメトキシシランに滴加した。この混合物
を４℃において更に１時間撹拌し、その後温度を
上昇させ、撹拌を合計５時間後に停止した。
次いで、10mlのCH3COONaの水溶液（10ｍ
Ｍ、PH４）を溶液に添加し、アルコキシ基の予備
加水分解を周囲温度において約30分間行わせた。
一方、焦性シリカ（AEROSIL−130）の水性
分散液を実施例１と同様にして調製し、前記の如
く得られたシランの水溶液をこの分散液にシリカ
のｇ当り50／μmolのシランの割合で添加した。
PHを8.5に調整し、グラフト化反応を周囲温度に
おいて72時間行わせた。
シラン化されたシリカ担体を単離し、実施例１
の方法によりリガンドにカツプリングさせ、水相
のml当りの40mgの固体の割合で50ｍＭ CaCl2、
50ｍＭ Tris（PH８）緩衝液中に再懸濁させた。
懸濁液を次いで前記と同一の緩衝液（PH８）中の
粗製膵臓抽出液に添加した。膵臓起源の汚染物質
に加えて、この抽出液はトリプシン及びキモトリ
プシンを含有した。抽出液の溶液に添加した担体
の割合は乾燥抽出物質のｇ当り10ｇであつた。30
分間接触後、固形分を前記実施例と同様にして分
離し、上澄液（S1）を一方の側においた。この
操作を残渣を同一緩衝液中に25mg／ｇシリカの割
合で懸濁させた後繰返し、この様にして第二の液
体部分（S2）を得た。最後に、固形分を３度目
にしかしテトラエチルアンモニウムブロマイド
（25ml／ｇ固形分）の1M溶液中に再懸濁させ遠心
分離して第三番目の液体部分（E1）を得た。
これらの各種獲得画分は次いで酵素の分析を行
つた。これらの分析はトリプシンについては基質
としてＮ−ベンゾイルアルギニン−ｐ−ニトロア
ニリド（BAPNA）及びキモトリプシンに対して
は基質としてグルタリル−フエニルアラニン−ｐ
−ニトロアニリド（GLUPHEPA）に基づくもの
であつた。これらの技術は下記の通りであつた： トリプシン：10μの分析用溶液を10ｍＭ
CaCl2及び50ｍＭ Tris−Hcl緩衝液、PH８中の
BAPNAの過剰の10-3M溶液に添加し、形成され
たｐ−ニトロアニリンの量を410nｍにおいて分
光光度法により測定した。BAPNA単位は周囲温
度において前記条件下において毎分1μmolの
BAPNAを加水分解することのできるトリプシン
の量と定義された。例えば、15600単位／mgの或
るBAEE活性を有する極めて純粋なトリプシンの
試料（SIGMA製タイプ）は2.35BAPNA単
位／mgの強度を有する。
キモトリプシン：10〜20μの分析用溶液を10
ｍＭ CaCl2、50ｍＭ Tris−HCl緩衝液PH7.6中
のGLUPHEPAの過剰の10-3M溶液に添加し、
410nｍにおける加水分解によるｐ−ニトロアニ
リンの放出速度を測定した。GLUPHEPA単位は
与えられた条件下における周囲温度での1μmolの
ｐ−ニトロアニリン／分を放出することのできる
トリプシンの量と定義された。例えば、与えられ
た65BTEE単位／mgの活性を有するキモトリプシ
ンの高純度製剤（SIGMA、タイプ）は68×
10-3GLUPHEPA単位（mg）の強度を有する。
これらの方法を用いて本実施例における各種画
分の分析して次の結果を得た： 【表】 これらの結果が明確に示すように、本発明のシ
リカ−４−フエニル−ブチルアミンの系はトリプ
シンの存在下において選択的にキモトリプシンを
固定する。固定されたキモトリプシンは又テトラ
エチルアンモニウム溶液により塩析され、10％未
満の出発トリプシンを含有するにすぎない。キモ
トリプシンに対する精製収率は77％であつた。
実施例 ４ 本実施例においては、酸化アルミニウム（タイ
プＣ、DEGUSSA）を鉱物質担体として用いた。
アルミナ（５ｇ）をPolytronホモジナイザーを
用いて50mlの水中に分散した。Coulterナノサイ
ザーで測定された分散後の粒子の平均径は220n
ｍであつた。又、グリシドキシ−プロピルトリメ
トキシシラン水溶液（１ｍmol／ml）を実施例１
と同様にして調製した。
シラン水溶液のアリコート部分を次いで撹拌し
ながらこのアルミナ懸濁液に添加し（アルミナの
ｇ当り１ｍmolのシラン）、PHを数滴の1N
NaOH水溶液を添加することにより7.5に調整し
た。一晩放置後、懸濁液を遠心分離（6000ｇ、10
ｍｎ）し、残渣を純粋中に溶解し、同一条件下に
再遠心分離した。このシラン化されたアルミナを
次いでPH9.0における0.2M重炭酸緩衝液中でｍ−
アミノフエニルホウ酸（0.5M）とカツプリング
させ、混合物をPH8.0及び周囲温度において72時
間放置した。アルミナ及びｍアミノフエニルホウ
酸系の粒子を次いで４回遠心分離を行うことによ
り洗浄し、水中に再懸濁させた。最後の遠心分離
操作後担体をPH8.0における10ｍＭ Tris、0.2ｍ
Ｍ CaCl2緩衝液に懸濁させた。
この担体を次いで用いてサブチリシンBPN′を
抽出及び精製した。47mg／mlの蛋白質及び
2000U／mlの酵素活性を有する実施例１において
用いたのと同一の清澄化発酵培地を用い、100mg
の担体をml溶液当り添加した。周囲温度で20分後
混合物を遠心分離した（6000ｇ、10分）。上澄液
を分析したところ、この液の酵素活性は初期酵素
活性の32％に対応した。残渣をペンタエリスリト
ールの0.5M溶液に懸濁し、１時間後に再遠心分
離して、液体画分Ｅを得た。この画分は最初に存
在した酵素活性の59％、及び出発溶液中に存在し
た蛋白質の量の24％を含有した。従つて、この操
作により最初のサブチリシンは2.25の精製因子を
もつて精製された。
実施例 ５ 10ｍmolのガンマ−アミノプロピル−トリメト
キシシランを５mlの0.02Mの酢酸ナトリウム溶
液、PH4.0に連続的に4N塩酸を添加することによ
りPHを４〜５に保つように注意を払いながら滴加
した。この溶液を次いで撹拌下に周囲温度におい
て30分間保つた。その容量を次いで蒸留水で10ml
にした。
焦性シリカ（Aerosil300、５ｇ）を
POLYTRONホモジナイザーを用いて50mlの水
中に分散した。シランの水溶液を次いでこの分散
シリカ懸濁液にｇシリカ当り、１ｍmolのシラン
の割合で添加し、溶液のPHを1M K2HPO4を添加
することにより7.4に調整した。この懸濁液を撹
拌しながら一晩周囲温度に放置した。
粒子を次いで遠心分離（10分、6000ｇ）し、残
渣を蒸留水に懸濁させた。この操作を４回繰返
し、粒子を順次1M NaCl、蒸留水、50：50水／
アルコール混合物、及び最後に純粋エタノールに
懸濁させた。エタノール中の最終懸濁液はml当り
約50mgのシリカを含有した。次に、エタノール中
においてＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−フエニルア
ラニン（Ｚ−Ｌ−Phe）の0.5M溶液を調製し、及
びＮ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，
２−ジヒドロキシリン（EEDQ）の0.5M溶液を
調製した。Ｚ−Ｌ−Pheの溶液10mlをシラン化さ
れたシリカ懸濁液100mlに添加し、次いで10mlの
EEDQの溶液を添加し、混合物を周囲温度におい
て撹拌下に24時間放置した。
粒子を次いで繰返し遠心分離の後、最初にエタ
ノール（３回）次いでエタノール／水混合物（１
回）及び最後に蒸留水中に再懸濁させることに洗
浄した。
これらの粒子を用いて実施例１において説明し
たサブチリシンBPN′を含有する溶液を精製し
た。200Uの酵素当り100mgのシリカ−Ｚ−Ｌ−
Pheを用いた。これらの条件下において、遠心分
離後の上澄後（S1）は初期酵素活性の１％未満
を含有するに過ぎなかつた。粒子を次いで25％イ
ソプロパノールを含有する1M NaCl溶液に懸濁
させ、懸濁液を１時間後に遠心分離した。今回は
上澄液は元の酵素活性の87％を含有した。
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